Summary
Het genereren van gedifferentieerde celtypen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) houdt een grote therapeutische belofte in, maar blijft uitdagend. PSCs vertonen vaak een inherent onvermogen om te differentiëren, zelfs wanneer ze worden gestimuleerd met een juiste reeks signalen. Hier beschreven is een eenvoudig hulpmiddel om de multi Lineage-differentiatie over verschillende PSC-lijnen te verbeteren.
Abstract
Ondanks het toenemende gebruik van pluripotente stamcellen (PSCs) blijven de uitdagingen bij het efficiënt differentiëren van embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen (Esc's en iPSCs) over verschillende kilometerstanden bestaan. Talrijke differentiatie protocollen zijn ontwikkeld, maar de variabiliteit over cellijnen en lage differentiatie percentages is een uitdaging voor het succesvol implementeren van deze protocollen. Hier beschreven is een eenvoudig en goedkoop middel om de differentiatie capaciteit van PSCs te vergroten. Eerder is aangetoond dat de behandeling van stamcellen met een lage concentratie van dimethylsulfoxide (DMSO) de neiging van een verscheidenheid aan PSCs aanzienlijk verhoogt om te differentiëren naar verschillende celtypen na gerichte differentiatie. Deze techniek is nu effectief gebleken voor verschillende soorten (bijv. muis, primaat en mens) in meerdere kilometerstanden, variërend van neuronen en corticale spheroïden tot gladde spiercellen en hepatocyten. De DMSO voor behandeling verbetert PSC differentiatie door het reguleren van de celcyclus en priming stamcellen om beter te reageren op differentiatie signalen. Hier is de gedetailleerde methodologie voor het gebruik van dit eenvoudige hulpmiddel als een reproduceerbare en breed toepasbaar middel om efficiënter te differentiëren PSCs naar elke Lineage van keuze.
Introduction
Het gebruik van pluripotente stamcellen heeft geleid tot tal van vooruitgang in biomedisch onderzoek, waaronder de velden van regeneratieve geneeskunde en stamcel therapieën, ziekte modellering en geneesmiddelen screening. Het heeft ook geleid tot het algemene vooruitzicht van meer vertaalbare onderzoek en gepersonaliseerde geneeskunde. De opkomst van de geïnduceerde pluripotente stamceltechnologie (iPSC) meer dan twintig jaar geleden heeft onderzoekers de mogelijkheid gelaten pluripotente stamcellen uit somatische weefsels te ontwikkelen en ze te differentiëren in functionele celtypen om een verscheidenheid aan pathologieën te bestuderen, waaronder cardiovasculaire, neurologische en immunologische ziekten. Hoewel er belangrijke stappen zijn gezet in technologie voor stamcel differentiatie, blijven de uitdagingen bij het effectief differentiëren van menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en iPSCs nog steeds bestaan, waardoor het wijdverbreide gebruik van stamceltechnologie in verschillende onderzoeksprogramma's. Inherente variabiliteit over verschillende cellijnen en klonen blijft obstakels vormen voor het differentiëren van stamcellijnen naar gewenste linages1. Bovendien blijft het afleiden van volwassen, terminaal gedifferentieerde functionele cellen van hPSCs een vervelend en inefficiënt proces over vele kilometerstanden. In feite, cellen gedifferentieerd van hPSCs vaak niet terminaal differentiëren in functionele cellen2. Bij het verder verplaatsen van stamcel therapieën om te gebruiken bij patiënten, is het noodzakelijk om de werkzaamheid van cellen die worden gegenereerd door hPSCs te verbeteren en te waarborgen.
Ons lab heeft een snelle, goedkope tool opgericht om de efficiëntie van het differentiëren van zowel iPSCs als ESCs aanzienlijk te verbeteren in volwassen celtypen. We constateerden dat voor behandeling van hiPSCs en hESCs met de veelgebruikte reagens Dimethylfumaraat sulfoxide (DMSO) voor 24 h tot 48 h voorafgaand aan gerichte differentiatie resulteert in een duidelijke verbetering van de capaciteit van stamcel differentiatie. Behandeling met DMSO verhoogt het aandeel van hipscs en hescs in de vroege G1-fase van de celcyclus en activeert het Retinoblastoom-eiwit (RB)3, een kritische regulator van celproliferatie, overleving en differentiatie4. In meer recent werk is geconstateerd dat rb en zijn familieleden verplicht zijn voor de Pro-differentiatie-effecten van DMSO, zodat tijdelijke inactivatie van rb de effecten van DMSO onderdrukt, terwijl de constitutieve activering van RB op een voorbijgaande manier DMSO van effecten5. Analoog aan de celcyclus tijdens de embryonale ontwikkeling, wordt de celcyclus van ESCs en ipscs gekenmerkt door een verkorte G1-fase die zelf vernieuwing6,7,8bevordert. Deze verkorte G1-fase zorgt voor meer onbeperkte proliferatie, maar beperkt het potentieel voor differentiatie4,9. Door het bevorderen van de arrestatie van de groei in G1 en activeren controlepunt controles in de celcyclus van hescs en ipscs, de DMSO behandeling priemgetallen cellen voor het lot van de cel verandert na gerichte differentiatie.
Tot op heden heeft DMSO voor behandeling aangetoond dat het de differentiatie capaciteit voor alle drie de kiem lagen verbetert in meer dan 30 controle-en ziektespecifieke humane ESC-en IPSC-cellijnen3,5 en de differentiatie van stamcellen en andere cellijnen naar een verscheidenheid van andere volwassen celtypen in volgende studies10,11,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 (tabel 1). Bovendien is de DMSO-behandeling effectief gebleken bij het verbeteren van de differentiatie van niet-humane primaire cellen21,23 (bijv. muis, primaat, konijn), wat duidt op gedeelde mechanismen voor verschillende soorten. Tot slot, DMSO voor behandeling is ook uitgebreid tot genediting technologie, met een bepaalde studie waaruit blijkt dat 24 h DMSO voor behandeling van hESCs/iPSCs aanzienlijk toegenomen het vermogen van geclusterde regelmatig Intergespreide korte palindroom herhalingen (CRISPR) /Crispr-geassocieerde proteïne-9 (Cas9)-gemedieerde bewerkings efficiëntie van niet-Codeer-DNA zonder onbedoelde mutaties29. Hier vindt u een gedetailleerde methodologie van de DMSO voor behandeling van hESCs en iPSCs voor toepassingen in stamcel biologie en gerichte differentiatie.
Protocol
1. onderhoud van de stamcel
Opmerking: Het hieronder beschreven Cell Maintenance Protocol is van toepassing op pluipotente stamcellen (PSCs) die in een aanhandige monolaag worden gehandhaafd. Media, andere reagentia en celcultuurplaten die vóór de DMSO-behandeling worden gebruikt, kunnen zo nodig worden aangepast. Voor alle volgende protocollen in dit manuscript moeten cellen worden behandeld onder een biologische veiligheidskast.
