Summary
פרוטוקול זה מתאר את השימוש בmacromolecular הצפיפות כדי ליצור מודל מחוץ לגוף האדם יפרטרופית רקמת צלקת הדומה בתנאים vivo. כאשר מעובדים בסביבה macromolecular צפופה, העור האנושי לגידולים התערוכה פנוטיפים, ביוכימיה, פיזיולוגיה, ופונקציונלי מאפיינים דומים רקמת צלקת.
Abstract
זה הוכח כי ברקמות vivo הם צפופים מאוד על ידי חלבונים, חומצות גרעין, מבריאוציצירופנים, פוליסכרידים, וכו '. הפרוטוקול הבא מחיל את טכניקת הצפיפות הmacromolecular (MMC) כדי לחקות את הצפיפות הפיזיולוגית הזו באמצעות הוספת פולימרים ניטרליים (קרוקודרים) לתרביות תאים בתוך מבחנה. מחקרים קודמים באמצעות ficoll או תוספי כמו הקרודרים להפגין כי הביטוי של קולגן אני ו fibronectin ב WI38 ו-WS-1 קווי התא משופרים באופן משמעותי באמצעות הטכניקה MMC. עם זאת, טכניקה זו לא אומתה יפרטרופית העיקרי צלקת-הנגזר העור האדם פיברוהפיצוצים (hHSFs). כמו צלקות יפרטרופית נובע התצהיר מוגזם של קולגן, פרוטוקול זה שואפת לבנות קולגן עשיר במודל צלקת יפרטרופית מתורבת על ידי החלת הטכניקה MMC עם hHSFs. מודל זה ממוטב MMC הוכח להיות בעל דמיון רב יותר עם רקמת צלקת vivo בהשוואה למערכות מסורתיות דו-ממדי (2-D) מערכות תרבות התא. כמו-כן, הוא חסכוני, חסכוני בזמן, ורצוי מבחינה אתית בהשוואה למודלים חייתיים. לפיכך, המודל הממוטב המדווח כאן מציע מודל "בvivo" מתקדם למחקרים יפרטרופית הקשורים לצלקת.
Introduction
רקמת צלקת מייצגת את נקודת הקצה של תיקון רקמות. עם זאת, אנשים רבים, במיוחד אלה הסובלים כוויות או טראומה1, הצטלקות יכולה להיות מוגזמת ולהטיל השפעות לא רצויות על מורפולוגיה ותפקוד של העור נרפא. למרות המנגנון המדויק של פתולוגי (צלקות יפרטרופית ו keloids) היווצרות צלקת לא מובנים לחלוטין, הפקדת מוגזמת של קולגן במהלך ריפוי הפצע הוכח להיות תרומה חיונית2.
הוא מבוסס היטב כי שינוי גורם הצמיחה ביתא 1 (tgf-β1) ו אלפא שריר חלק שרירים אקטין (αSMA) לשחק תפקידי מפתח בהיווצרות של יפרטרופית צלקות. הראיות מצביעות על כך מוגבה TGF-β1 ישירות מעוררת הפקדת מוגזמת של קולגן באמצעות ויסות SMAD איתות מסלול3. בנוסף, αSMA נמצא לתרום היווצרות צלקת יפרטרופית על ידי ויסות התכווצות התא והאפיתל בתהליך ריפוי הפצע4. היעדר מתאים בתוך מבחנה ומודלים vivo הוא מכשול גדול כלפי פיתוח והערכת התערבויות וטיפולים לשיקום צלקת. מטרת מחקר זה היא לנצל את הטכניקה הקיימת של MMC כדי לבנות "בvivo כמו" יפרטרופית צלקת מודל המתאים להערכת הרומן המתעוררים צלקת התערבויות הקשורות.
