Summary
Gedetailleerd onderzoek naar muggenstadia van malariaparasieten is van cruciaal belang voor het ontwerpen van effectieve transmissieblokkeringsstrategieën. Dit protocol laat zien hoe infectieuze gametocyten effectief kunnen worden gekweekt en deze gametocyten vervolgens aan muggen kunnen worden gevoerd om muggenstadia van P. falciparumte genereren .
Abstract
Malaria blijft een van de belangrijkste problemen voor de volksgezondheid en veroorzaakt aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit. Malaria is een door muggen overgedragen ziekte die wordt overgedragen door een besmettelijke beet van de vrouwelijke Anopheles-mug. Malariabestrijding zal uiteindelijk afhankelijk zijn van een veelheid aan benaderingen, waaronder manieren om overdracht naar, door en van muggen te blokkeren. Om muggenstadia van malariaparasieten in het laboratorium te bestuderen, hebben we een protocol geoptimaliseerd om zeer besmettelijke Plasmodium falciparum-gametocyten te cultureren, een parasietstadium dat nodig is voor overdracht van de menselijke gastheer naar de muggenvector. P. falciparum gametocyten rijpen door vijf morfologisch verschillende stappen, wat ongeveer 1-2 weken duurt. Gametocytencultuur beschreven in dit protocol wordt voltooid in 15 dagen en is besmettelijk voor muggen van dag 15-18. Deze protocollen zijn ontwikkeld om een continue cyclus van infectie competente gametocyten te handhaven en om ononderbroken toevoer van muggenstadia van de parasiet te behouden. Hier beschrijven we de methodologie van gametocytencultuur en hoe muggen met deze parasieten kunnen worden geïnfecteerd met behulp van glazen membraanvoeders.
Introduction
Malaria wordt veroorzaakt door Plasmodium-parasieten en wordt overgedragen op hun gewervelde gastheren via infectieuze beet van vrouwelijke Anopheles-muggen. Volgens het rapport van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) van 2019 waren er naar schatting 405.000 sterfgevallen, op een totaal van 228 miljoen gevallen van malaria1. De meeste malariagerelateerde sterfgevallen waren geconcentreerd in de Afrikaanse regio, vooral bij kinderen jonger dan vijf jaar. Hoewel de totale incidentie van malaria vanaf 2010 wereldwijd is afgenomen, is de daling de afgelopen jaren gestabiliseerd en zijn aanvullende controlestrategieën dringend nodig om de ziekte te elimineren.
Cyclische aseksuele bloedstadia van malariaparasieten veroorzaken ziektepathogenese en een kleine subset hiervan onderscheidt zich in vrouwelijke en mannelijke gametocyten. Plasmodium falciparum gametocyten zijn uniek van aard omdat ze 7-10 dagen nodig hebben om zich te ontwikkelen door vijf morfologisch verschillende stadia. Onrijpe gametocyten van stadium I tot IV worden gesekwestreerd in beenmergparenchym en blijven grotendeels afwezig in de periferecirculatie 2,3,4,5. Erytrocyten die zijn geïnfecteerd met volwassen stadium V-gametocyten komen vrij in de bloedbaan en circuleren vrij om door muggen te worden opgenomen. Eenmaal in het midgut van de mug worden gametocyten geactiveerd, door een verandering in temperatuur en blootstelling aan de midgut-omgeving, transformeren in vrouwelijke en mannelijke gameten en beginnen met de ontwikkeling van de muggenstadia, die culmineren in de infectieuze stadia van sporozoïeten in de speekselklieren van de mug6,7.
Sinds Trager en Jenson8 een gestandaardiseerde methode beschreven om P. falciparumte culmineren, zijn studies over de aseksuele bloedstadia sterk gevorderd. Het ontbreken van een betrouwbaar kweeksysteem voor seksuele stadia heeft het echter moeilijk gemaakt om P. falciparum-gametocyten, transmissiebiologie en muggenstadia te bestuderen. In de afgelopen jaren zijn verschillende methoden gepubliceerd die laboratoria hebben geholpen bij het vaststellen van gametocytenculturen9,10,11,12. Dit manuscript beschrijft een gestandaardiseerd en betrouwbaar protocol voor het cultureren van P. falciparum-gametocyten die een waardevolle bron kunnen vormen voor de malaria-onderzoeksgemeenschap. Deze methode maakt de robuuste productie van volwassen en infectieuze gametocyten mogelijk, wat samen met een gestandaardiseerd muggenvoedingsprotocol resulteert in een zeer betrouwbare muggeninfectie. Deze methoden werden vastgesteld om ononderbroken toevoer van gametocyten en parasieten in het muggenstadium te behouden. In dit manuscript beschrijven we een grondig gametocytencultuurprotocol (figuur 1), voorbereiding van glasmembraanvoeders en infectie van muggen met behulp van deze membraanvoeders (figuur 2), dissectie van midgut (figuur 3) en speekselklier van muggen (figuur 4) en kwantificering van infectie bij muggen na midgut en speekselklierdissectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bloedafnames die hieronder worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Johns Hopkins University. P. falciparum wordt gekweekt in verse RBC's onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidsniveau 2 (BSL2) faciliteit en voorzichtigheid is geboden bij het omgaan met biologische materialen. Na elke stap met bloed of bloedproducten wordt elk plasticgoed of glaswerk gespoeld met 10% bleekmiddel in de kap voordat het op de juiste manier wordt verwijderd.
1. Reagentia en bereiding
- Parasietisolaat P. falciparum NF54 (zie Tabel met materialen) werd gebruikt, dat infectieuze gametocyten tot twee maanden kan produceren terwijl het in continue kweek is.
