Summary
Denne protokollen beskriver hvordan du utfører raske lave kostnader luciferase analyser på middels gjennomstrømning ved hjelp av en insulin-koblet Gaussia luciferase som en proxy for insulin sekresjon fra beta celler. Analysen kan utføres med de fleste luminescence plate lesere og flerkanals pipetter.
Abstract
Utføre antistoff-baserte analyser for utskilles insulin post-sample samling krever vanligvis et par timer til en dag med analysen tid og kan være dyrt, avhengig av den spesifikke analysen. Utskilt luciferase analyser fremskynde resultater og lavere analysen kostnaden per prøve betydelig. Her presenterer vi en relativt underutnyttet tilnærming for å måle insulin sekretoriske aktivitet fra bukspyttkjertel β celler ved hjelp av Gaussia luciferase genetisk inn i C-peptid. Under proteolytiske behandling av proinsulin, C-peptid er excised slippe luciferase innenfor insulin sekretoriske vesicle hvor det er co-utskilt med insulin. Resultatene kan fås i løpet av få minutter etter prøvetaking samling på grunn av hastigheten på luciferase analyser. En begrensning av analysen er at det er en relativ måling av insulin sekresjon og ikke en absolutt kvantifisering. Denne protokollen er imidlertid økonomisk, skalerbar og kan utføres ved hjelp av de fleste standard luminescence plate lesere. Analoge og digitale flerkanals Pipetter forenkler flere trinn av analysen. Mange forskjellige eksperimentelle variasjoner kan testes samtidig. Når et fokusert sett med betingelser avgjøres, bør insulin konsentrasjonen måles direkte ved hjelp av antistoff-baserte analyser med standard kurver for å bekrefte luciferase analyseresultater.
Introduction
Metoden som presenteres her kan insulin sekresjon fra en genetisk modifisert beta cellelinje som skal analyseres raskt og rimelig i 96-brønn-plate-format. Nøkkelen til denne protokollen er en modifisert versjon av insulin med naturlig utskilt Gaussia luciferase (GLuc, ~ 18 KDA) innsatt (se figur 1) i C-peptid for å generere insulin-Gaussia (InsGLuc)1,2. Andre større proteiner, slik som GFP (~ 25 KDA), har blitt satt inn i C-peptid av insulin og utstilt den forventede post-translational behandling fra proinsulin-GFP til insulin og GFP-C-peptid3,4. For analysen i denne protokollen, GLuc har blitt Codon-optimalisert for pattedyr uttrykk og to mutasjoner har blitt innført for å forbedre glød-lignende Kinetics5,6. Flere kombinasjoner og replikerer av behandlings forhold kan lett testes i 96-brønn-plateformat og utskillelsen resultatene kan oppnås umiddelbart etter eksperimentet.
En stor fordel, som tidligere nevnt2, er den lave kostnaden for denne luciferase-baserte sekresjon måling (< $0.01/Well) som skiller den fra de relativt høyere kostnader og tekniske aspektene ved enzym-knyttet immunosorbentanalyse analyser (ELISAs) ( > $2/Well) og homogen tids løst fluorescens (HTRF) eller andre Förster resonans energi overføring (bånd)-basert antistoff (> $1/Well) analyser. I forhold til disse antistoff-baserte analysene, som måler konsentrasjonen av insulin ved å henvise til en standard kurve, måler InsGLuc-analysen sekretoriske aktivitet som en relativ sammenligning for å kontrollere brønner på tallerkenen. Derfor krever hvert eksperiment inkludering av riktige kontroller. Dette skillet er en trade-off for å tillate raske og rimelige målinger. Men, InsGLuc sekresjon har vist å være svært korrelert med insulin sekresjon målt ved Elisa1,2. Denne teknologien har blitt skalert opp for høy gjennomstrømming screening1,2,7 og har ført til identifisering av romanen modulatorer av insulin sekresjon inkludert en spenning-gated kalium kanal inhibitor7 i tillegg til en naturlig produkt hemmer av β-celle funksjon, Chromomycin a28. Bruken av InsGLuc er mest hensiktsmessig for forskere som planlegger å kontinuerlig teste mange forskjellige behandlings forhold for deres innvirkning på insulin sekresjon. I oppfølgingseksperimenter er det nødvendig å gjenta viktige funn i en Parental β-linje, og optimalt i murine eller menneskelige holmer, og måle insulin sekresjon ved hjelp av en antistoff-basert analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utarbeidelse av reagenser, medier og buffere (tabell 1)
- Forbered MIN6 komplette medier i 500 mL høy glukose (4,5 g/L) Dulbecco ' s modifiserte Eagle medium (DMEM) med følgende tilsetningsstoffer: 15% fosterets storfe serum (FBS), 100 enheter/mL penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 292 μg/mL L-glutamin, og 50 μM β-mercaptoethanol.