- Coat steriel, 6 goed, met weefselcultuur behandelde platen met een pluripotente stamcel-gekwalificeerde matrix of substraat volgens de instructies van de fabrikant en incuberen gedurende ten minste 1 uur in een CO2 -incubator (5% Co2, vochtige atmosfeer). Gecoate platen kunnen folie worden verpakt en gedurende maximaal een week bij 4 °C worden bewaard.
- De cryopreserved PSCs in een waterbad van 37 °C ontdooien. Steriliseer de flacon met ethanol voorafgaand aan de introductie tot de biologische veiligheidskast, breng de cellen dan onmiddellijk over met pipetteren naar een steriele conische buis met 5-10 volumes van voorverwarmde stamcel media.
- Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Aspireren de media en voorzichtig regenen de celpellet in 1 mL stamcel media aangevuld met een 10 μM ROTSREMMER, zoals Y-27632.
- Aspirate de cultuur matrix van de plaat en zaai de cellen op de gewenste dichtheid, typisch 0,5-1 x 106 cellen per goed in ten minste 2 ml stamcel media per put.
Opmerking: De plating dichtheid kan variëren over verschillende cellijnen, en klonen en dienovereenkomstig worden geoptimaliseerd. - Behoud de cellen door dagelijks te vervangen door voorverwarmde stamcel media. Splits de cellen op ongeveer 70%-80% confluentie of wanneer de celkolonies beginnen contact te maken.
- Voor het splitsen van cellen, aspireren de media en was de cellen één keer met steriele PBS. Inbroed de cellen met 1 mL van een dissociatie enzym oplossing per put gedurende 5-10 minuten bij 37 °C.
- Was en hervat de cellen met voorverwarmde stamcel media en breng deze over in een steriele conische buis met 5-10 volumes stamcel media. Volg de stappen 1.3-1.7 om de cellen te plaat.
2. DMSO voor behandeling
Opmerking: Wanneer de cellen voor DMSO voor behandeling vóór differentiatie worden geplateeerd, moet de celdichtheid van de start plating worden geoptimaliseerd met inachtneming van de typische groeisnelheid van de stamcel lijn en het differentiatie protocol dat wordt gebruikt. Valideer pluripotentie met behulp van conventionele markers, indien nodig. De cellen moeten ten minste 1x-2x na de eerste ontdooiing vóór de differentiatie worden door gevoerd.
-
2D cultuur differentiatie
- Wanneer de cellen een geschikte confluentie bereiken, de gecoate platen voorbereiden, de cellen ontkoppelen en een eencellige suspensie voorbereiden zoals hierboven beschreven.
- Tel de levende cellen met behulp van een hemocytometer of automatische celteller inclusief trypan Blue of een andere levensvatbaarheid marker.
- Plaat de cellen op een gecoate 6-put plaat met 0,5-1 x 106 cellen per put in stamcel media met de 10 ΜM-rotsremmer.
Opmerking: Voor de cellijnen die in ons laboratorium getest werden, resulteerden deze dichtheden doorgaans in 80%-90% confluente cellen binnen de 24 h DMSO voor behandeling. - Laat cellen 24 uur incueren bij 37 °C in een CO2 -incubator (5% Co2, vochtige atmosfeer).
- Bereid 1%-2% DMSO in voorverwarmde stamcel media (bijv. 100 μL DMSO in 10 mL van de media = 1% DMSO oplossing, of 200 μL DMSO in 10 mL van de Media = 2% DMSO oplossing).
- Na 24 h incubatie, aspireren de media uit cellen en vervang deze door DMSO oplossing.
- Laat de cellen gedurende 24 uur tot 48 uur incueren bij 37 °C in een CO2 -incubator (5% Co2, vochtige atmosfeer) voorafgaand aan differentiatie.
Opmerking: Typisch, een 24 h DMSO behandeling is voldoende over een meerderheid van de menselijke ESC en iPSC lijnen. Cellijnen met zeer langzame groeipercentages (lange Verdubbelings tijden) kunnen profiteren van de incubatie van 48 h met DMSO. Voor een incubatie van 48 h met DMSO kunnen media worden vervangen door verse stamcel media met 1%-2% DMSO na de eerste 24 uur van de behandeling.
-
3D-cultuur differentiatie:
- Wanneer de cellen een geschikte confluentie bereiken, dissociëren en verzamelen de cellen in een celsuspensie zoals hierboven beschreven.
- Tel de levende cellen met behulp van een hemocytometer of automatische celteller inclusief een levensvatbaarheid marker.
- Plaat de cellen in een ongecoat, laag-gehechtheid 6-goed plaat met 0,5-1 x 106 cellen per put in stamcel media met 10 ΜM-rotsremmer.
Opmerking: Voor de cellijnen die in ons laboratorium getest werden, resulteerden deze dichtheden doorgaans in 3D hPSC-bol-vorming binnen 24 uur van het instellen van cellen. - Laat cellen 24 uur incueren bij 37 °C in een CO2 -incubator (5% Co2, vochtige atmosfeer).
- Bereid 1%-2% DMSO in voorverwarmde stamcel media (bijv. 100 μL DMSO in 10 mL Media = 1% DMSO-oplossing, of 200 μL DMSO in 10 mL Media = 2% DMSO-oplossing).
- Vervang de media volgende standaardprocedures (bijvoorbeeld, kantel de plaat in een hoek van 30 °-45 ° om celbollen te laten vestigen op de bodem van de put; Breng cellen over naar een steriele conische buis en laat celbollen zich op de bodem van de buis vestigen; of Verzamel cellen die ik n suspensie met een pipet van 5 of 10 mL in een steriele conische buis en centrifuge cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT).
- Aspireren de media uit cellen en vervang deze door DMSO oplossing, pipetteren zachtjes.
- Laat cellen gedurende 24 uur tot 48 uur incueren bij 37 °C in een CO2 -incubator (5% Co2, vochtige atmosfeer) voorafgaand aan differentiatie.
Opmerking: Typisch, een 24 h DMSO behandeling is voldoende over een meerderheid van de menselijke ESC en iPSC lijnen. Cellijnen met zeer langzame groeipercentages (lange Verdubbelings tijden) kunnen profiteren van de incubatie van 48 h met DMSO. Voor een incubatie van 48 h met DMSO kunnen media worden vervangen door verse stamcel media met 1%-2% DMSO na de eerste 24 uur van de behandeling.
3. differentiatie aan primaire kiem lagen
Opmerking: Hieronder worden de methoden beschreven die eerder zijn getoond om effectief te zijn in ons laboratorium voor pscs gekweekt in een monolaag op 6 well Plates. Elk differentiatie Protocol van keuze moet worden gebruikt na de DMSO-behandeling om differentiatie in gewenste kilometerstanden te bevorderen. Verwijder DMSO-oplossing na een behandeling van 24-48 h en ga door met differentiatie volgens de standaardprotocollen.
-
Endoderm-differentiatie (aangepast van kroon et al.30)
- Behandel cellen vooraf met DMSO zoals hierboven beschreven voor 2D-culturen.
