Summary
Detaljerede undersøgelser af myg stadier af malaria parasitter er afgørende for at designe effektive transmission blokering strategier. Denne protokol viser, hvordan man effektivt kultur infektiøse gametocytter og derefter fodre disse gametocytter til myg til at generere myg stadier af P. falciparum.
Abstract
Malaria er fortsat et af de vigtigste folkesundhedsproblemer, der forårsager betydelig sygelighed og dødelighed. Malaria er en mygbåren sygdom, der overføres gennem en smitsom bid fra den kvindelige Anopheles myg. Malaria kontrol vil i sidste ende stole på et væld af tilgange, som omfatter måder at blokere transmission til, gennem og fra myg. For at studere myg stadier af malaria parasitter i laboratoriet, har vi optimeret en protokol til kultur meget smitsomme Plasmodium falciparum gametocytter, en parasit fase kræves til overførsel fra den menneskelige vært til myg vektor. P. falciparum gametocytter modnes gennem fem morfologisk forskellige trin, hvilket tager cirka 1-2 uger. Gametocyte kultur beskrevet i denne protokol er afsluttet i 15 dage og er smitsom for myg fra dag 15-18. Disse protokoller blev udviklet for at opretholde en kontinuerlig cyklus af infektion kompetente gametocytter og for at opretholde uafbrudt forsyning af myg stadier af parasitten. Her beskriver vi metoden for gametocytkultur og hvordan man inficerer myg med disse parasitter ved hjælp af glasmembranfødere.
Introduction
Malaria er forårsaget af Plasmodium parasitter og overføres til deres hvirveldyr værter via infektiøse bid af kvindelige Anopheles myg. Ifølge Verdenssundhedsorganisationens (WHO) rapport fra 2019 var der anslået 405.000 dødsfald fra i alt 228 millioner tilfælde af malaria1. De fleste malariarelaterede dødsfald var koncentreret i den afrikanske region, især blandt børn under fem år. Mens den samlede forekomst af malaria er faldet globalt fra 2010, i de seneste år tilbagegang har plateaued og yderligere kontrol strategier er presserende behov for at fjerne sygdommen.
Cykliske aseksuelle blod stadier af malaria parasitter forårsage sygdom patogenese og en lille delmængde af disse differentiere sig til kvindelige og mandlige gametocytter. Plasmodium falciparum gametocytter er unikke i naturen, da de tager 7-10 dage at udvikle gennem fem morfologisk forskellige stadier. Umodne gametocytter fra fase I til IV er afsondret i knoglemarvsparenkym og forbliver stort set fraværende fra perifer cirkulation2,3,4,5. Erythrocytter inficeret med modne fase V gametocytter frigives i blodbanen og cirkulerer frit for at blive taget op af myg. En gang inde i myg midgut aktiveres gametocytter gennem en ændring i temperatur og eksponering for midgut-miljøet til kvindelige og mandlige gameter og begynder udviklingen af mygstadiet, som kulminerer med de infektitive stadier af sporozoitter i mygspytkirtlerne6,7.
Siden Trager og Jenson8 beskrev en standardiseret metode til kultur P. falciparum, undersøgelser af de aseksuel blod faser har langt fremskreden. Manglen på et pålideligt kultursystem for seksuelle stadier har imidlertid gjort det vanskeligt at studere P. falciparum gametocytter, transmissionsbiologi og myggestadier. I de senere år er der blevet offentliggjort flere metoder , som har hjulpet laboratorier med at etablere vildtatcytkulturer9,10,11,12. Dette manuskript beskriver standardiserede og pålidelige protokol til kultur P. falciparum gametocytter, der kan repræsentere en værdifuld ressource for malaria forskning samfund. Denne metode muliggør robust produktion af modne og smitsomme gametocytter, som sammen med en standardiseret myg fodring protokol, resulterer i meget pålidelig myg infectivity. Disse metoder blev etableret for at opretholde uafbrudt forsyning af gametocytter og mygstadiet parasitter. I dette manuskript beskriver vi en grundig gametocytkulturprotokol (Figur 1), forberedelse af glasmembranfødere og infektion af myg ved hjælp af disse membranfødere (Figur 2), dissektion af midgut (Figur 3) og spytkirtel af myg (Figur 4) og kvantificering af infektion i myg efter midgut og spytkirtel dissektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Blodsamlinger beskrevet nedenfor er blevet godkendt af Institutional Review Board of Johns Hopkins University. P. falciparum dyrkes i friske RBCs under sterile forhold i et biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) anlæg, og forsigtighed bruges til at håndtere biologiske materialer. Efter hvert trin, der involverer blod eller blodprodukter, skylles hvert plastvarer eller glasvarer med 10% blegemiddel i emhætten, før de bortskaffes korrekt.
1. Reagenser og tilberedning
- Parasit isolere P. falciparum NF54 (se Tabel over materialer) blev brugt, som kan producere infektiøse gametocytter i op til to måneder, mens i kontinuerlig kultur.