OPMERKING: Niet alle aan cultuur aangepaste parasietlijnen produceren gametocyten en NF54-isolaten met een lage passage zijn het meest consistent. - O+ Erytrocyten: Verdun volbloed door toevoeging van een gelijk volume RPMI 1640-media en centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in een uitzwaairotor met vertraging ingesteld op 0. Verwijder voorzichtig de supernatant en buffy vacht (een witte band tussen plasma en verpakte erytrocyten, die de meeste witte bloedcellen en bloedplaatjes bevat) en voeg een gelijk volume RPMI toe. Herhaal de wasstap twee keer en voeg na de laatste wasbeurt één pelletvolume RPMI toe om 50% hematocriet te krijgen voor opslag bij 4 °C.
OPMERKING: Gametocyten rijpen over een periode van twee weken, waardoor het van cruciaal belang is om culturen te beginnen met verse erytrocyten, meestal erytrocyten die binnen een week worden getrokken, werkt goed. - O+ Human Serum: Pool ten minste 6 eenheden serum samen om het effect van normale variatie in serum van verschillende personen te minimaliseren. Steriliseer gepoold menselijk serum met behulp van filtratiekolven van 0,2 μm. Aliquot in porties van 50 ml of minder op basis van de behoefte en bewaren bij -20 °C.
OPMERKING: Erytrocyten en serum moeten afkomstig zijn van een compatibele bloedgroep voor P. falciparum-culturen. - 500x Hypoxanthine (100 ml) oplossing: Los 0,5 g hypoxanthine op in 100 ml van 1 M NaOH. Filter steriliseer en maak 5-10 ml aliquots voor opslag. Voorraden kunnen tot een jaar bewaard worden bij -20 °C en tot 2 weken bij 4 °C.
- Natriumbicarbonaat (optioneel): Los 7,5 g natriumbicarbonaat op in 100 ml gedeoniseerd water van weefselkweekkwaliteit en filtersteriliseren met een filter van 0,2 μm.
OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van de kaarsenpotmethode om microaerofiele omstandigheden te bieden voor P. falciparum in vitro cultuur en vereist geen natriumbicarbonaat. Als parasieten echter worden gekweekt met behulp van een malariagasmengsel (5% O2,5% CO2 en 90% N2), is het belangrijk om kweekmedia aan te vullen met 0,2% natriumbicarbonaat. - Volledige media: Om 500 ml complete media te bereiden, voegt u 1 ml hypoxanthine-oplossing en 50 ml gepoold menselijk serum toe aan 500 ml RPMI 1640. Voeg 15 ml 7,5% natriumbicarbonaat toe bij gebruik van een malariagasmengsel. Bewaar complete media bij 4 °C en gooi ze weg als de kleur van complete media verandert van oranje naar roze. Om verspilling te voorkomen, moet u voldoende complete media maken om binnen drie dagen te gebruiken.
- Exflagelatiemedia (optioneel): Maak exflagelatie- of ookinetemedia door 200 mg NaHCO3,5 mg hypoxanthine en 100 μL xantureninezuur (van 100 mM voorraad in water) op te lossen tot 100 ml onvolledige media (RPMI 1640 met glutamine en HEPES).
OPMERKING: Exflagelatie is het proces van mannelijke gametenvorming in het midden van vrouwelijke Anopheles-mug enkele minuten nadat het bloedmeel heeft in beslag genomen dat is geïnfecteerd met gametocyten. Mannelijke gametocyten van Plasmodium geven aanleiding tot 8 mannelijke gameten na een exflagelatiegebeurtenis. In vitro treedt dit proces spontaan op wanneer de cultuurtemperatuur wordt verlaagd tot kamertemperatuur (RT) en kan worden waargenomen in gekweekte volwassen gametocyten. - N-Acetylglucosamine (facultatief): Maak 500 mM stockoplossing van N-acetylglucosamine in water of onvolledige media, aliquot en bewaar bij -20 °C.
- NaCl-oplossingen: Los 0,9 g, 1,6 g en 12 g NaCl op in 100 ml gedeïoniseerd water van weefselkweekkwaliteit om 0,9%, 1,6% en 12% NaCl-oplossingen te maken. Filter steriliseren met 0,22 μm filter en bewaren bij 4 °C.
2. P. falciparum aseksuele stadiumcultuur
- Om te beginnen met het zaaien van parasieten, verwijdert u een bevroren injectieflacon met lage doorgang met P. falciparum NF54 uit de tank met vloeibare stikstof en ontdooit u snel in een waterbad bij 37 °C.
- Breng de inhoud (~ 1 ml) over naar een steriele centrifugebuis van 50 ml en voeg druppelsgewijs 0,2 volume voorgewarmde 12% NaCl toe, terwijl u de buis voorzichtig schudt om een gelijkmatige menging te garanderen. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT met intermitterend zacht schudden.
- Voeg 9 volumes van 1,6% NaCl druppelsgewijs toe, terwijl u zacht blijft mengen. Centrifugeer de inhoud bij 500 x g gedurende 5 minuten bij RT, gooi het supernatant voorzichtig weg. Voeg 9 volumes van 0,9% NaCl druppelsgewijs toe, terwijl u ervoor zorgt dat u de parasietkorrel consequent mengt. Centrifugeer opnieuw bij 500 x g gedurende 5 minuten bij RT. Verwijder het supernatant en de resuspend parasieten in 5 ml volledige media.
- Breng de inhoud over in een put van een 6-put weefselkweekplaat en voeg 100-200 μL verpakte RBC's toe.
- Incubeer parasietcultuur bij 37 °C in een kaarsenpot of in een modulaire incubatorkamer gezuiverd met een speciaal gasmengsel van 5% O2,5% CO2 en 90% N2.