- Bereid Wnt3a en Activin een voorraadoplossing.
- Bereid dag 1 endodermale differentiatie media door Wnt3a toe te voegen aan een eindconcentratie van 20 ng/mL en Activin A tot een eindconcentratie van 100 ng/mL naar het juiste volume van voorverwarmde RPMI-media.
- Na DMSO voor behandeling, aspireren media uit de cellen en vervang deze door dag 1 media (bv., 2 mL per put van een 6 goed plaat).
- Laat cellen 24 uur incueren bij 37 °C in een CO2 -incubator (5% Co2, vochtige atmosfeer).
- Maak dagen 2 en 3 endodermale differentiatie media door Activin A toe te voegen aan een eindconcentratie van 100 ng/mL op het juiste volume van voorverwarmde RPMI-media.
- Aspireren media uit de cellen en vervang deze door dag 2 media (bijv., 2 mL per put van een 6 goed plaat).
- Laat de cellen 24 uur incueren bij 37 °C in een CO2 -incubator (5% Co2, vochtige atmosfeer).
- Aspireren media uit de cellen en vervangen door dag 3 media (bijv., 2 mL per put van een 6 goed plaat).
-
Mesoderm-differentiatie (aangepast van Zhang et al.31)
- Pretreat de cellen met DMSO zoals hierboven beschreven voor 2D-culturen.
- Bereid Wnt3a en Activin een voorraadoplossing.
- Bereid mesodermale differentiatie media voor door Wnt3a toe te voegen aan een eindconcentratie van 20 ng/mL en Activin A tot een eindconcentratie van 100 ng/mL naar het juiste volume van voorverwarmde geavanceerde RPMI-media.
- Na DMSO voor behandeling, aspireren media uit cellen en vervangen door differentiatie media (bijvoorbeeld, 2 mL per put van een 6 goed plaat).
- Laat cellen 24 uur incueren bij 37 °C in een CO2 -incubator (5% Co2, vochtige atmosfeer).
-
Ectoderm-differentiatie (aangepast van Chambers et al.32)
- Pretreat de cellen met DMSO zoals hierboven beschreven voor 2D-culturen.
- Bereid Noggin en SB431542 stockoplossingen voor.
- Bereid ectodermale differentiatie basismedia voor door het oplossen van de afdek serum vervanging (KOSR) tot een uiteindelijke concentratie van 10% in Knockout-DMEM.
Opmerking: Bereid voldoende basismedia voor 3-4 dagen aan media wisseling. - Bereid ectodermale differentiatie media voor door Noggin toe te voegen aan een eindconcentratie van 500 ng/mL en SB431542 tot een eindconcentratie van 10 μM op het juiste volume van voorverwarmde KOSR/Knockout-DMEM.
- Na DMSO voor behandeling, aspireren media uit cellen en vervangen door differentiatie media (bijvoorbeeld, 2 mL per put van een 6 goed plaat).
- Laat cellen gedurende 3-4 dagen incueren bij 37 °C in een CO2 -incubator (5% Co2, vochtige atmosfeer), waarbij media dagelijks worden vervangen door vers toegevoegde differentiatie factoren.
4. differentiatie naar soorten voorlopercellen
Hieronder worden de methoden beschreven die eerder effectief blijken te zijn in ons laboratorium voor PSCs die in een 2D-of 3D-cultuur zijn geteeld. Elk differentiatie Protocol van keuze moet worden gebruikt na de DMSO-behandeling om differentiatie in gewenste kilometerstanden te bevorderen. Verwijder DMSO-oplossing na een behandeling van 24-48 h en ga door met differentiatie volgens de standaardprotocollen.
- Celdifferentiatie van neurale voorloper cellen (aangepast van Tchieu et al.33)
- Bereid 6 goed platen door coating met een pluripotente stamcel-gekwalificeerde gereduceerde groeifactor matrix of substraat, volgens de instructies van de fabrikant, voor ten minste 1 h in een CO2 incubator (5% Co2, vochtige atmosfeer). Gecoate platen kunnen folie worden verpakt en bewaard bij 4 °C gedurende maximaal 1 week.
- Plaat PSCs zoals hierboven beschreven bij een dichtheid van 0,5-1 x 106 cellen per put in stamcel media die een rotsremmer bevatten.
- Behandel cellen vooraf met DMSO zoals hierboven beschreven voor 2D-culturen.
- Bereid kleine chemische remmers LDN193189, SB431542, en XAV939 stockoplossingen.
- Maak dagen 1-3 neuroectoderm differentiatie media door de aanvulling van essentiële 6 media met 500 nM LDN193189, 10 μM SB431542 en 2 μM XAV939.
- Na DMSO voor behandeling, aspireren de media en vervangen door dagen 1-3 neuroectoderm media (bv., 2 mL per put van een 6 goed plaat). Media dagelijks wijzigen.
- Maak dagen 4-12 neuroectoderm differentiatie media door aanvulling van essentiële 6 media met 500 nM LDN193189 en 10 μM SB431542.
- Op dag 4 van differentiatie, aspireren de media en vervangen door dagen 4-12 neurodectoderm media. Verander de media dagelijks.
- Na 12 dagen van differentiatie moeten gedifferentieerde cellen passende markers van neurale voorlopercellen (Npc's) uitdrukken. Npc's kunnen verder worden onderhouden in neurale media met DMEM/F-12,5% B-27, 1% N-2, en aangevuld met 10 μg/mL basis fibroblast-groeifactor (bFGF). Doorgang de Npc's wanneer Confluent Health met behulp van een cel loslating oplossing, plating NPCs 0,5-1 x 106 cellen per put.
- Oligodendrocyten voorlopercellen celdifferentiatie (aangepast van Douvaras en Fossati34)
- Plaat de PSCs zoals hierboven beschreven bij een dichtheid van 1 x 105 per goed op gecoate 6 well Plates in stamcel media die een rotsremmer bevatten.
- Behandel cellen vooraf met DMSO zoals hierboven beschreven voor 2D-culturen.
- Bereid SB431542, LDN193189, all-trans retinoïnezuur (RA) en gladgestreken agonist (SAG) stockoplossingen.
- Bereid dagen 0 – 8 differentiatie media door aan te vullen DMEM/F-12 met 10 μM SB431542, 250 nM LDN193189, en 100 nM RA.
- Na DMSO voor behandeling, cellen met differentiatie media gedurende 8 dagen inbroed, dagelijks media verwisselen met vers toegevoegde differentiatie factoren (bijv. 2 mL per put van een 6-put).
- Op dag 8, vervang media met DMEM/F-12 met 1x MEM niet-essentiële aminozuren (NEAA) oplossing, 1X L-glutamine, 2-mercaptoethanol, penicillaire/streptomycine, en 1x N-2 aangevuld 100 nM RA en 1 μM SAG. Verander de media dagelijks.
- Na 12 dagen van differentiatie moeten gedifferentieerde cellen passende markers van oligodendrocyten voorlopercellen (OPCs) uitdrukken.