שחזור רקמות החיים מחוץ לגוף היה מטרה במשך שנים בקהילה המדעית. התפתחות בטכניקות החוץ-גופית בתחילת המאה ה-20 השיגה מטרה זו. הנוכחי טכניקות מבחנה התפתחו מעט מן ההפגנה המקורית של רו כי תאים עובריים יכולים לשרוד לשעבר vivo למשך מספר ימים בתמיסת מלח חם5. עם זאת, במתודולוגיות חוץ-גופית מוגבלים בעיקר לסוגי תאים בודדים המעובדים ב-2-D ואינם מvivo באופן מדויק רקמות בלתי מוגבלות. בעוד שימושי לבדיקת ביוכימיה תא, פיזיולוגיה וגנטיקה, רקמות מקוריות הן תלת-ממד ולשלב סוגי תאים מרובים. 2-D פשוט במערכות מבחנה הנושאים תאים מיונקים לסביבות מלאכותיות מאוד שבו הארכיטקטורה המקורית ספציפית רקמות הוא איבד6. בתורו, זה משפיע על אירועים תאיים ומסחטות, וכתוצאה מכך מורפולוגיה התא נורמלי, פיזיולוגיה, התנהגות7.
הריבית מאחורי פרוטוקול זה טמונה בפיתוח וניהול קליני של צלקות יפרטרופית ו keloids. בעוד הוא מבוסס היטב כי העור שפיברותקיעות אחראים במידה רבה לייצור שופע של collagens הנוכחי ברקמת צלקת, טיפוח פיברותקיעות העור באמצעות 2-D במערכות מבחנה נכשלת לשכפל את תחלופת הקולגן נצפתה ב vivo8. מודרני בשיטות מבחנה עדיין למעשה להשתמש "מלוחים חמים", סביבה שונה לחלוטין מזה ברקמות החיים. רקמות בvivo הם צפופים מאוד, עם חלבונים, חומצות גרעין, הריבונצירופדים, ו פוליסכרידים, הכובש 5% – 40% של נפח הכולל. כפי שאין שתי מולקולות יכול לכבוש את אותו החלל באותו זמן, יש מעט שטח פנוי זמין והעדר כמעט מוחלט של מים חינם9.
טכניקת ה-MMC מטילה אילוצים המשפיעים על המאפיינים התרמודינמיים של הנוזל הציטוזול והביניים. אינטראקציות מולקולריות, מכלולי קולטן לליטרים ואותות, אנזימים ואורגלים, מוגבלים ומוגבלות מאינטראקציה באופן חופשי9. אינטראקציות בתוך הסביבה הפראיסלנדי (כלומר, interstitium) גם הן מאולצת. הראיות האחרונות מאשרות כי ריכוזים גבוהים של קרו אינרטי פתרונות צפופים perturb דיפוזיה, האגודה הפיזית, צמיגות ונכסים הידרודינמיים10.
מעניין, מספר סוכני הצפיפות הפופולריים (כלומר, Ficoll dextran, polyvinylrolidone [PVP], ו נתרן 4-styreneסולפיאט [PSS]) אינם שקולים כאשר מוחלים על סוגי תאים שונים ובהגדרות שונות. במחקר קודם, פיקדול דווח להיות פחות ציטוטוקסיים עבור תאי גזע mesenchymal לעומת PVP. תוצאות אלו הפרדרו להיות תוצאה של המטען הנייטרלי ורדיוס הידרודינמי קטן יחסית11. לעומת זאת, המחקר השני מצא כי תוספי יעיל יותר בגירוי קולגן אני התצהיר על ידי הריאות האדם פיברופיצוצים לעומת ficoll12. נתונים מתוך המחקר שלנו עולה כי Ficoll מגביר את התצהיר הקולגן על ידי יפרטרופית הצלקת נגזר פיברופיצוצים, בעוד PVP הוא רעיל תאים אלה13.
