Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Insan pluripotent kök hücrelerinin DMSO ile geçici tedavisi farklılaşma teşvik etmek

Published: July 17, 2019 doi: 10.3791/59833
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine, 2Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine

Summary

İnsan pluripotent kök hücrelerinden farklılaştırılmış hücre türleri üreten (hPSCs) büyük terapötik söz tutar ama zorlu kalır. PSC 'ler genellikle uygun bir sinyal seti ile uyarıldığında bile ayrım yapmak için doğal bir yetersizlik sergiler. Burada açıklanan PSC hatları çeşitli arasında multilineage farklılaşma geliştirmek için basit bir araçtır.

Abstract

Pluripotent kök hücrelerinin (PSC 'Ler) büyüyen kullanımına rağmen, çeşitli çağlarda embriyonik ve indüklenen pluripotent kök hücrelerini (ESCs ve ıpscs) verimli bir şekilde ayırt etme zorlukları kalır. Çok sayıda farklılaşma protokolleri geliştirilmiştir, ancak hücre hatları arasında değişkenlik ve farklılaşma düşük oranlar başarıyla bu protokoller uygulanması zorluklar. Burada açıklanan, PSC 'lerin farklılaşma kapasitesini arttırmak için kolay ve ucuz bir araç. Daha önce, düşük konsantrasyonlu dimetil sulfoxid (DMSO) ile kök hücrelerin tedavisinde, farklı hücre türlerine yönlendirilmiş farklılaşma sonrasında ayırt etmek için çeşitli PSC 'lerin eğilimi önemli ölçüde artar gösterildi. Bu teknik artık farklı türler (örn., fare, primat ve insan) arasında, nöronların ve kortikal kürlerden düzgün kas hücrelerinin ve hepatositlere kadar değişen birden fazla sırlara kadar etkili olduğu gösterilmiştir. DMSO ön tedavisi, hücre döngüsünü düzenleyerek ve kök hücreleri ayrıştırılması sinyallerine daha duyarlı olması için astar oluşturarak PSC farklılaşmayı geliştirir. Burada sağlanan bu basit aracı yeniden üretilebilen ve yaygın olarak uygulanabilir bir yöntem olarak kullanmak için, PSC 'lerin herhangi bir seçim sırasının daha verimli bir şekilde ayırt edilmesi için ayrıntılı bir yöntemdir.

Introduction

Pluripotent kök hücrelerinin kullanımı, rejeneratif tıp ve kök hücreli tedaviler, hastalık modelleme ve ilaç taraması alanları da dahil olmak üzere Biyomedikal araştırmalarda çok sayıda gelişmelere yol açmıştır. Ayrıca daha çevrilebilir araştırma ve Kişiselleştirilmiş tıp genel umudu yol açmıştır. 20 yıl önce indüklenen pluripotent kök hücre (IPSC) teknolojisinin gelişini araştırmacılar somatik dokulardan pluripotent kök hücreleri geliştirmek ve çeşitli patolojiler çalışması için işlevsel hücre türlerine ayırt izin verdi, dahil Kardiyovasküler, nörolojik ve immünolojik hastalıklar. Kök hücre farklılaşma teknolojisinde önemli adımlar atılmasına karşın, insan embriyonik kök hücrelerini (hESCs) ve ıpscs 'nin etkili bir şekilde farklılaşması zorlukları hala devam ediyor, kök hücre teknolojisinin farklı araştırma programları. Farklı hücre hatları ve klonlar arasındaki içsel değişkenlik, kök hücre çizgilerini istenilen astarlara ayırmak için engel teşkil eder1. Ayrıca, Olgun, terminonal farklılaştırılmış fonksiyonel hücreler hPSCs türetme birçok satır boyunca sıkıcı ve verimsiz bir süreç kalır. Aslında, hPSCs farklılaştırılmış hücreler genellikle işlevsel hücrelere2farklılaştırmak için başarısız. Daha fazla hareket eden kök hücre tabanlı tedaviler hastalarda kullanmak için, geliştirmek ve hPSCs oluşturulan hücrelerin etkinliğini sağlamak için bir ihtiyaç vardır.

Laboratuvarımız, hem ıpscs hem de ESCs 'i olgun hücre türlerine ayırt etme verimliliğini önemli ölçüde artırmak için hızlı ve ucuz bir araç kurdu. HiPSCs ve hESCs 'nin yaygın olarak kullanılan reaktif dimetil sülfoxid (DMSO) ile ön tedavisinde, yönlendirilmiş farklılaşma işleminden önce 24 saat 48 h 'ye kadar kök hücre farklılaşma kapasitesinde belirgin bir iyileşme elde edildiğini tespit ettik. DMSO ile tedavi hücre döngüsünün erken G1 aşamasında hiPSCs ve hESCs oranını arttırır ve Retina proteini (RB)3, hücre proliferasyonu kritik bir regülatörü, hayatta kalma ve farklılaşma4' ü etkinleştirir. Daha yeni çalışma, bu RB ve aile üyelerinin DMSO Pro-farklılaşma etkileri için gerekli olduğu bulunmuştur, RB geçici inaktivasyonu DMSO etkilerini bastırır, geçici bir şekilde RB kurucu aktivasyonu artırır iken DMSO 'nun etkileri5. Embriyonik gelişim sırasında hücre döngüsüne benzerdir, ESCS ve ipscs hücre döngüsü, kendi kendine yenilenmeyi teşvik eden kısaltılmış G1 faz ile karakterize edilir6,7,8. Bu kısaltılmış G1 aşaması daha sınırsız proliferasyon sağlar ancak farklılaşma potansiyelini sınırlar4,9. G1 'de büyüme tutuklanmasını teşvik ederek ve hESCs ve ıpscs hücre döngüsünde kontrol noktası kontrollerini etkinleştirerek, DMSO tedavisi, yönlendirilmiş farklılaşma sonrasında hücre kaderi değişiklikleri için hücreleri değiştirir.

Bugüne kadar, DMSO ön 30 ' dan fazla kontrol ve hastalığa özgü insan ESC ve IPSC hücre hatları3,5 yanı sıra kök hücreleri ve diğer farklılaşma tüm üç germ katmanları için farklılaşma kapasitesini artırmak için gösterildi Sonraki çalışmalarda diğer olgun hücre türlerine çeşitli hücre hatları10,11,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 tane , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 (Tablo 1). Ayrıca, DMSO tedavisi, insan dışı primer hücrelerin21,23 (örn., fare, primat, tavşan) farklılaşmasını arttırmada etkili olduğu gösterilmiştir, türler arasında paylaşılan mekanizmalar öneriyor. Son olarak, DMSO ön aynı zamanda gen düzenleme teknolojisine uzatıldı, belirli bir çalışma, hescs/ıpscs 24 h DMSO ön önemli ölçüde kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromic tekrarlar yeteneğini artırdı (crıpr) /CRISPR-associated protein-9 (Cas9)-istenmeyen mutasyonlar dahil olmadan kodlama olmayan DNA 'nın aracılı düzenleme verimliliği29. Burada sağlanan kök hücre biyolojisinde uygulamalar için hESCs ve ıpscs DMSO ön tedavisi ayrıntılı bir metodoloji ve yönlendirilmiş farklılaşma.

Protocol

1. kök hücre Bakımı

Not: Aşağıda açıklanan hücre bakım protokolü, yapışan bir monolayer içinde tutulan pluipotent kök hücreleri (PSC 'ler) için geçerlidir. DMSO tedavisinden önce kullanılan medya, diğer reaktifler ve hücre kültürü plakaları gerektiğinde ayarlanabilir. Bu yazıda tüm aşağıdaki protokoller için, hücreler biyolojik güvenlik dolabı altında işlenmelidir.