- Celdifferentiatie van Hormoonprogenitor (aangepast van Pagliuca et al.35)
- Zaad PSCs bij 6 x 105 cellen/ml in stamcel Media Plus 10 μM rotsremmer in 500 ml spinner kolven geplaatst op een 9-positie roer plaat ingesteld bij rotatiesnelheid van 70 rpm in een incubator van 37 °c, 5% Co2en 100% vochtigheid.
- Toestaan dat clusters zich vestigen aan de onderkant van de kolf, aspireren de media, dan voorbehandelen met 1%-2% DMSO.
- Bereid Activin A, Chir99021, KGF, Sant1, all-trans retinoïnezuur (RA), LDN193189, PdBU, XXI, Alk51, T3, en Betacelluin stockoplossingen.
- Maak basismedia voor differentiatie op basis van de formulering in tabel 3.
- Na DMSO voor behandeling, aspireren media en vervangen door S1 media aangevuld met 100 ng/mL Activin A en 3 mM Chir99021 (bv., 500 mL per kolf). Laat incubatie gedurende 24 uur toe.
- Op dag 2 vervangt u media door S1-media aangevuld met 100 ng/mL Activin A. laat incubatie gedurende 2 dagen toe.
- Vervang op dag 4 media met S2-media aangevuld met 50 ng/mL KGF. Laat de incubatietijd gedurende 3 dagen na de eerste 2 dagen (dag 6) veranderen.
- Vervang op dag 7 media met S3-media aangevuld met 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1, 2 mM RA en 200 nM LDN193189. Laat incubatie gedurende 24 uur toe.
- Vervang op dag 8 media met S3-media aangevuld met 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1, 2 mM RA, 200 nM LDN193189 en 500 nM PdBU. Laat incubatie gedurende 24 uur toe.
- Op dag 9 vervangt u media door S3-media aangevuld met 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1 en 100 nM RA. Laat de incubatietijd gedurende 5 dagen toe, waarbij de media om de 2 dagen worden vervangen (dag 11 en 13).
- Vervang op de dagen 14 en 16 media door S5 media aangevuld met 0,25 mM Sant1, 100 nM RA, 1 mM XXI, 10 mM Alk5i II, 1 mM T3 en 20 ng/mL betacellulin (4 dagen totale incubatie).
- Vervang op de dagen 18 en 20 media door S5-media aangevuld met 25 nM RA, 1 mM XXI, 10 mM Alk5i II, 1 mM T3 en 20 ng/mL betacellulin.
5. immunocytochemische validering van differentiatie
Opmerking: De volgende methoden beschrijft een algemeen immunocytochemisch protocol dat indien nodig kan worden aangepast. Primaire antilichamen zijn degenen die eerder in ons laboratorium zijn gevalideerd. Andere technieken voor validatie van differentiatie kunnen ook worden gebruikt (bijvoorbeeld flow cytometrie, qPCR, RNA-sequencing, Western blotting, functionele assays, enz.).
-
Immunolabeling cellen
- Voor 3D-culturen in suspensie, plaat hele celclusters of clusters gedispergeerd in eencellige suspensie op gecoate platen voor 18-24 h voorafgaand aan fixatie.
- Aspirate media uit aanhangers en spoel kort met PBS bij RT op een shaker.
- Voor celfixatie, aspiraat PBS en incuberen cellen met 4% Paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 20 minuten bij RT op Shaker.
Let op: PFA voorraad moet worden bereid onder een rook afzuigkap als gevolg van de toxiciteit. Niet inademen en gepaste persoonlijke beschermingsmiddelen dragen. - Verwijder PFA en gooi deze weg in de juiste chemische afvalbak.
- Was cellen 3x met PBS gedurende ten minste 5 minuten per wasbeurt bij RT op een shaker.
- Voor celpermeisatie en blokkering, incuberen cellen met 5% Donkey serum bereid in 0,3% Triton-x 100/PBS voor 1 uur bij RT op een shaker.
- Bereid primaire antilichaam oplossing in dezelfde oplossing die wordt gebruikt voor permeabilisatie/blokkering.
- Inincuberen in primaire antilichaam oplossing 's nachts bij 4 °C op Shaker.
- Na een nachtelijke incubatie, wassen cellen 3x met PBS gedurende ten minste 5 minuten per wasbeurt bij RT op een shaker.
- Bereid secundaire antilichaam oplossing in permeabilization/blokkerende oplossing.
- Laat in een secundaire antilichaam oplossing voor 1 uur inbroed bij RT op een shaker.
- Aspirate secundaire antilichaam oplossing en spoel cellen 3x met PBS gedurende ten minste 5 minuten per wasbeurt bij RT op een shaker.
- Inbroed cellen met DAPI of een andere voorkeurs markering voor de juiste incubatietijd en spoel af in PBS.
-
Kwantificering van afbeeldingen
- Verkrijg minimaal drie beelden per toestand op een fluorescerende Microscoop en/of met een high content screening platform.
- Kwantificeer het percentage positieve cellen voor elke marker door het totale aantal cellen met antilichamen te tellen en de totale celaantallen (gebaseerd op DAPI/Hoechst-kernen-kleuring) met behulp van onbevooroordeelde beeldverwerkingssoftware (bijv. imagej) of een geautomatiseerd screening platform voor Analyses.
Representative Results
Morfologie van DMSO behandelde iPSCs
Menselijke ipscs die zijn afgeleid van controle onderwerpen werden gekweekt hetzij in een aanhandige 2D monolaag of in 3D-celsferen in suspensie. Ongeveer 24 h na initiële plating werden cellen behandeld met 1% of 2% DMSO voor 24 h in het onderhouds medium. Representatieve brightfield-afbeeldingen na DMSO-behandeling worden weergegeven in Figuur 1. In overeenstemming met eerdere rapporten voor ipscs onderhouden in een monolaag3, DMSO voor behandeling resulteerde in een voorbijgaande dosisafhankelijke daling van de groeisnelheid in vergelijking met niet-DMSO behandelde cellen (Figuur 1a). Deze verminderde proliferatie wordt geassocieerd met een toename van cel-naar-cel contact, dat is vooral uitgesproken in de 2% DMSO behandelde cellen weergeven van verhoogde vorming van meer sterk geclusterde celkolonies. In andere celtypen is gebleken dat DMSO-geïnduceerde G1-arrestatie gepaard gaat met een verhoogde expressie van eiwitten die betrokken zijn bij interacties van celcellen die de contact remming ondersteunen geïnduceerde groei arrestatie36. In iPSCs onderhouden als 3D celbollen, de DMSO behandeling verhoogd hetzelfde aantal celbollen (Figuur 1B). Bovendien resulteerde de DMSO-behandeling ook in minder variabele 3D-Sphere groottes, wat eerder indicatief is gebleken voor een verbeterde differentiatie capaciteit van de cellen37. Belangrijk, noch 1% of 2% DMSO resulteerde in celtoxiciteit, zoals gemeten door het aantal levensvatbaarheid (n = 3; 2D cultuur% levend = controle: 80 ± 1,3; 1% DMSO: 82 ± 3,7, 2%: 81 ± 2,7; 3D Culture% Live = controle: 81 ± 4,3; 1% DMSO: 82 ± 6,7, 2%: 82 ± 2,7). Over het algemeen zijn deze resultaten consistent met het idee dat DMSO-behandeling de celcyclus en groeipatronen in gekweekte stamcellen verandert. Deze effecten op remming van de groei zijn omkeerbaar wanneer de DMSO wordt verwijderd uit het medium, zoals eerder weergegeven3.