- Vervang media elke dag en controleer de groei door een dun bloeduitstrijkje te maken door een paar microliter uit de bezonken RBC-laag te trekken nadat het kweeksupernatant is aangezogen tijdens regelmatige mediaverandering.
- Gebruik steriel glazen Pasteur pipet om te tekenen en tik vervolgens in het midden van de glasplaat om een druppel cultuur over te brengen naar de dia. Plaats een andere glasplaat voor de druppel en trek deze terug om contact te maken met de RBC's, duw het snel in één beweging naar voren om dun uitstrijkje van RBC-monolaag te maken.
- Plaats de schuif horizontaal op een droogrek en laat hem aan de lucht drogen. Corrigeer het bloeduitstrijkje door absolute methanol op het uitstrijkje te laten vallen. Laat het vaste uitstrijkje volledig drogen en giet vervolgens voorzichtig 10% Geimsa-vlek vers verdund in water, totdat het bloeduitstrijkje volledig bedekt is. Laat cellen ongeveer 15 minuten vlekken.
- Was de overtollige vlek af door de glijbaan onder schoon leidingwater te spoelen en laat de glijbanen in verticale positie drogen.
- Bepaal parasitemie door dun bloeduitstrijkje op een microscoop te bekijken met behulp van olie-onderdompeling 100x objectief. Tel het aantal geïnfecteerde erytrocyten onder een totaal van ten minste 500 RBC's om procentuele parasitairemie te bepalen.
3. P. falciparum gametocytencultuur
OPMERKING: Gametocytenculturen hebben twee weken nodig om volwassen gametocyten te produceren die besmettelijk zijn voor muggen. De stappen van de gametocytencultuur worden beschreven in figuur 1. P. falciparumisolaten verliezen meestal het vermogen om gametocyten te produceren na langdurige in vitro kweek13. Om de kwaliteit van gametocyten te garanderen, moet de kweek worden gestart vanuit een feedercultuur met een lage passage, niet ouder dan 2 maanden sinds het ontdooien. Verwarm de media voor tot 37 °C en voer alle procedures uit op een schuifwarmer bij 38 °C. Zorg ervoor dat gametocytenculturen niet gedurende langere tijd uit de couveuse zijn om temperatuurschommelingen te minimaliseren.
- Zaai de gametocytencultuur (dag 0) met behulp van gemengde aseksuele stadium feedercultuur bij 0,3-1% parasitemie bij 4% hematocriet.
- Om een gametocytencultuur met zes putten op te zetten, centrifugeert u 5 ml feedercultuur bij 500 x g gedurende 5 minuten bij RT. Gooi het supernatant weg en suspend de pellet in 30 ml volledige media.
- Voeg 1,2 ml verpakte RBC's toe, meng en geef 5 ml af aan elke put van de 6 putjesplaat en incubeer in een kaarsenpot bij 37 °C.
OPMERKING: De hierboven beschreven gametocytencultuur is gebaseerd op een gemengde aseksuele feedercultuur bij 5% parasitemie. - Verander de media dagelijks gedurende 15-18 dagen, zonder de toevoeging van vers bloed, door zorgvuldig ongeveer 70-80% cultuursupernatant op te zuigen om te voorkomen dat bloedcellen worden verwijderd.
- Voeg 5 ml verse complete media toe aan elke put. Voeg tijdens het wisselen van media langzaam media toe met behulp van een serologische pipet tegen de wand van de put om te voorkomen dat de besnelde RBC-laag wordt verstoord.
OPMERKING: Omdat 1-2 ml van het kweekmedium overblijft tijdens mediaverandering, zal het totale kweekvolume tussen 6-7 ml liggen, na dag 1 van de gametocytencultuur. Tijdens het aanpassen van dit protocol is het raadzaam om elke dag bloeduitstrijkjes te maken om ervoor te zorgen dat parasieten gezond zijn. Het maken van een bloeduitstrijkje kan vaak het aantal cellen in cultuur uitputten. Om dit te voorkomen, tekent u een zeer klein volume. - Om volwassen gametocytemie te kwantificeren, maakt u bloeduitstrijkje tussen dag 15-18 en telt u het aantal volwassen gametocyten onder het totale aantal cellen.
OPMERKING: Volwassen gametocyten kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd met hun klassieke halvemaanvorm met gladde afgeronde uiteinden(figuur 5B). - Tel minimaal 1.000 RBC's en bereken het percentage RBC's dat besmet is met volwassen gametocyten.
- Om exflagelatiegebeurtenissen te kwantificeren, neemt u 200 μL gametocytencultuur en centrifugeert u gedurende 5 minuten bij RT bij 500 x g in een voorverwarmde buis. Resuspend de pellet in 20 μL exflagelatiemedia en breng over op een glasplaat met afdekslip.
- Na 15 minuten incubatie bij kamertemperatuur, begin met het tellen van exflagelatiecentra in fasecontrastmodus met behulp van 10x objectief. Tel exflagelatiecentra in ten minste vier velden om exflagelatiegebeurtenissen te berekenen.
OPMERKING: Een gedetailleerde methodologie van exflagellation assay is eerder beschreven door Delves et al10. Meer dan 20 exflagelatiegebeurtenissen per veld worden geschikt geacht voor membraanvoedingstests. - Gametocytenculturen hebben meestal lage niveaus van resterende aseksuele stadia. Als het experiment zuivere gametocyten vereist, behandel de cultuur dan met 50 mM N-acetylglucosamine.
- Voeg 0,5 ml N-acetylglucosamine toe uit 10x stockoplossing per put (5 ml) gedurende minimaal 3 dagen terwijl u de media verwisselt om resterende aseksuele stadia te verwijderen.