  1. Kat steril, 6 iyi, doku kültürü-bir pluripotent kök hücre nitelikli matris veya substrat üretici talimatlarına göre hazırlanan ve en az 1 h için inkük bir CO2 kuluçkucu (5% Co2, nemli atmosfer) ile işlenmiş plakalar. Kaplı plakalar film sarılmış ve bir hafta kadar 4 °C saklanır olabilir.
  2. 37 °C ' lik su küvetinde ağakopa ayrılmış PSC 'leri çözün. Biyolojik emniyet kabinine giriş öncesinde etanol ile sterilize şişe, sonra hemen prewarmed kök hücre medya 5-10 hacimleri içeren steril konik tüp pipetleme ile hücreleri transfer.
  3. 300 x g 'de hücreleri Oda SıCAKLıĞıNDA (RT) 5 dakika santrifüjler.
  4. Medyayı aspirate ve 10 μM kaya inhibitörü ile tamamlayıcı olarak 1 ml 'lik kök hücre medyasında hücre pelsini hafifçe pelletini, Y-27632 gibi.
  5. Tabandan kültür matrisini aspirate ve hücreleri istenilen yoğunlukta tohum, genellikle 0.5-1 x 106 hücre iyi başına en az 2 ml kök hücre medyasında da.
    Not: Kaplama yoğunluğu farklı hücre hatları ve klonlar arasında değişebilir ve buna göre optimize edilmelidir.
  6. Her gün prewarmed kök hücre medyasını değiştirerek hücreleri koruyun. Hücreleri kabaca% 70-80% konflukans veya hücre kolonileri temas yapmaya başlar Böl.
  7. Hücreleri bölmek için, medyayı Aspire ve steril PBS ile bir kez hücreleri yıkayın. 37 °c ' de 5-10 dakika için iyi başına 1 ml ayrışma enzim çözeltisi ile hücreleri kuluçla.
  8. Prewarmed kök hücre medya ile hücreleri yıkayın ve yeniden pelletini ve 5-10 hacim kök hücreli medya ile steril konik tüp transfer. Hücreleri plaka için 1.3-1.7 adımları izleyin.

2. DMSO Pretreatment

Not: Farklılaşma öncesinde DMSO ön için hücreler kaplama, başlangıç kaplama hücresi yoğunluğu kök hücre hattının tipik büyüme oranı yanı sıra kullanılan farklılaşma protokolü dikkate ile optimize edilmelidir. Gerektiğinde geleneksel işaretçileri kullanarak pluripotency doğrulayın. Ayrım yapmadan önce ilk çözülme işleminden sonra hücreler en az 1x-2x olarak geçmelidir.

  1. 2D kültür farklılaşma
    1. Hücreler uygun bir konflukans ulaştığında, kaplı plakaları hazırlayın, hücreleri ayırmak ve yukarıda açıklandığı gibi tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın.
    2. Tripan mavi veya başka bir canlılığı Marker dahil olmak üzere bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri saymak.
    3. Hücreleri 10 μM kaya inhibitörü ile kök hücre medyasında iyi başına 0,5-1 x 106 hücreli bir kaplanmış 6 kuyu plakasına yerleştirin.
      Not: Laboratuvarımızda test edilen hücre hatları için, bu yoğunluklar genellikle 24 h DMSO ön tedavisi içinde% 80-90% confluent hücresi ile sonuçlandı.
    4. Bir CO2 kuluçk (5% Co2, nemli atmosfer) içinde 37 °c ' de 24 h için inküyasyon hücrelerin izin verin.
    5. Prewarmed kök hücre medyasında% 1-2% DMSO hazırlayın (örn. 100 μL DMSO 'da 10 mL medya = 1% DMSO çözümü veya 200 μL DMSO 'da 10 mL medya = 2% DMSO çözümü).
    6. 24 saat kuluçk sonra, hücrelerden medya Aspire ve DMSO çözümü ile değiştirin.
    7. Bir CO2 kuluçk (5% Co2, nemli atmosfer) içinde 37 °c ' de 24 saat 48 h için inkübasyon hücrelerin farklılaşma öncesinde izin verin.
      Not: Genellikle, 24 saat DMSO tedavisi insan ESC ve IPSC hatları çoğunluğu boyunca yeterlidir. Çok yavaş büyüme oranlarına sahip hücre hatları (uzun ikiye katlama süreleri) DMSO ile 48 h inkübasyon yararlanabilir. DMSO ile 48 h inkübasyon için, medya ilk 24 h tedavisinden sonra% 1-2% DMSO ile taze kök hücre medyası ile değiştirilebilir.
  2. 3D kültür farklılaşma:
    1. Hücreleri uygun bir konfluency ulaştığında, DISSOCIATE ve yukarıda açıklandığı gibi bir hücre süspansiyon hücreleri toplamak.
    2. Bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri saymak bir canlılığı Marker dahil.
    3. 10 μM kaya inhibitörü ile kök hücre medyasında iyi başına 0.5-1 x 106 hücrelerde kaplanmamış, düşük ataşman 6 kuyu plakasının hücrelerini plaka.
      Not: Laboratuvarımızda test edilen hücre hatları için, bu yoğunluklar genellikle hücrelerin ayarlanması 24 h içinde 3D hPSC küre oluşumu sonuçlandı.
    4. Bir CO2 kuluçk (5% Co2, nemli atmosfer) içinde 37 °c ' de 24 h için inküyasyon hücrelerin izin verin.
    5. Prewarmed kök hücre medyasında% 1-2% DMSO hazırlayın (örn. 100 μL, 10 mL medya = 1% DMSO çözümü veya 200 μL DMSO 'da 10 mL medya =% 2 DMSO çözeltisi içinde).
    6. Standart prosedürler aşağıdaki ortam değiştirin (örneğin, 30 °-45 ° açı plaka eğim hücre küreler iyi altında yerleşmek için izin vermek için; hücreleri steril bir konik tüpe aktarın ve hücre kürlerinin tüpün alt kısmına yerleşmesine izin verin; veya hafifçe hücreleri toplamak i n süspansiyonu, 5 veya 10 mL 'Lik pipet kullanılarak steril konik tüpte ve 300 x g 'de Santrifüjlü hücrelerde 5 dk. RT).
    7. Medyayı hücrelerden aspirate ve DMSO solüsyonu ile değiştirin, yavaşça pipetleme yapın.
    8. Bir CO2 kuluçk (5% Co2, nemli atmosfer) içinde 37 °c ' de 24 saat 48 h için inkübasyon hücrelerin farklılaşma öncesinde izin verin.
      Not: Genellikle, 24 saat DMSO tedavisi insan ESC ve IPSC hatları çoğunluğu boyunca yeterlidir. Çok yavaş büyüme oranlarına sahip hücre hatları (uzun ikiye katlama süreleri) DMSO ile 48 h inkübasyon yararlanabilir. DMSO ile 48 h inkübasyon için, medya ilk 24 h tedavisinden sonra% 1-2% DMSO ile taze kök hücre medyası ile değiştirilebilir.

3. Primer germ katmanlarına farklılaşma

Not: Aşağıdaki yöntemler, daha önce 6 kuyu plakalı bir tek tabakalı içinde yetiştirilen PSC 'ler için laboratuvarımızda etkili olması için gösterilen yöntemleri açıklar. Tercih edilen herhangi bir farklılaşma protokolü, DMSO tedavisinden sonra istenilen çağların farklılaşımını teşvik etmek için kullanılmalıdır. 24-48 h tedavisinden sonra DMSO çözümünü kaldırın ve standart protokollerin ardından farklılaşma ile devam edin.