DMSO-behandeling verbetert de differentiatie van Esc's tot de primaire kiem lagen
HUES6 hESCs werden op gecoate platen gesekt gedurende 24 uur, gevolgd door een behandeling met 2% DMSO voor 24 uur in het onderhouds medium. De cellen werden vervolgens gedifferentieerd in de drie primaire kiem lagen na de behandel paradigma's getoond in Figuur 2A30,31,32. Gedifferentieerde cellen werden vervolgens vast en immunologisch gekleurd voor prototypische markers van elke respectievelijke kiem laag (SOX17 voor endoderm, brachyury voor mesoderm, en SOX1 voor Ectoderm). Zoals weergegeven in Figuur 2B, verhoogde 24 h van voor behandeling met 2% DMSO het percentage cellen dat elke respectievelijke kiem laag markeerder uitdrukt. Dit komt overeen met eerdere rapporten uit ons laboratorium met een verhoogde immunoreactiviteit, genexpressie, evenals een absoluut aantal gedifferentieerde cellen naar alle kiem lagen in stamcellen behandeld met DMSO3,5. HUES6 is een hESC-lijn met een zeer lage neiging tot differentiatie voor alle kilometerstanden1, maar de DMSO-behandeling verbetert aanzienlijk het vermogen om onderscheid te maken tussen alle kiem lagen.
DMSO-behandeling verbetert de differentiatie naar voorlopercellen-celtypen
Om het effect van DMSO op differentiatie naar CZS-voorlopercellen te onderzoeken, werden humane ipscs gedifferentieerd naar ofwel neurale voorlopercellen (npc's) of Oligodendrocyt voorlopercellen Cells (OPCs). Voor het genereren van Npc's, cellen werden voorbehandeld met 2% DMSO voor 24 h in het onderhouds medium gevolgd door 12 dagen van gerichte differentiatie33 (Figuur 3A). Zoals getoond in Figuur 3B, 2% DMSO voor behandeling verhoogde de uitdrukking van de NPC marker PAX6 in vergelijking met de controle. Met een ander eerder gevalideerd protocol34 (Figuur 3C) werden ipscs gedurende 12 dagen gedifferentieerd naar OPCs. Vergelijkbaar met Npc's, OPCs afgeleid van iPSCs voorbehandeld met 2% DMSO voor 24 h toonde een verhoging van de cellen van OPC markers OLIG2 (Figuur 3D).
Een initiële DMSO-behandeling blijft bestaan om differentiatie in volwassen celtypen te verbeteren
Om het effect van DMSO op de laatste stadia van een differentiatie protocol te onderzoeken, werden HUES8 hESCs voorbehandeld voor 24 h met 2% DMSO vóór differentiatie naar β-cellen na een 20-daags gericht differentiatie protocol zoals beschreven in Figuur 4a 35. HUES8 werden gebruikt omdat ze eerder hebben aangetoond dat ze een hogere neiging hebben naar endodermale Lineage1,38. Bij de definitieve endoderm fase, de gedifferentieerde cellen Express SOX17 en FOXA2, definitieve endoderm (DE) specifieke markers. Met verdere differentiatie in de alvleesklier voor ouders (PP1) fase, gedifferentieerde cellen Express PDX1 en FOXA2, markers karakteristiek voor alvleesklier voorlopercellen. In deze stadia van de differentiatie van de alvleesklier cellen waren de efficiëntieverbeteringen van inductie in DE en vervolgens in PP1 hoog voor zowel controle-als DMSO-behandelde hescs gedifferentieerd in elk van deze stadia (Figuur 4B, stadia 1 en 3). Hoewel de HUES8 cellijn is genoteerd om een verhoogde neiging om te differentiëren in de endodermale lineage, als differentiatie verder wordt geïnduceerd in de meer gespecialiseerde celtypen in de terminale stadia de DMSO-behandelde hESCs zijn veel meer de kans op het produceren van volwassen alvleesklier endocriene cellen. De efficiëntie van het genereren van PDX1/nkx 6.1 + alvleesklier voorlopercellen, neurogenin 3 + endocriene cellen, en nkx 6.1/C-peptide + SC-β cellen waren aanzienlijk hoger in de DMSO-behandelde hescs (Figuur 4B, stadia 4 en 5). Deze resultaten zijn in overeenstemming met de NPC-en OPC-differentiatie waaruit blijkt dat DMSO het differentiatie potentieel voor voorlopercellen verbetert en ook aantoont dat het effect van DMSO persistent is bij het genereren van meer gespecialiseerde celtypen. Dit is consistent met eerdere werkzaamheden, waar we hebben aangetoond dat de initiële 24 h DMSO behandeling verhoogt differentiatie in terminale celtypen over kiem lagen, met inbegrip van neuronale cellen en verslaan van cardiomyocyten31,39 in cellijnen met hoge of slechte voorwaarden voor differentiatie3.
Initiële DMSO-behandeling verbetert de hESC-afgeleide cel functie na in vivo transplantatie
Eerder hebben we de effectiviteit van DMSO-behandeling aangetoond bij het versterken van de differentiatie van hescs in functionele alvleesklier voorlopercellen die later een duidelijke verbetering vertonen in de insuline secretie in vivo3. Met behulp van eerder gepubliceerde protocollen3,30,40, HUES8 hescs werden behandeld met 1% DMSO voor 24 h, gedifferentieerd in alvleesklier progenitorcellen, en getransplanteerd in immunodeficiënte scid-beige muizen om te beoordelen (bijv. insuline secretie in reactie op een glucose-uitdaging of KCl-stimulatie) (Figuur 5a). Terwijl de efficiëntieverbeteringen van differentiatie in FOXA2 + (~ 90%) en PDX1 + (~ 75%) de voor ouders van pancreas waren vergelijkbaar tussen controle en DMSO-behandelde hESCs (Figuur 5B) voor de HUES8 hesc-lijn, de cellen onderscheiden zich van hescs na een 24 h 1% DMSO-behandeling had verbeterde responsiviteit op glucose en KCl stimulatie na in vivo transplantatie. Verbeteringen in functionaliteit waren duidelijk binnen 2 weken na de transplantatie (Figuur 5C) en bleven tot ten minste 16 weken na de transplantatie (Figuur 5D). Samen genomen suggereren deze resultaten dat DMSO-voor behandeling niet alleen de differentiatie-efficiëntie verhoogt naar kiem lagen, voorlopercellen en meer volwassen celtypen, maar ook dat het blijft bestaan om de functionaliteit van de gedifferentieerde cellen in vivo te verbeteren.