BEMÆRK: Ikke alle kulturtilpassede parasitlinjer producerer gametocytter, og NF54-isolater med lav passage er mest konsistente. - O+ Erythrocytter: Fortynd fuldblod ved at tilføje lige store mængder af RPMI 1640 medier og centrifuge ved 500 x g i 5 min ved stuetemperatur i en sving ud rotor med deacceleration indstillet til 0. Fjern forsigtigt supernatant og buffy frakke (et hvidt bånd mellem plasma og pakket erythrocytter, som indeholder de fleste hvide blodlegemer og blodplader) og tilsæt lige store mængder af RPMI. Gentag vasketrinnet to gange, og efter den sidste vask tilsættes et pillevolumen af RPMI for at få 50% hæmatokrit til opbevaring ved 4 °C.
BEMÆRK: Gametocytter modnes over en periode på to uger, hvilket gør det afgørende at begynde kulturer med friske erythrocytter, typisk erythrocytter trukket inden for en uge fungerer godt. - O+ Human Serum: Pulje mindst 6 enheder af serum sammen for at minimere effekten af normal variation i serum fra forskellige individer. Steriliseres puljet humant serum ved hjælp af 0,2 μm filtreringsflasker. Aliquot i dele af 50 mL eller mindre baseret på behovet og opbevares ved -20 °C.
BEMÆRK: Erythrocytter og serum skal være fra en kompatibel blodtype til P. falciparum kulturer. - 500x Hypoxanthine (100 mL) opløsning: Opløs 0,5 g hypoxanthine i 100 mL på 1 M NaOH. Filtrer sterilisere og gøre 5-10 mL aliquots til opbevaring. Lagre kan lagres op til et år ved -20 °C og op til 2 uger ved 4 °C.
- Natriumbicarbonat (Valgfrit): Opløs 7,5 g natriumbicarbonat i 100 mL deioniseret vand af vævskulturkvalitet og filtersteriliseres med 0,2 μm filter.
BEMÆRK: Denne protokol bruger stearinlys krukke metode til at give mikroaerophilic betingelser for P. falciparum in vitro kultur og kræver ikke natriumbicarbonat. Men hvis parasitter dyrkes ved hjælp af en malariagasblanding (5% O2, 5% CO2 og 90% N2), er det vigtigt at supplere kulturmedier med 0,2% natriumbicarbonat. - Komplet medie: For at forberede 500 mL komplette medier skal du tilføje 1 mL hypoxanthineopløsning og 50 mL poolet humant serum til 500 mL RPMI 1640. Tilsæt 15 mL af 7,5% natriumbicarbonat, hvis du bruger en malariagasblanding. Opbevar hele mediet ved 4 °C, og kassér, hvis farven på det komplette medie skifter fra orange til pink. For at undgå spild skal der laves nok komplette medier, der kan bruges inden for tre dage.
- Exflagellation medier (Valgfrit): Lav exflagellation eller ookinete medier ved at opløse 200 mg NaHCO3,5 mg Hypoxanthine og 100 μL xanthurensyre (fra 100 mM lager i vand) til 100 mL af ufuldstændige medier (RPMI 1640 med glutamin og HEPES).
BEMÆRK: Exflagellation er processen med mandlig gamet dannelse inde i midgut af kvindelige Anopheles myg få minutter efter det tager blod måltid inficeret med gametocytter. Mandlige gametocytter af Plasmodium give anledning til 8 mandlige gametes efter en exflagellation begivenhed. In vitro, denne proces opstår spontant, når kulturtemperaturen sænkes til stuetemperatur (RT) og kan observeres i kultiverede modne gametocytter. - N-Acetylglucosamin (Valgfrit): Lav 500 mM lageropløsning af N-acetylglucosamin i vand eller ufuldstændige medier, aliquot og opbevares ved -20 °C.
- NaCl-opløsninger: Opløs 0,9 g, 1,6 g og 12 g NaCl i 100 mL af vævskulturkvalitet deioniseret vand for at lave 0,9%, 1,6% og 12% NaCl-opløsninger. Filteret steriliseres med 0,22 μm filter og opbevares ved 4 °C.
2. P. falciparum aseksuelle scene kultur
- For at begynde parasitkulturen skal du fjerne et lavt passagefrosset hætteglas af P. falciparum NF54, fra den flydende nitrogentank og hurtigt optø i vandbad, der er indstillet til 37 °C.
- Overfør indholdet (~ 1 mL) til et 50 mL sterilt centrifugerør og dropwise tilsæt 0,2 volumen af præwarmed 12% NaCl, mens forsigtigt ryster røret for at sikre jævn blanding. Inkuber i 5 min på RT med periodisk blid rystelse.
- Tilsæt 9 bind af 1,6% NaCl dropwise, mens du fortsætter blid blanding. Centrifugere indholdet ved 500 x g i 5 min på RT, forsigtigt kassere supernatant. Tilsæt 9 bind af 0,9% NaCl dropwise, samtidig med at du sørger for konsekvent at blande parasitpillen. Centrifuge igen ved 500 x g i 5 min på RT. Fjern supernatant og genanvende parasitter i 5 mL af komplette medier.
- Overfør indholdet til en brønd af en 6 brøndvævskulturplade og tilsæt 100-200 μL pakkede RBCs.
- Inkuberes parasitkultur ved 37 °C i en lyskrukke eller i et modulært inkubatorkammer, der er renset med en særlig gasblanding på 5 % O2, 5 % CO2 og 90 % N2.