הוכח כי ההמרה של procollagen לקולגן הוא מהיר יותר בסביבה מאוד vivo14, בעוד שיעור התגובות הביולוגי מתעכב במערכת התרבות 2-D מדולל15. יש לנו אופטימיזציה בפרוטוקול מבחנה כאן, שילוב של MMC כדי להראות את הטיפוח של הכדורים העורי משמש כמו יותר "בvivo-כמו" מודל פיברוזיס העורי והיווצרות צלקת. בניגוד למערכת התרבות הדו המשותפת, טיפוח ה-hHSFs עם MMC מעורר את הביוסינתזה והפקדת הקולגן באופן משמעותי13. בעיקר, מאפיינים אחרים של סיסטיק (כלומר, ביטוי מוגבר של מטריקס מטאלוטיות [MMPs] ו ציטוקינים proinflammatory) ניכרים גם תחת פרוטוקול MMC זה אופטימיזציה13. כאשר מעובד בשיטה זו, הוא מוצג כי התאים העורי לכידה של הפרמטרים הפיסיולוגיים, ביוכימיים, פונקציונלי הנמדד vivo.
MMC אופטימיזציה בפרוטוקול מבחנה שימש כדי להעריך את הביטוי של קולגן ו חלבונים ecm אחרים על ידי העור פיברותקיעות מבודדים מיפרטרופית צלקת דרמיס ולא מעורב דרמיס הסמוכים. כאשר מעובדים בסביבות MMC בתוך מבחנה, זה כבר נצפתה כי hHSFs לבטא מאפיינים מסוימים (כלומר, mRNA, ביוכימיה, פיזיולוגיה, ו-פנוטיפ) דומה יפרטרופית רקמת צלקת בvivo. הראיות מצביעות על כך שתכונות פיזיות וכימיות הן שיקולים חשובים בעת בחירת מקרודרים ואופטימיזציה של תנאי MMC לצורך טיפוח-תרגול.
לצורך הוכחת העיקרון, פרוטוקול MMC מוחל כאן כדי להעריך ולכמת את היכולת של Shikonin ואת האנלוגיות שלה כדי לגרום אפופטוזיס. זה מאפשר הערכה של יישומים פוטנציאליים של אלה באופן טבעי-נגזר הרפואה הסינית המסורתית (TCM) תרכובות עבור ניהול עורי הצטלקות13. על אף, הפשטות, העלות והאפקטיביות והדייקנות של זה בפרוטוקול MMC מספק גם את התקנות האחרונות לחיסול ניסויים ביונקים על ידי הדירקטיבה של האיחוד האירופי 2010/63/האיחוד האירופי וארה ב. הסוכנות להגנת הסביבה (EPA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבית תאים
- שמירה על hHSFs ושריפוטות העור הרגיל נגזר מרקמת שאינו פתולוגי (hNSFs) ב בינונית שונה של הנשר של דולבקה (DMEM) המכיל 10% סרום עגל עוברי (FCS) ו 1% v/v פניצילין/סטרפטומיצין פתרון (P/S) ב 37 ° c בחממה עם 5% CO2/95
- רכישה של Ficoll 70, פיקדול 400 וחומצה אסקורבית מהחברות המתאימות.
2. בניית יפרטרופית של MMC מודל צלקת
- הזרע את ה-hHSFs או hNSFs (50,000/טוב) לצלחת 24 המכיל 1 מ ל של מדיה בכל באר.
- מניחים בחממה 37 ° c ב 5% CO2 ולעזוב את הלילה.
- הכן את מדיית MMC. בהתבסס על הנפח הכולל הנדרש עבור הניסוי, לייצר 10% FCS/DMEM מדיה על ידי ערבוב Ficoll 70 (18.75 mg/mL), פיקדול 400 (12.5 mg/mL), ו חומצה אסקורבית (100 μM).
- מניחים את התערובת לתוך מרחץ מים 37 ° c עבור 1 כדי לפזר את הקרודרים לתוך הפתרון, ולאחר מכן לעקר את מדיית MMC באמצעות מסנן 0.2 יקרומטר.
- לסחוט את התקשורת המושקע ולהחליף עם מדיה MMC שנעשו טרי.
- מודטה את התאים 6 ימים ב 37 ° c ו 5% CO2, שינוי התקשורת כל 3 ימים.