  1. Endoderm farklılaşma (Kroon ve ark.30' dan uyarlanmıştır)
    1. 2B kültürler için yukarıda açıklandığı gibi, hücreleri DMSO ile ön tedavi edin.
    2. Hazırlama Wnt3a ve Activin bir stok çözümleri.
    3. Hazırlamak gün 1 son konsantrasyon Wnt3a ekleyerek endodermal farklılaşma medya 20 ng/mL ve Activin A son konsantrasyon 100 ng/mL prewarmed RPMı medya uygun hacmine.
    4. Dmso pretreatment sonra, hücrelerden medya Aspire ve gün 1 medya ile değiştirin (örneğin, bir 6 kuyu plakası başına 2 ml).
    5. Bir CO2 kuluçk (5% Co2, nemli atmosfer) içinde 37 °c ' de 24 h için inküyasyon hücrelerin izin verin.
    6. Hazırlamak gün 2 ve 3 prewarmed RPMı medya uygun hacmine 100 ng/mL son konsantrasyona Activin A ekleyerek endodermal farklılaşma medya.
    7. Hücrelerden medya aspirate ve gün 2 medya ile değiştirin (örneğin, bir 6 kuyu plakası başına 2 mL).
    8. Bir CO2 kuluçk (5% Co2, nemli atmosfer) içinde 37 °c ' de 24 h için inküyasyon hücrelerin izin verin.
    9. Hücrelerden medya aspirate ve gün 3 medya ile değiştirin (örneğin, 2 mL iyi bir 6 kuyu plakası başına).
  2. Mesoderm farklılaşma (Zhang ve al.31' den uyarlanmıştır)
    1. 2B kültürler için yukarıda açıklandığı gibi hücreleri DMSO ile ön tedavi edin.
    2. Hazırlama Wnt3a ve Activin bir stok çözümleri.
    3. 20 ng/ml ve activin a son konsantrasyon Wnt3a ekleyerek Mezodermal farklılaşma medya hazırlamak 100 ng/ml prewarmed gelişmiş RPMI medya uygun hacmine.
    4. Dmso pretreatment sonra, hücrelerden medya Aspire ve farklılaşma medyaları ile değiştirin (örn., 6 kuyu plakası başına 2 ml).
    5. Bir CO2 kuluçk (5% Co2, nemli atmosfer) içinde 37 °c ' de 24 h için inküyasyon hücrelerin izin verin.
  3. Ectoderm farklılaşma (Chambers ve al.32tarafından uyarlanmıştır)
    1. 2B kültürler için yukarıda açıklandığı gibi hücreleri DMSO ile ön tedavi edin.
    2. Noggin ve SB431542 stok çözümlerini hazırlayın.
    3. Ektodermal farklılaşma baz medyasını nakavt serum replasmanı (KOSR) son konsantrasyon% 10 oranında nakavt DMEM ile hazırlayın.
      Not: 3-4 gün boyunca medya değişikliği için yeterli temel ortam hazırlayın.
    4. 500 ng/ml ve SB431542 son konsantrasyonuna noggin ekleyerek ektodermal farklılaşma medyasını hazırlayın 10 μM son konsantrasyon prewarmed kosr/Knockout dmem uygun hacmine.
    5. Dmso pretreatment sonra, hücrelerden medya Aspire ve farklılaşma medyaları ile değiştirin (örn., 6 kuyu plakası başına 2 ml).
    6. Hücrelerin 3-4 gün boyunca 37 °C ' de CO2 kuluçko (% 5 Co2, nemli atmosfer) içinde inkübasyon yapmasına izin verin, yeni eklenen farklılaşma faktörleri ile her gün medyayı değiştirin.

4. progenitor hücre türlerine farklılaşma

Aşağıda, 2D veya 3D kültürlerde yetiştirilen PSC 'ler için laboratuvarımızda etkili olması için önceden gösterilen yöntemler açıklanmaktadır. Tercih edilen herhangi bir farklılaşma protokolü, DMSO tedavisinden sonra istenilen çağların farklılaşımını teşvik etmek için kullanılmalıdır. 24-48 h tedavisinden sonra DMSO çözümünü kaldırın ve standart protokollerin ardından farklılaşma ile devam edin.

  1. Nöral progenitör hücre farklılaşma (Tchieu ve al.33tarafından uyarlanmıştır)
    1. Hazırlamak 6 iyi plaka ile kaplama bir pluripotent kök hücre nitelikli azaltılmış büyüme faktörü matris veya substrat, üretici talimatları başına, için en az 1 h bir CO2 kuluçk (5% Co2, nemli atmosfer). Kaplı plakalar film sarılmış ve 1 hafta kadar 4 °C saklanır olabilir.
    2. Plakalı PSC 'ler, kaya inhibitörü içeren kök hücre medyasında da 0.5-1 x 106 hücre yoğunluğunda yukarıda açıklandığı gibi.
    3. 2B kültürler için yukarıda açıklandığı gibi, hücreleri DMSO ile ön tedavi edin.
    4. Küçük kimyasal inhibitörleri LDN193189, SB431542 ve XAV939 stok çözümlerini hazırlayın.
    5. Hazırlamak gün 1-3 neuroectoderm farklılaşma medya ek tarafından Essential 6 medya ile 500 nM LDN193189, 10 μM SB431542, ve 2 μM XAV939.
    6. Dmso pretreatment sonra, medya Aspire ve gün 1-3 neuroectoderm medya ile yerine (örneğin, bir 6 kuyu plakası başına 2 ml). Günlük medya değiştirin.
    7. Hazırlamak gün 4-12 LDN193189 ve 10 μM SB431542 500 ile Essential 6 medya takviyesi tarafından neuroectoderm farklılaşma medya.
    8. 4. gün farklılaşma, medya Aspire ve gün 4-12 neurodectoderm medya ile değiştirin. Medyayı günlük olarak değiştirin.
    9. Farklılaşma 12 gün sonra, farklılaşmış hücreler nöral progenitör hücrelerin (NPCs) uygun belirteçleri ifade etmelidir. NPCs daha fazla DMEM/F-12, 2% B-1/27% N-2 içeren nöral medyada korunabilir ve 10 μg/mL temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ile desteklenmektedir. Geçiş NPCs bir hücre dekolmanı çözümü kullanarak confluent, 0,5-1 x 106 hücre Iyi başına NPCs kaplama.
  2. Oligodendrocyte progenitör hücre farklılaşma (Douvaras ve Fossati34tarafından uyarlanmış)
    1. Bir ROCK inhibitörü içeren kök hücre medyasında PSCs 'nin yukarıda açıklandığı şekilde, 1 x 105 ' in üzerinde iyi kaplı 6 kuyu plakasının yoğunluğunda plakasını yapın.
    2. 2B kültürler için yukarıda açıklandığı gibi, hücreleri DMSO ile ön tedavi edin.
    3. SB431542, LDN193189, All-Trans retinoik asit (RA) ve düzgünleştirilmiş agonist (SAG) stok çözümlerini hazırlayın.
    4. 10 μM SB431542, 250 nM LDN193189 ve 100 nM RA ile DMEM/F-12 takviyesi yaparak gün 0 – 8 farklılaşma ortamı hazırlayın.
    5. DMSO pretreatment sonrası, 8 gün boyunca farklılaşma medyası ile hücreleri kuluçat, taze eklenen farklılaşma faktörleri ile günlük medya değiştirme (örn., 6 iyi plaka başına 2 mL).
    6. 8. gün, DMEM/F-12 içeren medya yerine 1x MEM olmayan esansiyel amino asitler (NEAA) solüsyonu, 1X L-glutamin, 2-mercaptoetanol, penisilin/streptomisin ve 1x N-2 takviyesi 100 nM RA ve 1 μM SAG. Medyayı günlük olarak değiştirin.
    7. Farklılaşma 12 gün sonra, farklılaşmış hücreler oligodendrosit progenitör hücrelerin (OPCS) uygun belirteçleri ifade etmelidir.
  3. Endokrin progenitör hücre farklılaşma (Pagliuca ve al.35tarafından uyarlanmıştır)
    1. Kök hücre medyasında 6 x 105 hücreli/ml 'de çekirdek pscs, 500 ml Spinner Flsorunda 10 μM kaya inhibitörü, 70 RPM 'de bir 37 °c inkübörü,% 5 Co2ve% 100 nemde rotasyon hızında 9 pozisyonlu karıştırın plaka seti üzerine yerleştirilir.
    2. Kümeleri Flask altında yerleşmek için izin, medya Aspire, daha sonra% 1-2% DMSO ile ön muamele.
    3. Hazırlamak Activin A, Chir99021, KGF, Sant1, All-Trans retinoik asit (RA), LDN193189, PdBU, XXI, Alk51, T3, ve Betacelluin stok çözümleri.
    4. Tablo 3' teki formülasyona göre farklılaşma tabanı medyasını hazırlayın.
    5. DMSO pretreatment sonra, Aspire medya ve S1 Medya ile yerine 100 ng/mL Activin A ve 3 mM Chir99021 (örneğin, 500 mL her Flask) ile tamamlayıcı. 24 saat boyunca inkübasyon izni verin.
    6. 2. gün, 100 ng/mL Activin A ile desteklenen S1 medyası ile medyayı değiştirin. 2 gün boyunca inkübasyon sağlar.
    7. 4. gün, 50 ng/mL KGF ile tamamlayıcı medya ile S2 Medya değiştirin. 3 gün boyunca kuluçyaya izin verin, ilk 2 günden sonra medyayı değiştirme (6. gün).
    8. 7. gün, 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1, 2 mM RA ve 200 nM LDN193189 ile desteklenen S3 medyası ile medyayı değiştirin. 24 saat boyunca inkübasyon izni verin.
    9. 8. gün, 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1, 2 mM RA, 200 nM LDN193189 ve 500 nM PdBU ile desteklenen S3 medyası ile medyayı değiştirin. 24 saat boyunca inkübasyon izni verin.
    10. 9. günde, 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1 ve 100 nM RA ile desteklenen S3 medyası ile medyayı değiştirin. 5 gün boyunca kuluçyaya izin verin, her 2 günde bir medya değiştirme (11 ve 13. gün).
    11. 14 ve 16 günlerde, 0,25 mM Sant1, 100 nM RA, 1 mM XXI, 10 mM Alk5i II, 1 mM T3 ve 20 ng/mL betacellulin (4 gün toplam kuluçka) ile desteklenen S5 medyası ile medyayı değiştirin.
    12. 18 ve 20 gün içinde, 25 nM RA, 1 mm XXI, 10 mM Alk5i II, 1 mM T3 ve 20 ng/mL betacellulin ile desteklenen S5 medyası ile medyayı değiştirin.

