Summary
Ce protocole décrit comment effectuer des essais rapides de luciferase à faible coût à débit moyen à l'aide d'une luciferase Gaussia liée à l'insuline comme un proxy pour la sécrétion d'insuline à partir de cellules bêta. L'analyse peut être effectuée avec la plupart des lecteurs de plaques de luminescence et des pipettes multicanaux.
Abstract
L'exécution d'essais à base d'anticorps pour la collecte d'insuline sécrétée après l'échantillon nécessite généralement quelques heures à un jour de temps d'analyse et peut être coûteux, selon l'analyse spécifique. Les tests de luciferase sécrétés accélèrent les résultats et réduisent considérablement le coût d'analyse par échantillon. Ici nous présentons une approche relativement sous-utilisée pour évaluer l'activité sécrétrice d'insuline des cellules pancréatiques en utilisant la luciferase de Gaussia génétiquement insérée dans le C-peptide. Pendant le traitement protéolytique de la proinsuline, le C-peptide est excisé libérant la luciferase dans la vésicule sécrétrice d'insuline où elle est co-sécrétée avec l'insuline. Les résultats peuvent être obtenus dans les minutes qui suivent la collecte de l'échantillon en raison de la vitesse des tests de luciferase. Une limitation de l'analyse est qu'il s'agit d'une mesure relative de la sécrétion d'insuline et non d'une quantitation absolue. Cependant, ce protocole est économique, évolutif, et peut être exécuté en utilisant la plupart des lecteurs standard de plaque de luminescence. Les pipettes analogiques et numériques multicanaux facilitent plusieurs étapes de l'analyse. De nombreuses variations expérimentales peuvent être testées simultanément. Une fois qu'un ensemble ciblé de conditions sont décidés, les concentrations d'insuline devraient être mesurées directement utilisant des essais basés sur des anticorps avec des courbes standard pour confirmer les résultats d'essai de luciferase.
Introduction
La méthode présentée ici permet de sécrétion d'insuline à partir d'une lignée de cellules bêta génétiquement modifiées pour être évalué rapidement et à un prix abordable dans le format 96-bien-plaque. La clé de ce protocole est une version modifiée de l'insuline avec la luciferase Gaussia naturellement sécrétée (GLuc, 18 kDa) insérée (voir Figure 1) dans le C-peptide pour générer de l'insuline-Gaussia (InsGLuc)1,2. D'autres protéines plus grandes, telles que le GFP (25 kDa), ont été insérées avec succès dans le Peptide C de l'insuline et ont montré le traitement post-traductionnel prévu de la proinsuline-GFP à l'insuline et au GFP-C-peptide3,4. Pour l'astodonte dans ce protocole, GLuc a été codon-optimisé pour l'expression des mammifères et deux mutations ont été introduites pour améliorer la cinétique de lueur-comme5,6. Les combinaisons multiples et les répliques des conditions de traitement peuvent être facilement testées dans le format 96-bien-plaque et les résultats de sécrétion peuvent être obtenus immédiatement après l'expérience.