3. ביטוי הסכום הכולל של קולגן
- הכינו את הפתרון האדום של סיריוס (0.1% w/v). לפזר 0.2 g של ישיר אדום 80 אבקה ב 200 mL של מים מזוקקים מזוקק (ddH2O) עם 1 מ ל של חומצה אצטית.
- משף את מדיית MMC ומוסיף 300 μL של הפתרון של סיריוס Red לתוך כל באר. מודטה ב 37 ° c עבור 90 דקות.
- לשטוף בעדינות את הפתרון סיריוס אדום עם מים ברז ולאפשר את הצלחת להתייבש באוויר לילה.
- לחלץ את סיריוס אדום הכתם על ידי הוספת 200 μL של נתרן הידרוקסיד (0.1 M) לתוך כל טוב. מניחים את הצלחת על שייקר מסלולית עבור 5 – 10 דקות כדי לחלץ במלואו את הכתם האדום של סיריוס.
- העבר 100 μL של הכתם שחולצו סיריוס אדום לתוך 96 לוחית שקופה היטב ולמדוד את ספיגת ב 620 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלייט.
4. ביטוי של קולגן אני (כתמים חיסוני)
- שטוף את הבארות באמצעות 200 μL של תמיסת מלח פוספט באגירה (PBS, pH = 7.35).
- תקן את התאים באמצעות מתנול (500 μL/ועוד) ב 4 ° צ' עבור 10 דקות.
- חסימת אינטראקציות שאינן ספציפיות עם 3% סרום באלדק להסרת 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- מנושף את פתרון החסימה ואת הדגירה עם 200 μL של אנטי קולגן אני נוגדן (10 μg/mL) עבור 90 דקות ב RT.
- מנושף את הנוגדן העיקרי ולשטוף 3x עם PBS עבור 5 דקות כל אחד.
- דגירה עם 200 μL של עז אנטי ארנב-FITC נוגדן משני (1:400 דילול) ו 4', 6-diamidino-2-פניינילידול (dapi; 1:2000 דילול) עבור 30 דקות ב RT. לכסות את הצלחת עם רדיד אלומיניום.
- להיפטר הן נוגדן משני DAPI ולשטוף 3x עם PBS עבור 5 דקות כל אחד.
- המחש את הקרינה הפלואורסצנטית. ישירות מתחת למיקרוסקופ
5. כתמים מערביים
- שטוף את התאים 2x עם PBS.
- הוסף 40 μL של מאגר הליזה לתוך כל באר ומגרד את שכבת התא עם קצה של פיפטה. מאגר הפירוק מכיל מאגר ריפה, מעכב פרוטאז קוקטייל (PIC), 2 מ"מ vanadate נתרן, ו 10 מ"מ נתרן פלואוריד.
- להעביר את החלבון ליפוסט לצינורות מיקרוצנטריפוגה ולמדוד את ריכוז החלבון באמצעות שיטת חלבון לפי הוראות היצרן16.
- טען 10 μg של חלבון של כל קבוצה לתוך הבארות של 4% – 12% Bis-Tris חלבון. ביצוע נתרן dodecyl סולפט אלקטרופורזה ג'ל אלקטרופורזה (sds-עמוד) ב 200 V עבור 30 דקות.
- להעביר את החלבון כדי ניטרוצלולוזה על ידי הפעלת כתם מערבי ב 90 V עבור 90 דקות. להימנע היווצרות של בועות אוויר בין ג'ל ו ניטרוצלולוזה קרום.
- חסימת הקרום עם 10 מ ל של מאגר חסימה.
- דגירה עם נוגדנים הראשי ב 4 ° c לילה. נוגדנים עיקריים הם: אנטי קולגן אני, אנטי קולגן השלישי, אנטי קולגן IV, נגד αSMA, anti-MMP-1, נגד-MMP-2, anti-MMP-9, נגד-MMP-13, ו נגד גליצראלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (מגנד).
