Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

В vitro Модель человека кожные гипертрофические рубцы с помощью макромолекулярной crowding

Published: May 1, 2020 doi: 10.3791/61037
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1, 1,3, 1
1Skin Research Institute of Singapore, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 2School of Chemical and Life Sciences, Singapore Polytechnic, 3Institute of Medical Biology, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)

Summary

Этот протокол описывает использование макромолекулярной скученности для создания в пробирке человеческой гипертрофической модели рубцовой ткани, которая напоминает условия in vivo. При выращивании в переполненной макромолекулярной среде фибробласты кожи человека демонстрируют фенотипы, биохимию, физиологию и функциональные характеристики, напоминающие рубцовую ткань.

Abstract

Было показано, что ткани in vivo очень переполнены белками, нуклеиновыми кислотами, рибонуклеопротеитами, полисахаридами и т.д. Следующий протокол применяет макромолекулярную методика скученности (MMC), чтобы имитировать эту физиологическую скученность через добавление нейтральных полимеров (краудеров) к клеточным культурам in vitro. Предыдущие исследования с использованием Ficoll или dextran в качестве краудтеров показывают, что выражение коллагена I и фибронектина в линиях клеток WI38 и WS-1 значительно усиливается с помощью метода MMC. Тем не менее, этот метод не был проверен в первичных гипертрофических рубцов полученных человеческих фибробластов кожи (hHSFs). Как гипертрофические рубцы возникает из-за чрезмерного осаждения коллагена, этот протокол направлен на создание коллагена богатых в пробирке гипертрофической модели рубца, применяя технику MMC с hHSFs. Эта оптимизированная модель MMC, как было показано, обладает большим сходством с рубцовой тканью in vivo по сравнению с традиционными 2-мерными (2-D) системами клеточной культуры. Кроме того, это экономически эффективным, экономичным и этически желательным по сравнению с животными моделями. Таким образом, оптимизированная модель сообщила здесь предлагает передовые "виво-как" модель для гипертрофических рубцов, связанных исследований.

Introduction

Рубцовая ткань представляет собой конечную точку восстановления тканей. Тем не менее, у многих людей, особенно тех, кто страдает от ожогов или травм1, рубцы могут быть чрезмерными и налагать нежелательное воздействие на морфологию и функционирование исцелил кожи. Хотя точные механизмы патологических (гипертрофические рубцы и келоиды) образование рубцов не до конца изучены, чрезмерное осаждение коллагена во время заживления ран было продемонстрировано, чтобы быть существенным вкладом2.

Хорошо известно, что преобразование фактора роста бета 1 (TGF-No1) и альфа-гладкий мышечный актин (ЗСМА) играют ключевую роль в формировании гипертрофированного рубцов. Фактические данные свидетельствуют о том, что повышенный TGF-No1 непосредственно стимулирует чрезмерное осаждение коллагена через регулирование сигнального пути SMAD3. Кроме того, было установлено, что ЗСМА способствует гипертрофическому образованию рубцов, регулируя сокращение клеток и репиттелилиализацию в процессе заживления ран4. Отсутствие подходящих моделей in vitro и in vivo является основным препятствием на пути разработки и оценки мероприятий и методов лечения рубцов. Цель этого исследования заключается в использовании существующей техники MMC для создания "виво-как" гипертрофические рубцовая модель, которая подходит для оценки новых и возникающих рубцов, связанных с вмешательствами.

Воспроизводство живой ткани вне тела было целью в течение многих лет в научном сообществе. Развитие методов in vitro в начале ХХ века частично достигло этой цели. Текущие методы in vitro слегка эволюционировали от первоначальной демонстрации Ру, что эмбриональные клетки могут выжить ex vivo в течение нескольких дней в теплом сольнике5. Тем не менее, методологии in vitro в основном ограничиваются одноклеточными типами, культивируемыми в 2-D, и не точно переизглажают ткани in vivo. Хотя полезно для изучения биохимии клеток, физиологии и генетики, родные ткани 3-D и включают несколько типов клеток. Простые 2-D системы in vitro подвергают клетки млекопитающих высокоискусственной среде, в которой родная ткань-специфическая архитектура теряется6. В свою очередь, это влияет на внутриклеточные и внеклеточные события, в результате чего аномальные морфологии клеток, физиологии и поведения7.