- Udskift medier hver dag og overvåge væksten ved at gøre en tynd blod smøre ved at trække et par mikroliters fra fast RBC lag efter kultur supernatant er blevet indsugning under regelmæssige medieskift.
- Brug sterilt glas Pasteur pipette til at tegne og derefter trykke i midten af glas dias til at overføre en dråbe kultur til diaset. Placer en anden glas slide foran affaldet og trække det tilbage for at kontakte RBC'er, hurtigt skubbe det fremad i en bevægelse for at gøre tynd udtværing af RBC monolayer.
- Placer rutsjebanen vandret på et tørrestativ, og lad det lufttørre. Fix blodet smøre ved at droppe absolut methanol på smear. Lad den faste smear tørre helt og hæld derefter forsigtigt 10% Geimsa-plet frisk fortyndet i vand, indtil blod smear er helt dækket. Lad cellerne plette i ca. 15 min.
- Vask den overskydende plet af ved at skylle rutsjebanen under rent vand fra hanen og lad lysbillederne tørre i lodret position.
- Bestem parasitmi ved at se tynd blod smøre på et mikroskop ved hjælp af olie nedsænkning 100x mål. Tæl antallet af inficerede erythrocytter blandt i alt mindst 500 RBCs for at bestemme procent parasitmia.
3. P. falciparum gametocyte kultur
BEMÆRK: Gametocyte kulturer tager to uger at producere modne gametocytter smitsom til myg. Trinene i gametocyte kultur er skitseret i figur 1. P. falciparum isolater normalt mister evnen til at producere gametocyt efter lang sigt in vitro kultur13. For at sikre kvaliteten af gametocytter bør kulturen påbegyndes fra lav passage feeder kultur, ikke mere end 2 måneder gammel siden optøning. Forvarm mediet til 37 °C og udfør alle procedurer på et diasvarmersæt ved 38 °C. Sørg for, at gametocyte kulturer ikke er ude af inkubator i længere tid for at minimere temperaturudsving.
- Seed gametocyt kultur (dag 0) ved hjælp af blandet aseksuel fase feeder kultur på 0,3-1% parasitmia på 4% hæmatokrit.
- For at oprette en seks brønd gametocyt kultur, centrifuge 5 mL af feeder kultur på 500 x g i 5 min på RT. Kassér supernatant og genbruge pellet i 30 mL af komplette medier.
- Tilsæt 1,2 mL pakkede RBCs, bland og dispenser 5 mL til hver brønd af 6 brøndpladen og inkuberes i en stearinlyskrukke ved 37 °C.
BEMÆRK: Gametocyte kultur oprettet beskrevet ovenfor er baseret på en blandet aseksuel fase feeder kultur på 5% parasitmia. - Skift medier dagligt i 15-18 dage, uden tilsætning af frisk blod, ved omhyggeligt at aspireere omkring 70-80% kultur supernatant for at undgå at fjerne blodceller.
- Tilføj 5 mL friske komplette medier til hver brønd. Mens du ændrer medier, skal du langsomt tilføje medier ved hjælp af en serologisk pipette mod brøndens væg for at undgå at forstyrre det faste RBC-lag.
BEMÆRK: Fordi 1-2 mL af kulturmediet vil blive efterladt under medieændring, vil den samlede mængde kultur være mellem 6-7 mL, efter dag 1 af gametocyte kultur. Mens du tilpasser denne protokol, er det tilrådeligt at lave blodudstrygninger hver anden dag for at sikre, at parasitter er sunde. At lave en blodudtværing kan ofte nedbryde antallet af celler i kulturen. For at undgå dette skal du tegne en meget lille volumen. - For at kvantificere moden gametocytmi skal du smøre blod mellem dag 15-18 og tælle antallet af modne gametocytter blandt det samlede antal celler.
BEMÆRK: Modne gametocytter kan nemt identificeres med deres klassiske halvmåneform med glatte afrundede ender (Figur 5B). - Tæl mindst 1.000 RBCs og beregne procentdelen af RBCs inficeret med modne gametocytter.
- For at kvantificere eksflagellationshændelser skal du tage 200 μL gametocytkultur og centrifuge ved 500 x g i 5 minutter på RT i et forvarmet rør. Brug pelleten igen i 20 μL af eksflagellationsmedier og overføres til en glasrutschebane med dæksel.
- Efter 15 minutters inkubation ved stuetemperatur begynder du at tælle eksflagellationscentre i fasekontrasttilstand ved hjælp af 10x-mål. Tæl eksflagellationscentre i mindst fire felter for at beregne eksflagellationshændelser.
BEMÆRK: Delves et al10har tidligere beskrevet en detaljeret metode til eksflagellationsanalyse . Mere end 20 eksflagellationshændelser pr. felt anses for egnede til membranfodringsanalyse. - Gametocyte kulturer har typisk lave niveauer af resterende aseksuel stadier. Hvis eksperimentet kræver rene gametocytter, behandle kulturen med 50 mM N-acetylglucosamin.
- Tilsæt 0,5 ml N-acetylglucosamin fra 10x lageropløsning pr. brønd (5 ml) i mindst 3 dage, mens du skifter medie for at rydde resterende aseksuele stadier.