Un avantage majeur, comme précédemment noté2, est le faible coût de cette mesure de sécrétion à base de luciférase (lt; 0,01 $/puits) qui la différencie des coûts relativement plus élevés et des aspects techniques des essais immunosorbent liés aux enzymes (ELISA) ( 2 $/bien) et la fluorescence homogène résolue dans le temps (HTRF) ou tout autre anticorps à base de résonance de La Furster (FRET) (à partir de 1 $/bien) est à l'étude. Par rapport à ces essais à base d'anticorps, qui mesurent la concentration d'insuline en faisant référence à une courbe standard, l'analyse InsGLuc mesure l'activité sécrétrice comme comparaison relative aux puits de contrôle de la plaque. Pour cette raison, chaque expérience nécessite l'inclusion de contrôles appropriés. Cette distinction est un compromis pour permettre des mesures rapides et peu coûteuses. Cependant, la sécrétion InsGLuc a été démontrée pour être fortement corrélée avec la sécrétion d'insuline telle que mesurée par ELISA1,2. Cette technologie a été mise à l'échelle pour le dépistage à haut débit1,2,7 et a conduit à l'identification de nouveaux modulateurs de la sécrétion d'insuline, y compris un inhibiteur du canal de potassium à rayons de tension7 ainsi qu'un inhibiteur naturel du produit de la fonction cellulaire, la chromomycine A28. L'utilisation d'InsGLuc est plus appropriée pour les chercheurs qui prévoient de tester continuellement de nombreuses conditions de traitement différentes pour leur impact sur la sécrétion d'insuline. Dans les expériences de suivi, il est nécessaire de répéter les résultats clés dans une lignée cellulaire parentale, et de manière optimale dans les îlots murins ou humains, et de mesurer la sécrétion d'insuline à l'aide d'un test à base d'anticorps.
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Protocol
1. Préparation des réactifs, des supports et des tampons (tableau 1)
- Préparer le milieu complet MIN6 dans 500 mL de pénicilline à haute teneur en glucose (4,5 g/L) avec le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec les additifs suivants : 15 % de sérum bovin fœtal (FBS), 100 unités/mL de pénicilline, 100 g/mL de streptomycine, 292 g/mL L-gluta, et 50 m - mercaptoéthanol.
REMARQUE : La ligne stable de cellules dans ce cas est maintenue dans 250 'g/mL de l'antibiotique de G418. - Préparer le tampon de bicarbonate Krebs-Ringer (KRBH) en faisant une solution contenant 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7,4), 24 mM NaHCO3, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, et 1 mg/mL radioimmunoassay-grade bovine serum albumin (BSA). Le glucose doit être ajouté lorsque spécifié à partir d'un stock de 2 M.
REMARQUE : KRBH est employé pour incuber les cellules avec et sans stimulation afin d'évaluer la sécrétion d'insuline et/ou de luciferase de Gaussia. - Préparer la solution d'actions coelenterazine (CTZ) comme suit. Préparer le méthanol acidifié en ajoutant 106 l de HCl concentré à 10 ml de méthanol. Ensuite, dissoudre le CTZ lyophilisé dans du méthanol acidifié à 1 mg/mL et entreposer à -80 oC dans des tubes à bouchon s'acmoment.
REMARQUE : Ces stocks conservent une activité suffisante dans les analyses de luciferase de routine, même après 1 an de stockage approprié. - Préparer Gaussia luciferase (GLuc) tampon d'assay basé sur la littérature9 ainsi que des informations de brevet10 pour aider à la demi-vie de l'assay de luciferase Gaussia dans 96 format de plaque de puits. Utilisez la formule: 25 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA, 5% glycérol, 1 mg/mL Na2PO4, 300 mM d'ascorbate de sodium, 200 mM Na2SO3 dans l'eau. Congeler les stocks à -20 oC. Après la décongélation, entreposer le tampon à 4 oC.
- Pour préparer la solution de travail de la luciferase Gaussia, ajoutez 4,2 L/mL de la solution de stock CTZ de 1 mg/ml (2,36 mm) au tampon d'assay GLuc. Il en résulte une solution de travail 2x de 10 M CTZ qui aura une concentration finale de 5 M dans l'analyse.
2. Culture des cellules InsGLuc MIN6 et ensemencement pour les analyses de sécrétion
- Pour la culture des cellules MIN6, trypsiniser et semer les cellules une fois par semaine en utilisant des techniques standard de culture cellulaire. Changer les médias sur les cellules tous les deux à trois jours. Inclure dans les médias des antibiotiques de sélection appropriés, tels que 250 g/mL de G418.