Merk: den stabile cellelinjen i dette tilfellet opprettholdes i 250 mikrogram/mL G418 antibiotika. - Forbered Krebs-ringer bikarbonat buffer (KRBH) ved å lage en løsning som inneholder 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7,4), 24 mM NaHCO3, 1 mm MgCl2, 2 mm CaCl2, og 1 mg/ml radioimmunoassay-grade storfe serum albumin (BSA). Glukose skal tilsettes der spesifisert fra en 2 M lager.
Merk: KRBH brukes til å ruge cellene med og uten stimulering for å vurdere insulin og/eller Gaussia luciferase sekresjon. - Forbered coelenterazine (CTZ) lagerløsning som følger. Forbered surgjort metanol ved å tilsette 106 μL av konsentrert HCl til 10 mL metanol. Deretter oppløses lyofilisert CTZ i surgjort metanol ved 1 mg/mL og oppbevares ved-80 ° c i skrue-cap-rør.
Merk: disse bestandene beholder tilstrekkelig aktivitet i rutinemessige luciferase analyser, selv etter 1 år med riktig lagring. - Forbered Gaussia luciferase (GLuc) analysen buffer basert på litteraturen9 samt patent informasjon10 til hjelp i halveringstiden av Gaussia luciferase analysen i 96 brønn plateformat. Bruk formelen: 25 mM Tris pH-8, 1 mM EDTA, 5% glyserol, 1 mg/mL na2PO4, 300 mM natrium ascorbate, 200 mm na2så3 i vann. Fryse aksjer ved-20 ° c. Etter tine, Oppbevar bufferen ved 4 ° c.
- For å forberede Gaussia luciferase arbeids løsning, tilsett 4,2 μL/mL av 1 mg/mL (2,36 mM) CTZ lagerløsning til GLuc analysen buffer. Dette resulterer i en 2x arbeids løsning på 10 μM CTZ som vil ha en endelig konsentrasjon på 5 μM i analysen.
2. kultur InsGLuc MIN6 celler og seeding for sekresjon analyser
- Til kultur MIN6 celler, trypsinize og frø cellene en gang per uke ved hjelp av standard cellekultur teknikker. Endre Media på cellene hver to til tre dager. Ta med riktig valg antibiotika, for eksempel 250 μg/mL av G418 i mediet.
- For å gi et tilstrekkelig antall celler ukentlig for eksperimenter, vedlikeholde cellene i T75 flasker. Seeding 6 x 106 celler per T75 i 10 ml medier vil typisk gi 30 x 106 til 40 x 106 celler totalt per T75 etter 7 dager med kultur.
- For å forberede celler for plating i 96-brønn plater, vaske en confluent T75 av InsGLuc MIN6 celler to ganger med PBS og tilsett 2 mL Trypsin. Ruge ved 37 ° c for ~ 5 min eller til cellene distansere fra flasken. Bestem celle konsentrasjonen per milliliter.
- Fortynne cellene i komplette medier til 1 x 106 celler/ml for å resultere i 1 x 105 celler i 100 μL per brønn i en 96-brønn plate. Cellene skal være tilstrekkelig confluent for analysen etter 3 – 4 dager.
Merk: for å forlenge kultur perioden kan halve celle konsentrasjonen være belagt. Media endringer er ikke nødvendig før dagen av analysen med mindre cellene skal utsettes for eksperimentelle behandlinger.
- Fortynne cellene i komplette medier til 1 x 106 celler/ml for å resultere i 1 x 105 celler i 100 μL per brønn i en 96-brønn plate. Cellene skal være tilstrekkelig confluent for analysen etter 3 – 4 dager.
3. glukose-stimulert Gaussia luciferase sekresjon analysen
- På dagen for analysen forberede nok KRBH for eksperimentet (trinn 1,2). Minimum 50 mL KRBH per 96-brønn er nødvendig, og Forbered derfor minst 75 mL for å sikre tilstrekkelig buffer for eksperimentet. Forbered ekstra buffer hvis ulike kombinasjoner av behandlings forhold vil kreve KRBH for fortynning.
