Este protocolo describe el uso de aglomeración macromolecular para crear un modelo de tejido cicatricial humano in vitro que se asemeja a condiciones in vivo. Cuando se cultivan en un ambiente macromolecular lleno de gente, los fibroblastos de la piel humana exhiben fenotipos, bioquímica, fisiología y características funcionales que se asemejan al tejido cicatricial.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Modelo In Vitro de Cicatrices Hipertróficas Cutáneas Humanas usando Crowding Macromolecular
En este artículo
Resumen
Resumen
Se ha demostrado que los tejidos in vivo están muy llenos de proteínas, ácidos nucleicos, ribonucleoproteínas, polisacáridos, etc. El siguiente protocolo aplica una técnica de aglomeración macromolecular (MMC) para imitar este hacinamiento fisiológico mediante la adición de polímeros neutros (crowders) a cultivos celulares in vitro. Estudios previos con Ficoll o dextran como crowders demuestran que la expresión de colágeno I y fibronectina en las líneas celulares WI38 y WS-1 se mejoran significativamente mediante la técnica MMC. Sin embargo, esta técnica no ha sido validada en fibroblastos primarios de piel humana derivados de cicatrices hipertróficas (hHSF). A medida que la cicatrización hipertrófica surge de la excesiva deposición de colágeno, este protocolo tiene como objetivo construir un modelo de cicatriz hipertrófica in vitro rico en colágeno mediante la aplicación de la técnica MMC con hHSFs. Se ha demostrado que este modelo MMC optimizado posee más similitudes con el tejido cicatricial in vivo en comparación con los sistemas tradicionales de cultivo celular de 2 dimensiones (2-D). Además, es rentable, eficiente en el tiempo y éticamente deseable en comparación con los modelos animales. Por lo tanto, el modelo optimizado reportado aquí ofrece un modelo avanzado "in vivo-como" para estudios hipertróficos relacionados con la cicatriz.
Introducción
El tejido cicatricial representa la variable de reparación del tejido. Sin embargo, en muchos individuos, especialmente aquellos que sufren de quemaduras o trauma1, las cicatrices pueden ser excesivas e imponer efectos indeseables en la morfología y el funcionamiento de la piel curada. Aunque no se entienden completamente los mecanismos exactos de la formación patológica (cicatrices hipertróficas y queloides), la deposición excesiva de colágeno durante la cicatrización de heridas ha demostrado ser una contribución esencial2.
Está bien establecido que la transformación del factor de crecimiento....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Cultivo celular
- Mantener los hHSF y los fibroblastos dérmicos normales derivados del tejido no patológico (hNSF) en el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco que contiene un 10% de suero fetal (FCS) y una solución de 1% v/v de penicilina/estreptomicina (P/S) a 37oC en una incubadora con un 5% de CO 2/95% de aire.2
- Compra Ficoll 70, Ficoll 400 y ácido ascórbico de las empresas apropiadas.
2. Construcción del modelo de cicatrices hipertróficas MMC
- Sembrar los hHSF o hNSF (50.000/pozo) en una placa de 24 pocillos que contiene 1 ml de medios en cada pocal.
- Colocar en una incubad....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
En cada experimento se realizaron muestras de triplicado, y cada experimento se repitió 3 veces utilizando células de tres pacientes individuales. Los datos se expresan como porcentajes del grupo de control. Se aplicaron la prueba post-hoc de ANOVA unidireccional y Tukey para analizar las diferencias estadísticas (*p . 0,05).
MMC utilizando Ficoll al 9% FVO (ocupación de volumen fraccionario) mejora la cantidad total de colágeno y colágeno I deposición en hHSF13
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este protocolo tiene como objetivo optimizar y autenticar un modelo in vitro mejorado :scar-in-a-jar" para el tejido cicatricial cutáneo humano. Estudios anteriores han informado de la aplicación de la técnica MMC a los fibroblastos pulmonares humanos12, células madre mesenquimales de médula ósea humana23,y fibroblastos dérmicos humanos23 utilizando dextran12,Ficoll12y PVP23 como.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la financiación de la Agencia de Ciencia, Tecnología e Investigación de Singapur "SPF 2013/004: Investigación Básica de La Biología de la Piel" y la "Innovación para el Cuidado de la Herida para los Trópicos" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Los autores agradecen el asesoramiento y la asistencia de la Dra. Paula Benny y la Dra. Michael Raghunath.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.2 μ m filtro | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| anticuerpo primario alfa de actina de músculo liso (αSMA) | Abcam | AB5694 | |
| Sistema de PCR en tiempo real rápido 7500 de Applied Biosystems (termociclador) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ácido ascórbico | Wako | #013-12061 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford ensayo de proteínas | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Anticuerpo primario de colágeno I (para inmunotinción) | Abcam | 6308 | |
| Anticuerpo primario de colágeno I (para western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Anticuerpo primario de colágeno III | Abcam | ab7778 | |
| Anticuerpo primario de colágeno IV | Abcam | ab6586 | |
| Rojo directo 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Suero fetal de ternera (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| Anticuerpo primario GAPDH | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Anticuerpo secundario anti-conejo | Abcam | ab97050 | |
| Cicatriz hipertrófica humana/fibroblastos normales (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| Kit de síntesis de ADNc iScript | Bio-Rad | #1708890 | |
| Anticuerpo primario MMP-1 | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 anticuerpo primario | Abcam | ab39012 | |
| Anticuerpo primario MMP-2 | Abcam | ab37150 | |
| Anticuerpo primario MMP-9 | Abcam | ab38898 | |
| Espectrofotómetros de microvolumen NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Membrana de nitrocelulosa | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Geles de proteína | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Tampón de bloqueo Odyssey | LI-COR Biosciences | 927– 40000 | |
| Odyssey Fc Sistema de imagen | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Microscopio Olympus IX-81 HCS (para inmunotinción) | Olympus | N/A Solución | |
| penicilina/estreptomicina (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Ensayos PrimePCR | Bio-Rad | Imprimaciones personalizadas prerrecubiertas en placas de 96 pocillos según los requisitos | |
| Cóctel inhibidor de proteasa (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| tampón RIPA | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Vanadato de sodio | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodio vanadato | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Lector de microplacas multimodo | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
Referencias
- vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
- Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