5. farklılaşma immünosittokimyasal doğrulama

Not: Aşağıdaki yöntemlerle gerektiği gibi ayarlanabilen genel bir immünositokimyasal protokol açıklanmaktadır. Primer antikorlar daha önce laboratuvarımızda doğrulanmıştır. Farklılaşma doğrulamasının diğer teknikleri de kullanılabilir (örn., akış sitometri, qPCR, RNA sıralaması, Batı blokasyon, fonksiyonel Yöntemler, vb.).

  1. İmmunolabeling hücreler
    1. Süspansiyon 3D kültürler için, plaka tüm hücre kümeleri veya kümeleri tek hücreli süspansiyon içine kaplı plakaları üzerine dağılmış 18-24 için h önce sabitleme.
    2. Yapışan hücrelerden medya aspirate ve bir shaker üzerinde RT PBS ile kısaca yıkayın.
    3. Hücre fikfasyonu için, PBS Aspire ve PBS içinde 4% civarında formaldehite (PFA) ile hücreleri kuluçat, 20 dakika boyunca RT Shaker.
      Dikkat: PFA stok toksisitesi nedeniyle bir duman kaputu altında hazırlanmalıdır. Nefes ve uygun kişisel koruyucu ekipman giymek etmeyin.
    4. PFA 'yı çıkarın ve uygun kimyasal atık konteynerinde atın.
    5. Bir shaker üzerinde RT yıkama başına en az 5 dakika PBS ile hücreleri 3x yıkayın.
    6. Hücre geçirgen ve engelleme için,% 5 eşek serum% 0,3 Triton-x 100/PBS, RT bir shaker üzerinde 1 h için hazırlanan hücreleri inkük.
    7. Birincil antikor çözümünü, geçirgen/engelleme için kullanılan aynı çözümde hazırlayın.
    8. Ana antikor çözeltisi içinde bir gecede 4 °C ' de çalkalama.
    9. Gece kuluçdak sonra, bir shaker üzerinde RT yıkama başına en az 5 dakika için PBS ile hücreleri 3x yıkayın.
    10. Sekonder antikor solüsyonu geçirgen/engelleme çözümünde hazırlayın.
    11. Bir shaker üzerinde RT 1 h için ikincil antikor çözeltisi içinde inkübe izin verin.
    12. Bir shaker üzerinde RT yıkama başına en az 5 dakika için PBS ile ikincil antikor çözeltisi ve yıkama hücreleri 3x aspirate.
    13. DAPı veya uygun kuluçka süresi için başka bir tercih edilen işaretleyiciyle hücreleri inkübasyon yapın ve PBS 'de durulayın.
  2. Görüntü ölçümü
    1. Floresan mikroskop ve/veya yüksek içerik tarama platformu ile koşul başına en az üç görüntü kazanın.
    2. Tarafsız görüntüleme yazılımı (örn. ımagej) veya otomatik tarama platformu kullanılarak (DAPI/Hoechst çekirdekleri lekelenmesine dayalı) Toplam antikor lekeli hücre sayısı ve toplam hücre numaralarını sayarak her bir marker için pozitif hücrelerin yüzdesini ölçmek Analiz.

Representative Results

DMSO 'nun morfolojisi, ıpscs 'yi tedavi etmiştir
Kontrol konularından elde edilen insan iPhone 'lar, yapışan 2D Tek tabakalı veya 3D hücre küreler içinde süspansiyon içinde kültürlü. İlk kaplamandan yaklaşık 24 saat sonra, hücreler bakım ortamında 24 saat boyunca% 1 veya% 2 DMSO ile tedavi edildi. Dmso tedavisinden sonra temsili aydınlık alan görüntüleri Şekil 1' de gösterilir. Bir tek tabakalı3' te tutulan ıpscs için önceki raporlarla tutarlı olan DMSO ön, DMSO tarafından işlenmiş hücrelerde (Şekil 1a) karşılaştırıldığında büyüme oranlarında geçici bir doza bağımlı düşüşe neden oldu. Bu azalmış proliferasyon hücre-hücre temas bir artış ile ilişkilidir, özellikle de telaffuz edilir 2% DMSO daha yüksek kümelendirilmiş hücre kolonileri oluşumunu gösteren hücreler tedavi. Diğer hücre türlerinde, DMSO kaynaklı G1 tutuklama temas inhibisyonu indüklenen büyüme tutuklama36destekleyen hücre-hücre etkileşimleri dahil proteinlerin artan ifade ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. 3D hücre küreler olarak tutulan ıpscs, DMSO tedavisi benzer hücre küreler sayısını artırdı (Şekil 1B). Ayrıca, DMSO tedavisi daha az değişken 3D küre boyutları sonuçlandı, daha önce hücre37geliştirilmiş farklılaşma kapasitesinin göstergesi olarak gösterilmiştir. Daha da önemlisi, ne% 1 veya 2% DMSO hücre toksisitesi sonuçlandı, (n = 3; 2B kültür% Live = kontrol: 80 ± 1,3; 1% DMSO: 82 ± 3,7,% 2:81 ± 2,7; 3D kültür% Live = kontrol: 81 ± 4,3; 1% DMSO: 82 ± 6,7,% 2:82 ± 2,7). Genel olarak, bu sonuçlar DMSO tedavisi kültür kök hücrelerinde hücre döngüsü ve büyüme desenleri değiştirir kavramı ile tutarlı. Bu büyüme inhibisyonu üzerindeki etkileri DMSO orta kaldırılır zaman geri dönüşümlü olarak, daha önce gösterilen3.

