Summary
Questo protocollo descrive l'uso dell'affollamento macromolecolare per creare un modello di tessuto ipertrocico umano in vitro che assomiglia in condizioni di vivo. Quando coltivati in un ambiente macromolecolare affollato, i fibroblasti della pelle umana presentano fenotipi, biochimica, fisiologia e caratteristiche funzionali simili al tessuto cicatriziale.
Abstract
È stato dimostrato che i tessuti in vivo sono molto affollati da proteine, acidi nucleici, ribonucleoproteine, polisaccharide, ecc. Il seguente protocollo applica una tecnica di crowding macromolecolare (MMC) per imitare questo affollamento fisiologico attraverso l'aggiunta di polimeri neutri (crowders) alle colture cellulari in vitro. Studi precedenti che utilizzano Ficoll o dextran come crowder dimostrano che l'espressione del collagene I e della fibronectina nelle linee cellulari WI38 e WS-1 è notevolmente migliorata utilizzando la tecnica MMC. Tuttavia, questa tecnica non è stata convalidata nei fibroblasti cutanei umani ipertrofici primari (hHSF). Poiché le cicatrici ipertrofiche derivano dall'eccessiva deposizione di collagene, questo protocollo mira a costruire un modello di cicatrice ipertrotro ricco di collagene applicando la tecnica MMC con hHSFs. Questo modello MMC ottimizzato ha dimostrato di possedere più somiglianze con il tessuto cicatriziale in vivo rispetto ai tradizionali sistemi di coltura cellulare 2-D. Inoltre, è conveniente, efficiente in termini di tempo ed eticamente desiderabile rispetto ai modelli animali. Pertanto, il modello ottimizzato riportato qui offre un modello avanzato "in vivo" per studi ipertrofici correlati alle cicatrici.
Introduction
Il tessuto cicatriziale rappresenta il punto finale della riparazione dei tessuti. Tuttavia, in molti individui, specialmente quelli che soffrono di ustioni o traumi1, le cicatrici possono essere eccessive e impongono effetti indesiderati sulla morfologia e sul funzionamento della pelle guarita. Anche se i meccanismi esatti di formazione di cicatrici patologiche (cicatrici ipertrofiche e cheloidi) non sono completamente compresi, l'eccessiva deposizione di collagene durante la guarigione delle ferite è stata dimostrata essere un contributo essenziale2.
È ben noto che la trasformazione del fattore di crescita beta 1 (TGF-1) e dell'actina muscolare liscia alfa (ZMA) svolge un ruolo chiave nella formazione di cicatrici ipertrofiche. L'evidenza suggerisce che l'elevato TGF-1 stimola direttamente l'eccessiva deposizione di collagene regolando il percorso di segnalazione SMAD3. Inoltre, è stato trovato che l'sMA contribuisce alla formazione di cicatrici ipertrofiche regolando la contrazione cellulare e la reetilizzazione nel processo di guarigione della ferita4. La mancanza di modelli in vitro e in vivo adatti è un grave ostacolo allo sviluppo e alla valutazione di interventi e terapie per la correzione delle cicatrici. Lo scopo di questo studio è quello di utilizzare la tecnica MMC esistente per costruire un modello di cicatrice ipertrofica "in vivo" adatto per la valutazione di nuovi ed emergenti interventi legati alla cicatrice.
Riprodurre tessuto vivente al di fuori del corpo è stato un obiettivo per anni nella comunità scientifica. Lo sviluppo di tecniche in vitro all'inizio del ventesimo secolo ha in parte raggiunto questo obiettivo. Le attuali tecniche in vitro si sono leggermente evolute rispetto alla dimostrazione originale di Roux che le cellule embrionali possono sopravvivere all'esagono per diversi giorni in calda salina5. Tuttavia, le metodologie in vitro sono per lo più limitate atipi di cellule singole coltivati in 2D e non ricapitolano accuratamente i tessuti in vivo. Sebbene siano utili per esaminare la biochimica cellulare, la fisiologia e la genetica, i tessuti nativi sono 3D e incorporano più tipi di cellule. I sistemi in vitro 2D semplici sottopongano le cellule dei mammiferi ad ambienti altamente artificiali in cui l'architettura nativa specifica del tessuto viene persa6 . A sua volta, questo colpisce eventi intracellulari ed extracellulari, con conseguente morfologia cellulare anormale, fisiologia e comportamento7.