Интерес к этому протоколу лежит в разработке и клиническом ведении гипертрофированными рубцов и келоидов. Хотя хорошо установлено, что дермальные фибробласты в значительной степени ответственны за обильное производство коллагенов, присутствующих в рубцовой ткани, культивирование кожных фибробластов с использованием 2-D в пробирке систем не может воспроизвести оборот коллагена наблюдается в vivo8. Современные методы in vitro по-прежнему по существу используют "теплый солин", среду, полностью отличающаяся от среды в живых тканях. Ткани in vivo чрезвычайно переполнены, с белками, нуклеиновыми кислотами, рибонуклеопротеитами и полисахаридами, занимающими 5%-40% от общего объема. Поскольку ни одна из двух молекул не может занимать одно и то же пространство одновременно, свободного пространства мало и почти полное отсутствие свободной воды9.

Метод MMC налагает ограничения, влияющие на термодинамические свойства цитозола и интерстициальных жидкостей. Молекулярные взаимодействия, рецептор-лиганд сигнальные комплексы, ферменты и органеллы ограничены и ограничены от свободного взаимодействия9. Взаимодействия в периклеарной среде (т.е. интерститиум) также ограничены. Последние данные подтверждают, что высокие концентрации инертных макромолекулов в переполненных растворах возмущения диффузии, физической ассоциации, вязкости и гидродинамических свойств10.

Интересно, что несколько популярных агентов скученности (нат., Ficoll, dextran, polyvinylpyrrolidone »PVP» и натрий 4-styrenesulfonate »PSS») не эквивалентны при применении к различным типам клеток и в различных условиях. В одном предыдущем исследовании, Фиколл, как сообщается, менее цитотоксических для мезенхимальных стволовых клеток по сравнению с PVP. Эти результаты были интерпретированы как следствие его нейтрального заряда и относительно небольшого гидродинамического радиуса11. В отличие от этого, второе исследование показало, что декектин является более эффективным в стимулировании коллагена Я осаждения человека фибробластов легких по сравнению с Ficoll12. Данные нашего собственного исследования показывают, что Фиколл усиливает осаждение коллагена гипертрофированными рубцовами фибробластов, в то время как PVP является токсичным для этих клеток13.

Было продемонстрировано, что преобразование проколлагена в коллаген быстрее в очень переполненном in vivo окружающей среды14, в то время как скорость биологических реакций задерживается в разбавленной 2-D культуры системы15. Мы оптимизировали протокол in vitro здесь, включая MMC, чтобы показать выращивание кожных фибробластов, служащих в качестве более "виво-подобной" модели дермального фиброза и образования рубцов. В отличие от общей 2-D культуры системы, культивирование hHSFs с MMC стимулирует биосинтез и осаждение коллагена значительно13. Примечательно, что в этом оптимизированном протоколе MMC13проявляются и другие характеристики фиброза (т.е. повышенная экспрессия матричных металлопротеиназ и провоспалительных цитокинов). При выращивании с помощью этого метода, показано, что дермальные клетки резюмируют физиологические, биохимические и функциональные параметры, измеренные в vivo.

Оптимизированный протокол MMC in vitro был использован для оценки экспрессии коллагена и других белков ECM дермическими фибробластами, изолированными от гипертрофических рубцовой дермы и невовлеченной смежной дермы. При выращивании в средах MMC in vitro было отмечено, что hHSFs выражают определенные характеристики (т.е. мРНК, биохимия, физиология и фенотип), похожие на дермальные гипертрофические рубцовые ткани in vivo. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что физические и химические свойства являются важными соображениями при выборе сеулеров и оптимизации условий MMC для выращивания в пробирке.

Для доказательства принципа здесь применяется протокол MMC для качественной и количественной оценки способности Шиконина и его аналогов вызывать апоптоз. Это позволяет оценить потенциальные применения этих естественно полученных традиционной китайской медицины (TCM) соединений для управления кожные рубцы13. Несмотря на это, простота, рентабельность и своевременность этого протокола in vitro MMC также удовлетворяет недавние правила по ликвидации экспериментов на млекопитающих директивой ЕС 2010/63/EU и Агентством по охране окружающей среды США (EPA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Культура клеток

  1. Поддержание hHSFs и нормальных кожных фибробластов, полученных из непатологических тканей (hNSFs) в модифицированной среде Орла Dulbecco (DMEM), содержащей 10% фетальной икроножной сыворотки (FCS) и21% v/v пенициллин/стрептомицин раствор (P/S) при 37-C в инторе с 5%
  2. Купить Ficoll 70, Ficoll 400, и аскорбиновой кислоты от соответствующих компаний.