| Gedifferentieerd celtype | Eerste celtype | % DMSO | Lengte van de DMSO-behandeling | Lengte van de DMSO-behandeling |
| Hepatische cellen | Esc Hepatoma cellijn Esc Esc Mesenchymale stamcellen iPSCs Esc Esc Hepatoma cellijn Esc |
1,0 1,0 1,0 0,5 0.1-2.0 1,0 1,0 0,5 1,0 0,6 |
8 dagen Meerdere dagen 7 dagen 10-14 dagen 7-21 dagen 7 dagen 4 dagen 5 dagen 2-21 dagen Hele |
Basma et al., 2008 Kanebratt en Andersson, 2008 Hay et al., 2009 Duan et al., 2010 Alizadeh et al., 2014 Kondo et al., 2014 Szkolnicka et al., 2014 Czysz et al., 2015 Nikolaou et al., 2016 Vanhove et al., 2016 |
| Primaire kiem lagen | ESCs en iPSCs Van Van |
0.1-2.0 0,5 0.1-2.0 |
24 uur 24 uur 24 uur |
Chetty et al., 2013 Chetty et al., 2015 Li et al., 2018 |
| Cardiale cellen | ESCs en iPSCs P19 cellen ESCs en iPSCs Foetale mesenchymale stamcellen |
0.1-2.0 1,0 1.0-2.0 0,8-1,0 |
24 uur 4 dagen 24-30 uur 24 uur |
Chetty et al., 2013 Choi et al., 2014 van den Berg et al., 2016 Deng et al., 2017 |
| Pancreatic cellen | ESCs en iPSCs Van |
0.1-2.0 0,5 |
24 uur 24 uur |
Chetty et al., 2013 Chetty et al., 2015 |
| Gladde spiercellen | P19 cellen | 1,0 | 4 dagen | Choi et al., 2014 |
| Endotheel cellen | P19 cellen | 1,0 | 4 dagen | Choi et al., 2014 |
| Enterocyten | iPSCs | 0-1.6 | 4 dagen | Ogaki et al., 2015 |
| Darm epitheel | iPSCs | 0-1.6 | 4 dagen | Ogaki et al., 2015 |
| Neurale cellen | Marmoset iPSC | 0.05-2.0 | 24 uur | Qiu et al., 2015 |
| Neutrofielen | Leukemia cellijn | 1,25 | 6-8 dagen | Teimourian en Moghanloo, 2016 |
| Skelet Myotubes | iPSCs | 1,5 | 24 uur | Swartz et al., 2016 |
| Corticale organoïde | hiPSCs | 1,0 | 24 uur | Yoon et al., 2018 |
Tabel 1: samenvatting van eerder gepubliceerde werken die de gunstige effecten van DMSO-behandeling op differentiatie aantonen.
| S1 | S2 | S3 | S5 | |
| MCDB131 (L) | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Glucose (g) | 0,44 | 0,44 | 0,44 | 3,6 |
| Nahco3 p.a. (g) | 2,46 | 1,23 | 1,23 | 1,754 |
| FAF-BSA (g) | 20 | 20 | 20 | 20 |
| ITS-X (mL) | 0,02 | 0,02 | 5 | 5 |
| Glutamax (mL) | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Vitamine C (mg) | 44 | 44 | 44 | 44 |
| Heparin (mg) | 0 | 0 | 0 | 10 |
| P/S (mL) | 10 | 10 | 10 | 10 |
Tabel 2: componenten van basismedia voor de celdifferentiatie van hormoonprogenitor.
Figuur 1 : DMSO-behandeling verandert de groei van hPSCs. A) representatieve brightfield-afbeeldingen van hipscs in een monolaag na geen behandeling (controle) of behandeling met 1% of 2% DMSO gedurende 24 h. DMSO bevordert een voorbijgaande dosis-afhankelijke groeiremming van ipscs. B) representatieve brightfield-beelden van hipscs op platen met een geringe hechting om 3D-Sphere vorming mogelijk te maken na geen behandeling (controle) of behandeling met 1% of 2% DMSO gedurende 24 h. DMSO-behandeling resulteert in minder variabele 3D-Sphere vorming vergeleken met de controle. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : DMSO-behandeling verbetert de differentiatie van hPSCs naar primaire kiem lagen. A) Schematische differentiatie protocollen die worden gebruikt om de drie primaire kiem lagen te genereren. B) representatieve afbeeldingen van gedifferentieerde HUES6 hescs immunolabeled voor SOX17 (endoderm), brachyury (mesoderm) en SOX1 (Ectoderm). Voor behandeling met 2% DMSO voor 24 h verhoogde de differentiatie-efficiëntie over alle drie de kiem lagen. Percentages van cellen differentiëren in SOX17 + endodermale, Brachyury (Brachy) + mesodermale, of SOX1 + ectodermale cellen na gerichte differentiatie in elke kiem laag van controle en DMSO-behandelde hESCs worden genoteerd met SEM van drie biologische replicaten . Ongepaarde t-toets: endoderm p = 0,0003; mesoderm p = 0,047; Ectoderm p = 0,015. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : DMSO behandeling verbetert differentiatie naar neurale voorlopercellen celtypen. A) Schematische differentiatie protocol dat wordt gebruikt voor het genereren van neurale voorlopercellen (npc's). B) representatieve beelden van menselijke ipscs die zijn gedifferentieerd in npc's immunolabeled voor Pax6. 24 h van voor behandeling met 2% DMSO verhoogde het aantal PAX6 positieve cellen. Percentages van cellen die verschillen in Pax6 + Npc's na gerichte differentiatie van de controle en DMSO-behandelde menselijke iPSCs worden genoteerd met SEM van drie biologische replicaten. Ongepaarde t-toets: p = 0,0225. Schaalbalk = 200 μm. (C) Schematische differentiatie protocol dat wordt gebruikt om oligodendrocyten voorlopercellen (OPCs) te genereren. D) representatieve beelden van menselijke ipscs die zijn gedifferentieerd in OPCs-immunolabeled voor OPC-markers Olig2. 24 uur voor behandeling met 2% DMSO verhoogde de expressie van beide OPC-markers vergeleken met de controle. Percentages cellen differentiëren in Olig2 + OPCs na gerichte differentiatie van de controle en DMSO-behandelde menselijke iPSCs worden opgemerkt met SEM van vier biologische replicaten. Ongepaarde t-toets: p = 0,0466. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : DMSO-behandeling verbetert het terminaldifferentiatie potentieel van hPSCs. A) Schematische voorstelling van een ~ 20-daagse gerichte differentiatie van HUES8 hescs in terminaal gedifferentieerde pancreas endocriene cellen. B) immunokleuring voor de aangegeven markers in elke fase van differentiatie na gerichte differentiatie van onbehandelde controle cellen en cellen, voorbehandeld met 2% DMSO gedurende 24 uur. De initiële DMSO-behandeling blijft bestaan om de differentiatie in terminale endocriene celtypen te verhogen in de laatste stadia van gerichte differentiatie. Percentages van cellen die in elke fase van differentiatie in de aangegeven markers differentiëren na gerichte differentiatie van de controle en DMSO-behandelde hESCs worden genoteerd met SEM van twee tot vier biologische replicaten. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Initiële DMSO-behandeling van hPSCs verbetert de glucose responsiviteit na transplantatie van voorlopercellen in vivo. A) Schematische voorstelling van geleide differentiatie (~ 15 dagen) van HUES8 hescs in pancreas voorlopercellen (PP2) na geen behandeling (controle) of een 24 h 1% DMSO-behandeling en daaropvolgende transplantatie (5.000.000-cellen) in immunodeficiënte SCID-beige muizen. B) percentage cellen dat in PDX1 + en FOXA2 + alvleesklier voorlopercellen wordt onderscheiden na in vitro gerichte differentiatie van de controle en DMSO-behandelde hescs onmiddellijk vóór de transplantatie (n = 1). C) gemiddelde Elisa-metingen van humane insuline uit het serum van muizen na een lage (2,5 mm) of hoge (15 mm) glucose-uitdaging of kaliumchloride (KCl) stimulatie bij (C) 2 weken en (D) 16 weken na transplantatie van alvleesklier voorlopercellen onderscheiden zich van controle en DMSO-behandelde hESCs (foutbalken = SEM; n = 3 bij 2 weken en 16 weken voor controle; n = 2 bij 2 weken en 16 weken voor DMSO). Tweeweg ANOVA: p = 0,0051 voor controle versus DMSO na 2 weken; p = 0,0116 voor controle versus DMSO na 16 weken. De muizen die op de verschillende tijdstippen zijn bestudeerd, zijn verschillend. De resultaten zijn aangepast van Chetty et al.3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Samengevat, dit protocol beschrijft een eenvoudig en goedkoop instrument om de differentiatie capaciteit van pluripotente stamcellen (PSCs) te vergroten tot alle primaire kiem lagen, verschillende soorten gespecialiseerde voorlopercellen, en zelfs functionele, volwassen celtypen in in vitro en in vivo-instellingen. Geïllustreerd zijn specifieke differentiatie protocollen die effectief zijn gereproduceerd in ons laboratorium en andere, maar elk differentiatie Protocol van keuze kan worden gebruikt na de DMSO-behandeling. Zoals weergegeven in tabel 1, heeft een aantal laboratoria ook een verhoging van de PSC-differentiatie aangetoond na een voorbijgaande DMSO-behandeling met behulp van verschillende paradigma's om verschillende andere terminale celtypen te genereren. Bovendien, hoewel de methoden hier beschrijven het gebruik van menselijke pscs, de DMSO voor behandeling kan worden gebruikt voor verschillende soorten en is aangetoond dat effectief in muis, konijn, en primaat pscs.