L'interesse alla base di questo protocollo sta nello sviluppo e nella gestione clinica di cicatrici e cheloidi ipertrofi. Mentre è ben noto che i fibroblasti dermici sono in gran parte responsabili dell'abbondante produzione di collageni presenti nel tessuto cicatriziale, coltivando fibroblasti dermici utilizzando sistemi 2D in vitro non riesce a riprodurre il turnover di collagene osservato in vivo8. I metodi in vitro contemporanei usano ancora essenzialmente la "calda salina", un ambiente completamente diverso da quello dei tessuti viventi. I tessuti in vivo sono estremamente affollati, con proteine, acidi nucleici, ribonucleoproteine e polisaccaridi, che occupano il 5-40% del volume totale. Poiché non ci sono due molecole che possono occupare lo stesso spazio allo stesso tempo, c'è poco spazio libero disponibile e una quasi completa assenza di acqua libera9.
La tecnica MMC impone vincoli che influenzano le proprietà termodinamiche del citosol e dei fluidi interstiziali. Le interazioni molecolari, i complessi di segnalazione recettore-ligando, gli enzimi e gli organelli sono confinati e limitati dall'interazione libera9. Anche le interazioni all'interno dell'ambiente pericellulare (cioè l'interstizio) sono vincolate. Recenti evidenze confermano che alte concentrazioni di macromolecole ineret in soluzioni affollate perturbno la diffusione, l'associazione fisica, la viscosità e le proprietà idrodinamiche10.
È interessante notare che diversi agenti di affollamento popolari (ad esempio, Ficoll, dextran, poliviglierino-PVP] e sodio 4-styrenesulfonate [PSS]) non sono equivalenti se applicati a diversi tipi di cellule e in diverse impostazioni. In uno studio precedente, Ficoll è stato segnalato per essere meno citotossico per le cellule staminali mesenchymiche rispetto al PVP. Questi risultati sono stati interpretati come la conseguenza della sua carica neutra e del raggio idrodinamico relativamente piccolo11. Al contrario, un secondo studio ha trovato che dextran è più efficace nello stimolare il collagene I deposizione da fibroblasti polmonari umani rispetto a Ficoll12. I dati del nostro studio suggeriscono che Ficoll migliora la deposizione di collagene da fibroblasti ipertrofici derivati da cicatrici, mentre il PVP è tossico per queste cellule13.
È stato dimostrato che la conversione del procollagene al collagene è più veloce in un ambiente in vivo molto affollato14, mentre il tasso di reazioni biologiche è ritardato in un sistema di coltura 2D diluito15. Abbiamo ottimizzato il protocollo in vitro qui, incorporando MMC per mostrare la coltivazione di fibroblasti dermici che servono come un modello più "in vivo" per la fibrosi dermica e la formazione di cicatrici. In contrasto con il sistema di coltura 2D comune, coltivare hHSF con MMC stimola significativamente la biosintesi e la deposizione di collagene13. In particolare, altre caratteristiche della fibrosi (cioè una maggiore espressione delle metalloproteine di matrice [MMP] e delle citochine infiammatorie) sono evidenti anche in questo protocollo MMC ottimizzato13. Quando coltivate con questo metodo, si ha dimostrato che le cellule dermiche ricapitolano i parametri fisiologici, biochimici e funzionali misurati in vivo.
Il protocollo MMC in vitro ottimizzato è stato utilizzato per valutare l'espressione del collagene e di altre proteine ECM da fibroblasti dermici isolati da dermi cicatrici ipertrofi e dermi sconnessi adiacenti non coinvolti. Quando viene coltivato in ambienti MMC in vitro, è stato osservato che hHSF esprimono determinate caratteristiche (ad esempio, mRNA, biochimica, fisiologia e fenotipo) simili al tessuto lecito ipertrofico dermifico in vivo. Le prove indicano che le proprietà fisiche e chimiche sono considerazioni importanti quando si selezionano i crowder e si ottimizzano le condizioni MMC per la coltivazione in vitro.