- לשטוף את הקרום עם 0.1% TBS-רצף 20 (5x עבור 5 דקות כל אחד). TBS/יצירת רצף 20 (1 L) מכיל את הפרטים הבאים: 50 mL של 1 M טריס (pH = 7.4), 30 מ ל 5 מ נתרן כלוריד, 1 מ ל של רצף 20, ו 920 mL של ddH2O.
- דגירה עם מין נוגדן משני המתאים ב RT עבור 1 h.
- חזור על שלב 5.8 והמחש את הקרינה הפלואורסצנטית באמצעות מערכת דימות.
6. RT-PCR
- לאסוף את ה-RNA הכולל באמצעות מאגר הליזה מעורבב עם 2-mercaptoethanol כלולים בערכת שיטת החילוץ RNA.
- לטהר את ה-RNA לפי הוראות היצרן17.
- למדוד את ריכוז RNA באמצעות ספקטרוסקופיה מיקרוvolume.
- בצעו את הסינתזה הראשונה של cDNA באמצעות ערכת סינתזה של cDNA לפי הוראות היצרן.
- בדים מותאמים אישית מסופקים (מצופה מראש) ב96 לוחות היטב. מערבבים 100 ng של דגימות cDNA עם 10 μL של SYBR ירוק שילוב לתוך לוחית אישית.
- הגדל את אמצעי האחסון הכולל ל-20 μL/היטב באמצעות ddH2O.
- הפעל RT-PCR באמצעות ציקלייר תרמית בעקבות ההוראות של היצרן: 40 מחזורים של הרפתקאות ב 98 ° c עבור 15 s וריפוי/הארכה ב 60 ° c עבור 60 s. הגנים שנבדקו ב-RT-PCR כוללים: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4 , SMAD7, IL1A, IL1B , IL6, IL8 , MMP1 , MMP2 , MMP3 , TGFB1 , ו-והוא .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דגימות שלישיה נערכו בכל ניסוי, וכל ניסוי חזר על עצמו 3x באמצעות תאים משלושה חולים בודדים. נתונים מבוטאים כאחוזים מקבוצת הפקדים. בכיוון אחד של ANOVA ו-Tukey של מבחן שלאחר-הוק הוחלו לנתח הבדלים סטטיסטיים (*p ˂ 0.05).
MMC באמצעות שימוש ב-9% FVO (תפוסת נפח החלקי) משפר את הכמות הכוללת של קולגן וקולגן אני התצהיר ב hHSF13. כפי שמודגם באיור 1A, צפיפות התא של hHSFs גברה באופן משמעותי לאחר השימוש בפיקדול ב -9% ו-18% fvo לעומת הפקד ו-MMC באמצעות PVP. איור 1B, C מציין כי ficoll (ב 9% fvo) הגדילו באופן משמעותי את התצהיר של קולגן (כולל קולגן I) לעומת ניסוחים אחרים MMC. אנליזה כמותית (איור 1D, E) עוד הוכיחה כי ficoll (ב 9% fvo) השתפרה ביותר באופן היעיל ביותר את התצהיר של קולגן.
hHSFs ו-hNSFs שטיפח בסביבות MMC נמצאו כדי לווסת את הביטוי של מינים ECM בנוסף קולגן13. נתונים שדווחו באיור 2 מצביעים על כך שכאשר hhsfs ו-hnsfs טיפחו עם MMC, הביטוי של קולגן IV גם גדל באופן משמעותי. מטריקס מטאלוסים (MMPs) לשחק תפקיד חשוב במהלך ריפוי פצעים והיווצרות צלקת, ויסות הרכבת ECM, ושיפוץ18. MMPs גם לתרום התפשטות התא, הגירה התא, אנגיוגנזה ו אפופטוזיס19. בעיקר, ביטוי מוגבה של MMPs נמצא לצבור רקמות צלקת יפרטרופית לעומת רקמות יליד20. זה נצפה כי הביטוי של MMP-2, -9, ו-13 היו upregulated באופן משמעותי בתרבויות hNSF ו hHSF שטיפח בסביבות MMC.