DMSO tedavisi, ESCs 'in primer germ katmanlarına farklılaşmasını geliştirir
HUES6 hESCs, 24 saat boyunca% 2 DMSO ile bakım ortamında 24 h için kaplanmış plakalara dikilmiştir. Hücreler, Şekil 2A30,31,32' de gösterilen tedavi paradigmaları sonrasında üç primer germ katmanına ayrılır. Farklılaşmış hücreler daha sonra sabit ve immünolojik her ilgili germ tabakası prototiplik belirteçleri için lekelenmiş (endoderm için SOX17, mesoderm için brachyury, ve ectoderm için SOX1). Şekil 2B'de görüldüğü gıbı,% 2 DMSO ile 24 saat ön tedavi, her bir germ katman işaretleyicisini ifade eden hücrelerin oranını artırdı. Bu, yüksek immünoreactivity, Gen ifadesinin yanı sıra DMSO3,5ile tedavi edilen kök hücrelerdeki tüm germ katmanlarına doğru farklılaşmış hücrelerin mutlak sayısını gösteren laboratuvarımızın önceki raporlarıyla uyumludur. HUES6 tüm sırlarda farklılaşma için çok düşük eğilimi olan bir hESC hattı1, henüz DMSO tedavisi önemli ölçüde tüm germ katmanları arasında ayırt etmek kapasitesini geliştirir.

Dmso tedavisi progenitör hücre türlerine farklılaşma geliştirir
Dmso 'nun CNS progenitör hücre türlerine farklılaşması üzerinde etkisini araştırmak için, insan ipscs, nöral progenitör hücrelerine (NPCs) veya oligodendrosit progenitör hücrelerine (OPCS) ayırt edildi. NPCs oluşturmak için, hücreler bakım ortamında 24 h için% 2 DMSO ile ön tedavi edildi ve ardından 12 gün yönlendirilmiş farklılaşma33 (Şekil 3A). Şekil 3B'de gösterildiği gibi,% 2 DMSO ön kontrol ile karşılaştırıldığında NPC Marker PAX6 ifadesi arttı. Önceden doğrulanmış başka bir protokol34 (Şekil 3C) kullanarak, ıpscs 12 gün boyunca OPCS 'e ayrılır. NPCs 'ye benzer şekilde, 24 h için% 2 DMSO ile önceden işlenmiş ıpscs 'den türetilen OPCs, OPC işaretçileri OLIG2 (Şekil 3D) ifade eden hücrelerin artış oranını göstermiştir.

İlk DMSO tedavisi, Olgun hücre türlerine farklılaşma geliştirmek için devam eder
DMSO 'nın farklılaşma protokolünün ikinci aşamalarında etkisini araştırmak için, HUES8 hESCs, Şekil 4a 'da açıklanan 20 gün boyunca yönlendirilmiş farklılaşma protokolünün ardından β hücrelere farklılaşmadan önce% 2 DMSO ile 24 saat önceden tedavi edildi 35. HUES8, daha önce endosdermal Lineage1,38karşı daha yüksek bir eğilimi olduğu gösterilmiştir olarak kullanıldı. Kesin endoderm aşamasında, farklılaşmış hücreler ekspres SOX17 ve FOXA2, kesin endoderm (DE) spesifik işaretçileri. Pankreas ataları daha fazla farklılaşma ile (PP1) sahne, farklılaşmış hücreler ekspres PDX1 ve FOXA2, pankreatik progenitör hücrelerin karakteristik işaretler. Pankreatik hücre farklılaşma bu aşamalarında, DE ve daha sonra içine indüksiyon verimlilikleri PP1 her iki kontrol ve DMSO-tedavi hescs bu aşamaların her biri içine farklılaşmış için yüksek oldu (Şekil 4B, Aşama 1 ve 3). HUES8 hücre çizgisinin endodermal kaderinde ayrım yapmak için artmış eğilimi olduğu belirtilse de, farklılaşma daha özel hücre türlerine daha fazla indüklenmiş olduğu için Terminal aşamalarında DMSO-tedavi hESCs çok daha fazla Olgun pankreas endokrin hücreler üretmek muhtemeldir. PDX1/nkx 6.1 + pankreas progenitör hücreleri, neurogenin 3 + endokrin hücreler ve nkx 6.1/C-peptid + SC-β hücreleri üreten verimliliği DMSO-tedavi hescs önemli ölçüde daha yüksek oldu (Şekil 4B, Aşama 4 ve 5). Bu sonuçlar, DMSO 'nın progenitör hücre türlerine farklılaşma potansiyelini arttırdığını ve DMSO 'nın etkisini daha özel hücre türleri üretmeye karşı kalıcı olduğunu gösteren NPC ve OPC farklılaşma ile aynıdır. Bu, ilk 24 h DMSO tedavisinin, nöronal hücrelere dahil olmak üzere germ katmanlarında Terminal hücresi türlerine farklılaşmasını arttırdığı ve kardiyomiyositlerin dövdüğü31,39 farklılaşma için yüksek veya kötü eğilimi olan hücre çizgilerinin3.

İlk DMSO tedavisi , In vivo transplantasyonu sonrasında HESC türevi hücre fonksiyonunu geliştirir
Daha önce, biz daha sonra insülin salgılanması içinde vivo3olarak belirgin bir gelişme gösteren fonksiyonel pankreas progenitör hücrelere hescs farklılaşma artırılması DMSO tedavisinin etkinliğini göstermiştir. Daha önce yayımlanan protokolleri kullanarak3,30,40, HUES8 hescs ile tedavi edildi 1% DMSO için 24 h, pankreatik progenitör hücrelere farklılaşmış, ve bağışıklık eksikliği scid-bej fareler içine nakledilen değerlendirmek için (örneğin, glikoz zorluk veya KCl stimülasyonuna yanıt olarak insülin salgılanması) (Şekil 5a). FOXA2 + (~% 90) içine farklılaşma verimlilikleri iken ve PDX1 + (~ 75%) Pankreatik progenatörler kontrol ve DMSO-tedavi hESCs arasında karşılaştırılabilir (Şekil 5B) HUES8 HESC hattı için, bir 24 h 1% DMSO tedavisi aşağıdaki hescs farklılaşmış hücreler glikoz ve KCL için yanıt artırıldı in vivo nakli takiben stimülasyon. İşlevdeki iyileştirmeler 2 hafta sonrası transplantasyon sırasında açıktı (Şekil 5C) ve en az 16 hafta sonrası transplantasyon (Şekil 5D). Birlikte alındığında, bu sonuçlar DMSO ön sadece mikrop katmanları, progenitör hücreler ve daha olgun hücre türleri için farklılaşma verimliliğini artırır, ama aynı zamanda bu farklılaşmış hücrelerin işlevselliğini geliştirmek için devam ettiğini düşündürmektedir in vivo.

