Summary
Здесь мы представляем протокол иммуногистохимического теста для обнаружения антигена вируса бешенства в качестве альтернативного диагностического теста для тканей, фиксированных формалином.
Abstract
Одним из основных диагностических методов борьбы с бешенством является обнаружение вирусного рибонуклеопротеинового (RNP) комплекса (антигена) в инфицированных образцах тканей. В то время как тест на прямые флуоресцентные антитела (DFA) или прямой экспресс-иммуногистохимический тест (DRIT) чаще всего используются для обнаружения антигена, оба теста требуют свежих и / или замороженных тканей для отпечатков на слайдах до обнаружения антигена с использованием антител. Если образцы собраны и зафиксированы в формалине, ни один из тестов не является оптимальным для обнаружения антигена, однако тестирование может быть выполнено с помощью обычной иммуногистохимии (IHC) после встраивания в парафиновые блоки и секционирования. При этом методе IHC ткани окрашивают антирабильскими антителами, срезы депарафинизируют, антиген извлекают частичным протеолизом или другими методами и инкубируют с первичными и вторичными антителами. Антигены окрашивают пероксидазой хрена/аминоэтилкарбазолом и контрапятнистами гематоксилином для визуализации с помощью светового микроскопа. В дополнение к обнаружению специфического антигена, фиксация формалина предлагает другие преимущества, такие как определение гистологических изменений, расслабленные условия хранения и транспортировки образцов (при температуре окружающей среды), возможность тестирования ретроспективных случаев и повышение биологической безопасности за счет инактивации инфекционных агентов.
Introduction
Бешенство – острый прогрессирующий энцефалит, вызываемый отрицательным чувством РНК-вирусов, относящихся к роду lyssavirus1. Почти 99% всех человеческих смертей, вызванных инфекцией вирусом бешенства (RABV), типовым членом рода, передается собаками2. Диагностика бешенства подозреваемых животных основывается на обнаружении антигена (в первую очередь вируснокодируемого нуклеопротеина, N-белка) в комплексе с геномной РНК (рибонуклеопротеиновый комплекс, RNP) в ткани головного мозга3. Обнаружение антигена с помощью теста на прямые флуоресцентные антитела (DFA) считается золотым стандартом для диагностики бешенства4. Способ использует свежий или свежезамороженный материал мозга, сенсорное оттиск на слайде, фиксацию в ацетоне, окрашивание с использованием коммерчески доступного флуоресцентного изотиоцианата (FITC), меченого моноклональными или поликлональными антителами (mAbs/pAbs) и считываемого флуоресцентной микроскопией5. Тест DFA является быстрым, чувствительным и специфическим для обнаружения антигена бешенства в свежей ткани мозга. Недавно было продемонстрировано, что прямой экспресс-иммуногистохимический тест (DRIT), модифицированный метод иммуногистохимии (IHC), демонстрирует аналогичную чувствительность к DFA, но предлагает преимущество световой микроскопии для визуализации6. Хотя метод обнаружения, используемый в DRIT, аналогичен IHC, на начальном этапе используются свежие или замороженные ткани для создания сенсорных отпечатков образца с последующей фиксацией в формалине.
IHC является широко используемым методом для определения гистологических изменений и обнаружения белков с использованием специфических антител в формалин-фиксированных тканях, встроенных в парафиновые блоки. IHC является установленным альтернативным тестом для обнаружения антигена бешенства в тканевых секциях7. IHC был особенно использован для диагностики ретроспективных случаев, в течение которого проявились неврологические заболевания, для определения бремени бешенства8. Парафин-внедренные формалин-фиксированные ткани сохраняют белки для обнаружения даже через несколько лет при хранении при температуре окружающей среды9. Лечение формалином модифицирует белки путем сшивания и изменения боковых цепей аминокислот, что может привести к тому, что эпитопы больше не будут реагировать против антител10. В то время как тест IHC для обнаружения антигена бешенства включает либо mAbs, либо pAbs, последний является выгодным, поскольку можно обнаружить несколько эпитопов и расходящихся лиссавирусов11.
Стандартными этапами, участвующими в IHC, являются фиксация тканей формалином, встраивание в парафиновые блоки, сечение тканей, депарафинизация и гидратация, восстановление эпитопов, реактивность против первичных и вторичных антител и развитие с использованием хромогенных субстратов. В этой рукописи подробно описан протокол диагностики бешенства. Для обнаружения антигена бешенства используется сыворотка мыши, иммунизированная RABV (pAbs), полученная в Центрах США по контролю и профилактике заболеваний (CDC) Атланты, штат Джорджия, в сочетании с биотинилированными антимышечные вторичными антителами. Биотинилированные АБС обнаруживаются добавлением комплекса стрептавидин-пероксидазы хрена (HRP) с последующим развитием цвета с аминоэтилкарбазоловым субстратом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
В то время как протокол IHC был выполнен на формалин-фиксированных тканях, которые инактивируют RABV, если они присутствуют, соответствующие протоколы биобезопасности должны соблюдаться должным образом. Все процедуры биобезопасности описаны в 5-м издании (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm) «Биобезопасность в микробиологических и биомедицинских лабораториях» (BMBL), включая ношение надлежащих средств индивидуальной защиты (СИЗ) и требования к вакцинации, как описано12. Кроме того, следует соблюдать надлежащую локализацию и обращение с опасными химическими веществами (такими как формалин, AEC и ксилол) (например, вытяжные вытяжки).