Per il proof-of-principle, il protocollo MMC viene qui applicato per valutare qualitativamente e quantitativamente la capacità di Shikonin e dei suoi analoghi di indurre l'apoptosi. Ciò consente di valutare le potenziali applicazioni di questi composti di medicina tradizionale cinese (TCM) derivati naturalmente per la gestione delle cicatrici dermiche13. Nonostante ciò, la semplicità, l'efficacia in termini di costi e la tempestività di questo protocollo MMC in vitro soddisfano anche le recenti normative volte ad eliminare la sperimentazione nei mammiferi da parte della direttiva UE 2010/63/EU e dell'Agenzia per la protezione dell'ambiente degli Stati Uniti (EPA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultura cellulare
- Mantenere hHSF e normali fibroblasti dermici derivati da tessuto non patologico (hNSF) nel mezzo modificato dell'Aquila (DMEM) di Dulbecco contenente il 10% di siero di vitello fetale (FCS) e l'1% v/v di soluzione di penicillina/streptomicina (P/S) a 37 gradi centigradi in un incubatore con 5% di CO2/95%.
- Acquistare Ficoll 70, Ficoll 400 e acido ascorbico dalle società appropriate.
2. Costruzione del modello MMC di cicatrici ipertrofice
- Seme le hHSFs o hNSF (50.000/bene) in una piastra da 24 pozze contenente 1 mL di supporti in ogni pozzo.
- Mettere in un'incubatrice a 37 gradi centigradi al 5% di CO2 e lasciare la notte.
- Preparare i supporti MMC. Sulla base del volume totale richiesto per l'esperimento, produrre 10% supporti FCS/DMEM mescolando Ficoll 70 (18,75 mg/mL), Ficoll 400 (12,5 mg/mL) e acido ascorbico (100 M).
- Collocare il composto in un bagno d'acqua a 37 gradi per 1 h per disperdere i crowder nella soluzione, quindi sterilizzare i supporti MMC utilizzando un filtro da 0,2 m.
- Aspirare i supporti spesi e sostituirli con i media MMC appena fatti.
- Incubare le cellule per 6 giorni a 37oC e 5% CO2, cambiando i media ogni 3 giorni.
3. Espressione della quantità totale di collagene
- Preparare la soluzione rossa Disius (0,1% w/v). Sciogliere 0,2 g di polvere Direct Red 80 in 200 mL di acqua distillata deionizzata (ddH2O) con 1 mL di acido acetico.
- Aspirati il supporto MMC e aggiungete la soluzione 300 L di Sirius Red in ogni pozzo. Incubare a 37 gradi centigradi per 90 min.
- Sciacquare delicatamente la soluzione Sirius Red con acqua di rubinetto e lasciare asciugare all'aria durante la notte.
- Estrarre la macchia di Sirio Red aggiungendo 200 l' di idrossido di sodio (0,1 M) in ogni pozzo. Posizionare la piastra su uno shaker orbitale per 5-10 min per estrarre completamente la macchia rosso di Sirio.
- Trasferire 100 l della macchia Sirius Red estratta in una piastra 96 ben trasparente e misurare l'assorbimento a 620 nm utilizzando un lettore di microplacche.
4. Espressione di collagene I (immunostaining)
- Lavare i pozzi utilizzando 200 gradi di salina con buffer fosfato (PBS, pH - 7,35).
- Fissare le cellule utilizzando metanolo (500 l/pozzetto) a 4 gradi centigradi per 10 min.
- Blocca le interazioni non specifiche con il 3% di albumina del siero bovino per 30 min a temperatura ambiente (RT).
- Aspirare la soluzione di blocco e incubare con 200 l of anticorpo i anti-collagen (10 g/mL) per 90 min a RT.