2. Конструкция гипертрофической модели шрама MMC

  1. Семя hHSFs или hNSFs (50,000/well) в 24 хорошо пластины, содержащие 1 мл носителей в каждой скважине.
  2. Поместите в инкубатор 37 градусов по Цельсию при 5% CO2 и оставьте на ночь.
  3. Подготовьте средства массовой информации MMC. Основываясь на общем объеме, необходимом для эксперимента, производят 10% FCS/DMEM-носителей, смешивая Ficoll 70 (18,75 мг/мл), Ficoll 400 (12,5 мг/мл) и аскорбиновую кислоту (100 мкм).
  4. Поместите смесь в водяную ванну 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч, чтобы разогнать сеулеров в раствор, затем стерилизовать MMC-носители с помощью фильтра 0,2 мкм.
  5. Аспирируйте отработанные средства массовой информации и заменяете свежеприготовленными MMC-сми.
  6. Инкубировать клетки в течение 6 дней при 37 и 5% CO2, меняя средства массовой информации каждые 3 дня.

3. Выражение общего количества коллагена

  1. Подготовка красного раствора Sirius (0,1% ж/в). Растворите 0,2 г порошка Direct Red 80 в 200 мл дистиллированной деионированной воды (ddH2O) с 1 мл уксусной кислоты.
  2. Аспирировать MMC средств массовой информации и добавить 300 Зл Сириус Красный раствор в каждой скважине. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 90 мин.
  3. Аккуратно промыть раствор Sirius Red водопроводной водой и дать пластине высохнуть на ночь.
  4. Извлеките пятно Sirius Red, добавив в каждую скважину 200 л гидроксида натрия (0,1 М). Поместите пластину на орбитальный шейкер в течение 5-10 минут, чтобы полностью извлечь пятно Sirius Red.
  5. Передача 100 л извлеченного красного пятна Sirius Red в прозрачную пластину 96 скважин и измерьте абсорбцию на уровне 620 нм с помощью микроплитного считывателя.

4. Выражение коллагена I (иммуностоидинг)

  1. Вымойте скважины с помощью 200 л фосфатно-буферного сосудистого раствора (PBS, рН 7,35).
  2. Исправьте клетки с помощью метанола (500 л/ну) при 4 градусах по Цельсию в течение 10 мин.
  3. Блок неспецифических взаимодействий с 3% бычьей сыворотки альбумина в течение 30 минут при комнатной температуре (RT).
  4. Аспирировать блокирующий раствор и инкубировать с 200 зл антиколлагена I антитела (10 мкг/мл) в течение 90 минут на RT.
  5. Аспирируй первичное антитело и мойте 3x с PBS в течение 5 мин каждый.
  6. Инкубировать с 200 зл козла анти-Rabbit-FITC вторичных антител (1:400 разбавления) и 4',6-диамидино-2-фенилинол (DAPI; 1: 2000 разбавления) в течение 30 мин на RT. Обложка пластины с алюминиевой фольгой.
  7. Откажитесь от вторичных антител и DAPI и промыть 3x с PBS в течение 5 минут каждый.
  8. Визуализируйте флуоресценцию окрашивания непосредственно под микроскопом.