1. Формалиновая фиксация тканей
- Поместите 3-5 мм тканей головного мозга, собранных после некропсии13, в 10% фосфатный буферный раствор формалина (соотношение от 1:20 до 1:50 ткани/формалин) в течение 24-72 ч.
ВНИМАНИЕ: Формалин является токсичным фиксатором. - Запишите приблизительный вес (размер) ткани, тип ткани (области мозга) и объем формалина. Для лабораторий важно документировать и вести учет времени фиксации.
- Для более длительного хранения тканей после фиксации формалина и перед обработкой поместите ткань в 70% этанол.
2. Обработка тканей
- После фиксации образца рассекните ткань, чтобы включить важные области мозга, например, поперечные сечения ствола мозга, мозжечок (3 доли) или гиппокамп (оба гиппокампа), каждый из которых разрезается толщиной от 3 до 5 мм и помещается в кассеты обработки.
- Обработать тканевые кассеты для инфильтрации парафинового воска, встроенные в парафиновые блоки и секционированные (от 3 до 6 мкм) на микротоме.
3. Приготовление материалов / Окрашивание посуды
- Установите окрашивание посуды14 (Таблица материалов),как показано на рисунке 1. Наполните каждое блюдо 250 мл раствора.
- Приготовление раствора субстрата 3-Амино-9-этилкарбизола (AEC)
- Растворите одну таблетку 20 мг 3-амино 9-этилкарбазола (AEC) в 5 мл N,N, диметилформамида с помощью стеклянной пипетки.
ВНИМАНИЕ: AEC является канцерогеном.
- Растворите одну таблетку 20 мг 3-амино 9-этилкарбазола (AEC) в 5 мл N,N, диметилформамида с помощью стеклянной пипетки.
- Приготовление раствора протеазы (например, Проназы) для извлечения антигена
- Растворить 7 мг протеазы в 200 мл PBS.
- Подготовка промывного буфера PBS-T
- Добавьте от 10 мл Tween 80 до 990 мл PBS. Хорошо перемешать, чтобы образовался однородный раствор.
4. Депараффинизация и регидратация тканей
- Сделайте парафиновое сечение 5 мкм с помощью микротома, вынесите его на водяную баню при 38 °C и соберите на стеклянные горки. Пометьте слайды устойчивой к реагентам ручкой/маркером.
- Поместите горки на лоток и расплавите в духовке с температурой 55-60 °C в течение 1 ч. Не поднимайте температуру выше 60 °C, так как это может уничтожить вирусный антиген.
- Достаньте горки из духовки и сразу же депарафинизируйте в 3 последовательных ксилоловых ополаскивающих по 5 мин каждая в посуде 1, 2 и 3.
- Регидратация секций на слайде путем последовательных погружений в уменьшающееся разбавление этанола в деионизированную воду: (с 4 по 11 - ополаскиватель) посуда 4: ксилол/100% этанол (1:1); блюдо 5: 100% этанол; блюдо 6: 100% этанол; блюдо 7: 95% этанол; блюдо 8: 95% этанол; блюдо 9: 80% этанол; блюдо 10: 70% этанол; блюдо 11: деионизированная вода(рисунок 1. Установка посуды).
ВНИМАНИЕ: Ксилол является опасным химическим веществом, и работа должна проводиться в вытяжном вытяжке.
5. Извлечение протеолитического антигена
- Обрабатывайте слайды протеазой (2,5 мкг/мл PBS) в течение 30 минут для извлечения протеолитического антигена в чашке 12.
- Затем промыть в PBS-T в течение 10 мин (блюдо 13).
- Обработать 3% перекисью водорода в течение 10 мин (блюдо 14).
- Снова вымойте PBS-T в течение 10 минут (посуда 15).
6. Процедура окрашивания
- Обрабатывайте слайды по одному, удерживая оставшиеся слайды погруженными в буфер (не снимайте весь держатель слайдов - держите слайды влажными). Удалите один слайд и смойте лишний буфер (с помощью бумажного полотенца) вокруг участка ткани, стараясь не нарушить участок ткани. Инкубировать горки в влагообойной камере, изготовленной путем размещения увлажненные бумажные полотенца, на лабораторной столешницы14 при комнатной температуре с обычной козьей сывороткой (блокировкой) в течение 15 мин.