OPMERKING: N-acetylglucosamine kan ook de invasie van seksueel gepleegde merozoites blokkeren, de behandeling moet pas na dag 7 van de gametocytencultuur worden gestart.
4. Muggeninfectie met behulp van standaard membraanvoedingstest (SMFA)
OPMERKING: Gametocyten die in vitro worden gekweekt, kunnen aan muggen worden gevoerd met behulp van glazen membraanvoeders. Het instellen van het bloedtoevoerapparaat is weergegeven in figuur 2. Zoals hierboven beschreven, moet u gametocyten altijd op 37 °C houden om activering te voorkomen voordat ze door muggen worden ingenomen. Voorwarm plastic, reagentia en apparatuur gebruikt met gametocytenkweek tot 37 °C.
- Verhonger 3-7 dagen oude vrouwelijke Anopheles-muggen door hun suikerwater gedurende 6,5 uur of 's nachts te verwijderen voordat het membraan zich voedt.
- Breng ze over met gemotoriseerde of mondbediende aspirators naar papieren bekers bedekt met een dubbele laag fijnmazig weefsel. U kunt ook muggen in een koude kamer of koelkast neerhalen om ze over te brengen naar de papieren bekers.
OPMERKING: Een pint formaat beker kan worden gebruikt om tot 100 muggen te voeden. - Centrifugeer gewassen bloed op 500 x g gedurende 5 minuten bij RT en gooi supernatant weg. Voeg een gelijk volume vers ontdooid menselijk serum toe om het volbloed te reconstitueren. Breng het bloed- en serummengsel gedurende 30 minuten over in het waterbad dat is ingesteld op 37 °C.
- Breng de gametocytencultuur over op een voorverwarmde plastic buis van 15 ml en centrifugeer deze gedurende 5 minuten bij 37 °C bij 600 x g. Aspirateer het kweeksupernatant zorgvuldig en maak een dun bloeduitstrijkje om volwassen gametocytemie te bepalen zoals hierboven beschreven.
- Om de uiteindelijke bloedtoevoer te maken, verdunt u de gametocytenkorrel tot een gewenste concentratie met gereconstitueerd volbloed. Houd de bloedtoevoer op 37 °C totdat muggen en glazen feeders klaar zijn.
OPMERKING: Volwassen gametocytenconcentraties tussen 0,02 en 0,3% zorgen voor een consistente muggeninfectie. Het is echter raadzaam om gametocytemie te optimaliseren door verschillende concentraties aan verschillende kopjes muggen te voeren. - Zorg ervoor dat de glazen membraanaanvoeren twee openingen hebben, een smalle bovenste opening om het geïnfecteerde bloed te pipetteren en een onderste opening voor membraanaanhechting. Snijd een paraffinefilm in vierkanten, rek uit tot een gelijkmatige dikte en plak op de opening van de feeder om een afgesloten compartiment voor de bloedtoevoer te creëren.
- Bevestig membraantoevoer aan een waterbad in de bloedsomloop door slangen aan elke kant aan te sluiten om de doorgang van warm water door de mantel rond membraantoevoerers mogelijk te maken.
OPMERKING: Verschillende glazen feeders kunnen in serie worden aangesloten om plaats te bieden aan meerdere voedingsomstandigheden. - Nadat alle feeders zijn aangesloten op het waterbad, schakelt u het in en inspecteert u op eventuele lekken.
- Plaats feeders in het midden van het gaas op muggenbekers met membraanzijde naar beneden en beveilig feeders met behulp van klemmen of tape. Zorg ervoor dat membraanvoeders niet naar een kant zijn gekanteld om een gelijkmatige verdeling van het bloedvoer en nauw contact van de hele feeder met het gaas op kopjes mogelijk te maken, zodat muggen vanuit de beker toegang krijgen.
- Pipetteer ongeveer 200-1000 μL bloedtoevoer naar membraanvoeders.
OPMERKING: Het volume van de bloedtoevoer varieert op basis van het aantal muggen en de grootte van de membraantoevoer. Gebruik voor 14 mm glazen feeder en 50 muggen 200 μL bloedvoer. - Zorg ervoor dat het laden goed is gedaan en dat er bloedtoevoer over de paraffinefilm is gelegd.
- Laat muggen zich ongeveer 30 minuten voeden met intermitterende monitoring.
OPMERKING: Blaas muggen voorzichtig met de mond om CO2 te leveren, wat een verbeterde bloedtoevoer zal veroorzaken. - Verwijder ongefokte muggen door ze neer te slaan in een koude kamer. Inspecteer muggen zichtbaar op uitstulping en roodheid in de buik als een teken van vers bloedmeel. U kunt ook een in de mond bediende aspirator gebruiken om selectief ongefokte muggen te verwijderen.
- Gooi ongevoede muggen weg, nadat je ze in 70% ethanol hebt geweekt en voer muggen terug in de muggenbeker.
- Dubbele kooi muggenbekers en breng ze over naar een incubator met hoge insluiting die is gespecificeerd voor muggen die zijn geïnfecteerd met menselijke malariaparasiet P. falciparum.
- Plaats wattenschijfjes gedrenkt in 10% sucrose op de muggenbekers om ze te voorzien van suikermeel. Vervang wattenschijfjes om de dag, totdat muggen zijn ontleed.
5. Muggendissectie halverwege de darm en kwantificering van de oöcystbelasting
OPMERKING: Een schema van midgutdissectie is weergegeven in figuur 3.
- 7-8 dagen na het voeden van het bloed, breng muggenbekers over naar 4 ° C gedurende 10 minuten om muggen neer te halen.