BEMÆRK: N-acetylglucosamin kan blokere invasion af seksuelt engagerede merozoitter også, behandling bør indledes først efter dag 7 af gametocyte kultur.
4. Myggeinfektion ved hjælp af standard membran fodring assay (SMFA)
BEMÆRK: Gametocytter dyrket in vitro kan fodres til myg ved hjælp af glasmembranfødere. Opsætning af blodfodringsapparatet er vist i figur 2. Som beskrevet ovenfor skal du altid opretholde gametocytter ved 37 °C for at undgå aktivering, før de indtages af myg. Præwarm plast, reagenser og udstyr anvendes med gametocyt kultur til 37 °C.
- Sulte 3-7-dages gamle kvindelige Anopheles myg ved at fjerne deres sukkervand i 6,5 timer eller natten over før membranfodring.
- Overfør dem ved hjælp af motoriserede eller mundbetjente aspiratorer til papirkopper dækket med dobbelt lag af fintmasket stof. Alternativt kan du vælte myg i et koldt rum eller køleskab for at overføre dem til papirkopperne.
BEMÆRK: En pint størrelse kop kan bruges til at fodre op til 100 myg. - Centrifuge vaskede blod ved 500 x g i 5 min ved RT og kassér supernatant. Tilsæt et lige så volumen af frisk optøet humant serum for at rekonstruere hele blodet. Blod- og serumblandingen overføres til vandbadet, der er indstillet til 37 °C i 30 min.
- Overfør gametocytkultur til forvarmet 15 mL plastrør og centrifuge ved 600 x g i 5 min ved 37 °C. Omhyggeligt aspirere kulturen supernatant og gøre tynde blod smøre at bestemme modne gametocytemia som beskrevet ovenfor.
- For at gøre det endelige blodfoder fortyndes gametocyt pellet til en ønsket koncentration ved hjælp af rekonstitueret fuldblod. Hold blodfoderet ved 37 °C, indtil myg og glasfødere er klar.
BEMÆRK: Modne gametocyt koncentrationer mellem 0,02 til 0,3% vil give konsekvent myg infectivity. Det er dog tilrådeligt at optimere gametocytemia ved at fodre forskellige koncentrationer til forskellige kopper myg. - Sørg for, at glasmembranfødere har to åbninger, en smal topåbning til pipette af det inficerede blod og en bundåbning til membrantilbehør. Skær en paraffinfilm i firkanter, stræk til en jævn tykkelse og hold dig til åbningen af føderen for at skabe forseglet rum til blodfoderet.
- Fastgør membranfødere til et kredsløbsvandbad ved at forbinde slanger på hver side for at give mulighed for passage af varmt vand gennem jakken omkring membranfødere.
BEMÆRK: Flere glasfødere kan tilsluttes i serie for at imødekomme flere fodringsforhold. - Når alle fødefodere er forbundet til vandbadet, tændes det og inspicerer for eventuelle lækager.
- Placer foderautomater i midten af net på myg kopper med membran-side ned og sikre foderautomater ved hjælp af klemmer eller tape. Sørg for, at membranfødere ikke vippes til nogen side for at tillade jævn fordeling af blodfoderet og tæt kontakt med hele feederen med nettet på kopper, så myg kan få adgang inde fra koppen.
- Pipette omkring 200-1000 μL blodfoder i membranfødere.
BEMÆRK: Mængden af blodfoderet varierer afhængigt af antallet af myg og størrelsen af membranføderen. For 14 mm glasføder og 50 myg bruger 200 μL blodfoder. - Sørg for, at lastningen blev udført korrekt, og blodfoder blev overlejret på paraffinfilmen.
- Lad myg fodre i ca. 30 minutter med periodisk overvågning.
BEMÆRK: Blæs forsigtigt myg med munden for at give CO2, hvilket vil fremkalde forbedret blodfodring. - Fjern unfed myg ved at banke dem ned i et koldt rum. Synligt inspicere myg for bule og rødme i maven som et tegn på frisk blod måltid. Alternativt kan du bruge en munddrevet aspirator til selektivt at fjerne ufedne myg.
- Kassér ufedne myg, efter at have blødgjort dem i 70% ethanol og læg fodret myg tilbage i mygkoppen.
- Dobbelt bur myg kopper og overføre dem til høj indeslutning inkubator specificeret for myg inficeret med human malaria parasit P. falciparum.
- Placer bomuldspuder gennemblødt i 10% saccharose på myg kopper for at give dem sukker måltid. Udskift bomuldspuder hver anden dag, indtil myg er dissekeret.
5. Mygge midt-gut dissektion og oocyst belastning kvantificering
BEMÆRK: Der vises et skema over midgut dissektion i figur 3.
- 7-8 dage efter blodfodring overføres myggekopper til 4 °C i 10 minutter for at vælte myg.
- Overfør myg, der skal dissekeres til en petriskål på is ved hjælp af finespidsede sammenkvepper.
- Soak myg i 70% ethanol i 1-2 minutter for at aflive dem. Tilsæt PBS til Petriskålen for at vaske ethanolen af, når alle myggene er aflivet.