Hoewel hogere doseringen van DMSO bekend zijn als cytotoxisch, zijn de lage doses die bij deze methode worden gebruikt (1%-2%) voor een voorbijgaande periode resulteren in minimale celdood. Terwijl de totale celaantallen onmiddellijk na DMSO behandeling kan afnemen als gevolg van DMSO bevordering van celcyclus arrestatie in de G1 fase van de celcyclus, eerdere studies tonen aan dat cellen in staat zijn om hetzelfde niveau van confluentie als controleculturen te bereiken na verwijdering van DMSO3.
Het percentage en de duur van de DMSO-voor behandeling moeten per cellijn worden geoptimaliseerd. De behandelingstijd moet worden aangepast met inachtneming van de fiets-/Verdubbelings tijd van de cellen. Muis-PSCs hebben bijvoorbeeld meestal veel kortere fiets tijden van ongeveer 15 uur; Dus, DMSO behandeling voor 15 h voor deze cellen is voldoende. Sommige laboratoria hebben ook geconstateerd dat de DMSO-behandeling heilzaam is wanneer deze wordt voortgezet tijdens het differentiatie protocol of bij lagere concentraties (Zie tabel 1). Er moet worden opgemerkt dat sommige PSC-lijnen meer op differentiatie van specifieke kilometerstanden kunnen worden gericht. Zo is aangetoond dat HUES6 cellen minder toelaatbaar zijn voor differentiatie en dus een duidelijke verbetering met DMSO-behandeling hadden (Figuur 2). Als alternatief is aangetoond dat HUES8 cellen in Figuur 4 en Figuur 5 een hogere neiging hebben naar endodermale differentiatie; Er werden dus minder verschillen getoond tussen controle en DMSO voor differentiatie in de beginfase naar definitieve endoderm. Niettemin, de verbetering van DMSO voor behandeling wordt waargenomen in latere stadia van differentiatie in deze cellijn (Figuur 4B). De DMSO-behandeling is ook veelzijdig omdat het effectief is in zowel 2D-als 3D-celculturen, het kan worden gebruikt met verschillende soorten coatingmateriaal op celcultuurplaten, en het werkt in verschillende soorten onderhouds medium die groei en uitbreiding van hPSCs (bijv. mTeSR, E8, MEF-geconditioneerde media, enz.).
Meer in het algemeen suggereren deze resultaten dat de start toestand van pluripotente stamcellen een sterke invloed heeft op de neiging voor initiële differentiatie en terminale differentiatie in functionele celtypen. We hebben eerder aangetoond dat de DMSO-behandeling functioneert via rb in hpscs-3,5. RB speelt een belangrijke rol bij het bevorderen van terminaldifferentiatie, celoverleving en de genetische stabiliteit van cellen41,42,43,44, en het kan daarom de aanhoudende effecten op cellen verklaren worden onderscheiden van DMSO-behandelde hPSCs. Het targeten van deze vroege vormen van regulering kan hPSCs op een beter traject voor differentiatie plaatsen en uiteindelijk hun nut voor regeneratieve geneeskunde verbeteren.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door beurzen van de Stanford University School of Medicine en een Siebel Fellowship uitgereikt aan S. C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353046 | |
| 9-Position stir plate | Chemglass | CLS-4100 | |
| Accutase | Gibco | 11105-01 | |
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| Advanced RPMI | Gibco | 12633012 | |
| Alk5i II | Axxora | ALX-270-445 | |
| All-trans retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| anti-Brachyury | R&D Systems | AF2085 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-C-peptide | Developmental Studies Hybridoma Bank | GN-ID4 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-FoxA2 | Millipore | 07-633 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-Nkx2.2 | University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-Nkx6.1 | University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank; | F55A12-supernatant | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-Olig2 | EMD Millipore | MABN50 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-Pax-6 | Biolegend | 901301 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-Pdx1 | R&D Systems | AF2419 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-SOX1 | R&D Systems | AF3369 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-SOX17 | R&D Systems | AF1924 | No variablity observed across different lot numbers |
| B-27 Supplement, minus Vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Basic fibroblast growth factor | Gibco | PHG0264 | |
| Betacellulin | Thermo Fisher Scientific | 50932345 | |
| Chir99021 | Stemgent | 04-000-10 | |
| CMRL 1066 | Corning | 99-603-CV | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAF1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Disposable Spinner Flasks | Corning, VWR | 89089-814 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Essential 6 Media | Gibco | A1516501 | |
| FAF-BSA | Proliant | 68700 | |
| FGF7 | PeproTech | 100-19 | |
| Geltrex | Gibco | A1413202 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Human Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO Diagnostics | 80-INSHUU-E01.1 | |
| ITS-X | Invitrogen | 51500056 | |
| KGF | Peprotech | AF-100-19 | |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| L-3,3′,5-Triiodothyronine (T3) | EMD Millipore | 642245 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 354277 | |
| MCDB-131 | Cellgro | 15-100-CV | |
| MEM NEAA | Gibco | 11140050 | |
| mTeSR 1 | StemCell Technologies | 5850 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| NaHCO3 | Sigma | S3817 | |
| Noggin Fc Chimera Protein | R&D Systems | 3344-NG-050 | |
| PdBU | EMD Millipore | 524390 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| Sant1 | Sigma-Aldrich | S4572 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Smoothened Agonist, SAG | EMD Millipore | 566660 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning | 3471 | |
| Vitamin C | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Wnt3a | R&D Systems | 5036-WN | |
| XAV 939 | Tocris | 3748 | |
| XXI | EMD Millipore | 565790 | |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72302 |
References
- Osafune, K., et al. Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines. Nature Biotechnology. 26 (3), 313-315 (2008).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Review Genetics. 15 (2), 82-92 (2014).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Conklin, J. F., Sage, J. Keeping an eye on retinoblastoma control of human embryonic stem cells. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (5), 1023-1030 (2009).