- Breng muggen over om te worden ontleed naar een petrischaaltje op ijs met behulp van een tang met fijne punt.
- Week muggen in 70% ethanol gedurende 1-2 minuten om ze te euthanaseren. Voeg PBS toe aan de petrischaal om de ethanol af te wassen nadat alle muggen zijn geëuthanaseerd.
OPMERKING: Voordat u PBS toevoegt, moet u ervoor zorgen dat alle muggen dood zijn. - Monteer een glazen dia op de ontleedmicroscoop en pipetteer 100 μL PBS in het midden. Breng voorzichtig één mug met een tang over in de PBS en laat de rest van de muggen in de petrischaal op ijs staan.
- Houd met behulp van een tang met fijne punt het derde segment van de buik van het achterste uiteinde van de mug en houd met een tweede tang de overgang tussen de thorax en de buik vast. Trek zachtjes aan de buik totdat het midgut volledig is blootgesteld.
- Gooi de rest van het muggenweefsel weg en breng het midgut over op een schone dia met een paar druppels PBS.
- Wanneer het gewenste aantal muggen is ontleed, verwijdert u de PBS voorzichtig met een pipet en bevlekt u het midgut met 0,2% mercurochroom gedurende 2-5 minuten.
- Verwijder overtollig mercurochroom en zet midguts op de dia zodat ze gemakkelijk onder de lichtmicroscoop kunnen worden gevisualiseerd.
- Plaats een afdekslip en tel oöcysten op elk midgut onder 10x objectief. Oöcysten kleuren roze en zijn cirkelvormig(figuur 6C).
6. Muggen speekselklierdissectie en kwantificering van de sporozoïetbelasting
OPMERKING: Een schema van speekselklierdissectie is weergegeven in figuur 4.
- 14-18 dagen na het voeden van het bloed, plaats muggenbekers op 4 °C gedurende 10 minuten.
OPMERKING: Het is belangrijk om te wachten tot muggen stoppen met bewegen. - Terwijl u wacht tot muggen stoppen met bewegen, bereidt u gereedschappen voor dissectie voor.
- Plaats een glazen plaat op een dissectiemicroscooptrap. Bereid 2 sets van 25 G naalden op 1 ml spuiten en een 9 "Pasteur pipet en rubberen bol. Plaats 70% EtOH en dissectiemedium (HBSS, L-15 of PBS) in een 6 putplaat.
- Breng in de koelcel verdoofde muggen over in een 6-putplaat met 70% EtOH. Beweeg muggen voorzichtig met een tang om ervoor te zorgen dat alle muggen doorweekt zijn en breng vervolgens muggen over naar het dissectiemedium door een tang te gebruiken om 70% EtOH af te wassen.
- Ga naar de dissectieruimte en plaats muggen op een dissectiemicroscoopstadium.
- Verwijder overtollig medium van muggen, voeg indien nodig nieuw medium toe tijdens de dissectie. Voorkom dat muggen uitdrogen, maar te veel vloeistof maakt dissectie moeilijker.
- Gebruik 2 spuiten met 25 G-naalden, houd de thorax en het hoofd van de mug vast en trek het hoofd voorzichtig omhoog om speekselklieren uit de thorax te trekken.
- Koppel speekselklieren los van hoofd en thorax met een naald.
- Plaats speekselklieren tijdelijk in een apart druppeltje medium op de glasplaat.
- Na het ontleden van 15-20 speekselklieren, verzamel ze in een buis met lage retentie met behulp van de Pasteur pipet.
OPMERKING: Zodra speekselklieren het brede deel van de Pasteur-pipet binnendringen, blijven ze aan het glas plakken en is het moeilijk om ze eruit te krijgen. - Pellet speekselklieren door korte puls spin in een tafelcentrifuge. Verwijder het dissectiemedium zonder de pellet te verstoren en voeg 100 μL nieuw dissectiemedium toe.
- Maal speekselklieren met een kleine homogenisator gedurende 1 minuut om sporozoïeten te verkrijgen.
- Plaats 10 μL dissectiemedium met sporozoïeten op een hemocytometer.
OPMERKING: Afhankelijk van het aantal speekselklieren, kan het nodig zijn om de sporozoïetoplossing te verdunnen tot 1:10 tot 1:50 met medium voordat men gaat tellen. - Tel het aantal sporozoïeten in twee van de vier kwadranten en bereken het aantal sporozoïeten/muggen:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier presenteren we resultaten van een reeks membraanvoeders met behulp van P. falciparum NF54-gametocytenculturen gegenereerd met behulp van het bovenstaande protocol (zie (Figuur 5). De gametocytencultuur werd geïnitieerd met ongeveer 0,5% aseksuele cultuur in gemengd stadium op dag 0, die op dag 4 en dag 5 uitgroeide tot een piekparasiet van ongeveer 15%. Zoals te zien is in figuur 5A bij deze hoge parasietmie, worden de parasieten gestrest en crasht de aseksuele stadiumcultuur. Deze stress resulteert echter gelijktijdig in de inductie van gametocytogenese. Vroege gametocyten verschenen na dag 6 en dag 7 en aseksuele parasieten daalden langzaam, maar bleven op een laag niveau. Aanwezigheid van aseksuele stadiumparasieten had geen invloed op muggenvoedingsexperimenten. Als gametocyten echter moeten worden gebruikt in experimenten die zuivere culturen vereisen, zoals geneesmiddelgevoeligheidstests en proteomische of transcriptomische studies, kunnen resterende aseksuele stadia worden verwijderd door behandeling met 50 mM N-acetylglucosamine. De meerderheid van de gametocyten rijpt tot stadium V op dag 15, waarna ze besmettelijk worden voor muggen en klaar waren om te worden gevoerd. Representatieve beelden van Giemsa-gekleurde bloeduitstrijkjes op verschillende tijdstippen na het starten van de gametocytencultuur zijn weergegeven in figuur 5B.