- Aspirare l'anticorpo primario e lavare 3x con PBS per 5 min ciascuno.
- Incubazione con 200-L di anticorpo secondario capra anti-Rabbit-FITC (1:400 diluizione) e 4 ',6-diamidino-2-fenilondole (DAPI; 1: 2000 diluizione) per 30 min a RT. Coprire la piastra con foglio di alluminio.’
- Eliminare sia l'anticorpo secondario che IL DAPI e lavare 3x con PBS per 5 min ciascuno.
- Visualizza la colorazione a fluorescenza direttamente al microscopio.
5. Gonfiore occidentale
- Lavare le cellule 2x con PBS.
- Aggiungere 40 l' l di tampone di lisi in ogni pozzo e raschiare lo strato cellulare con una punta di pipetta. Il buffer di lisi contiene buffer RIPA, cocktail inibitore proteasi (PIC), 2 mM di sodio vanadate e 10 mM di fluoruro di sodio.
- Trasferire il lisato proteico in tubi di microcentrismo e misurare la concentrazione proteica utilizzando un saggio proteico come base delle istruzioni del produttore16.
- Caricare 10 g di proteine di ciascun gruppo nei pozzi del 4%–12% dei gel proteici Bis-Tris. Eseguire l'elettroforesi gel di sodio solfato sodio poliacrilamide (SDS-PAGE) a 200 V per 30 min.
- Trasferire la proteina nella membrana di nitrocellulosa eseguendo una macchia occidentale a 90 V per 90 min. Evitare la formazione di bolle d'aria tra la membrana del gel e la nitrocellulosa.
- Bloccare la membrana con 10 mL di buffer di blocco.
- Incubare con anticorpi primari a 4 oC durante la notte. Gli anticorpi primari sono: anti-collagene I, anti-collagene III, anti-collagen IV, anti-sMA, anti-MMP-1, anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-MMP-13 e dehydrogenassi 3-fosfatide anti-gliceraldedede 3-fosfati (GAPDH).
- Lavare la membrana con 0,1% TBS-Tween 20 (5 x per 5 min ciascuno). TBS/Tween 20 (1 L) contiene quanto segue: 50 mL di 1 M Tris (pH - 7,4), 30 mL di 5 M di cloruro di sodio, 1 mL di Tween 20 e 920 mL di ddH2O.
- Incubare con una specie appropriata anticorpo secondario a RT per 1 h.
- Ripetere il passaggio 5.8 e visualizzare la fluorescenza utilizzando un sistema di imaging.
6. RT-PCR
- Raccogliere l'RNA totale utilizzando il buffer di lisi mescolato con 2-mercaptoetanolo incluso nel kit di analisi di estrazione dell'RNA.
- Purificare l'RNA come indicato nelle istruzioni del produttore17.
- Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolume.
- Eseguire la sintesi cDNA primo filamento utilizzando un kit di sintesi cDNA come istruzioni del produttore.
- I primer oligonucleotidi RT-PCR sono forniti (precoated) in piatti personalizzati 96 well. Mescolare 100 ng di campioni di cDNA con 10 .L di supermix verde SYBR nella piastra personalizzata.
- Aumentare il volume totale a 20 /l utilizzando ddH2O.
- Eseguire RT-PCR utilizzando un ciclore termico seguendo le istruzioni del produttore: 40 cicli di denatura a 98 gradi per 15 s e annealing/estensione a 60 gradi centigradi per 60 s. I geni testati in RT-PCR includono: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3, TGFB1 e VEGF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sono stati eseguiti campioni triplicati in ogni esperimento e ogni esperimento è stato ripetuto 3 volte utilizzando cellule di tre singoli pazienti. I dati sono espressi come percentuali del gruppo di controllo. Il test post-hoc di ANOVA e Tukey è stato applicato unidirezionale per analizzare le differenze statistiche(p .0,05).
MMC utilizzando Ficoll al 9% FVO (occupazione del volume frazionario) migliora la quantità totale di collagene e collagene I deposizione in hHSF13. Come illustrato nella Figura 1A, la densità cellulare degli hHSF è aumentata significativamente dopo la coltura con Ficoll al 9% e al 18% di FVO rispetto al controllo e a MMC che utilizzano il PVP. Figura 1B,C indica che Ficoll (al 9% FVO) ha migliorato significativamente la deposizione di collagene (compreso il collagene I) rispetto ad altre formulazioni MMC. L'analisi quantitativa (Figura 1D,E) ha inoltre dimostrato che Ficoll (al 9% FVO) ha migliorato in modo efficace la deposizione di collagene.
HHSF e hNSF coltivati in ambienti MMC sono stati trovati per regolare l'espressione delle specie ECM oltre al collagene13. I dati riportati nella Figura 2 indicano che quando hHSF e hNSF sono stati coltivati con MMC, anche l'espressione del collagene IV è aumentata in modo significativo. Matrice metalloproteine (MMP) svolgono un ruolo importante durante la guarigione delle ferite e la formazione di cicatrici, la regolazione dell'assemblaggio ECM, e la ristrutturazione18. Gli MMP contribuiscono anche alla proliferazione cellulare, alla migrazione cellulare, all'angiogenesi e all'apoptosi19. In particolare, è stata trovata un'espressione elevata di MMP che si accumula nei tessuti cicatrici ipertrofici rispetto ai tessuti nativi20. È stato osservato che l'espressione di MMP-2, -9 e -13 è stata significativamente aggiornata nelle culture hNSF e hHSF coltivate in ambienti MMC.
Abbiamo anche sondato per la sintesi di interleucina-6 (IL-6) e fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF); tuttavia, questi non erano rilevabili in una macchia occidentale. Al contrario, l'analisi RT-PCR (Figura 3) ha rivelato che l'espressione di IL6 era significativamente upregolata, mentre l'espressione di VEGF era downregolata in hNSF e hHSF coltivati in condizioni MMC. Una maggiore espressione di IL-6 è stata dimostrata per contribuire alla formazione di cicatrici ipertrofiche21. Paradossalmente, si dice anche che la formazione di cicatrici ipertrofiche è associata a un'espressione elevata di VEGF22. L'analisi RT-PCR qui eseguita ha indicato che l'espressione del VEGF è stata notevolmente attenuata negli hNSF e negli hHSF coltivati in condizioni MMC.
Infine, i risultati hanno dimostrato sia 1) una maggiore sintesi di collageni, collagene I, collagene IV, MMP-2, MMP-9 e MMP-13 de novo e 2) aumento dell'espressione dell'mRNA IL6 in hHSF e hNSFs. Nel loro insieme, questi dati indicano che la coltivazione di hHSF e hNFF primari nelle formulazioni multimediali che includono risultati MMC nella conservazione dell'espressione genica caratteristica, della biochimica e dei fenotipi osservati nel tessuto autoctono ipertrofico in vivo, portando a un solido modello "scar-in-a-jar".