BEMÆRK: Før du tilføjer PBS, skal du sørge for, at alle myggene er døde. - Monter et glasrutschebane på dissekeremikroskop og pipette 100 μL PBS i midten. Overfør forsigtigt en myg ved hjælp af sammenkr ville ind i PBS og lad resten af myggene i petriskålen være på is.
- Ved hjælp af fine-tippet sammentrulninger, hold det tredje segment af maven fra den bageste ende af myggen og med anden kraft holde krydset mellem brystkassen og maven. Træk forsigtigt maven, indtil midgut er fuldt eksponeret.
- Kassér resten af myggevævet og overfør midgut til en ren dias, der indeholder et par dråber PBS.
- Når det ønskede antal myg er blevet dissekeret, skal du forsigtigt fjerne PBS ved hjælp af en pipette og plette midgut med 0,2% mercurochrome i 2-5 min.
- Fjern overskydende mercurochrome og line-up midguts på diaset, så de let kan visualiseres under lysmikroskopet.
- Placer en dækning slip og tælle oocysts på hver midgut under 10x mål. Oocysts plet pink og er cirkulære i form (Figur 6C).
6. Mygge spytkirtel dissektion og sporozoit belastning kvantificering
BEMÆRK: Et skema over spytkirtel dissektion er vist i figur 4.
- 14-18 dage efter blodfodring, placer myggekopper ved 4 °C i 10 min.
BEMÆRK: Det er vigtigt at vente, indtil myg holder op med at bevæge sig. - Mens du venter på myg til at stoppe med at bevæge sig, forberede værktøjer til dissektion.
- Placer en glasplade på en dissektion mikroskop fase. Forbered 2 sæt 25 G nåle på 1 mL sprøjter og en 9 "Pasteur pipette og gummi pære. Placer 70% EtOH og dissektion medium (HBSS, L-15 eller PBS) i en 6 brønd plade.
- I det kolde rum overføres bedøvede myg i en 6 brøndplade, der indeholder 70% EtOH. Flyt forsigtigt myg med sammentrækninger for at sikre, at alle myg er gennemblødt, og overfør derefter myg til dissektionsmediet ved hjælp af sammenkædninger til at vaske 70% EtOH.
- Flyt til dissektionsrummet og læg myg på et dissektionsmikroskopstadium.
- Fjern overskydende medium fra myg, tilsæt nyt medium efter behov under dissektion. Undgå myg fra udtørring endnu for meget væske gør dissektion vanskeligere.
- Brug 2 sprøjter med 25 G nåle, hold myg thorax og hoved, og træk forsigtigt hovedet opad for at trække spytkirtler fra brystkassen.
- Afbryd spytkirtlerne fra hoved og brystkasse med en nål.
- Midlertidig sted spytkirtler i en separat dråbe medium på glaspladen.
- Efter dissekere 15-20 spytkirtler, indsamle dem i en lav tilbageholdelse rør ved hjælp af Pasteur pipetten.
BEMÆRK: Når spytkirtlerne kommer ind i den brede del af Pasteur-pipetten, holder de sig til glasset, og det er svært at få dem ud. - Pellet spytkirtler ved kort puls spin i en tabel-top centrifuge. Fjern dissektionsmediet uden at forstyrre pelleten, og der tilsættes 100 μL nyt dissektionsmedium.
- Grind spytkirtler med en lille homogenisator i 1 minut for at opnå sporozoitter.
- Placer 10 μL dissektionsmedium, der indeholder sporozoitter, på et hæmocytometer.
BEMÆRK: Afhængigt af antallet af spytkirtler kan man være nødt til at fortynde sporozoitopløsningen til 1:10 til 1:50 med medium før optælling. - Tæl antallet af sporozoitter i to af de fire kvadranter og beregn antallet af sporozoitter / myg:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her præsenterer vi resultater fra en række membran feeds ved hjælp af P. falciparum NF54 gametocyte kulturer genereret ved hjælp af protokollen ovenfor (se (Figur 5). Gametocyte kultur blev indledt med ca. 0,5% blandet fase aseksuel kultur på dag 0, som voksede til et højdepunkt parasitmia på ca. 15% af dag 4 og dag 5. Som vist i figur 5A ved denne høje parasitmia er parasitterne stressede, og den aseksuel scenekultur går ned. Men denne stress samtidig resulterer i induktion af gametocytogenese. Tidlige gametocytter dukkede op efter dag 6 og dag 7 og aseksuelle parasitmi langsomt faldt, men forblev på et lavt niveau. Tilstedeværelsen af aseksuel fase parasitter påvirkede ikke myg fodring eksperimenter. Men hvis gametocytter skal anvendes i forsøg, der kræver rene kulturer, såsom lægemiddelfølsomhed assays og proteomiske eller transskriptomiske undersøgelser, resterende aseksuel stadier kan fjernes ved behandling med 50 mM N-acetylglucosamin. De fleste gametocytter modnes til fase V ved dag 15 på hvilket tidspunkt de bliver smitsomme for myg og var klar til at blive fodret. Repræsentative billeder af Giemsa-farvede blod udstrygninger på forskellige tidspunkter efter indledningen af gametocyt kultur er vist i figur 5B.