5. Западный blotting

  1. Вымойте клетки 2x с PBS.
  2. Добавьте 40 qL буфера lysis в каждую скважину и соскребите слой клетки кончиком пипетки. Буфер лисиса содержит буфер RIPA, коктейль-ингибитор протеазы (PIC), ванадат натрия 2 мМ и фтор натрия 10 мМ.
  3. Передача белка лизат в микроцентрифуговых трубах и измерения концентрации белка с помощью протеинового анализа в соответствии с инструкциями производителя16.
  4. Загрузите 10 мкг белка каждой группы в скважины 4%-12% белковых гелей Bis-Tris. Выполните натрия dodecyl сульфат полиакриламид гель электрофоресис (SDS-PAGE) при 200 В в течение 30 мин.
  5. Перенесите белок в мембрану нитроцеллюлозы, запустив вестернную подувку при 90 В в течение 90 мин. Избегайте образования пузырьков воздуха между гельом и мембраной нитроцеллюлозы.
  6. Заблокируйте мембрану 10 мл блокирующего буфера.
  7. Инкубировать с первичными антителами при 4'C ночь. Первичными антителами являются: антиколлаген I, антиколлаген III, антиколлаген IV, анти-ЗСМА, анти-ММП-1, анти-ММП-2, анти-ММП-9, анти-ММП-13 и анти-глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH).
  8. Вымойте мембрану с 0,1% TBS-Tween 20 (5x на 5 мин каждый). TBS/Tween 20 (1 Л) содержит следующее: 50 мл 1 М Трис (рН 7,4), 30 мл 5 М хлорида натрия, 1 мл Tween 20, и 920 мл ddH2O.
  9. Инкубировать с видом соответствующих вторичных антител на RT в течение 1 ч.
  10. Повторите шаг 5.8 и визуализировать флуоресценцию с помощью системы визуализации.

6. РТ-ПЦР

  1. Соберите общую РНК с помощью буфера лизиса, смешанного с 2-меркаптоэтанолом, включенным в набор асссеа для удаления РНК.
  2. Очистите РНК в рамках инструкций производителя17.
  3. Измерьте концентрацию РНК с помощью микротомного спектрофотометра.
  4. Выполните первый синтез пряди cDNA с помощью комплекта синтеза кДНК в рамках инструкций производителя.
  5. RT-PCR олигонуклеотид ные обеспечиваются (предварительно) в пользовательских 96 скважинных пластин. Смешайте 100 нг образцов кДНК с 10 зл и зеленым супермиксом SYBR в настраиваемую пластину.
  6. Увеличьте общий объем до 20 л/хорошо с помощью ddH2O.
  7. Запустите RT-PCR с помощью теплового велосипеда в соответствии с инструкциями производителя: 40 циклов денатурирования при 98 градусах по Цельсию на 15 с и аннулировании/расширении при 60 градусах по Цельсию за 60 с. Гены, протестированные в RT-PCR включают в себя: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3, TGFB1, и VEGF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Трипликатные образцы были выполнены в каждом эксперименте, и каждый эксперимент был повторен 3x с использованием клеток из трех отдельных пациентов. Данные выражаются в процентах контрольной группы. Для анализа статистических различий были применены односторонние ANOVA и пост-специальный тест Tukey(п. 0,05).

MMC с использованием Ficoll на 9% FVO (фракционная заполняемость объема) повышает общее количество коллагена и коллагена I осаждения в hHSF13. Как показано на рисунке 1A, плотность клеток hHSFs значительно увеличилась после культивирования с Ficoll на 9% и 18% FVO по сравнению с контролем и MMC с помощью PVP. Рисунок 1B,C указывает на то, что Фиколл (на 9% FVO) значительно улучшил осаждение коллагена (в ключая коллаген i) по сравнению с другими формулировками MMC. Количественный анализ(рисунок 1D,E) далее показал, что Фиколл (на 9% FVO) наиболее эффективно улучшил осаждение коллагена.

hHSFs и hNSFs, культивируемые в средах MMC, были найдены для регулирования экспрессии видов ECM в дополнение к коллагену13. Данные, представленные на рисунке 2, свидетельствуют о том, что, когда hHSFs и hNSFs культивировались с помощью MMC, экспрессия коллагена IV также значительно возросла. Матрица металлопротеиназы (ММП) играют важную роль во время заживления ран и образования рубцов, регулируя eCM сборки, и ремоделирования18. ММП также способствуют пролиферации клеток, миграции клеток, ангиогенеза и апоптоза19. Примечательно, что повышенное выражение ММП было обнаружено, чтобы накопить в гипертрофических рубцовых тканей по сравнению с родной ткани20. Было отмечено, что выражение MMP-2, -9 и -13 было значительно upregulated в обоих hNSF и hHSF культур культивируется в средах MMC.