- Li, J., et al. A transient DMSO treatment increases the differentiation potential of human pluripotent stem cells through the Rb family. PLoS One. 13 (12), 0208110 (2018).
- Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246 (4930), 629-634 (1989).
- Pardee, A. B. G1 events and regulation of cell proliferation. Science. 246 (4930), 603-608 (1989).
- Orford, K. W., Scadden, D. T. Deconstructing stem cell self-renewal: genetic insights into cell-cycle regulation. Nature Review Genetics. 9 (2), 115-128 (2008).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
- Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
- Duan, Y., et al. Differentiation and characterization of metabolically functioning hepatocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (4), 674-686 (2010).
- Szkolnicka, D., Farnworth, S. L., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Deriving functional hepatocytes from pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 30, 1-12 (2014).
- Vanhove, J., et al. H3K27me3 Does Not Orchestrate the Expression of Lineage-Specific Markers in hESC-Derived Hepatocytes In Vitro. Stem Cell Reports. 7 (2), 192-206 (2016).
- Kanebratt, K. P., Andersson, T. B. Evaluation of HepaRG cells as an in vitro model for human drug metabolism studies. Drug Metabolism & Disposition. 36 (7), 1444-1452 (2008).
- Nikolaou, N., Green, C. J., Gunn, P. J., Hodson, L., Tomlinson, J. W. Optimizing human hepatocyte models for metabolic phenotype and function: effects of treatment with dimethyl sulfoxide (DMSO). Physiological Reports. 4 (21), (2016).
- Kondo, Y., et al. An efficient method for differentiation of human induced pluripotent stem cells into hepatocyte-like cells retaining drug metabolizing activity. Drug Metabolism Pharmacokinetics. 29 (3), 237-243 (2014).
- Alizadeh, E., et al. The effect of dimethyl sulfoxide on hepatic differentiation of mesenchymal stem cells. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 44 (1), 157-164 (2016).
- Czysz, K., Minger, S., Thomas, N. DMSO efficiently down regulates pluripotency genes in human embryonic stem cells during definitive endoderm derivation and increases the proficiency of hepatic differentiation. PLoS One. 10 (2), 0117689 (2015).
- Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 5, 17297 (2015).
- Choi, S. C., et al. Mixl1 and Flk1 Are Key Players of Wnt/TGF-beta Signaling During DMSO-Induced Mesodermal Specification in P19 cells. Journal of Cellular Physiology. 230 (8), 1807-1821 (2015).
- Chetty, S., et al. A Src inhibitor regulates the cell cycle of human pluripotent stem cells and improves directed differentiation. Journal of Cell Biology. 210 (7), 1257-1268 (2015).
- Qiu, Z., et al. Marmoset induced pluripotent stem cells: Robust neural differentiation following pretreatment with dimethyl sulfoxide. Stem Cell Research. 15 (1), 141-150 (2015).
- Swartz, E. W., et al. A Novel Protocol for Directed Differentiation of C9orf72-Associated Human Induced Pluripotent Stem Cells Into Contractile Skeletal Myotubes. Stem Cells Translational Medicine. 5 (11), 1461-1472 (2016).
- Teimourian, S., Moghanloo, E. Thwarting PTEN Expression by siRNA Augments HL-60 Cell Differentiation to Neutrophil-Like Cells by DMSO and ATRA. DNA Cell Biology. 35 (10), 591-598 (2016).
- van den Berg, C. W., Elliott, D. A., Braam, S. R., Mummery, C. L., Davis, R. P. Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes Under Defined Conditions. Methods in Molecular Biology. 1353, 163-180 (2016).
- Deng, F., et al. Combination of retinoic acid, dimethyl sulfoxide and 5-azacytidine promotes cardiac differentiation of human fetal liver-derived mesenchymal stem cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 147-159 (2016).
- Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2018).
- Stratigopoulos, G., De Rosa, M. C., LeDuc, C. A., Leibel, R. L., Doege, C. A. DMSO increases efficiency of genome editing at two non-coding loci. PLoS One. 13 (6), 0198637 (2018).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nature Biotechnology. 26 (4), 443-452 (2008).
- Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
- Douvaras, P., Fossati, V. Generation and isolation of oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (8), 1143-1154 (2015).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Fiore, M., Degrassi, F. Dimethyl sulfoxide restores contact inhibition-induced growth arrest and inhibits cell density-dependent apoptosis in hamster cells. Experimental Cell Research. 251 (1), 102-110 (1999).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
- Bock, C., et al. Reference Maps of human ES and iPS cell variation enable high-throughput characterization of pluripotent cell lines. Cell. 144 (3), 439-452 (2011).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Jacks, T., et al. Effects of an Rb mutation in the mouse. Nature. 359 (6393), 295-300 (1992).
- Nguyen, D. X., Baglia, L. A., Huang, S. M., Baker, C. M., McCance, D. J. Acetylation regulates the differentiation-specific functions of the retinoblastoma protein. The EMBO Journal. 23 (7), 1609-1618 (2004).
- Slack, R. S., et al. Cells differentiating into neuroectoderm undergo apoptosis in the absence of functional retinoblastoma family proteins. Journal of Cell Biology. 129 (3), 779-788 (1995).
- Gu, W., et al. Interaction of myogenic factors and the retinoblastoma protein mediates muscle cell commitment and differentiation. Cell. 72 (3), 309-324 (1993).