Tussen 8 en 10 dagen na bloedtoevoer werden muggen ontleed om de prevalentie en intensiteit van de infectie te bepalen. Prevalentie is het percentage gevoede muggen die oöcysten hebben, terwijl intensiteit het aantal oöcysten is dat in elke mug wordt aangetroffen. Beide zijn belangrijke indicatoren voor het succes van de feed. Gegevens van 5 onafhankelijke muggenvoeders zijn weergegeven in figuur 6. Voeders werden gekozen om de normale variatie in de niveaus van infectiviteit te laten zien na voeding met 0,3% volwassen gametocyten vanaf dag 16 cultuur van P. falciparum NF54. Oöcystintensiteiten bieden kwantitatieve gegevens om de mug-infectiviteit van gametocyten te bepalen en de prevalentie toont het percentage gevoede muggen dat geïnfecteerd raakte. Deze gegevens kunnen worden gebruikt om transmissieblokkerende middelen te evalueren en om doelen voor transmissieblokkerende vaccins en geneesmiddelen te identificeren en te karakteriseren. Het aantal oöcysten varieerde zowel binnen als tussen experimenten en vereiste 25-50 muggen per cohort om het effect van verschillende experimentele omstandigheden te bepalen.
Oöcystintensiteiten worden beschouwd als eindpunt van de meeste transmissieblokkerende testen en strategieën, maar het aantal sporozoïeten is meestal belangrijk voor de biologie van sporozoïeten en voor leverstadiumstudies. Tabel 1 toont het gemiddelde aantal sporozoïeten verkregen per mug uit 12 onafhankelijke bloedvoeders. Zoals te zien is in de tabel, was het gemiddelde aantal sporozoïeten consistent, maar er was één experiment waarbij we nul sporozoïeten verkregen, wat af en toe falen van de test vertegenwoordigt.
Figuur 1: Workflow van P. falciparum gametocytencultuur en membraanvoedingsprotocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Opstelling muggenbloedvoeding. (A) Glazen feeder en rechthoekig stuk paraffine film (B) Twee glazen feeders weergegeven voor en na parafilm membraan bevestiging (C) Glazen feeder bovenop muggenbeker en verbonden met circulatie waterbad. (D,E) Pipetteren van bloedtoevoer in de glastoevoer (F) Onderste weergave van glastoevoer met homogene verdeling van bloedtoevoer (G) Verschillende muggen die zich voeden door parafilmmembraan. (H)Bovenaanzicht van muggenbekers na het voeren, met druppels bloed die worden uitgescheiden door de voedende muggen aan de onderkant van de beker. Schaalbalk = 10 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Grafische weergave met stappen van muggendissectie van midgut. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Grafische weergave met stappen van muggensekselklierdissectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: P. falciparum gametocytencultuur en oöcystvisualisatie op geïnfecteerd muggenmiddengut. A)Tijdsverloop van 15 dagen gametocytencultuur, met een steile vermenigvuldiging van aseksuele stadia tot piekparasitairemie binnen de eerste 4 dagen, gevolgd door gametocytogenese en rijping in de loop van de tijd. (B)Geimsa-gekleurd dun bloeduitstrijkje met verschillende stadia van gametocytencultuur, dag 1 vroege aseksuele fase, dag 4 piek aseksuele parasitemie, dag 6 gestreste cultuur als gevolg van hoge parasietbelasting, dag 9 & 12 vroege gametocyten en dag 15 met volwassen mannelijke en vrouwelijke gametocyten. Morfologisch vroege stadium gametocyten waren niet te onderscheiden van aseksuele stadia, maar laat stadium II vertoonde de halvemaanvorm met puntige uiteinden en langwerpig als parasiet zich ontwikkelde tot stadium III en IV. Volwassen stadium V-gametocyten werden echter gekenmerkt door een klassieke halvemaanvorm met afgeronde uiteinden en minimale zichtbaarheid van de gastheercel14. Schaalbalk = 10 mm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: P. falciparum oöcysten telt per mug midgut. (A)Grafiek toont oöcystentellingen door de jaren heen, voor elk experiment werden muggen gevoed met 0,3% gametocyten en midguts werden ontleed op dag 8 na bloedtoevoer. Elke stip vertegenwoordigt het aantal oöcysten van individuele midguts en de horizontale lijn vertegenwoordigt de mediane waarde. (B) Tabel toont het gemiddelde aantal oöcysten, de prevalentie van geïnfecteerde muggen en het verspreidingsgebied. (C)Foto's van oöcysten op muggenmiddendgut uit twee afzonderlijke bloedvoedingsexperimenten bij verschillende vergrotingen. Schaalbalk = 150 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Experiment | Dag van dissectie (na bloedtoevoer) | Gemiddelde sporozoiet/mug |
| 1 | 14 | 42, 000 |
| 2 | 14 | 40, 000 |
| 3 | 14 | 42, 750 |
| 4 | 15 | 25, 411 |
| 5 | 15 | 33, 750 |
| 6 | 14 | 15, 750 |
| 7 | 16 | 0 |
| 8 | 15 | 33, 200 |
| 9 | 14 | 56, 333 |
| 10 | 14 | 45, 333 |
| 11 | 17 | 43, 750 |
| 12 | 16 | 56, 000 |
Tabel 1: Gemiddeld aantal speekselklieren sporozoïeten per mug gedurende 12 onafhankelijke cycli over een periode van 2 jaar. A. stephensi-muggen werden gevoed met 0,3% P. falciparum-gametocyten en 15-20 muggen werden ontleed tussen dag 14-17 na bloedtoevoer. Gemiddelde sporozoïet tellingen per mug worden getoond.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven methoden worden al meer dan 10 jaar met succes gebruikt bij het Johns Hopkins Malaria Research Institute15,16,17,18,19,20,21,22. Gametocyten geproduceerd met behulp van dit protocol zijn gebruikt voor gametocytocidale assays met hoge doorvoer22, voor proteomische15, evenals voor transcriptomische23 studies. Een belangrijke reden om deze methoden te ontwikkelen is echter om de volwassen gametocyten te gebruiken om muggen te infecteren voor studies naar muggenstadia en sporozoïeten23,24,25,26. Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol van het genereren van volwassen P. falciparum gametocyten en infectie van muggen met behulp van glazen membraanvoeders. Deze methoden zijn van cruciaal belang voor elk laboratorium dat werkt aan transmissieblokkeringsstrategieën, sporozoïtische stadia en pre-erytrocytische leverstadia van P. falciparum.