Figura 1: MMC migliora la quantità totale di collagene e collagene I deposizione in hHSFs. (A) Morfologia cellulare, (B) collageni totali, macchiati con Sirius Red, (C) collagene I espressione, dimostrata da immunofluorescenza, (D) analisi quantitativa del collagene totale, e (E) analisi quantitativa della deposizione di collagene I. Gli hHSF sono stati coltivati in media integrati con Ficoll (9% e 18% FVO), PVP40 (18% FVO), o PVP360 (54% e 72% FVO), per 6 giorni. Sono state selezionate immagini rappresentative. La quantificazione dell'immagine è stata eseguita utilizzando ImageJ ed è espressa come percentuale media del controllo. Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti 3 volte utilizzando cellule isolate da tre donatori non correlati. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando ANOVA unidirezionale con il post-test di Tukey (sezionep < 0,05 rispetto al gruppo di controllo, le barre di errore indicano SEM). Barre di scala : (A) 0,5 mm, (B) 2 mm e (C) 0,5 mm. Questa cifra è stata modificata da uno studio precedente13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Effetti di MMC sull'espressione della proteina cellulare. Gli hHSF e gli hNSF sono stati sottoposti a colture in condizioni MMC per 6 giorni. Lisati interi a cellule sono stati preparati con tampone RIPA contenente cocktail inibitore proteasi, vanadate di sodio e fluoruro di sodio. La concentrazione proteica è stata misurata utilizzando l'ansay proteico. Vengono presentate immagini rappresentative. Per l'analisi quantitativa, le intensità delle singole bande proteiche sono state misurate con densitometria, normalizzate in GAPDH e convertite in percentuale dell'hNSF nel mezzo normale utilizzando il software ImageJ. Tutti gli esperimenti sono stati effettuati 3 volte utilizzando cellule di tre donatori non correlati. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando ANOVA unidirezionale con il post-test di Tukey(p < 0,05, le barre di errore indicano SEM). Questa cifra è stata modificata da uno studio precedente13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Effetti di MMC sull'espressione genica cellulare. Gli hHSF e gli hNSF sono stati coltivati in condizioni MMC per 6 giorni. L'RNA totale è stato raccolto utilizzando un kit di analisi, e il primo filamento cDNA è stato sintetizzato utilizzando il kit di sintesi cDNA. L'espressione genica bersaglio è stata normalizzata in GAPDH e convertita nella percentuale dell'hNSF nel mezzo normale. Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti 3 volte utilizzando cellule di tre donatori non correlati. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando ANOVA unidirezionale con il post-test di Tukey(p < 0,05, le barre di errore indicano SEM). Questa cifra è stata modificata da uno studio precedente13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo protocollo mira a ottimizzare e autenticare un modello in vitro migliorato:scar-in-a-jar per il tessuto cicatriziale cutaneo umano. Studi precedenti hanno segnalato l'applicazione della tecnica MMC ai fibroblasti polmonari umani12, cellule staminali mesenchymiche del midollo osseo umano23e fibroblasti dermici umani23 utilizzando dextran12, Ficoll12e PVP23 come crowder. Nello studio riportato qui, il protocollo precedentemente pubblicato per i fibroblasti ipertrofi della pelle umana a cicatrici è stato ottimizzato con Ficoll o PVP come crowder.
La selezione e la concentrazione di crowder macromolecolari sono parametri critici, in quanto non producono risultati equivalenti. Uno studio precedente ha riferito che PVP40 (18% FVO) e PVP360 (54% FVO) migliorano significativamente la deposizione di collagene e la proliferazione cellulare nei fibroblasti dermici23 (effetti del PVP a FVOs >54% non sono testati). Tuttavia, queste due condizioni non funzionano in modo coerente per hHSF utilizzando questo protocollo.
Come mostrato nella Figura 1, Ficoll migliora significativamente la deposizione di collagene I rispetto al controllo, mentre PVP non ha effetti significativi. Ficoll al 9% FVO aumenta significativamente la quantità totale di collagene e collagene tipo ho rispetto a Ficoll al 18% FVO. Inoltre, è fondamentale utilizzare cellule di basso passaggio, poiché i fibroblasti dermici primari hanno una durata di vita limitata nella coltura24. È stato scelto di utilizzare solo hHSF appena isolato per mantenere il fenotipo in vivo. Dopo una coltivazione prolungata, gli hHSF primari mostrano una morfologia insolita e risposte funzionali atipiche. Si raccomanda inoltre che il mezzo MMC sia integrato con acido ascorbico, un induttore chiave di sintesi del collagene in hHSF25. Inoltre, è suggerito da altri ricercatori di utilizzare gli stessi anticorpi elencati nella Tabella dei materiali per studi correlati all'HHSF; tuttavia, gli anticorpi devono essere convalidati se si applica questo protocollo ad altri tipi di cellule.
Come riportato nei risultati rappresentativi, l'inclusione di folletti macromolecolari è stata trovata per stimolare l'espressione del collagene (ad esempio, collagene I, collagene IV, MMP e IL6) in hHSF rispetto agli hHSF che sono stati coltivati utilizzando condizioni classiche non MMC. Si sostiene che il modello MMC ottimizzato conserva aspetti del fenotipo in vivo degli hHSF, ricapitolando la loro morfologia caratteristica, la biochimica, la fisiologia e l'abbondante matrice extracellulare del tessuto cicatriziale cutaneo in vivo (in contrasto con gli attuali approcci di coltura 2D). Non siamo in grado di identificare alcun modello in vitro simile che sia in grado di riassumere simili proprietà simili a quelle di in vivo. Rispetto ai modelli animali esistenti, questo protocollo MMC è più rapido e più facile da usare, conveniente ed efficiente in termini di tempo. Il cutumido e altri ha stabilito un modello di cicatrice ipertrofica porcina utilizzando lesioni termiche, che sembra avere caratteristiche simili a quelle delle cicatrici ipertrofie umane26. Tuttavia, oltre ai costi e al tempo necessari per mantenere gli animali, l'esperimento richiede più di 3 mesi per completare26. Questo modello MMC ottimizzato richiede circa 1 settimana di preparazione prima di essere pronto per l'uso.
Il protocollo offre un modello in vitro avanzato per l'esame di nuove terapie anti-cicatriziali. Il modello MMC è stato utilizzato per valutare la Shikonina, una molecola precedentemente riportata per inibire la formazione de novo delle cicatrici, per la bonifica delle cicatrici ipertrofie mature27,,28. Una valutazione simile di nuovi composti e interventi che utilizzano approcci classici alla scoperta di farmaci e alla scoperta di un concetto richiederebbe notevoli risorse, fondi e tempo. Questo studio ha richiesto finanze minime e può essere completato entro diversi mesi. Il protocollo è flessibile e facilmente adattabile per le applicazioni nello sviluppo e nella valutazione di nuovi trattamenti per cicatrici ipertrofi prima degli studi sugli animali.
Inoltre, questo protocollo può essere ulteriormente modificato per sviluppare più proprietà "in vivo". Ad esempio, la presenza di TGF-1 sovrabbondante è una scoperta coerente nei tessuti ipertrofici, mediando la formazione di cicatrici stimolando la sintesi del collagene e la deposizione28. Il TGF-1 potrebbe essere facilmente incorporato nel protocollo MMC e migliorare ulteriormente la ricapitolazione della patologia in vivo. Non abbiamo ancora esplorato il pieno potenziale del modello, che può essere utile per altre patologie correlate al collagene e all'ECM (ad es. scleroderma, fibrosi polmonare, fibrosi endomiocardiale, ecc.). Inoltre, sarebbe interessante osservare gli effetti della console MMC sulle cellule per un periodo di coltura più lungo, ad esempio 2 o 3 settimane. Vale anche la pena valutare ulteriormente gli effetti di MMC sull'architettura gerarchica cellulare e ECM e sull'allineamento, in particolare l'orientamento del collagene, poiché queste caratterizzazioni sono essenziali per la formazione di tessuto cicatriziale in vivo.
Una delle principali limitazioni di questo protocollo è la restrizione dei tipi di cellule. La formazione di cicatrici ipertrofiche comporta la partecipazione di varie popolazioni cellulari, e le interazioni tra diversi tipi di cellule svolge un ruolo essenziale nella formazione delle cicatrici. Ad esempio, anche i cheratinociti svolgono un ruolo importante nella guarigione delle ferite cutanee e nella formazione delle cicatrici29. Incorporare ulteriori popolazioni di cellule in questo modello migliorerà notevolmente il suo significato nella ricerca futura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti dell'Agenzia per la Scienza, la Tecnologia e la Ricerca di Singapore "SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research" e della "Wound Care Innovation for the Tropics" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Gli autori riconoscono con gratitudine i consigli e l'assistenza del Dr. Paula Benny e del Dr. Michael Raghunath.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
- Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
- Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
- Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
- Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
- Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Fan, C., et al. Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
- Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, Pt 7 1341-1353 (2005).
- Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
- Ernst, O., Zor, T.
- Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
- Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
- Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
- Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
- Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
- Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
- Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
- Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
- Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
- Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
- Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
- Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H.