Mellem 8 og 10 dage efter blodfodring blev myg dissekeret for at bestemme forekomsten og intensiteten af infektionen. Prævalens er procentdelen af fodrede myg, der har oocysts, mens intensitet er antallet af oocysts, der findes i hver myg. Begge er vigtige indikatorer for foderets succes. Data fra 5 uafhængige myggefoder er vist i figur 6. Feeds blev valgt til at vise den normale variation i niveauet af infektionsevne efter fodring med 0,3% modne gametocytter fra dag 16 kultur P. falciparum NF54. Oocyste intensiteter giver kvantitative data til bestemmelse myg infectivity af gametocytter og prævalens viser procentdelen af fodret myg, der blev smittet. Disse data kan bruges til at evaluere transmissionsblokeringsmidler og til at identificere og karakterisere mål for transmissionsblokering af vacciner og lægemidler. Antallet af oocysts varierede både inden for og mellem eksperimenter og krævede 25-50 myg pr. kohorte for at bestemme effekten af forskellige eksperimentelle forhold.
Oocyst intensiteter betragtes som slutpunkt for de fleste transmission blokering assays og strategier, men antallet af sporozoitter er normalt vigtigt for sporozoit biologi og for lever fase undersøgelser. Tabel 1 viser det gennemsnitlige antal sporozoitter opnået pr myg fra 12 uafhængige blodfoder. Som vist i tabellen, gennemsnitlige antal sporozoitter var konsekvent, men der var et eksperiment, hvor vi opnåede nul sporozoitter, der repræsenterer lejlighedsvis svigt af analysen.
Figur 1: Arbejdsgang for P. falciparum gametocyt kultur og membran fodring protokol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Myggeblod fodring set-up. (A) Glasføder og rektangulær stykke paraffinfilm(B) To glasfødere, der vises før og efter parafilmmembrantilbehør(C) Glasføder oven på myggebægeret og forbundet med cirkulationsvandbad. (D,E) Pipettering af blodfoder i glasføderen (F) Bundvisning af glasføderen, der viser homogen fordeling af blodfoder (G) Flere myg, der fodrer gennem parafilmmembranen. (H) Top visning af myg kopper efter fodring, der viser dråber af blod udskilles af fodring myg i bunden af koppen. Skalalinje = 10 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Grafisk repræsentation, der viser trin af myg midgut dissektion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Grafisk repræsentation, der viser trin af myg spytkirtel dissektion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: P. falciparum gametocyte kultur og oocyst visualisering på inficerede myg midgut. (A) Tidsforløbet på 15 dages gametocytkultur, der viser stejl multiplikation af aseksuel stadier for at toppe parasitmia inden for de første 4 dage, efterfulgt af gametocytogenese og modning over tid. (B) Geimsa-farvede tynde blod smear viser forskellige stadier af gametocyte kultur, dag 1 tidlig aseksuel fase, dag 4 peak aseksuelle parasitmi, dag 6 stresset kultur på grund af høj parasit belastning, dag 9 & 12 tidlige gametocytter og dag 15 viser modne mandlige og kvindelige gametocytter. Morfologisk tidlig fase gametocytter var skelnes fra aseksuel fase, men sent fase II viste halvmåne form med spidse ender og aflange som parasit udviklet til fase III og IV. Ældre fase V gametocytter, dog var kendetegnet ved klassisk halvmåne form med afrundede ender og minimal værtscelle synlighed14. Skalalinje = 10 mm Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: P. falciparum oocysts tæller pr myg midgut. (A) Grafen viser oocyste tæller i årenes løb, for hvert eksperiment, myg blev fodret med 0,3% gametocytter og midguts blev dissekeret på dag 8 post blodfoder. Hver prik repræsenterer antallet af oocysts fra individuelle midguts og den vandrette linje repræsenterer medianværdien. (B) Tabellen viser middelt antal, forekomst af inficerede myg og infektionsområde. (C) Billeder der viser oocysts på myg midgut fra to separate blod fodring eksperimenter på forskellige forstørrelser. Skalalinje = 150 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Eksperiment | Dag for dissektion (post blodfoder) | Gennemsnitlig sporozoit/myg |
| 1 | 14 | 42, 000 |
| 2 | 14 | 40, 000 |
| 3 | 14 | 42, 750 |
| 4 | 15 | 25, 411 |
| 5 | 15 | 33, 750 |
| 6 | 14 | 15, 750 |
| 7 | 16 | 0 |
| 8 | 15 | 33, 200 |
| 9 | 14 | 56, 333 |
| 10 | 14 | 45, 333 |
| 11 | 17 | 43, 750 |
| 12 | 16 | 56, 000 |
Tabel 1: Gennemsnitligt antal spytkirtler sporozoitter pr myg i 12 uafhængige cyklusser over en 2-årig periode. A. stephensi myg blev fodret med 0,3% P. falciparum gametocytter og 15-20 myg blev dissekeret mellem dag 14-17 efter blod fodring. Gennemsnitlige sporozoittællinger pr. Myg vises.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoder beskrevet her er blevet anvendt med succes på Johns Hopkins Malaria Research Institute i mere end 10 år15,16,17,18,19,20,21,22. Gametocytter produceret ved hjælp af denne protokol er blevet brugt til høj gennemløb gametocytocidal assays22, for proteomiske15, samt for transskriptomiske23 undersøgelser. Men en væsentlig grund til at udvikle disse metoder er at bruge de modne gametocytter til at inficere myg til undersøgelser af myg stadier og sporozoitter23,24,25,26. Dette manuskript beskriver en detaljeret protokol for at generere modne P. falciparum gametocytter og infektion af myg ved hjælp af glasmembranfødere. Disse metoder er afgørende for ethvert laboratorium, der arbejder på transmissionsblokeringsstrategier, sporozoitstadier og præ-erythrocytiske leverstadier af P. falciparum.
Ifediba og Vanderberg beskrev i 1981 den langsigtede kultur af P. falciparum, i nærværelse af 50 μg/mL hypoxanthine, som producerede meget smitsomme modne gametocytter27. Siden da har der været talrige publikationer, der beskriver metoder til at producere gametocytter til forskellige applikationer9,10,11,12. De fleste af disse publikationer udnytte tidligere beskrevet gametocytogenesis-inducerende betingelser for at øge udbyttet. Ved hjælp af betingede medier, der understreger kulturen ved pludselig parasitmi stigning, fald i hæmatokrit at efterligne anæmi, røde blodlegemer lysis og log fase undertrykkelse af bulk op, kan bruges til at fremkalde gametocytogenese. Den metode, der er beskrevet her, er enkel og tidsbestemt. Initier gametocyt kultur med 0,3-1% aseksuel fase parasitmi på 4% hæmatokrit og ændre medier hver dag indtil dag 15-18. For at opnå ensartede resultater er det afgørende at begynde gametocytkultur med lave aseksuelle faseparasitter, bruge friske RBCs (<1 uge) og sørge for, at kulturtemperaturen ikke svinger under medieændring. Da falciparum gametocyt udviklingsproces opstår afsondret i statiske forhold af ekstravaskulære rum i knoglemarv4,5, er det vigtigt ikke at forstyrre afgjortE RBC lag i hele kulturperioden.
Dyrkning P. falciparum gametocytes med konsistens er krævende, men at få dem til at inficere myg præsenterer et andet niveau af kompleksitet. Membran fodring er underlagt flere variabler end gametocytter, såsom alder og egnethed myg, midgut mikrobiota, og fodring adfærd28,29. Normalt viser SMFA-data en høj grad af variation og kræver et stort antal myg for at identificere virkningerne af forskellige eksperimentelle tilstande11,28. Brug af lav passage kultur for gametocytter, sunde 3 - 6-dages gamle myg og optimeret membran fodring protokol kan hjælpe med variationer i oocyst tæller.
Protokollen beskrevet her for både gametocyt dyrkning og membran fodring, er blevet optimeret over mange år. Disse metoder giver en detaljeret beskrivelse for opnåelse af modne transmission kompetente gametocytter, standard membran fodring assay, myg midgut dissektion og oocyst kvantificering samt spytkirtel dissektion og sporozoit kvantificering. Disse protokoller er konsekvente med hensyn til antallet af gametocytter er nødvendige for at give pålidelig myg infectivity og robust oocyst tæller og sporozoit udbytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfattere takker Bloomberg Philanthropies for økonomisk støtte til Johns Hopkins Malaria Research Institute (JHMRI). Dette arbejde ville ikke have været muligt uden den ekspertise, som JHMRI insekt- og parasitologikernefaciliteterne havde stillet til rådighed.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Sugar solution | |||
| 10ml serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
| 1ml serological pipet | Falcon | 357521 | |
| 25 ml serological pipet | Falcon | 357535 | |
| 37°C Incubator | |||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml serological pipet | Falcon | 357543 | |
| 6 well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
| 70% Ethanol | |||
| 9" glass pipet | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Anopheles Mosquitoes | JHMRI, Insectary core | We use A. stephensi or A. gambiae (keele) | |
| cell counter | |||
| Circulating water bath | |||
| fine tip forceps | Fisherbrand | 12-000-122 | |
| Geimsa stain | Sigma | GS1L | |
| Glass desiccator | |||
| Glass membrane feeder | Chemglass Life Sciences | CG183570 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Human Blood O+ | JHU | Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit | |
| Human Serum O+ | Interstate blood bank | Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C. | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9337 | Make 500x stock in 1M NaOH |
| Mercurochrome | Sigma | M7011 | Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed |
| Micro Pipette | |||
| Microscope | Olympus | Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work. | |
| Mosquito cups | Neptune cups | ||
| N-acetylglucosamine | Sigma | A3286 | Optional and needed only when pure gametocytes are required. |
| Netting | Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding | ||
| Parafilm | |||
| PBS | |||
| Petri dish | Thermo Scientific | 249964 | |
| Pipet tips | |||
| Pipetman | |||
| Plasmodium falciparum NF54 | BEI Resources | MRA-1000 | Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply |
| RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Media contains glutamine and HEPES |
| Slide warmer | |||
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation |
| water bath | |||
| Xanthurenic Acid | Sigma | D120804 | For flagellation media |
References
- World Health Organization.
- Sinden, R. E., Smalley, M. E. Gametocytogenesis of Plasmodium falciparum in vitro: The cell-cycle. Parasitology. 79 (2), 277-296 (1979).