Ifediba en Vanderberg beschreven in 1981 de langetermijncultuur van P. falciparum, in aanwezigheid van 50 μg /ml hypoxanthine die zeer besmettelijke volwassen gametocyten produceerde27. Sindsdien zijn er talloze publicaties geweest die methoden beschrijven om gametocyten te produceren voor verschillende toepassingen9,10,11,12. De meeste van deze publicaties maken gebruik van eerder beschreven gametocytogenese-inducerende omstandigheden om de opbrengst te verhogen. Met behulp van geconditioneerde media, het benadrukken van de cultuur door plotselinge toename van de parasitairemie, daling van hematocriet om bloedarmoede na te bootsen, rode bloedcellysis en logfaserepressie door bulk omhoog, kan worden gebruikt om gametocytogenese te induceren. De hier beschreven methode is eenvoudig en beproefd. Start de gametocytencultuur met 0,3-1% aseksuele stadiumparasitairemie bij 4% hematocriet en verander elke dag van media tot dag 15-18. Om consistente resultaten te bereiken, is het van cruciaal belang om te beginnen met gametocytencultuur met aseksuele stadiumparasieten met een lage passage, verse RBC's (<1 week) te gebruiken en ervoor te zorgen dat de cultuurtemperatuur niet fluctueert tijdens mediaverandering. Aangezien het ontwikkelingsproces van falciparum-gametocyten gesekwestreerd optreedt in statische omstandigheden van extravasculaire ruimtes in beenmerg4,5, is het belangrijk om bezinkte RBC-lagen gedurende de kweekperiode niet te verstoren.
Het kweken van P. falciparum-gametocyten met consistentie is veeleisend, maar om ze muggen te laten infecteren, is een ander niveau van complexiteit. Membraanvoeding is onderhevig aan verschillende andere variabelen dan gametocyten, zoals leeftijd en fitheid van mug, midgut microbiota en voedingsgedrag28,29. Gewoonlijk vertonen SMFA-gegevens een hoge mate van variabiliteit en vereisen ze een groot aantal muggen om effecten van verschillende experimentele omstandigheden te identificeren11,28. Met behulp van lage passagecultuur voor gametocyten, gezonde 3 - 6-dagen oude muggen en een geoptimaliseerd membraanvoedingsprotocol kunnen helpen bij variaties in oöcystentellingen.
Het hier beschreven protocol voor zowel gametocytenteelt als membraanvoeding, is gedurende vele jaren geoptimaliseerd. Deze methoden bieden een gedetailleerde beschrijving voor het verkrijgen van volwassen transmissie competente gametocyten, standaard membraanvoedingstest, muggen midgut dissectie en oöcyst kwantificering, evenals speekselklierdissectie en sporozoïet kwantificering. Deze protocollen zijn consistent in termen van het aantal gametocyten dat nodig is om betrouwbare muggeninfectie en robuuste oöcystentellingen en sporozoïetopbrengsten te bieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Auteurs bedanken Bloomberg Philanthropies voor financiële steun aan het Johns Hopkins Malaria Research Institute (JHMRI). Dit werk zou niet mogelijk zijn geweest zonder de expertise van JHMRI insecten- en parasitologie kernfaciliteiten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Sugar solution | |||
| 10ml serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
| 1ml serological pipet | Falcon | 357521 | |
| 25 ml serological pipet | Falcon | 357535 | |
| 37°C Incubator | |||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml serological pipet | Falcon | 357543 | |
| 6 well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
| 70% Ethanol | |||
| 9" glass pipet | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Anopheles Mosquitoes | JHMRI, Insectary core | We use A. stephensi or A. gambiae (keele) | |
| cell counter | |||
| Circulating water bath | |||
| fine tip forceps | Fisherbrand | 12-000-122 | |
| Geimsa stain | Sigma | GS1L | |
| Glass desiccator | |||
| Glass membrane feeder | Chemglass Life Sciences | CG183570 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Human Blood O+ | JHU | Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit | |
| Human Serum O+ | Interstate blood bank | Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C. | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9337 | Make 500x stock in 1M NaOH |
| Mercurochrome | Sigma | M7011 | Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed |
| Micro Pipette | |||
| Microscope | Olympus | Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work. | |
| Mosquito cups | Neptune cups | ||
| N-acetylglucosamine | Sigma | A3286 | Optional and needed only when pure gametocytes are required. |
| Netting | Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding | ||
| Parafilm | |||
| PBS | |||
| Petri dish | Thermo Scientific | 249964 | |
| Pipet tips | |||
| Pipetman | |||
| Plasmodium falciparum NF54 | BEI Resources | MRA-1000 | Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply |
| RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Media contains glutamine and HEPES |
| Slide warmer | |||
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation |
| water bath | |||
| Xanthurenic Acid | Sigma | D120804 | For flagellation media |
References
- World Health Organization.