- Forbered et reservoar med glukose fri KRBH. Dekanter mediet fra 96-brønn plate (r) ved raskt å invertere platen over en laboratorie vask og deretter blot fast på en stabel med papirhåndklær for å fjerne overflødig medium.
- Bruk enten en elektronisk eller manuell 8-kanals pipette, Pipetter 100 μL/Well KRBH fra reservoaret over 96-brønn platen (e). Gjenta for totalt to vasker.
- (Valgfritt trinn av akutte sammensatte behandlinger) Hvis ikke utfører bedøve handling, gå med skritt 3,5 og 3,6 uten modifisering. For å teste effekten av små molekyler på insulin sekresjon, kan forbindelsene legges til cellene i preinkubering perioden, stimulering periode, eller begge deler.
- En teknikk er å legge forbindelser i batch til KRBH i 1,5 mL rør og bruke en justerbar 8-kanals Digital pipette for å overføre Drug-KRBH fra rørene til celler i 96-brønn plater.
Merk: Hvis en justerbar pipette ikke er tilgjengelig, kan en kopi 96-brønn plate av Drug-KRBH gjøres og en standard 8-kanals pipette kan brukes til å overføre buffer. Ytterligere modifikasjoner til behandling paradigmet kan gjøres for å behandle celler for 24 h i Media før analysen, som tidligere beskrevet1,8.
- En teknikk er å legge forbindelser i batch til KRBH i 1,5 mL rør og bruke en justerbar 8-kanals Digital pipette for å overføre Drug-KRBH fra rørene til celler i 96-brønn plater.
- Tilsett 100 μL av KRBH som inneholder ønsket konsentrasjon av glukose eller forbindelser, og plasser fatet i 37 ° c inkubator for 1 time.
Merk: avhengig av eksperimentell layout, er det svært nyttig å ha en elektronisk flerkanals pipette som gjør overgangen kanalen avstander fra en kolonne på åtte 1,5-mL rør til 8 rader av en 96-brønn plate. - Etter 1 h av preinkubering, Dekanter buffer i vasken og blot fast på papir håndkle. Tilsett 100 μL av glukose frie KRBH per brønn for å vaske bort akkumulert bakgrunn av Gaussia luciferase. Dekanter platen igjen og Legg kontroll og stimulerende forhold til platen på 100 μL per brønn. Plasser parabolen i 37 ° c inkubator for 1 time.
- Samle 50 μL av supernatanten forsiktig ved hjelp av en flerkanals pipette, skiftende tips mellom behandlings forhold etter behov, og Overfør supernatanten til en ren ugjennomsiktig hvit 96-brønn analyse plate.
Merk: klare bunnplater med hvit vegger kan brukes om nødvendig, selv om en betydelig mengde luciferase signal vil gå tapt. - Etter Oppsamling av 50 μL av KRBH supernatanten, kan prøven analyseres umiddelbart. Om nødvendig, forsegle og lagre prøver ved 4 ° c for et par dager (GLuc aktivitet halveringstid ~ 6 dager) eller-20 ° c i opptil en måned11,12.
4. utskilles Gaussia luciferase analysen
- For å forberede GLuc analysen arbeids løsning, pipette den nødvendige mengden CTZ lagerløsning (4,2 μL/mL) i GLuc analysen buffer. For å hindre oppvarming av CTZ, pipette CTZ raskt ved-80 ° c fryser eller holde røret på tørr is.
- Ved hjelp av en elektronisk flerkanals pipette kan du raskt legge til 50 μL av GLuc analysen arbeids løsning per brønn på tvers av 96-parabolen inneholder de innsamlede KRBH supernatanter. Hvis det er noen dråper på sidene av noen brønner, kort spinne platen i en bord-Top swing-bøtte sentrifuger.