- Pour fournir un nombre suffisant de cellules par semaine pour des expériences, maintenir les cellules dans les flacons T75. L'ensemencement de 6 x 106 cellules par T75 dans 10 ml de support donnera généralement 30 x 106 à 40 x 106 cellules au total par T75 après 7 jours de culture.
- Pour préparer les cellules pour le placage dans des plaques de 96 puits, lavez un T75 confluent de cellules InsGLuc MIN6 deux fois avec du PBS et ajoutez 2 ml de trypsine. Incuber à 37 oC pendant 5 min ou jusqu'à ce que les cellules se dissocient du flacon. Déterminer la concentration cellulaire par millilitre.
- Diluer les cellules dans un support complet à 1 x 106 cellules/mL pour donner lieu à 1 x 105 cellules dans 100 L par puits dans une plaque de 96 puits. Les cellules doivent être suffisamment confluentes pour l'attaque après 3 à 4 jours.
REMARQUE : Pour prolonger la période de culture, la moitié de la concentration cellulaire peut être plaquée. Les changements médiatiques ne sont pas nécessaires avant le jour de l'élection, sauf si les cellules doivent être soumises à des traitements expérimentaux.
- Diluer les cellules dans un support complet à 1 x 106 cellules/mL pour donner lieu à 1 x 105 cellules dans 100 L par puits dans une plaque de 96 puits. Les cellules doivent être suffisamment confluentes pour l'attaque après 3 à 4 jours.
3. Test de sécrétion de luciférase Gaussia stimulée par le glucose
- Le jour de l'assay préparer suffisamment de KRBH pour l'expérience (étape 1.2). Un minimum de 50 ml de KRBH par plaque de 96 puits est nécessaire, donc préparer au moins 75 ml pour assurer un tampon suffisant pour l'expérience. Préparer tampon supplémentaire si différentes combinaisons de conditions de traitement médicamenteux exigera KRBH pour la dilution.
- Préparer un réservoir avec KRBH sans glucose. Décant le milieu de 96-puits plaque(s) en inversant rapidement la plaque sur un évier de laboratoire, puis bien tachère fermement sur une pile de serviettes en papier pour enlever l'excès de milieu.
- À l'aide d'une pipette électronique ou manuelle à 8 canaux, pipette 100 L /well KRBH du réservoir à travers la plaque de 96 puits.s. Répétez l'opération pour un total de deux lavages.
- (Étape facultative des traitements composés aigus) Si vous n'effectuez pas de traitements médicamenteux, passez par les étapes 3.5 et 3.6 sans modification. Pour tester les effets de petites molécules sur la sécrétion d'insuline, des composés peuvent être ajoutés aux cellules pendant la période de préincubation, la période de stimulation, ou les deux.
- Une technique consiste à ajouter des composés en lot à l'KRBH dans des tubes de 1,5 ml et à utiliser une pipette numérique réglable à 8 canaux pour transférer le médicament-KRBH des tubes aux cellules dans des plaques de 96 puits.
REMARQUE : Si une pipette réglable n'est pas disponible, une réplique de 96 puits de drogue-KRBH peut être faite et une pipette standard à 8 canaux peut être utilisée pour transférer la mémoire tampon. D'autres modifications au paradigme de traitement peuvent être apportées pour traiter les cellules pendant 24 h dans les médias avant l'analyse, comme décrit précédemment1,8.
- Une technique consiste à ajouter des composés en lot à l'KRBH dans des tubes de 1,5 ml et à utiliser une pipette numérique réglable à 8 canaux pour transférer le médicament-KRBH des tubes aux cellules dans des plaques de 96 puits.
- Ajouter 100 l de KRBH contenant la concentration désirée de glucose ou de composés et placer le plat dans l'incubateur de 37 oC pendant 1 h.