כמו כן ביילנו לסינתזה של אינטרלוקין 6 (IL-6) ומקדם הצמיחה של כלי הדם ("ה)"; עם זאת, אלה היו בלתי ניתן לגילוי בכתם המערבי. לעומת זאת, הניתוח RT-PCR (איור 3) חשף שהביטוי של IL6 היה משמעותי ביותר, ואילו הביטוי של הוופ הוסדר ב-Hnsfs ו-hhsfs שטיפח בתנאי MMC. ביטוי מוגבר של IL-6 הוכח לתרום יפרטרופית צלקת היווצרות21. אופן פרדוקסאלי, הוא דיווח גם כי היווצרות של צלקות יפרטרופית קשורה עם ביטוי מוגבה של ה-ומעלה22. ניתוח ה-RT-PCR המבוצע כאן מצביע על כך שהביטוי של הווורף היה מחליש מאוד ב-hnsfs ו-hhsfs שטיפח בתנאי MMC.
לבסוף, התוצאות הפגינו הן 1) מוגברת syntheses של collagens, קולגן אני, קולגן IV, MMP-2, MMP-9, ו-MMP-13 דה נובו ו 2) ביטוי מוגבר של IL6 Mrna ב hhsfs ו-hnsfs. יחד, נתונים אלה מצביעים על כך הטיפוח של הhhהראשוניים ו hNSFs בניסוחים מדיה הכוללים את התוצאות של MMC שמירה על ביטוי הגן האופייני, ביוכימיה, ופנוטיפים נצפתה ברקמת צלקת מקורית יפרטרופית ב vivo, המובילה למודל "צלקת בצנצנת" חזקה.
איור 1: MMC משפר את הכמות הכוללת של קולגן וקולגן אני התצהיר ב hHSFs. (A) תא מורפולוגיה, (ב) סה כ collagens, ויטראז ' עם סיריוס אדום, (ג) קולגן אני ביטוי, הפגינו על ידי Immunofluorescence (ד) ניתוח כמותי של קולגן סה, ו (E) ניתוח כמותי של קולגן אני התצהיר. ה-hHSFs היו מתורבתים בתקשורת בתוספת בפיקדול (9% ו-18% FVO), PVP40 (18% FVO), או PVP360 (54% ו 72% FVO), במשך 6 ימים. תמונות מייצגות נבחרו. כימות תמונה בוצעה באמצעות ImageJ והוא מבוטא כאחוז הממוצע של הפקד. כל הניסויים חזרו על עצמם 3x באמצעות תאים מבודדים שלושה תורמים לא קשורים. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ANOVA חד-כיוון עם הבדיקה שלאחר המבחן של Tukey (*p < 0.05 לעומת קבוצת הבקרה, קווי שגיאה מציינים את SEM). קנה מידה ברים = (A) 0.5 מ"מ, (ב) 2 מ"מ, ו (ג) 0.5 מ"מ. דמות זו שונתה ממחקר הקודם13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: השפעות MMC על ביטוי חלבון התא. הhhsfs ו-hNSFs היו מתורבתים תחת תנאי MMC במשך 6 ימים. ליקוטים תא שלם היו מוכנים עם מאגר ריפה המכיל קוקטייל פרוטאז מעכבי, נתרן vanadate, ו נתרן פלואוריד. ריכוז החלבון נמדד בעזרת שיטת החלבון. תמונות מייצגות מוצגות. לצורך אנליזה כמותית, העוצמות של להקות החלבונים הבודדות נמדדו באמצעות הדסי, מנורמל ל-"גנד", והומרו לאחוז הhNSF במדיום הרגיל באמצעות תוכנת ImageJ. כל הניסויים בוצעו 3x באמצעות תאים משלושה תורמים שאינם קשורים. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ANOVA חד כיוון עם הבדיקה של Tukey (*p < 0.05, קווי שגיאה מצביעים על SEM). דמות זו שונתה ממחקר הקודם13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השפעות MMC על ביטוי הגנים הסלולריים. ההחספות וההנססים טיפחו תחת תנאי MMC במשך 6 ימים. סה כ RNA נקצרו באמצעות ערכת שיטת הפעולה, והראשון הגדיל cDNA היה מסונתז באמצעות ערכת סינתזה cDNA. ביטוי הגנטי של היעד היה מנורמל ל-GDH והומר לאחוז הhNSF במדיום הרגיל. כל הניסויים חזרו על עצמו 3x באמצעות תאים משלושה תורמים שאינם קשורים. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ANOVA חד כיוון עם הבדיקה של Tukey (*p < 0.05, קווי שגיאה מצביעים על SEM). דמות זו שונתה ממחקר הקודם13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה נועד למטב ולאמת שיפור: צלקת-in-a-צנצנת מודל בלתי מתורבת לרקמת צלקת אנושית. מחקרים קודמים דיווחו על היישום של הטכניקה של MMC לריאות האדם פיברותקיעות12, מח עצם האדם mesenchymal גזע התאים23, ואת הגוף האנושי פיברופיצוצים23 באמצעות תוספי12, ficoll12, ו PVP23 כקרודרס. במחקר שדווח כאן, הפרוטוקול שפורסם בעבר עבור יפרטרופית צלקת שנגזר העור האדם פיברותקיעות היה אופטימיזציה עם Ficoll או PVP כמו קרודרס.
הבחירה והריכוז של macromolecular קרודרים הם פרמטרים קריטיים, כפי שהם לא להניב תוצאות שוות ערך. מחקר קודם דיווח כי PVP40 (18% FVO) ו PVP360 (54% FVO) לשפר באופן משמעותי את התצהיר הקולגן ואת התפשטות התא בפיברופיצוצים העור23 (ההשפעות של PVP ב fvo > 54% הם נבדקו). עם זאת, שני תנאים אלה אינם פועלים בעקביות עבור hHSFs באמצעות פרוטוקול זה.
כפי שמוצג באיור 1, פיקדול מגביר באופן משמעותי את הקולגן אני התצהיר בהשוואה לשליטה, בעוד PVP אין אפקטים משמעותיים. בשנת 9% FVO מגדילה באופן משמעותי את הסכום הכולל של קולגן וסוג קולגן ההשוואה לפיקדול ב 18% FVO. בנוסף, זה קריטי להשתמש בתאים של מעבר נמוך, כמו פיברוכדורים העורי הראשי יש תוחלת חיים מוגבלת בתרבות24. זה נבחר להשתמש רק hHSFs בודדים לשמור על vivo פניטיפים. לאחר טיפוח ממושך, ההאשסים הראשוניים מציגים מורפולוגיה יוצאת דופן ותגובות פונקציונליות טיפוסיות. מומלץ גם כי בינונית MMC להיות בתוספת עם חומצה אסקורבית, סליל מפתח של סינתזה קולגן ב hHSF25. יתרה מזאת, מוצע על ידי חוקרים אחרים להשתמש באותם נוגדנים המפורטים בטבלת החומרים למחקרים הקשורים ל-hhsf; עם זאת, יש לאמת נוגדנים אם החלת פרוטוקול זה על סוגי תאים אחרים.
כפי שדווח בתוצאות הנציג, הכללה של macromolecular קרודרס נמצא לעורר את הביטוי של קולגן (כלומר, קולגן אני, קולגן IV, MMPs, ו IL6) ב hhsfs בהשוואה hhsfs שטיפחו באמצעות התנאים הקלאסיים שאינם MMC. נטען כי מודל ה-MMC הממוטב שומר על היבטים של hHSFs ב-vivo פניטיפ, ומסכם את המבנה האופייני שלהם, ביוכימיה, פיזיולוגיה ומטריצה שופעת של רקמת צלקת עורית בvivo (בניגוד לגישות הקיימות של התרבות הדו). אנחנו לא יכולים לזהות כל דומה במודל מתורבת שמסוגל ללכוד דומה במאפייני "בvivo-כמו". בהשוואה לדגמי בעלי חיים קיימים, פרוטוקול MMC זה מהיר יותר, כמו גם ידידותי יותר למשתמש, חסכוני וחסכוני בזמן. כאשר הוא הקים מודל צלקת יפרטרופית חזירי באמצעות פציעה תרמית, אשר מופיע יש מאפיינים דומים לזה של האדם יפרטרופית צלקות26. עם זאת, בנוסף לעלויות והזמן הדרושים לשמירה על בעלי החיים, הניסוי דורש יותר מ -3 חודשים עד להשלמת26. מודל MMC מיטבי זה דורש כשבוע של הכנה לפני המוכנות לשימוש.