- Les luminescence i en passende plate leser i løpet av få minutter og lese hver brønn med en 0,1 s integrasjons tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å måle ytelsen til analysen under kontroll forhold, en enkel glukose dose-respons kurve eller en stimulering ved hjelp av diazoksid paradigmet kan gjennomføres. I tilfelle av det tidligere, pre-incubating cellene for 1 t i glukose-frie forhold etterfulgt av behandling for 1 t med økende glukose konsentrasjoner bør resultere i svært lite sekretoriske aktivitet på og under 5 mM, mens økt sekresjon er observert over 8 mM glukose (figur 2). Stimulering med 35 mM KCl fungerer også som en positiv kontroll for stimulert sekresjon. Inkludering av sekresjon-modulerende medikamenter i løpet av stimulering perioden bør gi den forventede hemming eller potensiering av utskilt GLuc aktivitet (Figur 3). For eksempel binder diazoksid KATP -kanalen og hindrer den fra å lukke ved økt [ATP/ADP] ratio, blokkerer membran depolarization og forebygge sekresjon13. Phorbol estere som para-methoxyamphetamine (PMA) aktivere protein kinase C (PKC) og er kjent forsterkere av insulin sekresjon14. Til slutt aktiverer stimulering med 1 μM adrenalin α2a-adrenerge reseptorer som igjen aktiverer heterotrimeric G-protein kompleks gi, hemme membran depolarization og insulin sekresjon15. Det er viktig å erkjenne at mens MIN6 celler er en udødelig cellelinje, begynner de å miste riktig glukose-indusert insulin sekresjon svar (for eksempel venstre-skiftende av responsen kurve) etter forlenget passaging16. Av denne grunn er det god praksis å rutinemessig kultur alle MIN6 cellelinjer i opptil åtte uker (splitting en gang per uke) før du starter over fra flytende nitrogen aksjer.
Figur 1: beskrivelse av InsGLuc-reporteren. (A) først, en stabil β cellelinje (i dette tilfellet MIN6 celler) ble generert uttrykker insulin-Gaussia transgene fra rotte insulin promoter. (B) det fulle proteinet er syntetisert og pakket i insulin granulat sammen med endogene insulin. Prohormone convertases Cleave peptid, indikert av stjernene. (C) behandlet insulin og Gaussia utskilles og luciferase aktivitet oppdages ved TILSETNING av CTZ i en ATP-uavhengig, oksygen avhengig reaksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: den InsGLuc reporter er en trofast proxy av insulin sekresjon fra MIN6 beta celler. (A) respons av MIN6 InsGLuc celler til økende glukose konsentrasjoner og KCl (35 mm) med Gaussia luciferase sekresjon. Data er gjennomsnittlig fold luciferase aktivitet ± SE sammenlignet med 0 mM glukose forhold for tre uavhengige eksperimenter. *, P < 0,05. Figuren er blitt modifisert med tillatelse fra Kalwat et al. ACS sensorer 20161. © 2016 American Chemical Society. (B) InsGLuc REPORTER i MIN6 celler viser forventet sekretoriske respons på Diazoksid (DZ) paradigmet der 250 μM DZ-behandling holder KATP Channel åpen, blokkerer membran depolarization mindre ekstracellulære KCl (35 mm) er gitt å lokke fram "utløser" kalsium tilstrømningen. Videre tillegg av glukose (20 mM) under DZ + KCl tilstand avslører metabolsk forsterkning av sekresjon som oppstår uten ytterligere økninger i kalsium tilstrømningen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: inkludering av sekresjon-modulerende forbindelser under glukose-stimulerer InsGLuc sekresjon. InsGLuc MIN6 celler belagt i 96-brønn format som beskrevet var preincubated i glukose-fri KRBH for 1 t. celler ble deretter behandlet med eller uten 20 mM glukose i nærvær av dimethyl sulfoxide (DMSO) (0,1%), KCl (35 mM), diazoksid (250 μM), PMA (100 nM), eller adrenalin (1 μM) for 1 h. søylediagram representerer gjennomsnittet ± SE av minst 3 uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Krebs-ringer bikarbonat buffer (KRBH) | |||
| Lagerløsning eller pulver | Lager | Endelig konsentrasjon | 100 mL |
| KCl | 0,25 til 5m | 5 mM av | 2 ml |
| Nacl | 4 M og | 120 mM | 3 ml |
| Hepes, pH 7,4 | 1 M fra | 15 mM | 1,5 ml |
| NaHCO3 | 0,5 til 5m | 24 mM | 4,8 ml |
| MgCl2 | 1 M fra | 1 mM med | 0,1 ml |