REMARQUE : Selon la disposition expérimentale, il est extrêmement utile d'avoir une pipette multicanal électronique qui permet de faire la transition des distances de canal d'une colonne de huit tubes de 1,5 mL aux 8 rangées d'une plaque de 96 puits. - Après le 1 h de préincubation, décanter le tampon dans l'évier et éponger fermement sur du papier essuie-tout. Ajouter 100 l de KRBH sans glucose par puits pour laver le fond accumulé de la luciferase Gaussia. Décant la plaque à nouveau et ajouter le contrôle et les conditions de stimulation à la plaque à 100 L par puits. Placer le plat dans l'incubateur à 37oC pendant 1 h.
- Recueillir soigneusement 50 L de supernatant à l'aide d'une pipette multicanal, en changeant les pointes entre les conditions de traitement au besoin, et transférer le supernatant à une plaque blanche opaque propre 96-bien d'analyse.
REMARQUE : Des plaques à fond clair à parois blanches peuvent être utilisées si nécessaire, bien qu'une quantité importante de signal de luciferase soit perdue. - Après la collecte de 50 L de supernatant KRBH, l'échantillon peut être évalué immédiatement. Si nécessaire, sceller et stocker les échantillons à 4 oC pendant quelques jours (activité GLuc demi-vie de 6 jours) ou -20 oC pour un mois11,12.
4. Assay de luciferase secret de Gaussia
- Pour préparer la solution de travail d'assay GLuc, pipette la quantité requise de solution de stock CTZ (4,2 l/mL) dans le tampon d'aspiration GLuc. Pour éviter le réchauffement de la CTZ, pipette le CTZ rapidement au congélateur de -80 oC ou de garder le tube sur la glace sèche.
- À l'aide d'une pipette multicanal électronique, ajoutez rapidement 50 l de la solution de travail d'analyse GLuc par puits dans le plat de 96 puits contenant les supernatants KRBH collectés. S'il y a des gouttelettes sur les côtés des puits, faites-tourner brièvement la plaque dans une centrifugeuse à seau à balançoire sur table.
- Lisez la luminescence dans un lecteur de plaque approprié en quelques minutes et lisez chaque puits avec un temps d'intégration de 0,1 s.
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Representative Results
Pour évaluer la performance de l'analyse dans des conditions de contrôle, une simple courbe dose-réponse au glucose ou une stimulation utilisant le paradigme du diazoxide peut être complétée. Dans le cas de l'ancien, pré-incubation des cellules pendant 1 h dans des conditions sans glucose suivie par le traitement pendant 1 h avec des concentrations croissantes de glucose devrait avoir comme conséquence très peu d'activité sécrétrice à et au-dessous de 5 mM, alors que la sécrétion accrue est observée au-dessus de 8 mM glucose (Figure 2). La stimulation avec 35 mM KCl sert également de contrôle positif pour la sécrétion stimulée. L'inclusion de médicaments modulation de la sécrétion pendant la période de stimulation devrait donner l'inhibition ou la potentialisation prévue de l'activité Sécrétée de GLuc (figure 3). Par exemple, le diazoxide lie le canal KATP et l'empêche de se fermer sur une augmentation du ratio [ATP/ADP], bloquant la dépolarisation des membranes et empêchant la sécrétion13. Les esters phorbol comme la para-méthoxyamphétamine (PMA) activent la protéine kinase C (PKC) et sont des amplificateurs connus de la sécrétion d'insuline14. Enfin, la stimulation avec 1 M d'épinéphrine active les récepteurs adrénergiques2A-qui à leur tour activent le complexe hétérotrimérique g-protéine Gi, inhibant la dépolarisation membranaire et la sécrétion d'insuline15. Il est important de reconnaître que tandis que les cellules MIN6 sont une lignée cellulaire immortelle, ils commencent à perdre des réponses appropriées de sécrétion d'insuline induite par le glucose (comme le déplacement à gauche de la courbe de réponse) après passage prolongé16. Pour cette raison, il est de bonne pratique de culturer régulièrement toutes les lignées cellulaires MIN6 pendant jusqu'à huit semaines (fractionnement une fois par semaine) avant de recommencer à partir de stocks d'azote liquide.
Figure 1 : Description du journaliste d'InsGLuc. (A) Tout d'abord, une lignée cellulaire stable (dans ce cas-ci les cellules MIN6) a été générée exprimant le transgène insuline-Gaussia du promoteur d'insuline de rat. (B) La protéine complète est synthétisée et emballée dans des granules d'insuline avec de l'insuline endogène. Les convertases prohormonecles censer le peptide, indiquépar par les astérisques. (C) L'insuline traitée et Gaussia sont co-sécrétées et l'activité de luciférase est détectée par l'ajout de CTZ dans une réaction ATP-indépendante, dépendante de l'oxygène. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Le journaliste d'InsGLuc est un fidèle proxy de la sécrétion d'insuline à partir des cellules bêta MIN6. (A) Réponse des cellules InsGLuc MIN6 à l'augmentation des concentrations de glucose et KCl (35 mM) avec la sécrétion de luciferase De Gaussia. Les données sont l'activité moyenne de luciferase de pli - SE comparée aux conditions de glucose de 0 mM pour trois expériences indépendantes. P lt; 0,05. Le chiffre a été modifié avec la permission de Kalwat et coll. ACS Sensors 20161. © 2016 American Chemical Society. (B) Le journaliste d'InsGLuc dans les cellules MIN6 montre la réponse sécrétrice attendue au paradigme du diazoxide (Dz) où 250 M Dz traitement détient le canal KATP ouvert, bloquant la dépolarisation de la membrane à moins que KCl extracellulaire (35 mM) est fourni pour susciter l'afflux de calcium « déclenchant ». L'ajout supplémentaire de glucose (20 mM) sous l'état de Dz et KCl indique l'amplification métabolique de la sécrétion qui se produit sans d'autres augmentations de l'afflux de calcium. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Inclusion de composés modulation sécrétion pendant la sécrétion InsGLuc de glucose-stimule. InsGLuc MIN6 cellules plaquées dans le format 96-bien tel que décrit ont été préincubtés dans KRBH sans glucose pendant 1 h. Les cellules ont ensuite été traitées avec ou sans 20 mM de glucose en présence de sulfoxure de diméthyle (DMSO) (0,1 %), KCl (35 mM), diazoxide (250 M), PMA (100 nM), ou L'épinéphrine (1 M) pour 1 h. Le graphique à barres représente la moyenne d'au moins 3 expériences indépendantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Tampon de bicarbonate Krebs-Ringer (KRBH) | |||
| Solution de stock ou poudre | stock | Concentration finale | 100 ml |
| Kcl | 0,25 M | 5 mM | 2 ml |
| Nacl | 4 M | 120 mm | 3 ml |
| Hepes, pH 7,4 | 1 M | 15 mM | 1,5 ml |
| NaHCO3 Annonces | 0,5 M | 24 mM | 4,8 ml |
| MgCl2 | 1 M | 1 mM | 0,1 ml |
| CaCl2 (en) | 1 M | 2 mM | 0,2 ml |
| eau | H2o | 88,4 ml | |
| BSA de catégorie RIA | poudre | 1 mg/ml | 100 mg |
| Faire frais le jour de l'expérience. | |||
| Gaussia Assay Buffer | |||
| Solution de stock ou poudre | stock | Concentration finale | 50 ml |
| Phosphate de disodium | poudre | 0,1 % (1 mg/mL) | 50 mg |
| Glycérol | 40% | 5% | 6,25 ml |
| Bromure de sodium | poudre | 150 mm | 772 mg |
| EDTA pH 8 | 0,5 M | 1 mM | 100 l |
| Tris-HCl pH 8 | 1M | 25 mM | 1,25 ml |
| Acide ascorbique | poudre | 300 mm | 2,64 g |
| Na2SO3 | poudre | 200 mm | 1,26 g |
| eau | jusqu'à 50mL | ||
| Conserver dans les aliquots à -20 oC, décongeler un à la fois et conserver à 4 oC. | |||
| Recette modifiée de Luft et coll. BMC Biochemistry 2014, 15:14. | |||
| MeOH acidifié | |||
| Solution de stock ou poudre | stock | Concentration finale | 10 ml |
| Méthanol | 100% | 10 ml | |
| Hcl | 11,65 M | 1,06 % | 0,106 ml |
| Solution Coelenterazine | |||
| Solution de stock ou poudre | stock | Concentration finale | 1 mL |
| Coelenterazine Coelenterazine | poudre | 1 mg/ml (2,36 mm) | 1 mg |
| Méthanol acidifié | 1 mL | ||
| 4,2 L de stock par 1 ml de Gaussia Assay Buffer donne 10 M CTZ à utiliser comme solution de travail 2x. | |||
| Par exemple, ajoutez 50 l de solution de travail 2x à 50 'L d'échantillon KRBH contenant Gaussia sécrété. | |||
Tableau 1 : Recettes de tampons et de solutions de stock utilisées pour effectuer les essais présentés.