Мы также исследовали синтез интерлейкина-6 (IL-6) и сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF); однако, они были необнаружимы в западной погревить. В отличие от этого, rt-PCR анализ(рисунок 3) показал, что выражение IL6 был значительно upregulated, в то время как выражение VEGF был downregulated в hNSFs и hHSFs культивируется в условиях MMC. Увеличенное выражение IL-6 было продемонстрировано для того чтобы способствовать к гипертрофическому образованиюшрама 21. Парадоксально, но также сообщается, что образование гипертрофических рубцов связано с повышенным выражением VEGF22. Анализ РТ-ПЦР, проведенный здесь, показал, что выражение VEGF значительно ослаблено в hNSF и hHSFs, культивируемых в условиях MMC.

Наконец, результаты продемонстрировали как 1) увеличение синтеза коллагенов, коллагена I, коллагена IV, MMP-2, MMP-9, и MMP-13 de novo и 2) повышенной экспрессии IL6 mRNA в HHSFs и hNSFs. Взятые вместе, эти данные показывают, что выращивание первичных hHSFs и hNSFs в средствах массовой информации формулировки, которые включают результаты MMC в удержании характерной экспрессии генов, биохимии и фенотипов наблюдается в родной гипертрофической рубцовой ткани in vivo, что приводит к надежной "шрам-в-банк" модель.

Figure 1
Рисунок 1: MMC увеличивает общее количество коллагена и коллагена I осаждения в hHSFs. (A) Клеточная морфология, (B) тотальные коллагены, окрашенные Сириус омичем, (С) коллаген I выражением, продемонстрированная иммунофлуоресценцией, (D) количественный анализ общего коллагена и (Е) количественный анализ осаждения коллагена I. hHSFs были культивированы в средствах массовой информации, дополненных Ficoll (9% и 18% FVO), PVP40 (18% FVO), или PVP360 (54% и 72% FVO), в течение 6 дней. Были выбраны репрезентативные изображения. Количественная оценка изображения была выполнена с помощью ImageJ и выражается как средний процент управления. Все эксперименты были повторены 3x с использованием клеток, изолированных от трех неродственных доноров. Статистический анализ был проведен с использованием односторонней ANOVA с пост-тестTu(p qlt; 0.05 против контрольной группы, бары ошибок указывают SEM). Шкала баров (A) 0,5 мм, (B) 2 мм, и (C) 0,5 мм. Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущим исследованием13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Влияние MMC на экспрессию клеточного белка. hHSFs и hNSFs культивировались в условиях MMC в течение 6 дней. Целые клеточные лисаты были подготовлены с буфером RIPA, содержащим коктейль-ингибитор протеазы, ванадат натрия и фтор натрия. Концентрация белка была измерена с помощью протеинового анализа. Представлены репрезентативные изображения. Для количественного анализа интенсивность отдельных белковых полос была измерена с помощью денситометрии, нормализована в GAPDH и преобразована в процент от hNSF в обычной среде с использованием программного обеспечения ImageJ. Все эксперименты были проведены в 3x с использованием клеток из трех неродственных доноров. Статистический анализ был проведен с использованием односторонней ANOVA с пост-тестTu(p slt; 0.05, бары ошибок указывают SEM). Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущим исследованием13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Влияние MMC на экспрессию генов клеток. hHSFs и hNSFs культивировались в условиях MMC в течение 6 дней. Общая РНК была собрана с помощью набора ассеа, а первая прядь cDNA была синтезирована с помощью набора синтеза кДНК. Целевое выражение гена было нормализовано до GAPDH и преобразовано в процент hNSF в нормальной среде. Все эксперименты были повторены 3x с использованием клеток из трех неродственных доноров. Статистический анализ был проведен с использованием односторонней ANOVA с пост-тестTu(p slt; 0.05, бары ошибок указывают SEM). Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущим исследованием13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол направлен на оптимизацию и аутентификации улучшенной модели in-scar-in-a-jar для человеческой кожной рубцовой ткани. Предыдущие исследования сообщили о применении метода MMC для человека фибробластов легких12, человеческий костный мозг мезенхимальных стволовых клеток23, и человека дермальных фибробластов23 с использованием dextran12, Ficoll12, и PVP23 как толпы. В исследовании, опубликованном здесь, ранее опубликованный протокол для гипертрофированный шрам полученных человеческих фибробластов кожи была оптимизирована с Ficoll или PVP как crowders.