- Инкубировать с оптимальным заранее определенным разведением первичных антирабических антител (1:250 разведение мышиной антирабической сыворотки, неопубликованное) (положительный контроль) и отрицательных контрольных антител при комнатной температуре, аналогичной приведенной выше (этап 6.1.) в течение 60 мин без промывок между ними.
- Через 60 мин вымыть С ПБС-Т в течение 10 мин (блюдо 16).
- Инкубировать с биотинилированным антителом (видоспецифичным) в камере влажности при комнатной температуре в течение 15 мин (обработка такая же, как и на этапе 6.1.).
- Вымойте PBS-T в течение 10 мин (посуда 16).
- Инкубировать с комплексом Стрептавидин-HRP во влагообрабатываемой камере при комнатной температуре в течение 15 мин (обработка такая же, как 6.1.).
- Вымойте PBS-T в течение 10 мин (посуда 16).
- Инкубировать с пероксидазным субстратом, аминоэтилкарбазолом (AEC), в камере влажности при комнатной температуре в течение 10 мин. Сделайте AEC непосредственно перед использованием. Для этого добавьте 1 мл раствора AEC к 14 мл ацетатного буфера 0,1M, рН 5,2. Добавьте 0,15 мл 3% H2O2. Процедить смесь непосредственно перед использованием (фильтр 0,45 мкм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий раствор AEC стабилен только в течение 2-3 ч. Раствор AEC можно хранить в холодильнике в течение более длительных периодов времени. - Мыть в деионизированной воде 10 мин (посуда 17)
- Разбавленный гематоксилином Гилла 1:2 деионизированной водой в течение 2 мин (блюдо 18).
- Смойте избыток гематоксилина деионизированным водяным ополаскиваемым (блюда 19 и 20).
- Смойте в scott's Tap water 30 s (раствор для румян) посуды 21.
- Мыть в деионизированной воде 10 мин (посуда 22)
- Снимайте горки по одной - монтируем водорастворимой монтажной средой.
- Читайте слайды на световом микроскопе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 2 демонстрирует репрезентативные результаты окрашивания IHC положительных и отрицательных контрольных образцов в различных протестированных тканях мозга. Рисунки 2A,D,G представляют положительные образцы в 200x, в то время как Рисунок 2B,E,H соответствует 400-кратному увеличению, соответственно. Рисунок 2А-С соответствуют стволу мозга; Рисунок 2D-F соответствуют клеткам мозжечка и Пуркинье; и рисунок 2G-I соответствуют гиппокампу. Рисунок 2C,F,I являются отрицательными контрольными образцами. Пурпурно-красное окрашивание демонстрирует развитие цвета с использованием субстрата AEC на синем фоне (Гематоксилин контрокрашен) за счет реакционной способности антител против антигена бешенства. AEC представляет собой пероксидазный субстрат, который при реакции окисления, катализируемой HRP, приводит к нерастворимому в воде осадку, наблюдаемому под световым микроскопом.
Положительный результат при IHC соответствует пурпурно-красному окрашиванию в срезах тканей. Окрашивание цитоплазматических включений и зернистых включений различного размера свидетельствует о положительных образцах на RABV-инфекции. Образцы считаются отрицательными, если не наблюдалось специфического красного окрашивания или только синий фон из-за гематоксилина. В дополнение к положительному окрашиванию, распределение включений может обеспечить косвенную количественную оценку уровней антигена бешенства в образце, что может соответствовать вирусной нагрузке образцов тканей. Независимо от уровней распределения, любое конкретное окрашивание будет классифицировать образец как положительный для обнаружения антигена RABV.
Рисунок 1: Блок-схема, показывающая различные этапы тестирования IHC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Иммуногистохимическое окрашивание положительной и отрицательной бешеной мозговой ткани. (A)Интрацитоплазматические вирусные включения и обнаружение антигена вируса бешенства в стволе мозга в 200 раз больше общего увеличения; (B)положительный ствол мозга 400x; (C)отрицательный контроль ствола мозга 200x; (D)включения вируса бешенства в мозжечок 200x; (E)клетки мозжечка и Пуркинье 400x; (F)мозжечок отрицательный контроль; (G)Вирусные включения в гиппокампе 200x; (H)гиппокамп 400x; гиппокамп отрицательный контроль 200х. Красное пятно указывает на наличие антигена вируса бешенства методом комплексного окрашивания Стрептавидин-биотин (субстрат AEC). Гематоксилин контрокрастин (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Из-за высокого уровня смертности от бешенства после появления симптомов диагностика подозреваемых животных на инфекцию RABV чрезвычайно важна для соответствующего постэкспозиционного профилактического лечения. Диагностика бешенства в первую очередь зависит от методов DFA, DRIT и ПЦР с использованием свежих или замороженных тканей. Для тестирования закрепленных формалином тканей тест IHC предоставляет альтернативный метод чувствительного и специфического обнаружения антигена RABV. В то время как ткани, зафиксированные в формалине, имеют белки, стабилизированные из-за модификации боковых цепей, таких как сшивки, образцы должны быть обработаны до обнаружения антигена. В этом протоколе эпитопы были восстановлены путем частичного протеолитического переваривания протеазой (например, проназой), чтобы обеспечить связывание первичных антител с комплексом RNP. В то время как mAbs, реактивные против N-белка, преимущественно полагаются на DFA и DRIT, pAbs, которые являются реактивными против нескольких эпитопов на N-белке, были бы предпочтительны для теста IHC. Кроме того, реактивность или pAbs могут быть более широкими по отношению к различным вариантам RABV и против лиссавирусов, не являющихся бешенством, по сравнению с mAbs.