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Discussion
Ici nous présentons une méthode pour évaluer rapidement les réponses de sécrétion d'insuline glucose-stimulées des cellules de MIN6. Pour les meilleures réponses dans l'essai, il est important de semer les cellules MIN6 à la densité appropriée et leur permettre de devenir 85-95% confluent. Cela améliore les réponses cellulaires au glucose en raison de l'amélioration des contacts cellulaires et de la synchronisation, qui se produit à la fois dans les îlots primaires17,18,19,20,21 ainsi que MIN6 cellules16,18. Pour éviter les pertes dans la réponse sécrétrice à la stimulation de glucose, il est important de maintenir les cellules à aussi bas d'un passage que possible et la culture des cellules pendant seulement 6-8 semaines avant de décongeler une nouvelle fiole des stocks d'azote liquide. Des modifications peuvent être apportées à la stratégie de placage dans la section 2 du protocole pour s'adapter à l'équipement disponible au besoin. Le plaquage des cellules InsGLuc MIN6 dans des plaques de 96 puits pour les essais de sécrétion permet un grand nombre de puits pour les manipulations expérimentales (y compris les répliques) ainsi que le maintien de la précision du placage dans un cadre de laboratoire normal, comme le placage dans les plats avec un puits plus élevé les nombres exigent souvent l'équipement spécial habituellement disponible dans les coeurs de criblage à haut débit.
Les essais actuels pour la sécrétion d'insuline, autres que l'analyse indirecte de la luciferase décrite ici, comprennent : les ELISA qui utilisent des réadmissions coloriométriques (analyse directe), des radioimmunoassays (test de compétition) qui utilisent des réadmissions radioactives, des anticorps à base de FRET l'analyse de la concurrence22 et HTRF23 qui utilise FRET entre les anticorps liés à la teinture pour mesurer l'insuline directement, et les aptamers de l'ADN24. Chacune de ces méthodes a ses propres avantages, mais en général elles sont plus coûteuses et/ou longues qu'un analyse de luciferase. Une limitation clé de l'assay InsGLuc est le fait que l'activité luminescente de la luciferase co-sécrétée n'est qu'un proxy pour la sécrétion d'insuline réelle. En outre, il n'y a aucune différence prévue dans l'activité de luciferase entre Gaussia avec des fragments de C-peptide sur son N- et C-termini ou Gaussia dans la protéine de proinsuline, comme Gaussia luciferase a été avec succès employé comme étiquette pour mesurer la sécrétion de d'autres protéines25. Cela met en évidence l'exigence d'études de confirmation utilisant des essais qui mesurent spécifiquement l'insuline traitée. Des solutions de rechange aux mesures directes et indirectes de la sécrétion d'insuline peuvent également être utilisées pour évaluer la fonction cellulaire. Une variété de journalistes optiques existent pour les réreads,y compris le ratio ATP:ADP, l'afflux de calcium, le ratio NAD /NADH, l'activation extracellulaire des kinases (ERK) réglementées par le signal (ERK) ou les niveaux cycliques de monophosphate d'adénosine (cAMP)26.