| CaCl2 | 1 M fra | 2 mM med | 0,2 ml |
| Vann | H2o | 88,4 ml | |
| RIA-grade BSA | Pulver | 1 mg/mL | 100 mg |
| Gjør friskt på dag med eksperiment. | |||
| Gaussia analysen buffer * | |||
| Lagerløsning eller pulver | Lager | Endelig konsentrasjon | 50 mL |
| Disodium fosfat | Pulver | 0,1% (1 mg/mL) | 50 mg |
| Glyserol | 40 prosent | 5 | 6,25 mL |
| Natrium bromide | Pulver | 150 mM | 772 mg |
| EDTA pH 8 | 0,5 m | 1 mM med | 100 μL |
| Tris-HCl pH 8 | 1M | 25 mM | 1,25 mL |
| Askorbinsyre * | Pulver | 300 mM | 2,64 g |
| Na2SO3** | Pulver | 200 mM | 1,26 g |
| Vann | opptil 50 ml | ||
| Oppbevares i alikvoter ved-20 ° c, Tin en om gangen og hold ved 4 ° c. | |||
| * Modifisert oppskrift fra luft et al. BMC biokjemi 2014, 15:14. | |||
| Surgjort MeOH | |||
| Lagerløsning eller pulver | Lager | Endelig konsentrasjon | 10 mL |
| Metanol | 100 prosent | 10 mL | |
| Hcl | 11,65 til 5m | 1,06 prosent | 0,106 mL |
| Coelenterazine løsning | |||
| Lagerløsning eller pulver | Lager | Endelig konsentrasjon | 1 mL av |
| Coelenterazine | Pulver | 1 mg/mL (2,36 mM) | 1 mg av |
| Surgjort metanol | 1 mL av | ||
| 4,2 μL av lager per 1 mL Gaussia analyse buffer resulterer i 10 μM CTZ som skal brukes som en 2x arbeids løsning. | |||
| For eksempel, tilsett 50 μL av 2x arbeids løsning til 50 μL av KRBH-prøve som inneholder utskilles Gaussia. | |||
Tabell 1: buffer og lager løsnings oppskrifter som brukes til å utføre de presenterte analysene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heri presenterer vi en metode for å raskt vurdere glukose-stimulert insulin sekresjon reaksjoner fra MIN6 β celler. For de beste svarene i analysen er det viktig å frø MIN6 cellene på riktig tetthet og tillate dem å bli 85-95% confluent. Dette forbedrer β Cell responser til glukose på grunn av forbedrede celle-celle-kontakter og synkronisering, som forekommer både iprimær holmer17,18,19,20,21 , så vel som MIN6 cellene16,18. For å hindre tap i sekretoriske respons på glukose stimulering, er det viktig å opprettholde cellene på et så lavt av en passasje som mulig og kultur cellene for bare 6-8 uker før tine et nytt hetteglass fra flytende nitrogen aksjer. Endringer kan gjøres i plating strategien i protokoll Seksjon 2 for å tilpasse seg det tilgjengelige utstyret etter behov. Plating InsGLuc MIN6 celler i 96-brønn plater for sekresjon analyser gir et stort antall brønner for eksperimentell manipulasjoner (inkludert replikerer) samt opprettholde nøyaktigheten av plating i en normal Lab innstilling, som plating i retter med høyere brønn tall krever ofte spesialutstyr som vanligvis er tilgjengelig i screening-kjerner med høy gjennomstrømming.
Gjeldende analyser for insulin sekresjon, annet enn den indirekte luciferase analysen beskrevet her, inkluderer: ELISAs som bruker fargemetrisk readouts (direkte analyse), radioimmunoassays (konkurranse analyse) som bruker radioaktivt readouts, bånd-basert antistoff konkurranse analysen22 og HTRF23 som bruker bånd mellom Dye-koblede antistoffer for å måle INSULIN direkte, og DNA aptamers24. Hver av disse metodene har sine egne fordeler, men generelt er de dyrere og/eller tidkrevende enn en luciferase analysen. En viktig begrensning av InsGLuc analysen er det faktum at selvlysende aktivitet av co-utskilt luciferase er bare en proxy for faktisk insulin sekresjon. I tillegg er det ingen forventet forskjell i luciferase aktivitet mellom Gaussia med fragmenter av C-peptid på sin N-og C-Termini eller Gaussia innenfor proinsulin protein, som Gaussia luciferase har blitt brukt som en kode for å måle utskillelsen av andre proteiner25. Dette fremhever kravet om bekreftelse studier ved hjelp av analyser som måler behandlet insulin spesielt. Alternativer til direkte og indirekte målinger av insulin sekresjon kan også brukes til å vurdere β celle funksjon. En rekke optiske journalister finnes for readouts inkludert ATP: ADP ratio, kalsium tilstrømningen, NAD+/NADH ratio, ekstracellulære signal-regulert KINASER (erk) aktivering, eller syklisk adenosin monofosfat (cAMP) nivåer26.