- Sinden, R. E.
- Joice, R., et al. Plasmodium falciparum transmission stages accumulate in the human bone marrow. Science Translational Medicine. 6 (244), 5 (2014).
- Abdulsalam, A. H., Sabeeh, N., Bain, B. J. Immature Plasmodium falciparum gametocytes in bone marrow. American Journal of Hematology. 85 (12), 943 (2010).
- Ghosh, A. K., Jacobs-Lorena, M. Plasmodium sporozoite invasion of the mosquito salivary gland. Current Opinion in Microbiology. 12 (4), 394-400 (2009).
- Bennink, S., Kiesow, M. J., Pradel, G. The development of malaria parasites in the mosquito midgut. Cellular Microbiology. 18 (7), 905-918 (2016).
- Trager, W., Jenson, J. B.
- Duffy, S., Loganathan, S., Holleran, J. P., Avery, V. M. Large-scale production of Plasmodium falciparum gametocytes for malaria drug discovery. Nature Protocols. 11 (5), 976-992 (2016).
- Delves, M. J., et al. Routine in vitro culture of P. Falciparum gametocytes to evaluate novel transmission-blocking interventions. Nature Protocols. 11 (9), 1668-1680 (2016).
- Habtewold, T., et al. Streamlined SMFA and mosquito dark-feeding regime significantly improve malaria transmission-blocking assay robustness and sensitivity. Malaria Journal. 18 (1), 24 (2019).
- Demanga, C. G., et al. The development of sexual stage malaria gametocytes in a Wave Bioreactor. Parasites and Vectors. 10 (1), 216 (2017).
- Brockelman, C. R. Conditions favoring gametocytogenesis in the continuous culture of Plasmodium falciparum. Journal of Eukaryotic Microbiology. 29, 454-458 (1982).
- Meibalan, E., Marti, M. Biology of malaria transmission. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 7, (2017).
- Essuman, E., et al. A novel gametocyte biomarker for superior molecular detection of the plasmodium falciparum infectious reservoirs. Journal of Infectious Diseases. 216 (10), 1264-1272 (2017).
- Simões, M. L., Mlambo, G., Tripathi, A., Dong, Y., Dimopoulos, G. Immune regulation of plasmodium is anopheles species specific and infection intensity dependent. mBio. 8 (5), 01631 (2017).
- Oakley, M. S., et al. Transcriptome analysis based detection of Plasmodium falciparum development in Anopheles stephensi mosquitoes. Scientific Reports. 8, 11568 (2018).
- Saraiva, R. G., et al. Chromobacterium spp. mediate their anti-Plasmodium activity through secretion of the histone deacetylase inhibitor romidepsin. Scientific Reports. 8, 6176 (2018).
- Tao, D., et al. Sex-partitioning of the Plasmodium falciparum stage V gametocyte proteome provides insight into falciparum-specific cell biology. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (10), 2705-2724 (2014).
- Grabias, B., Zheng, H., Mlambo, G., Tripathi, A. K., Kumar, S. A sensitive enhanced chemiluminescent-ELISA for the detection of Plasmodium falciparum circumsporozoite antigen in midguts of Anopheles stephensi mosquitoes. Journal of Microbiological Methods. 108, 19-24 (2015).
- Ferrer, P., Vega-Rodriguez, J., Tripathi, A. K., Jacobs-Lorena, M., Sullivan, D. J. Antimalarial iron chelator FBS0701 blocks transmission by Plasmodium falciparum gametocyte activation inhibition. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (3), 1418-1426 (2015).
- Sanders, N. G., Sullivan, D. J., Mlambo, G., Dimopoulos, G., Tripathi, A. K. Gametocytocidal screen identifies novel chemical classes with Plasmodium falciparum transmission blocking activity. PLoS One. 9 (8), 105817 (2014).
- Lindner, S. E., et al. Transcriptomics and proteomics reveal two waves of translational repression during the maturation of malaria parasite sporozoites. Nature Communications. 10, 4964 (2019).
- McLean, K. J., et al. Generation of Transmission-Competent Human Malaria Parasites with Chromosomally-Integrated Fluorescent Reporters. Scientific Reports. 9, 13131 (2019).
- Espinosa, D. A., et al. Proteolytic Cleavage of the Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein Is a Target of Protective Antibodies. Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1111-1119 (2015).
- Swearingen, K. E., et al. Interrogating the Plasmodium Sporozoite Surface: Identification of Surface-Exposed Proteins and Demonstration of Glycosylation on CSP and TRAP by Mass Spectrometry-Based Proteomics. PLoS Pathogens. 12 (4), 1005606 (2016).
- Ifediba, T., Vanderberg, J. P. Complete in vitro maturation of Plasmodium falciparum gametocytes. Nature. 294 (5839), 364-366 (1981).
- Miura, K., et al. An inter-laboratory comparison of standard membrane-feeding assays for evaluation of malaria transmission-blocking vaccines. Malaria Journal. 15, 463 (2016).
- Miura, K., et al. Qualification of Standard Membrane-Feeding Assay with Plasmodium falciparum Malaria and Potential Improvements for Future Assays. PLoS One. 8 (3), 57909 (2013).