Les applications futures d'InsGLuc en particulier semblent être dans le dépistage à haut débit. Cet exemple a déjà été utilisé dans une poignée de petits écrans publiés1,2 et les écrans plus grands non publiés sont soit terminés7 ou en cours. Le développement d'autres itérations de cette technologie peut impliquer le marquage d'autres hormones d'îcles sécrétées avec des luciferases pour faciliter des mesures rapides, telles que pour le glucagon ou la somatostatine. Des modifications pourraient être apportées dans tous les cas où la lignée cellulaire est recréée à l'aide d'approches alternatives, y compris CRISPR/Cas9, lentivirus, ou transposase-négociée insertion dans n'importe quelle ligne de cellules bêta appropriée. D'autres modifications possibles au journaliste original peuvent inclure la substitution de luciferases sécrétées alternatives pour Gaussia ou la combinaison de plusieurs luciferases sécrétées différentes liées à différentes hormones pour un jeu d'âne multiplexé. Au-delà de la culture cellulaire, la technologie CRISPR/Cas9 présente la possibilité de générer un modèle de souris où une luciferase appropriée est intégrée à la région de codage C-peptide d'Ins2 dans le génome. Une telle souris serait faisable étant donné que des souris transgéniques ont été créées avec GFP frappé dans le même site de C-peptide27 et permettrait la mesure de la fonction cellulaire endogène avec un résultat de luciferase in vivo ou ex vivo.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient tous les membres actuels et anciens du laboratoire Cobb pour leur travail et leurs discussions précieux, et Dionne Ware pour son aide administrative. Michael Kalwat est soutenu par une Fondation de recherche sur le diabète juvénile SRA-2019-702-Q-R. Ce travail a été rendu possible grâce à NIH R37 DK34128 et Welch Foundation Grant I1243 à Melanie Cobb. Les premières parties de ce travail ont également été soutenues par un NIH F32 DK100113 à Michael Kalwat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| rIns-GLuc stable MIN6 cells | Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 4.5 g/L glucose media |
| fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| beta-mercaptoethanol | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| glutamine | Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C. |
| T75 tissue culture flasks | Fisher Scientific | 07-202-000 | |
| 96 well tissue culture plates | Celltreat | 229196 | |
| Reagent reservoirs (50 mL) | Corning | 4870 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secretion assay reagents | |||
| BSA (RIA grade) | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific | 15568414 | |
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional drugs for stimulation experiments | |||
| Diazoxide | Sigma | D9035 | Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added. |
| epinephrine (bitartrate salt) | Sigma | E4375 | Stock solution: 5 mM in water |
| PMA (phorbol 12-myristate) | Sigma | P1585 | Stock solution: 100 µM in DMSO |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guassia assay materials | |||
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| Glycerol | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| Sodium Bromide | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | Stock solution: 0.5 M pH 8 |
| Tris base | RPI | T60040-1000.0 | Stock solution: 1 M pH 8 |
| Ascorbic Acid | Fisher Scientific | AAA1775922 | US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability. |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA |
| Coelenterazine (native) | Nanolight / Prolume | 3035MG | Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM) |
| OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 6005290 | Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent | BioTek | 8041000 | A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required. |
| 8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL) | Integra | 4724 | An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format |
| 8-channel 200 µL pipette | Transferpette S 20-200 µL | 2703710 |
References
- Kalwat, M. A., et al. Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways. ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).
- Burns, S. M., et al. High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function. Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).
- Rajan, S., et al. In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).
- Watkins, S., et al. Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide. Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).
- Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence. Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).
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