Одним из основных ограничений теста IHC является то, что протокол включает в себя несколько последовательных шагов и занимает около 6 часов для завершения. Если ткань должна быть зафиксирована в формалине и внедрена в парафиновые блоки, требуется дополнительно 1 - 2 дня, прежде чем ткань может быть окрашена. Другим ограничением является отсутствие коммерческих первичных антител против бешенства для теста IHC. Тем не менее, IHC предоставляет возможность для диагностики бешенства, когда для тестирования доступны только ткани FF. Тест IHC особенно важен для тестирования случаев бешенства, если одна половина тканей хранится в формалине (и других нефиксированных тканях, протестированных DFA), и необходимо проверить полное поперечное сечение ствола мозга и других тканей, как это требуется для диагностики. Обнаружение антигена бешенства с помощью теста IHC может быть использовано для посмертных образцов мозга человека для диагностики и / или ретроспективного анализа подозрительных случаев на основе клинических симптомов. Хотя IHC не был одобрен в качестве первичного или подтверждающего теста для диагностики бешенства, такого как DFA, метод обнаруживает антиген с использованием специфических антител к бешенстве. Сравнение DFA с использованием свежих/замороженных тканей и FF обеспечило аналогичную чувствительность испецифичность 15. Если антитела непосредственно не конъюгированы с FITC (требование для теста DFA), меченые HRP антитела могут использоваться в IHC для окрашивания антигена бешенства. Преимуществом обнаружения на основе HRP является возможность использования светового микроскопа для наблюдения. Современные коммерчески доступные реагенты DFA, FITC конъюгированные антитела к бешенство (mAbs) не обнаруживают антиген после фиксации формалина из-за модификации эпитопов. Однако, если FITC конъюгированный бешенство специфические pAbs доступны, его можно использовать в качестве метода окрашивания, как рекомендовано Всемирной организацией здравоохранения16. В дополнение к обнаружению антигена, ткани FF могут быть подвергнуты выделению РНК с последующим ПЦР и секвенированием с использованием специфических праймеров для подтверждения наличия геномной РНК RABV.
К другим преимуществам формалин-фиксированных тканей можно отнести определение гистологических изменений методом окрашивания гематоксилином и эозином. В то время как лечение формалином сохраняет белок, оно полностью инактивирует большинство патогенов в образце из-за обширного сшивания белков и деградации или модификации нуклеиновых кислот. Таким образом, метод повышает безопасность обработки, транспортировки и тестирования биологических образцов по сравнению с DFA. Этап фиксации ацетона в DFA не инактивирует RABV и должен обрабатываться с помощью соответствующих PPE17. Образцы после фиксации формалина стабильны и могут храниться при температуре окружающей среды, что подходит для малоресурсных зон, где доступ к холодному хранилищу ограничен. Аналогичным образом, парафин-внедренные формалин-фиксированные ткани могут рассматриваться для длительного хранения при температуре окружающей среды без потери реакционной способности антител против белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим лаборантов, эпидемиологов и филиалы департаментов общественного здравоохранения за представление образцов в Центры по контролю и профилактике заболеваний. Выводы и заключения в этом докладе являются выводами авторов и не обязательно отражают официальную позицию Центров по контролю и профилактике заболеваний. Использование фирменных наименований и коммерческих источников предназначено только для идентификации и не подразумевает одобрения со стороны Центров по контролю и профилактике заболеваний.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging - microscope | Multiple vendors |
References
- Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184 (2017).
- Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
- Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
- WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1 (2018).
- Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
- Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
- Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
- Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
- Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
- Manning, S. E., et al. Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
- WHO. Laboratory techniques in rabies. 1, 5th ed, 67-72 (2018).
- Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
- WHO. Diagnostic procedures for antigen detection. , https://www.who.int/rabies/about/antigendetection/en (2016).
- Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).