Отбор и концентрация макромолекулярных краудеров являются критическими параметрами, так как они не дают эквивалентных результатов. Предыдущее исследование сообщило, что PVP40 (18% FVO) и PVP360 (54% FVO) значительно повысить осаждение коллагена и пролиферации клеток в дермальных фибробластов23 (эффекты ПВП на FVOs;54% непроверены). Тем не менее, эти два условия не работают последовательно для hHSFs с помощью этого протокола.

Как показано на рисунке 1, Фиколл значительно повышает осаждение коллагена I по сравнению с контролем, в то время как PVP не имеет значительных эффектов. Фиколл на 9% FVO значительно увеличивает общее количество коллагена и коллагена типа I по сравнению с Ficoll на 18% FVO. Кроме того, очень важно использовать клетки низкого прохода, так как первичные кожные фибробласты имеют ограниченный срок службы в культуре24. Было выбрано использовать только только только изолированные hHSF для того чтобы сохранить phenotype in vivo. После длительного культивирования первичные HHSFs демонстрируют необычную морфологию и нетипичные функциональные реакции. Также рекомендуется, чтобы среда MMC была дополнена аскорбиновой кислотой, ключевым индуктором синтеза коллагена в hHSF25. Кроме того, другие исследователи предлагают использовать те же антитела, перечисленные в таблице материалов, для исследований, связанных с hHSF; однако, антитела должны быть проверены, если применение этого протокола к другим типам клеток.

Как сообщается в репрезентативных результатах, включение макромолекулярных краудеров было установлено, чтобы стимулировать экспрессию коллагена I, коллагена I, ММП и IL6) в hHSFs по сравнению с hHSFs, которые культивировались с использованием классических условий, не связанных с ММК. Утверждается, что оптимизированная модель MMC сохраняет аспекты hHSFs' in vivo phenotype, повторяя их характерную морфологию, биохимию, физиологию и обильную внеклеточную матрицу кожной рубцовой ткани in vivo (в отличие от существующих подходов к культуре 2-D). Мы не в состоянии определить какой-либо аналогичной модели in vitro, которая способна резюмировать аналогичные "виво-подобные" свойства. По сравнению с существующими моделями животных, этот протокол MMC является более быстрым, а также более удобным, экономичным и экономичным. Cuttle et al. установили свиную гипертрофическую модель рубца с использованием термальных повреждений, которые, как представляется, имеют сходные характеристики с человеческими гипертрофическими шрамами26. Однако, в дополнение к затратам и времени, необходимых для содержания животных, эксперимент требует более 3 месяцев, чтобы завершить26. Эта оптимизированная модель MMC требует около 1 недели подготовки перед готовимостью к использованию.

Протокол предлагает передовую модель in vitro для изучения новых анти-рубцов терапии. Модель MMC была использована для оценки Шиконина, молекулы, ранее сообщалось, чтобы ингибировать де Ново образование рубцов, для восстановления зрелых гипертрофических рубцов27,28. Аналогичная оценка новых соединений и мероприятий с использованием классических подходов к обнаружению наркотиков и доказательства концепции потребует значительных ресурсов, средств и времени. Это исследование требовало минимальных финансовых средств и может быть завершено в течение нескольких месяцев. Протокол является гибким и легко адаптируемым для применения в разработке и оценке новых гипертрофических рубцов лечения до изучения на животных.

Кроме того, этот протокол может быть дополнительно изменен, чтобы развивать более "виво-подобные" свойства. Например, наличие чрезмерного TGF-No1 является последовательным выводом в гипертрофических рубцовых тканях, посредника образования рубцов, стимулируя синтез коллагена и осаждение28. ТГФ-З1 можно было бы легко включить в протокол MMC и еще больше улучшить повторение патологии in vivo. Мы еще не изучили весь потенциал модели, который может быть полезен для других коллагеновых и ECM связанных патологий (т.е. склеродермия, легочный фиброз, эндомиокардиальный фиброз и т.д.). Кроме того, было бы интересно наблюдать за воздействием MMC на клетки в течение более длительного периода культуры, например, 2 или 3 недели. Также стоит дополнительно оценить влияние MMC на клеточную и eCM иерархическую архитектуру и выравнивание, в частности ориентацию коллагена, так как эти характеристики необходимы для формирования рубцовой ткани in vivo.