Den fremtidige anvendelser av InsGLuc spesielt synes å være i høy gjennomstrømming screening. Denne analysen har allerede blitt brukt i en håndfull av publiserte små skjermer1,2 og upubliserte større skjermer er enten fullført7 eller i gang. Utvikling av andre gjentakelser av denne teknologien kan innebære tagging av andre skilles ut Holme hormoner med luciferases for å lette raske målinger, for eksempel for glukagon eller somatostatin. Modifikasjoner kan gjøres i alle fall der cellelinjen er gjenskapt ved hjelp av alternative tilnærminger inkludert CRISPR/Cas9, lentivirus eller transposase-mediert innsetting i en passende beta cellelinje. Ytterligere mulige endringer i den opprinnelige reporteren kan inkludere erstatte alternative utskilt luciferases for Gaussia eller kombinere flere forskjellige utskilles luciferases knyttet til ulike hormoner for en multiplekset analysen. Utover cellekultur, CRISPR/Cas9 teknologi presenterer muligheten for å generere en musemodell der en passende luciferase er banket inn til C-peptid koding regionen av Ins2 i Genova. En slik mus ville være gjennomførbart gitt at transgene mus har blitt opprettet med GFP banket inn i samme C-peptid område27 og ville tillate måling av endogene β celle funksjon med en luciferase analysen in vivo eller ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker alle nåværende og tidligere medlemmer av Cobb laboratoriet for verdifullt arbeid og diskusjoner, og Dionne ware for administrativ bistand. Michael Kalwat er støttet av en juvenil diabetes Research Foundation SRA-2019-702-Q-R. Dette arbeidet ble gjort mulig gjennom NIH R37 DK34128 og Welch Foundation Grant I1243 til Melanie Cobb. Tidlige deler av dette arbeidet ble også støttet av en NIH F32 DK100113 til Michael Kalwat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| rIns-GLuc stable MIN6 cells | Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 4.5 g/L glucose media |
| fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| beta-mercaptoethanol | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| glutamine | Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C. |
| T75 tissue culture flasks | Fisher Scientific | 07-202-000 | |
| 96 well tissue culture plates | Celltreat | 229196 | |
| Reagent reservoirs (50 mL) | Corning | 4870 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secretion assay reagents | |||
| BSA (RIA grade) | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific | 15568414 | |
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional drugs for stimulation experiments | |||
| Diazoxide | Sigma | D9035 | Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added. |
| epinephrine (bitartrate salt) | Sigma | E4375 | Stock solution: 5 mM in water |
| PMA (phorbol 12-myristate) | Sigma | P1585 | Stock solution: 100 µM in DMSO |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guassia assay materials | |||
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| Glycerol | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| Sodium Bromide | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | Stock solution: 0.5 M pH 8 |
| Tris base | RPI | T60040-1000.0 | Stock solution: 1 M pH 8 |
| Ascorbic Acid | Fisher Scientific | AAA1775922 | US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability. |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA |
| Coelenterazine (native) | Nanolight / Prolume | 3035MG | Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM) |
| OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 6005290 | Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent | BioTek | 8041000 | A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required. |
| 8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL) | Integra | 4724 | An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format |
| 8-channel 200 µL pipette | Transferpette S 20-200 µL | 2703710 |
References
- Kalwat, M. A., et al. Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways. ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).
- Burns, S. M., et al. High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function. Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).
- Rajan, S., et al. In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).
- Watkins, S., et al. Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide. Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).
- Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence. Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).
- Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo. Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).
- Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. Burns, S. M., Wagner, B. K., Vetere, A. , WO2018175324A1 (2018).
- Kalwat, M. A., et al. Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells. Journal of General Physiology. , (2018).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15 (1), 14 (2014).
- Ohmiya, Y., Wu, C. Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity. U.S. Patent. , 7,718,389 B2 (2010).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).
- Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
- Henquin, J. C. Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose. Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).
- Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification. Molecular & Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).
- Straub, S. G., Sharp, G. W. Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).
- Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868 (2012).
- Head, W. S., et al. Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious. Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).
- Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet. The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129 (2), 359-370 (2007).
- Jaques, F., et al. Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion. Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).
- Calabrese, A., et al. Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells. Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).
- Bielefeld-Sevigny, M. AlphaLISA immunoassay platform- the "no-wash" high-throughput alternative to ELISA. Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).
- Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles. Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835 (2018).
- Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion. Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).
- Frank, J. A., et al. Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release. Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