- Sinden, R. E., Smalley, M. E. Gametocytogenesis of Plasmodium falciparum in vitro: The cell-cycle. Parasitology. 79 (2), 277-296 (1979).
- Sinden, R. E.
- Joice, R., et al. Plasmodium falciparum transmission stages accumulate in the human bone marrow. Science Translational Medicine. 6 (244), 5 (2014).
- Abdulsalam, A. H., Sabeeh, N., Bain, B. J. Immature Plasmodium falciparum gametocytes in bone marrow. American Journal of Hematology. 85 (12), 943 (2010).
- Ghosh, A. K., Jacobs-Lorena, M. Plasmodium sporozoite invasion of the mosquito salivary gland. Current Opinion in Microbiology. 12 (4), 394-400 (2009).
- Bennink, S., Kiesow, M. J., Pradel, G. The development of malaria parasites in the mosquito midgut. Cellular Microbiology. 18 (7), 905-918 (2016).
- Trager, W., Jenson, J. B.
- Duffy, S., Loganathan, S., Holleran, J. P., Avery, V. M. Large-scale production of Plasmodium falciparum gametocytes for malaria drug discovery. Nature Protocols. 11 (5), 976-992 (2016).
- Delves, M. J., et al. Routine in vitro culture of P. Falciparum gametocytes to evaluate novel transmission-blocking interventions. Nature Protocols. 11 (9), 1668-1680 (2016).
- Habtewold, T., et al. Streamlined SMFA and mosquito dark-feeding regime significantly improve malaria transmission-blocking assay robustness and sensitivity. Malaria Journal. 18 (1), 24 (2019).
- Demanga, C. G., et al. The development of sexual stage malaria gametocytes in a Wave Bioreactor. Parasites and Vectors. 10 (1), 216 (2017).
- Brockelman, C. R. Conditions favoring gametocytogenesis in the continuous culture of Plasmodium falciparum. Journal of Eukaryotic Microbiology. 29, 454-458 (1982).
- Meibalan, E., Marti, M. Biology of malaria transmission. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 7, (2017).
- Essuman, E., et al. A novel gametocyte biomarker for superior molecular detection of the plasmodium falciparum infectious reservoirs. Journal of Infectious Diseases. 216 (10), 1264-1272 (2017).
- Simões, M. L., Mlambo, G., Tripathi, A., Dong, Y., Dimopoulos, G. Immune regulation of plasmodium is anopheles species specific and infection intensity dependent. mBio. 8 (5), 01631 (2017).
- Oakley, M. S., et al. Transcriptome analysis based detection of Plasmodium falciparum development in Anopheles stephensi mosquitoes. Scientific Reports. 8, 11568 (2018).
- Saraiva, R. G., et al. Chromobacterium spp. mediate their anti-Plasmodium activity through secretion of the histone deacetylase inhibitor romidepsin. Scientific Reports. 8, 6176 (2018).
- Tao, D., et al. Sex-partitioning of the Plasmodium falciparum stage V gametocyte proteome provides insight into falciparum-specific cell biology. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (10), 2705-2724 (2014).
- Grabias, B., Zheng, H., Mlambo, G., Tripathi, A. K., Kumar, S. A sensitive enhanced chemiluminescent-ELISA for the detection of Plasmodium falciparum circumsporozoite antigen in midguts of Anopheles stephensi mosquitoes. Journal of Microbiological Methods. 108, 19-24 (2015).
- Ferrer, P., Vega-Rodriguez, J., Tripathi, A. K., Jacobs-Lorena, M., Sullivan, D. J. Antimalarial iron chelator FBS0701 blocks transmission by Plasmodium falciparum gametocyte activation inhibition. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (3), 1418-1426 (2015).
- Sanders, N. G., Sullivan, D. J., Mlambo, G., Dimopoulos, G., Tripathi, A. K. Gametocytocidal screen identifies novel chemical classes with Plasmodium falciparum transmission blocking activity. PLoS One. 9 (8), 105817 (2014).
- Lindner, S. E., et al. Transcriptomics and proteomics reveal two waves of translational repression during the maturation of malaria parasite sporozoites. Nature Communications. 10, 4964 (2019).
- McLean, K. J., et al. Generation of Transmission-Competent Human Malaria Parasites with Chromosomally-Integrated Fluorescent Reporters. Scientific Reports. 9, 13131 (2019).
- Espinosa, D. A., et al. Proteolytic Cleavage of the Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein Is a Target of Protective Antibodies. Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1111-1119 (2015).
- Swearingen, K. E., et al. Interrogating the Plasmodium Sporozoite Surface: Identification of Surface-Exposed Proteins and Demonstration of Glycosylation on CSP and TRAP by Mass Spectrometry-Based Proteomics. PLoS Pathogens. 12 (4), 1005606 (2016).
- Ifediba, T., Vanderberg, J. P. Complete in vitro maturation of Plasmodium falciparum gametocytes. Nature. 294 (5839), 364-366 (1981).
- Miura, K., et al. An inter-laboratory comparison of standard membrane-feeding assays for evaluation of malaria transmission-blocking vaccines. Malaria Journal. 15, 463 (2016).
- Miura, K., et al. Qualification of Standard Membrane-Feeding Assay with Plasmodium falciparum Malaria and Potential Improvements for Future Assays. PLoS One. 8 (3), 57909 (2013).