Одним из основных ограничений этого протокола является ограничение типов клеток. Гипертрофированное образование рубцов включает в себя участие различных популяций клеток, и взаимодействие между различными типами клеток играет важную роль в образовании рубцов. Например, кератиноциты также играют важную роль в кожное заживление ран и образование рубцов29. Включение дополнительных популяций клеток в эту модель значительно повысит ее значимость в будущих исследованиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана финансированием из Сингапура Агентство по науке, технологиям и исследованиям "SPF 2013/004: Биология кожи Основные исследования" и "Wound Care Инновации для тропиков" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Авторы с благодарностью признают советы и помощь д-ра Паулы Бенни и д-ра Майкла Рагхунатха.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm filter Sartorius 16534
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific P36962
Alexa Fluor 680 Thermo Fisher Scientific A-21076
Alexa Fluor 800 Thermo Fisher Scientific A-11371
alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody Abcam ab5694
Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) Thermo Fisher Scientific 4351106
Ascorbic acid Wako #013-12061
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich #A2153
Bradford protein assay Bio-Rad 500-0006
Collagen I primary antibody (for immunostaining) Abcam 6308
Collagen I primary antibody (for western blot) Abcam ab21286
Collagen III primary antibody Abcam ab7778
Collagen IV primary antibody Abcam ab6586
Direct Red 80 Sigma-Aldrich 2610108
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Life Technologies 11996-065
Fetal calf serum (FCS) Life Technologies 6000-044
Ficoll 400 GE HealthCare #17-0300-10
Ficoll 70 GE HealthCare #17-0310-10
GAPDH primary antibody Sigma-Aldrich G8795
Goat Anti-Rabbit secondary antibody Abcam ab97050
Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) Cell Research Corporation 106, 107, 108
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad #1708890
MMP-1 primary antibody Abcam ab38929
MMP-13 primary antibody Abcam ab39012
MMP-2 primary antibody Abcam ab37150
MMP-9 primary antibody Abcam ab38898
NanoDrop Microvolume Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific N/A
Nitrocellulose membrane Bio-Rad 10484060
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher Scientific NP0321BOX
Odyssey blocking buffer LI-COR Biosciences 927–40000
Odyssey Fc Imaging System LI-COR Biosciences N/A
Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) Olympus N/A
Penicillin/streptomycin solution (P/S) Life Technologies 15140-122
PrimePCR Assays Bio-Rad Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement
Protease inhibitor cocktail (PIC) Sigma-Aldrich 11697498001
PVP 360 Sigma #PVP360
PVP 40 Sigma #PVP40
RIPA buffer Merck R0278
RNeasy Plus Mini Kit QIAGEN #74134
Sodium vanadate Sigma-Aldrich 450022
Sodium vanadate Sigma-Aldrich 450243
SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader Molecular Devices N/A
SsoAdvanced universal SYBR green supermix Bio-Rad #172-5270
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
  2. Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
  3. Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
  4. Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
  5. Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  7. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  8. Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
  9. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  10. Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
  11. Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
  12. Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
  13. Fan, C., et al. Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
  14. Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, Pt 7 1341-1353 (2005).
  15. Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
  16. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the bradford protein assay. Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).
  17. Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
  18. Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
  19. Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
  20. Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
  21. Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
  22. Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
  23. Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
  24. Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
  25. Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
  26. Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
  27. Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
  28. Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
  29. Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).

Tags

Биоинженерия Выпуск 159 гипертрофический рубец фибробласты макромолекулярная скученность коллаген внеклеточная матрица среда градиента плотности поливинилпирролидон
В vitro Модель человека кожные гипертрофические рубцы с помощью макромолекулярной crowding
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fan, C., Lim, L. K. P., Wu, Z.,… More

Fan, C., Lim, L. K. P., Wu, Z., Sharma, B., Gan, S. Q., Liang, K., Upton, Z., Leavesley, D. In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding. J. Vis. Exp. (159), e61037, doi:10.3791/61037 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter