Medición de la secreción relativa de insulina mediante un sustituto de la Luciferase co-secretada

Resumen

Este protocolo describe cómo realizar ensayos rápidos de luciferasa de bajo costo a rendimiento medio utilizando una Gaussia luciferase ligada a la insulina como un proxy para la secreción de insulina de células beta. El ensayo se puede realizar con la mayoría de los lectores de placas de luminiscencia y pipetas multicanal.

Resumen

La realización de ensayos basados en anticuerpos para la recolección secreta de insulina después de la muestra suele requerir unas horas a un día de tiempo de ensayo y puede ser costoso, dependiendo del ensayo específico. Los ensayos de luciferasa secretas aceleran los resultados y reducen sustancialmente el costo del ensayo por muestra. Aquí presentamos un enfoque relativamente infrautilizado para medir la actividad secretora de insulina de las células pancreáticas mediante el uso de Gaussia luciferasa insertada genéticamente dentro del péptido C. Durante el procesamiento proteolítico de la proinsulina, el péptido C se extirparte liberando la luciferasa dentro de la vesícula secretora de insulina donde se co-secreta con insulina. Los resultados se pueden obtener en cuestión de minutos después de la recolección de muestras debido a la velocidad de los ensayos de luciferasa. Una limitación del ensayo es que es una medida relativa de la secreción de insulina y no una cuantificación absoluta. Sin embargo, este protocolo es económico, escalable y se puede realizar utilizando la mayoría de los lectores de placas de luminiscencia estándar. Las pipetas multicanal analógicas y digitales facilitan múltiples pasos del ensayo. Muchas variaciones experimentales diferentes se pueden probar simultáneamente. Una vez que se decide un conjunto focalizado de condiciones, las concentraciones de insulina deben medirse directamente utilizando ensayos basados en anticuerpos con curvas estándar para confirmar los resultados del ensayo de luciferas.

Introducción

El método presentado aquí permite que la secreción de insulina de una línea de células beta modificadagenéticamente se ensaye rápida y asequiblemente en formato de 96 placas de pozo. La clave de este protocolo es una versión modificada de la insulina con la Gaussia luciferase naturalmente secretada (GLuc, 18 kDa) insertada (ver Figura 1) en el péptido C para generar insulina-Gaussia (InsGLuc)^1,2. Otras proteínas más grandes, como la GFP (25 kDa), se han insertado con éxito en el péptido C de la insulina y han exhibido el procesamiento post-traduccional esperado de....

Protocolo

1. Preparación de reactivos, medios y buffers (Tabla 1)

1. Preparar el medio completo de la min6 en 500 ml de medio águila modificado (DMEM) de alta glucosa (4,5 g/L) de Dulbecco con los siguientes aditivos: 15% de suero bovino fetal (FBS), 100 unidades/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina, 292 g/ml de glutamina y 50 m lglutinamina y 50 ml -mercaptoetanol.
   NOTA: La línea celular estable en este caso se mantiene en 250 g/ml de antibiótico G418.
2. Preparar el tampón de bicarbonato Krebs-Ringer (KRBH) haciendo una solución que contenga 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7.4), 24 mM NaHCO₃, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂

Resultados

Para medir el rendimiento del ensayo en condiciones de control, se puede completar una simple curva de dosis-respuesta de glucosa o una estimulación utilizando el paradigma de diazoxida. En el caso de la primera, la preincubación de las células durante 1 h en condiciones libres de glucosa seguida de tratamiento durante 1 h con concentraciones de glucosa crecientes debe dar lugar a muy poca actividad secretora en y por debajo de 5 mM, mientras que el aumento de la secreción se observa por .......

Discusión

Aquí presentamos un método para evaluar rápidamente las respuestas de secreción de insulina estimuladas por la glucosa de las células MIN6. Para obtener las mejores respuestas en el ensayo es importante sembrar las células MIN6 con la densidad adecuada y permitir que se conviertan en un confluente del 85-95%. Esto mejora las respuestas celulares a la glucosa debido a la mejora de los contactos y la sincronización de células celulares, que se produce tanto en los islotes primarios^17,

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Materiales de cultivo celular
rIns-GLuc células MIN6 estables			Línea celular parental MIN6 que expresa de manera estable pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc y se mantiene en 250 ug/ml G418
DMEM	Sigma	D6429	4.5 g/L
de glucosa suero bovino fetal,	Sigma	F4135
/ Estreptomicina	Thermo-Fisher Scientific	SV30010
beta-mercaptoetanol	Thermo-Fisher Scientific	BP 176-100
glutamina	Thermo-Fisher Scientific	BP379-100
Tripsina-EDTA	Sigma	T3924-500
G418	Gold Biotechnology	G418-10	Solución madre 250 mg/mL en agua. Congele las alícuotas a -20 °C.
Matraces de cultivo de tejidos T75	Fisher Scientific	07-202-000
placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos	Celltreat	229196
Reservorios de reactivos (50 mL)	Corning	4870
Name	Company	Número de catálogo	Comments
ensayo de secreción fuerte
BSA (grado RIA)	Thermo-Fisher Scientific	50-146-952
D-(+)-Glucosa	Sigma	G8270-1KG
KCl	Thermo-Fisher Scientific	P217-500
NaCl	Thermo-Fisher Scientific	S271-3
Hepes, pH 7,4	Thermo-Fisher Scientific	50-213-365
NaHCO3	Thermo-Fisher Scientific	15568414
MgCl2	Thermo-Fisher Scientific	M9272-500G
CaCl2	Sigma	C-7902
Name	Company	Número de catálogo	>Comments
Medicamentos opcionales para experimentos de estimulación
Diazoxide	Sigma	D9035	Solución madre: 50 mM en NaOH 0.1N. Agregue la misma cantidad de 0.1N HCl a cualquier tampón donde se agregue diazóxido.
epinefrina (sal de bitartrato)	Sigma	E4375	Solución madre: 5 mM en agua
PMA (forbol 12-miristato)	Sigma	P1585	Solución madre: 100 y micro; M en DMSO
strong>Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
Guassia materiales de ensayo
Fosfato disódico (Na2HPO4)	Thermo-Fisher Scientific	S374-500
Glicerol	Thermo-Fisher Scientific	G334
Bromuro de sodio	Thermo-Fisher Scientific	AC44680-1000
EDTA	Thermo-Fisher Scientific	AC44608-5000	Solución madre: 0,5 M pH 8
Tris base	RPI	T60040-1000.0	Solución madre: 1 M pH 8
Ácido ascórbico	Fisher Scientific	AAA1775922	La US7718389 de patentes de EE. UU. sugirió que el ascorbato puede aumentar la estabilidad de la celenterazina.
Na2SO3	Sigma	S0505-250G	Patente de EE. UU. US8367357 sugerido sulfito puede disminuir el fondo debido a BSA
Coelenterazina (nativa)	Nanolight / Prolume	3035MG	Solución madre: 1 mg/ml en MeOH acidificado (2,36 mM)
OptiPlate-96, Microplaca blanca opaca de 96 pocillos	Perkin Elmer	6005290	Cualquier placa blanca opaca de 96 pocillos debería ser suficiente. Las placas inferiores transparentes también funcionarán, sin embargo, se perderá parte de la señal.
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
Equipo
Synergy H1 Lector de placas híbrido o equivalente	BioTek	8041000	Se requiere un lector de placas con detección de luminiscencia y capacidades de placas de 96 pocillos.
Pipeta VOYAGER de 8 canales (50-1250 y micro; L)	Integra	4724	Una pipeta multicanal automatizada es extremadamente útil para la adición rápida de reactivos de luciferasa y celdas de recubrimiento en formato de 96 pocillos
, 8 canales, 200 y micro; Pipeta L	Transferpette S 20-200 µ L	2703710

medio Penicilina inactivada por calor<