Farklılaşmış hücre tipi Başlangıç hücre türü % DMSO DMSO tedavisinin uzunluğu DMSO tedavisinin uzunluğu
Hepatik hücreler Esc
Hepatoma hücre hattı
Esc
Esc
Mezenkimal kök hücreler
iPSCs 'ler
Esc
Esc
Hepatoma hücre hattı
Esc		 1,0
1,0
1,0
0,5
0.1-2.0
1,0
1,0
0,5
1,0
0,6		 8 gün boyunca
Birkaç gün
7 gün boyunca
10-14 gün
7-21 gün
7 gün boyunca
4 gün boyunca
5 gün boyunca
2-21 gün
Boyun -ca		 Basma ve ark., 2008
Kanebratt ve Andersson, 2008
Saman ve ark., 2009
Duan ve ark., 2010
Alizadeh et al., 2014
Kondo et al., 2014
Szkolnicka ve al., 2014
Czysz et al., 2015
Nikolaou ve ark., 2016
Vanhove et ark., 2016
Primer germ katmanları ESCs ve ıpscs
hESC
hESC		 0.1-2.0
0,5
0.1-2.0		 24 saat boyunca
24 saat boyunca
24 saat boyunca		 Chetty ve ark., 2013
Chetty ve ark., 2015
Li et al., 2018
Kardiyak hücreler ESCs ve ıpscs
P19 hücreler
ESCs ve ıpscs
Fetal mezenkimal kök hücreler		 0.1-2.0
1,0
1.0-2.0
0.8-1.0		 24 saat boyunca
4 gün boyunca
24-30 saat
24 saat boyunca		 Chetty ve ark., 2013
Choi et al., 2014
Van den Berg et al., 2016
Deng et al., 2017
Pankreas hücreleri ESCs ve ıpscs
hESC		 0.1-2.0
0,5		 24 saat boyunca
24 saat boyunca		 Chetty ve ark., 2013
Chetty ve ark., 2015
Pürüzsüz Kas hücreleri P19 hücreler 1,0 4 gün boyunca Choi et al., 2014
Endotel hücreleri P19 hücreler 1,0 4 gün boyunca Choi et al., 2014
Enterositler iPSCs 'ler 0-1.6 4 gün boyunca Ogaki et al., 2015
Gut epitelyum iPSCs 'ler 0-1.6 4 gün boyunca Ogaki et al., 2015
Nöral hücreler Marmoset iPSC 0.05-2.0 24 saat boyunca Qiu et al., 2015
Nötrofil Lösemi hücre hattı 1,25 6-8 gün Teimourian ve Moghanloo, 2016
İskelet Myotubes iPSCs 'ler 1,5 24 saat boyunca Swartz et al., 2016
Kortikal nevuslardır hiPSCs 1,0 24 saat boyunca Yoon et al., 2018

Tablo 1: DMSO tedavisinin farklılaşma üzerinde yararlı etkilerini gösteren daha önce yayımlanan çalışmanın Özeti.

S1 S2 S3 S5
MCDB131 (L) 1 1 1 1
Glikoz (g) 0,44 0,44 0,44 3,6
NaHCO3 (g) 2,46 1,23 1,23 1,754
FAF-BSA (g) 20 20 20 20
ONUN-X (mL) 0,02 0,02 5 5
Glutamax (mL) 10 10 10 10
C vitamini (mg) 44 44 44 44
Heparin (mg) 0 0 0 10
P/S (mL) 10 10 10 10

Tablo 2: bileşenlerin endokrin progenitör hücre farklılaşma baz Medias.

Figure 1
Şekil 1 : DMSO tedavisi hPSCs büyümesini değiştirir. (A) 24 h için% 1 veya% 2 DMSO ile hiçbir tedavi (kontrol) veya tedavi aldıktan sonra bir tek tabakalı içinde kaplama hipscs temsilcisi aydınlık alan görüntüleri. DMSO, ISCs 'nin geçici bir doza bağımlı büyüme inhibisyonu teşvik eder. (B) 24 h için% 1 veya% 2 DMSO ile hiçbir tedavi (kontrol) veya tedavi aldıktan sonra 3D küre oluşumuna izin vermek için düşük ataşman plakaları üzerine kaplanmış hipscs temsilcisi aydınlık alan görüntüleri. DMSO tedavi sonuçları daha az değişken 3D küre oluşumu kontrol ile karşılaştırıldığında. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Figure 2
Şekil 2 : DMSO tedavisi, hPSCs 'nin primer germ katmanlarına farklılaşmasını geliştirir. (A) üç primer germ katmanını oluşturmak için kullanılan farklılaşma protokollerinin şematiği. (B) SOX17 (endoderm), brachyury (mesoderm) ve SOX1 (ectoderm) için immunolabeled FARKLıLAŞMıŞ HUES6 hescs temsili görüntüleri. 24 saat boyunca% 2 DMSO ile ön tedavi, üç germ katmanının tamamında farklılaşma verimliliğini artırdı. SOX17 + endodermal, brachyury (brachy) + mesodermal veya SOX1 + ektodermal hücreler arasında ayrım yapan hücrelerin yüzdeleri, her bir mikrop tabakasının kontrol katmanına yönlendirilmiş farklılaşma ve DMSO-tedavi edilen hescs ile üç biyolojik çoğaltır SEM ile belirtilmiştir . Eşleştirilmemiş t-testi: endoderm p = 0,0003; mezoderm p = 0,047; ektoderm p = 0,015. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Figure 3
Şekil 3 : DMSO tedavisi nöral progenitör hücre türlerine farklılaşma geliştirir. (A) neural progenitör hücreler (NPCs) oluşturmak için kullanılan farklılaşma protokolünün şematik. (B) Pax6 için immünolabeled NPCs ayırt ınsan ıpscs temsili görüntüleri. % 2 DMSO ile 24 saat ön tedavi sayısı PAX6 pozitif hücreleri artırdı. Kontrol ve DMSO-işlenmiş insan ıpscs yönlendirilmiş farklılaşma aşağıdaki Pax6 + NPCs ayrım hücrelerin yüzdeleri SEM üç biyolojik çoğaltır ile belirtilmiştir. Eşlenmemiş t-testi: p = 0,0225. Ölçek çubuğu = 200 μm. (C) oligodendrosit progenitör hücreler (OPCS) oluşturmak için kullanılan farklılaşma protokolünün şematik. (D) Olig2 OPC işaretçileri için immünolabeled OPCS içine ayırt ınsan ıpscs temsili görüntüleri. 2% DMSO ile ön tedavi 24 h kontrol ile karşılaştırıldığında her iki OPC işaretçileri ifade arttı. Kontrol ve DMSO-işlenmiş insan ıpscs yönlendirilmiş farklılaşma sonrasında Olig2 + OPCs içine ayrım hücrelerin yüzdeleri SEM dört biyolojik çoğaltır ile belirtilmiştir. Eşlenmemiş t-testi: p = 0,0466. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Figure 4
Şekil 4 : DMSO tedavisi hPSCs Terminal farklılaşma potansiyelini artırır. (A) a ~ 20 günlük bir ŞEMATIK HUES8 hescs farklılaşma ölümcül farklılaşmış pankreas endokrin hücrelere. (B) tedavi edilmemiş kontrol hücrelerinin ve hücrelerin 2% DMSO ile 24 h için önceden tedavi edilen farklılaşması sonrasında farklılaşma her aşamasında belirtilen belirteçleri için immünostasyon. İlk DMSO tedavisi, yönlendirilmiş farklılaşma ikinci aşamalarında Terminal endokrin hücre türlerine farklılaşma artırmak için devam eder. Kontrol ve DMSO-tedavi hESCs yönlendirilmiş farklılaşma aşağıdaki farklılaşma her aşamasında belirtilen işaretçileri ayrım hücrelerin yüzdeleri SEM ile iki ila dört biyolojik çoğaltır belirtilir. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Figure 5
Şekil 5 : Hpscs ilk DMSO tedavisi pankreas progenitör hücrelerinin transplantasyonu sonrasında glikoz tepkisini arttırır. (A) herhangi bir tedavi (kontrol) veya 24 h 1% DMSO tedavisi ve sonraki transplantasyon (5.000.000 hücreler) üzerine bağışıklık yetersizliği halinde, (a) HUES8 hescs 'in yönlendirilmiş farklılaşma (~ 15 gün) şematiği, pankreatik progenitör hücrelere (PP2) SCıD-bej fareler. (B) PDX1 + ve FOXA2 + pankreatik progenitör hücrelerine ayrım yapan hücrelerin yüzdesi, in vitro yönlendirmeden sonra kontrol ve DMSO-tedavi edilen hescs 'dan hemen sonra transplantasyon (n = 1). (C) düşük (2,5 mm) veya yüksek (15 mm) glikoz zorluk veya potasyum klorür (KCL) stimülasyon (c) 2 hafta ve (D) 16 hafta sonra pankreatik transplantasyon sonrası farelerin SERUMUNDAN insan insülininin ELISA ölçümleri anlamına gelir kontrol ve DMSO-tedavi hescs ayırt progenitör hücreleri (hata çubukları = SEM; n = 3 2 hafta ve 16 hafta kontrol için; n = 2, 2 hafta ve 16 hafta DMSO için). İki yönlü ANOVA: p = 0,0051 kontrol vs. DMSO için 2 hafta; p = 0,0116 kontrol vs DMSO için 16 hafta. Farklı zaman noktalarında okuılan fareler farklıdır. Sonuçlar Chetty ve al.3' ten uyarlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Discussion