הפרוטוקול מציע מודל מתקדם מבחינה גופית לבדיקת טיפולים נגד צלקות הרומן. מודל MMC שימש להערכת shikonin, מולקולה דווחה בעבר כדי לעכב את היווצרות דה נובו של צלקות, לשיקום של צלקות יפרטרופית בוגרות27,28. הערכה דומה של תרכובות הרומן והתערבויות באמצעות גישות קלאסיות לגילוי סמים והוכחת הרעיון ידרוש משאבים ניכרים, קרנות, וזמן. מחקר זה דרש כספים מינימליים וניתן להשלימה תוך מספר חודשים. הפרוטוקול הוא גמיש ובקלות להתאמה עבור יישומים בפיתוח והערכה של הרומן יפרטרופית טיפולים צלקת לפני מחקרים בעלי חיים.
בנוסף, ניתן לשנות פרוטוקול זה כדי לפתח מאפיינים נוספים של "בvivo-כמו". לדוגמה, הנוכחות של TGF שופע β1 הוא ממצא עקבי ברקמות צלקת יפרטרופית, היווצרות צלקת מדיה על ידי עירור סינתזה קולגן ותצהיר28. TGF-β1 יכול להיות משולב בקלות לתוך פרוטוקול MMC ולשפר עוד יותר לכידה של בvivo פתולוגיה. עדיין לא בחנו את הפוטנציאל המלא של המודל, אשר עשוי להיות שימושי עבור קולגן אחרים, ו ECM הקשורות הפתווגיות (כלומר, סקלרודרמה, פיברוזיס ריאתי, endomyocardial פיברוזיס, וכו '). כמו-כן, יהיה מעניין להתבונן בהשפעות של MMC על תאים במשך תקופת תרבות ארוכה יותר, כגון 2-3 שבועות. כדאי גם להעריך עוד יותר את ההשפעות של MMC על התא ו-ECM אדריכלות הירארכית ויישור, במיוחד את הכיוון של קולגן, כמו המאפיינים האלה חיוניים במערך רקמת צלקת vivo.
אחת המגבלות העיקריות של פרוטוקול זה היא ההגבלה של סוגי תאים. היווצרות צלקת יפרטרופית כרוך השתתפות של אוכלוסיות תאים שונים, ואת האינטראקציות בין סוגי תאים שונים ממלא תפקיד חיוני במבנה צלקת. לדוגמה, keratinocytes גם לשחק תפקיד חשוב בריפוי פצע עורית והיווצרות צלקת29. שילוב אוכלוסיות תאים נוספות במודל זה ישפר במידה רבה את חשיבותו במחקר עתידי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מימון של הסוכנות של סינגפור למדע, טכנולוגיה ומחקר "SPF 2013/004: ביולוגיה של העור מחקר בסיסי" ואת "טיפוח הפצע חדשנות עבור הטרופיקס" חיל האוויר-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. המחברים הכירו בהכרת תודה ובסיוע ד ר פאולה בני וד ר מיכאל ראע'בט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
- Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
- Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
- Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
- Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
- Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Fan, C., et al. Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
- Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, Pt 7 1341-1353 (2005).
- Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
- Ernst, O., Zor, T.
- Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
- Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
- Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
- Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
- Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
- Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
- Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
- Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
- Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
- Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
- Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
- Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H.