Özetle, bu protokol pluripotent kök hücrelerinin farklılaşma kapasitesini artırmak için basit ve ucuz bir araç açıklar (PSC 'ler) tüm primer mikrop katmanları için, özel progenitör hücreleri çeşitli türleri, ve hatta fonksiyonel, Olgun hücre türleri in vitro ve in vivo ayarlar. Illustrated, laboratuvarımızda ve diğerlerinin yanı sıra etkili bir şekilde çoğaltılan spesifik farklılaşma protokolleridir, ancak DMSO tedavisinin ardından tercih edilen herhangi bir farklılaşma protokolü kullanılabilir. Tablo 1' de gösterildiği gibi, bir dizi laboratuar, çeşitli diğer Terminal hücresi türleri oluşturmak için farklı paradigmalar kullanarak geçici DMSO tedavisinden sonra PSC farklılaşma geliştirmesini de göstermiştir. Ayrıca, buradaki Yöntemler insan PSC 'lerin kullanımını tarif etse de, DMSO ön tedavisi türler arasında kullanılabilir ve fare, tavşan ve primat PSC 'lerde etkili olduğu gösterilmiştir.

DMSO yüksek dozlarda sitotoksisik olduğu bilinmektedir rağmen, bu yöntemle kullanılan düşük dozlarda (1%-2%) en az hücre ölümü geçici bir süre sonucu için. DMSO tedavisinden hemen sonra genel hücre numaraları hücre döngüsünün G1 aşamasında hücre döngüsü tutuklama DMSO promosyon nedeniyle azalabilir iken, önceki çalışmalar hücrelerin kaldırıldıktan sonra kontrol kültürleri olarak aynı seviyeye ulaşmak mümkün olduğunu gösterir DMSO3.

DMSO ön tedavisi yüzdesi ve süresi hücre çizgisi başına en iyi duruma getirilmelidir. Tedavi süresi, hücrelerin Bisiklet/ikiye katlama süresi için dikkate alınarak ayarlanmalıdır. Örneğin, fare PSC 'leri genellikle yaklaşık 15 saat daha kısa Bisiklet süreleri vardır; Bu nedenle, bu hücreler için 15 h DMSO tedavisi yeterlidir. Bazı laboratuvarlar, farklılaşma protokolü sırasında veya daha düşük konsantrasyonlarda devam ederken DMSO tedavisinin yararlı olmasını da bulmuştu (bkz. Tablo 1). Bazı PSC hatları belirli sırlara farklılaşma için daha değiştirilebilir olduğunu unutulmamalıdır. Örneğin, HUES6 hücrelerin farklılaşma için daha az uygun olduğu gösterildi ve böylece DMSO tedavisi ile gelişme işaretlendi (Şekil 2). Alternatif olarak, Şekil 4 ve Şekil 5 ' te kullanılan HUES8 hücrelerin endodermal farklılaşma yönünde daha yüksek bir eğilimi olduğu gösterilmiştir; Böylece, ilk aşamalarında kesin endoderm 'ye doğru farklılaşma için kontrol ve DMSO arasında daha az farklar gösterildi. Yine de, bu hücre hattında farklılaşımın daha sonraki aşamalarında DMSO ön tedavisinin geliştirilmesi görülmektedir (Şekil 4B). DMSO tedavisi aynı zamanda hem 2D hem de 3D hücre kültürleri sistemlerinde etkili olduğu için çok yönlü olup, hücre kültürü plakaları üzerinde çeşitli kaplama malzemesi ile kullanılabilir ve büyüme ve genişlemenin geliştirilmesine teşvik eden farklı bakım ortamı türlerinde çalışır hPSCs (örn., mTeSR, E8, MEF, medya, vb).

Daha genel olarak, bu sonuçlar, pluripotent kök hücrelerinin başlangıç durumunun, ilk farklılaşma eğilimi üzerinde güçlü bir etkiye sahip olduğu gibi, işlevsel hücre türlerine Terminal farklılaşması olduğunu düşündürmektedir. Biz daha önce göstermiştir ki DMSO tedavi fonksiyonları RB üzerinden hpscs3,5. RB, Terminal farklılaşma, hücre hayatta kalma ve hücrelerin genetik istikrar41,42,43,44teşvik önemli bir rol oynar ve bu nedenle hücreler üzerinde kalıcı etkileri açıklayabilir DMSO tarafından işlenmiş hPSCs farklılaşmış. Yönetmelik bu erken modları hedefleme ayırt etmek için daha iyi bir yörünge üzerinde hPSCs yerleştirebilir ve sonuçta rejeneratif tıp için yardımcı programını geliştirmek.

Disclosures

Yazarlar hiçbir şey açıklamak zorunda.

Acknowledgments

Bu çalışma Stanford Üniversitesi Tıp Fakültesi 'nden hibe ve S. C 'ye verilen bir Siebel bursu ile destekleniyordu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Gibco 21985023
6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate Corning 353046
9-Position stir plate  Chemglass CLS-4100
Accutase Gibco 11105-01
Activin A R&D Systems 338-AC
Advanced RPMI Gibco 12633012
Alk5i II Axxora ALX-270-445
All-trans retinoic acid  Sigma-Aldrich R2625
anti-Brachyury R&D Systems AF2085 No variablity observed across different lot numbers
anti-C-peptide Developmental Studies Hybridoma Bank GN-ID4 No variablity observed across different lot numbers
anti-FoxA2 Millipore 07-633 No variablity observed across different lot numbers
anti-Nkx2.2 University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank 74.5A5 No variablity observed across different lot numbers
anti-Nkx6.1 University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank;  F55A12-supernatant No variablity observed across different lot numbers
anti-Olig2 EMD Millipore MABN50 No variablity observed across different lot numbers
anti-Pax-6 Biolegend 901301 No variablity observed across different lot numbers
anti-Pdx1 R&D Systems AF2419 No variablity observed across different lot numbers
anti-SOX1  R&D Systems AF3369 No variablity observed across different lot numbers
anti-SOX17 R&D Systems AF1924 No variablity observed across different lot numbers
B-27 Supplement, minus Vitamin A Gibco 12587010
Basic fibroblast growth factor Gibco PHG0264
Betacellulin Thermo Fisher Scientific  50932345
Chir99021 Stemgent 04-000-10
CMRL 1066 Corning 99-603-CV
Countess II FL Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific  AMQAF1000
D-(+)-Glucose Sigma  G7528 
DAPI Invitrogen  D1306
Disposable Spinner Flasks Corning, VWR 89089-814
DMEM/F-12 Gibco 11320033
DMSO  Sigma-Aldrich D2650
Essential 6 Media Gibco A1516501
FAF-BSA Proliant  68700
FGF7 PeproTech 100-19
Geltrex Gibco A1413202
GlutaMAX  Gibco 35050061
Heparin  Sigma  H3149 
Human Ultrasensitive Insulin ELISA ALPCO Diagnostics 80-INSHUU-E01.1
ITS-X Invitrogen  51500056
KGF Peprotech AF-100-19
Knockout DMEM Gibco 10829018
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828028
L-3,3′,5-Triiodothyronine (T3) EMD Millipore 642245
LDN193189 Stemgent 04-0074
Matrigel Matrix Corning 354277
MCDB-131  Cellgro  15-100-CV 
MEM NEAA Gibco 11140050
mTeSR 1 StemCell Technologies 5850
N2 Supplement Life Technologies 17502048
NaHCO3 Sigma  S3817 
Noggin Fc Chimera Protein R&D Systems 3344-NG-050
PdBU EMD Millipore 524390
Penicillin/Streptomycin  Mediatech  30-002-CI
RPMI Gibco 11875-093
Sant1 Sigma-Aldrich S4572
SB431542 Stemgent 04-0010
Smoothened Agonist, SAG EMD Millipore 566660
StemPro Accutase Gibco A1110501 
TrypLE Gibco 12604013
Ultra-Low Attachment Microplates Corning 3471
Vitamin C Sigma-Aldrich A4544 
Wnt3a R&D Systems 5036-WN
XAV 939 Tocris 3748
XXI EMD Millipore 565790
Y-27632 StemCell Technologies 72302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Osafune, K., et al. Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines. Nature Biotechnology. 26 (3), 313-315 (2008).
  2. Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Review Genetics. 15 (2), 82-92 (2014).
  3. Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
  4. Conklin, J. F., Sage, J. Keeping an eye on retinoblastoma control of human embryonic stem cells. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (5), 1023-1030 (2009).
  5. Li, J., et al. A transient DMSO treatment increases the differentiation potential of human pluripotent stem cells through the Rb family. PLoS One. 13 (12), 0208110 (2018).
  6. Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246 (4930), 629-634 (1989).
  7. Pardee, A. B. G1 events and regulation of cell proliferation. Science. 246 (4930), 603-608 (1989).
  8. Orford, K. W., Scadden, D. T. Deconstructing stem cell self-renewal: genetic insights into cell-cycle regulation. Nature Review Genetics. 9 (2), 115-128 (2008).
  9. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  10. Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
  11. Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
  12. Duan, Y., et al. Differentiation and characterization of metabolically functioning hepatocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (4), 674-686 (2010).
  13. Szkolnicka, D., Farnworth, S. L., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Deriving functional hepatocytes from pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 30, 1-12 (2014).
  14. Vanhove, J., et al. H3K27me3 Does Not Orchestrate the Expression of Lineage-Specific Markers in hESC-Derived Hepatocytes In Vitro. Stem Cell Reports. 7 (2), 192-206 (2016).
  15. Kanebratt, K. P., Andersson, T. B. Evaluation of HepaRG cells as an in vitro model for human drug metabolism studies. Drug Metabolism & Disposition. 36 (7), 1444-1452 (2008).
  16. Nikolaou, N., Green, C. J., Gunn, P. J., Hodson, L., Tomlinson, J. W. Optimizing human hepatocyte models for metabolic phenotype and function: effects of treatment with dimethyl sulfoxide (DMSO). Physiological Reports. 4 (21), (2016).
  17. Kondo, Y., et al. An efficient method for differentiation of human induced pluripotent stem cells into hepatocyte-like cells retaining drug metabolizing activity. Drug Metabolism Pharmacokinetics. 29 (3), 237-243 (2014).
  18. Alizadeh, E., et al. The effect of dimethyl sulfoxide on hepatic differentiation of mesenchymal stem cells. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 44 (1), 157-164 (2016).
  19. Czysz, K., Minger, S., Thomas, N. DMSO efficiently down regulates pluripotency genes in human embryonic stem cells during definitive endoderm derivation and increases the proficiency of hepatic differentiation. PLoS One. 10 (2), 0117689 (2015).
  20. Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 5, 17297 (2015).
  21. Choi, S. C., et al. Mixl1 and Flk1 Are Key Players of Wnt/TGF-beta Signaling During DMSO-Induced Mesodermal Specification in P19 cells. Journal of Cellular Physiology. 230 (8), 1807-1821 (2015).
  22. Chetty, S., et al. A Src inhibitor regulates the cell cycle of human pluripotent stem cells and improves directed differentiation. Journal of Cell Biology. 210 (7), 1257-1268 (2015).
  23. Qiu, Z., et al. Marmoset induced pluripotent stem cells: Robust neural differentiation following pretreatment with dimethyl sulfoxide. Stem Cell Research. 15 (1), 141-150 (2015).
  24. Swartz, E. W., et al. A Novel Protocol for Directed Differentiation of C9orf72-Associated Human Induced Pluripotent Stem Cells Into Contractile Skeletal Myotubes. Stem Cells Translational Medicine. 5 (11), 1461-1472 (2016).
  25. Teimourian, S., Moghanloo, E. Thwarting PTEN Expression by siRNA Augments HL-60 Cell Differentiation to Neutrophil-Like Cells by DMSO and ATRA. DNA Cell Biology. 35 (10), 591-598 (2016).
  26. van den Berg, C. W., Elliott, D. A., Braam, S. R., Mummery, C. L., Davis, R. P. Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes Under Defined Conditions. Methods in Molecular Biology. 1353, 163-180 (2016).
  27. Deng, F., et al. Combination of retinoic acid, dimethyl sulfoxide and 5-azacytidine promotes cardiac differentiation of human fetal liver-derived mesenchymal stem cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 147-159 (2016).
  28. Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2018).
  29. Stratigopoulos, G., De Rosa, M. C., LeDuc, C. A., Leibel, R. L., Doege, C. A. DMSO increases efficiency of genome editing at two non-coding loci. PLoS One. 13 (6), 0198637 (2018).
  30. Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nature Biotechnology. 26 (4), 443-452 (2008).
  31. Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
  32. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  33. Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
  34. Douvaras, P., Fossati, V. Generation and isolation of oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (8), 1143-1154 (2015).
  35. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  36. Fiore, M., Degrassi, F. Dimethyl sulfoxide restores contact inhibition-induced growth arrest and inhibits cell density-dependent apoptosis in hamster cells. Experimental Cell Research. 251 (1), 102-110 (1999).
  37. Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
  38. Bock, C., et al. Reference Maps of human ES and iPS cell variation enable high-throughput characterization of pluripotent cell lines. Cell. 144 (3), 439-452 (2011).
  39. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  40. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  41. Jacks, T., et al. Effects of an Rb mutation in the mouse. Nature. 359 (6393), 295-300 (1992).
  42. Nguyen, D. X., Baglia, L. A., Huang, S. M., Baker, C. M., McCance, D. J. Acetylation regulates the differentiation-specific functions of the retinoblastoma protein. The EMBO Journal. 23 (7), 1609-1618 (2004).
  43. Slack, R. S., et al. Cells differentiating into neuroectoderm undergo apoptosis in the absence of functional retinoblastoma family proteins. Journal of Cell Biology. 129 (3), 779-788 (1995).
  44. Gu, W., et al. Interaction of myogenic factors and the retinoblastoma protein mediates muscle cell commitment and differentiation. Cell. 72 (3), 309-324 (1993).

Tags

Gelişimsel biyoloji sayı 149 insan pluripotent kök hücreleri diferüzik DMSO Retinoblastom protein hücre döngüsü hücre kaderi
Insan pluripotent kök hücrelerinin DMSO ile geçici tedavisi farklılaşma teşvik etmek
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sambo, D., Li, J., Brickler, T.,… More

Sambo, D., Li, J., Brickler, T., Chetty, S. Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation. J. Vis. Exp. (149), e59833, doi:10.3791/59833 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter