Summary
Detaljerade undersökningar på myggstadier av malariaparasiter är avgörande för att utforma effektiva överföringsblockeringsstrategier. Detta protokoll visar hur man effektivt odlar infektiösa gametocyter och sedan matar dessa gametocyter till myggor för att generera myggstadier av P. falciparum.
Abstract
Malaria är fortfarande ett av de viktigaste folkhälsoproblemen och orsakar betydande sjuklighet och dödlighet. Malaria är en myggburen sjukdom som överförs genom en smittsam bit från den kvinnliga Anopheles myggan. Malariakontroll kommer så småningom att förlita sig på en mängd tillvägagångssätt, vilket inkluderar sätt att blockera överföring till, genom och från myggor. För att studera myggstadier av malariaparasiter i laboratoriet har vi optimerat ett protokoll för att odla mycket smittsamma Plasmodium falciparum gametocyter, ett parasitstadium som krävs för överföring från den mänskliga värden till myggvektorn. P. falciparum gametocyter mognar genom fem morfologiskt distinkta steg, som tar ungefär 1-2 veckor. Gametocytkulturen som beskrivs i detta protokoll är klar om 15 dagar och är smittsam för myggor från dag 15-18. Dessa protokoll utvecklades för att upprätthålla en kontinuerlig cykel av infektion kompetenta gametocyter och för att upprätthålla oavbruten leverans av mygga stadier av parasiten. Här beskriver vi metoden för gametocytkultur och hur man infekterar myggor med dessa parasiter med hjälp av glasmembranmatare.
Introduction
Malaria orsakas av Plasmodium parasiter och överförs till sina ryggradsdjur värdar via infektiös bit av kvinnliga Anopheles myggor. Enligt Världshälsoorganisationens (WHO) rapport från 2019 fanns det uppskattningsvis 405 000 dödsfall, från totalt 228 miljoner fall av malaria1. De flesta malariarelaterade dödsfallen var koncentrerade till den afrikanska regionen, särskilt bland barn under fem år. Medan den totala incidensen av malaria har minskat globalt från 2010, har nedgången under de senaste åren planat ut och det finns ett trängande behov av ytterligare kontrollstrategier för att eliminera sjukdomen.
Cykliska asexuella blod stadier av malaria parasiter orsakar sjukdom patogenes och en liten delmängd av dessa skiljer sig från kvinnliga och manliga gametocyter. Plasmodium falciparum gametocytes är unika till sin natur eftersom de tar 7-10 dagar att utveckla genom fem morfologiskt distinkta stadier. Omogna gametocyter från steg I till IV är kvarsatta i benmärgsparenkym och är till stor del frånvarande från perifer cirkulation2,3,4,5. Erytrocyter infekterade med mogna steg V-gametocyter frigörs i blodomloppet och cirkulerar fritt för att tas upp av myggor. En gång inuti myggmiten aktiveras gametocyter, genom en temperaturförändring och exponering för midgutmiljön, omvandlas till kvinnliga och manliga könsceller och börjar utveckla myggstadierna, vilket kulminerar med de smittsamma stadierna av sporozoiter i myggsalivkörtlarna6,7.
Sedan Trager och Jenson8 beskrev en standardiserad metod för att odla P. falciparumhar studier på asexuella blodscener utvecklats kraftigt. Bristen på ett tillförlitligt kultursystem för sexuella stadier har dock gjort det svårt att studera P. falciparum gametocytes, överföringsbiologi och myggstadier. Under de senaste åren har flera metoder publicerats som har hjälpt laboratorier att etablera gametocytkulturer9,10,11,12. Detta manuskript beskriver standardiserade och tillförlitliga protokoll till kultur P. falciparum gametocytes som kan utgöra en värdefull resurs för malariaforskningsgemenskapen. Denna metod möjliggör robust produktion av mogna och infektiösa gametocyter som tillsammans med ett standardiserat myggmatningsprotokoll resulterar i mycket tillförlitlig mygginfektionsförmåga. Dessa metoder fastställdes för att upprätthålla oavbruten leverans av gametocyter och myggsteg parasiter. I detta manuskript beskriver vi ett grundligt gametocytkulturprotokoll (figur 1), beredning av glasmembranmatare och infektion av myggor med hjälp av dessa membranmatare (figur 2), dissekering av midgut (figur 3) och salivkörtel av myggor(figur 4), och kvantifiering av infektion hos mygga efter midgut och salivkörtel dissekering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Blodsamlingar som beskrivs nedan har godkänts av Institutional Review Board vid Johns Hopkins University. P. Falciparum odlas i färska RBC under sterila förhållanden i en anläggning för biosäkerhetsnivå 2 (BSL2) och försiktighet används för att hantera biologiska material. Efter varje steg som involverar blod eller blodprodukter sköljs varje plast eller glas med 10% blekmedel i huven innan det kasseras korrekt.
1. Reagenser och beredning
- Parasitisolat P. falciparum NF54 (se Tabell över material)användes, som kan producera infektiösa gametocyter i upp till två månader i kontinuerlig kultur.
OBS: Inte alla kulturanpassade parasitlinjer producerar gametocyter, och låg passage NF54 isolat är mest konsekventa. - O+ Erytrocyter: Späd helblod genom att tillsätta lika stor volym av RPMI 1640-media och centrifug vid 500 x g i 5 minuter vid rumstemperatur i en svängning ut rotor med retardation inställd på 0. Ta försiktigt bort supernatant och buffy coat (ett vitt band mellan plasma och packade erytrocyter, som innehåller de flesta vita blodkroppar och trombocyter) och tillsätt lika stor mängd RPMI. Upprepa tvättsteget två gånger och efter den slutliga tvätten tillsätt en pelletsvolym RPMI för att få 50% hematokrit för lagring vid 4 °C.
OBS: Gametocyter mognar under en period av två veckor vilket gör det viktigt att börja kulturer med färska erytrocyter, vanligtvis erytrocyter som dras inom en vecka fungerar bra. - O+ Human Serum: Samla minst 6 serumenheter tillsammans för att minimera effekten av normal variation i serum från olika individer. Sterilisera poolat humant serum med 0,2 μm filtreringskolvar. Aliquot i portioner om 50 ml eller mindre baserat på behovet och förvara vid -20 °C.
OBS: Erytrocyter och serum måste vara från en kompatibel blodtyp för P. falciparum kulturer. - 500x hypoxantinlösning (100 ml): Lös upp 0,5 g hypoxantin i 100 ml 1 M NaOH. Filtrera sterilisera och gör 5-10 ml alikvoter för lagring. Lagren kan lagras upp till ett år vid -20 °C och upp till 2 veckor vid 4 °C.
- Natriumbikarbonat (valfritt): Lös upp 7,5 g natriumbikarbonat i 100 ml avjoniserat vatten av vävnadskulturkvalitet och filtrera sterilisera med 0,2 μm filter.
OBS: Detta protokoll använder ljusburkmetoden för att ge mikroaerofila förhållanden för P. falciparum in vitro-odling och kräver inte natriumbikarbonat. Men om parasiter odlas med en malariagasblandning (5% O2, 5% CO2 och 90% N2), är det viktigt att komplettera odlingsmedier med 0,2% natriumbikarbonat. - Komplett media: För att förbereda 500 ml komplett media, tillsätt 1 ml hypoxantinlösning och 50 ml poolat humant serum till 500 ml RPMI 1640. Tillsätt 15 ml 7,5% natriumbikarbonat om du använder en malariagasblandning. Förvara helmediet vid 4 °C och kassera om färgen på hela mediet ändras från orange till rosa. För att undvika avfall, gör tillräckligt med kompletta medier för att användas inom tre dagar.
- Exflagellationsmedier (valfritt): Gör exflagellation eller ookinete media genom att lösa upp 200 mg NaHCO3,5 mg Hypoxanthine och 100 μL xanthurensyra (från 100 mM lager i vatten) till 100 ml ofullständigt medium (RPMI 1640 med glutamin och HEPES).
OBS: Exflagellation är processen för manlig gametbildning inuti mitten av kvinnliga Anopheles mygga några minuter efter att det tar blodmjöl infekterat med gametocyter. Manliga gametocyter av Plasmodium ger upphov till 8 manliga gameter efter en exflagellation händelse. In vitro sker denna process spontant när kulturtemperaturen sänks till rumstemperatur (RT) och kan observeras i odlade mogna gametocyter. - N-acetyglucosamin (valfritt): Gör 500 mM lagerlösning av N-acetyglucosamin i vatten eller ofullständiga medier, alikvot och lagra vid -20 °C.
- NaCl-lösningar: Lös upp 0,9 g, 1,6 g och 12 g NaCl i 100 ml av avjoniserat vatten av vävnadskulturkvalitet för att göra 0,9%, 1,6% och 12% NaCl-lösningar. Filtrera sterilisera med 0,22 μm filter och förvara vid 4 °C.
2. P. falciparum asexuell scenkultur
- För att börja parasitkulturen, ta bort en låg passage frusen flaska av P. falciparum NF54, från den flytande kvävetanken och tina snabbt i vattenbad som är inställd på 37 °C.
- Överför innehållet (~ 1 mL) till ett 50 ml sterilt centrifugrör och tillsätt 0,2 volym förvarnad 12% NaCl, samtidigt som du försiktigt skakar röret för att säkerställa jämn blandning. Inkubera i 5 min vid RT med intermittent mild skakning.
- Tillsätt 9 volymer på 1,6% NaCl dropwise, samtidigt som du fortsätter att blanda försiktigt. Centrifugera innehållet vid 500 x g i 5 min vid RT, kassera försiktigt supernatanten. Tillsätt 9 volymer 0,9% NaCl dropwise, samtidigt som du ser till att konsekvent blanda parasitpelleten. Centrifugera igen vid 500 x g i 5 min vid RT. Ta bort supernatanten och återanvänd parasiterna till 5 ml komplett media.
- Överför innehållet till en brunn på en 6 väl mjukpappersodlingsplatta och tillsätt 100-200 μL packade RBC: er.
- Inkubera parasitkultur vid 37 °C i en ljusburk eller i en modulär inkubatorkammare rensad med speciell gasblandning på 5% O2,5% CO2 och 90% N2.
- Ersätt media varje dag och övervaka tillväxten genom att göra ett tunt blodfläck genom att dra några mikroliter från sedimenterat RBC-lager efter att kulturgengenten har aspireras under regelbunden medieförändring.
- Använd sterilt glas Pasteur pipetter för att rita och knacka sedan i mitten av glasrutschbanan för att överföra en droppe kultur till diabilden. Placera en annan glasrutschbana framför droppen och dra tillbaka den för att kontakta RBC: erna och tryck den snabbt framåt i en rörelse för att göra tunt utstryk av RBC-monolayer.
- Placera bilden horisontellt på ett torkställ och låt den lufttorka. Fixera blodfläcken genom att släppa absolut metanol på utstryket. Låt det fasta utstryket torka helt och häll sedan försiktigt 10% Geimsa-fläcken nyspädd i vatten tills blodfläcken är helt täckt. Låt cellerna färga i ca 15 minuter.
- Tvätta bort den överflödiga fläcken genom att skölja av rutschkanan under rent kranvatten och låt rutschkanorna torka i vertikalt läge.
- Bestäm parasitmi genom att titta på tunt blodfläck på ett mikroskop med hjälp av oljesänkning 100x mål. Räkna antalet infekterade erytrocyter bland totalt minst 500 RBC för att bestämma procent parasitmi.
3. P. falciparum gametocyte kultur
OBSERVERA: Gametocytkulturer tar två veckor att producera mogna gametocyter som är smittsamma för myggor. Stegen i gametocytkulturen beskrivs i figur 1. P. falciparum isolat förlorar vanligtvis förmågan att producera gametocyte efter långsiktig in vitro kultur13. För att säkerställa kvaliteten på gametocyter bör kulturen initieras från låg passagematarkultur, högst 2 månader gammal sedan upptining. Förvarma medier till 37 °C och utför alla procedurer på en varmare uppsättning vid 38 °C. Se till att gametocytkulturer inte är ur inkubatorn under en längre period för att minimera temperaturfluktuationer.
- Frö gametocytkulturen (dag 0) med blandad asexuell scenmatarkultur vid 0,3-1% parasitmi vid 4% hematokrit.
- För att skapa en sex väl gametocytkultur, centrifugera 5 ml matarkultur vid 500 x g i 5 minuter på RT. Kassera supernatanten och återanvända pelleten i 30 ml komplett media.
- Tillsätt 1,2 ml packade RBC: er, blanda och dispensera 5 ml till varje brunn på 6 brunnsplattan och inkubera i en ljusburk vid 37 °C.
OBS: Gametocyte kultur som beskrivs ovan är baserad på en blandad asexuell scenmatarkultur vid 5% parasitmi. - Byt media dagligen i 15-18 dagar, utan tillsats av färskt blod, genom att försiktigt aspirera ca 70-80% kultur supernatant för att undvika att ta bort blodkroppar.
- Lägg till 5 ml färskt komplett medium till varje brunn. När du byter media, lägg långsamt till media med en serologisk pipett mot brunnens vägg för att undvika att störa det sedimenterade RBC-skiktet.
OBS: Eftersom 1-2 ml av odlingsmediet kommer att lämnas under medieförändringen, kommer den totala volymen av kultur att vara mellan 6-7 ml, efter dag 1 av gametocytkulturen. När du anpassar detta protokoll är det lämpligt att göra blodfläckar varannan dag för att se till att parasiter är friska. Att göra ett blodfläck kan ofta utarma antalet celler i kulturen. För att undvika detta, rita en mycket liten volym. - För att kvantifiera mogen gametocytemi, gör blodfläck mellan dag 15-18 och räkna antalet mogna gametocyter bland totalt antal celler.
OBS: Mogna gametocyter kan enkelt identifieras med sin klassiska halvmåneform med släta rundade ändar (figur 5B). - Räkna minst 1 000 RBC och beräkna procentandelen RBC infekterade med mogna gametocyter.
- För att kvantifiera exflagellationshändelser, ta 200 μL gametocytkultur och centrifugera vid 500 x g i 5 minuter vid RT i ett förvärmt rör. Återanvänd pelleten i 20 μL exflagellationsmedier och överför till en glasrutschbana med täckglidning.
- Efter 15 minuters inkubation vid rumstemperatur, börja räkna exflagellationscentra i faskontrastläge med 10x mål. Räkna exflagellationscenter i minst fyra fält för att beräkna exflagellationshändelser.
OBS: En detaljerad metod för exflagellationsanalys har beskrivits tidigare av Delves et al10. Mer än 20 exflagellationshändelser per fält anses vara lämpliga för membranmatningsanalys. - Gametocytkulturer har vanligtvis låga nivåer av kvarvarande asexuella stadier. Om experimentet kräver rena gametocyter, behandla kulturen med 50 mM N-acetyglucosamin.
- Tillsätt 0,5 ml N-acetyglucosamin från 10x lagerlösning per brunn (5 ml) i minst 3 dagar medan du byter media för att rensa återstående asexuella stadier.
OBS: N-acetyglucosamin kan blockera invasion av sexuellt engagerade merozoiter också, behandling bör inledas först efter dag 7 av gametocyt kultur.
4. Mygginfektion med standard membranmatningsanalys (SMFA)
OBS: Gametocyter som odlas in vitro kan matas till myggor med hjälp av glasmembranmatare. Inrättandet av blodmatningsapparaten visas i figur 2. Som beskrivits ovan, alltid upprätthålla gametocyter vid 37 °C för att undvika aktivering innan de intas av myggor. Förkrigstidens plastartiklar, reagenser och utrustning används med gametocytkultur till 37 °C.
- Svält 3-7-dagars gamla kvinnliga Anopheles myggor genom att ta bort deras sockervatten i 6,5 h eller över natten före membranmatning.
- Överför dem med motoriserade eller mundrivna aspiratorer till papperskoppar täckta med dubbla lager av fint nättyg. Alternativt kan du slå ner myggor i ett kallt rum eller kylskåp för att överföra dem till pappersmuggarna.
OBS: En pint storlek kopp kan användas för att mata upp till 100 myggor. - Centrifug tvättade blod vid 500 x g i 5 min vid RT och kasserade supernatant. Tillsätt en lika stor mängd nyupptinat humant serum för att rekonstruera hela blodet. Överför blod- och serumblandningen till vattenbadet vid 37 °C i 30 minuter.
- Överför gametocytkultur till förvärmt 15 ml plaströr och centrifug vid 600 x g i 5 min vid 37 °C. Aspirera försiktigt kulturen supernatant och göra tunt blod utstryk för att bestämma mogen gametocytemia enligt beskrivningen ovan.
- För att göra det slutliga blodmatningen, späd gametocytpelleten till önskad koncentration med rekonstituerat helblod. Håll blodtillförseln vid 37 °C tills myggor och glasmatare är klara.
OBS: Mogna gametocytkoncentrationer mellan 0,02 och 0,3% ger konsekvent mygginfektionsförmåga. Det är dock lämpligt att optimera gametocytemia genom att mata olika koncentrationer till olika koppar myggor. - Se till att glasmembranmatarna har två öppningar, en smal toppöppning för att pipett det infekterade blodet och en bottenöppning för membranfäste. Skär en paraffinfilm i rutor, sträck till en jämn tjocklek och håll fast vid matarens öppning för att skapa förseglat utrymme för blodmatningen.
- Fäst membranmatare på ett cirkulationsvattenbad genom att ansluta slangar på varje sida för att möjliggöra passage av varmt vatten genom jackan runt membranmatare.
OBS: Flera glasmatare kan anslutas i serie för att passa för flera utfodringsförhållanden. - När alla matare är anslutna till vattenbadet, slå på det och inspektera eventuella läckor.
- Placera matare i mitten av nätet på myggkoppar med membransidan nedåt och säkra matare med klämmor eller tejp. Se till att membranmatare inte lutas åt någon sida för att möjliggöra jämn fördelning av blodmatningen och nära kontakt med hela mataren med nätet på koppar, för att ge myggor tillgång inifrån koppen.
- Pipett ca 200–1000 μL blodtillförsel till membranmatare.
OBS: Volymen av blodmatningen varierar beroende på antalet myggor och storleken på membranmataren. För 14 mm glasmatare och 50 myggor använd 200 μL blodfoder. - Se till att lastningen gjordes korrekt och blodmatningen överlagrades på paraffinfilmen.
- Låt myggor mata i ca 30 min med intermittent övervakning.
OBS: Blås försiktigt myggor med munnen för att ge CO2 som kommer att inducera förbättrad blodmatning. - Ta bort ofödda myggor genom att slå ner dem i ett kallt rum. Synligt inspektera myggor för utbuktning och rodnad i buken som ett tecken på färsk blodmjöl. Alternativt kan du använda en munstyrd aspirator för att selektivt ta bort ofödda myggor.
- Kassera ofödda myggor, efter blötläggning av dem i 70% etanol och sätt matade myggor tillbaka i myggkoppen.
- Dubbla bur myggkoppar och överför dem till hög inneslutningsinkubator som anges för myggor infekterade med mänsklig malariaparasit P. falciparum.
- Placera bomullskuddar som blötläggs i 10% sackaros på myggkopparna för att ge dem sockermjöl. Byt ut bomullskuddar varannan dag tills myggor dissekeras.
5. Mygga mid-gut dissekering och oocyst last kvantifiering
OBS: En schematisk av midgut dissekering visas i figur 3.
- 7-8 dagar efter blodmatning, överför myggkoppar till 4 °C i 10 minuter för att slå ner myggor.
- Överför myggor som ska dissekeras till en Petri-maträtt på is med hjälp av finspetsade tångar.
- Blötlägg myggor i 70% etanol i 1-2 min för att avliva dem. Tillsätt PBS till Petri-skålen för att tvätta av etanolen efter att alla myggor har avlivats.
OBS: Innan du lägger till PBS, se till att alla myggor är döda. - Montera en glasrutschbana på dissekerande mikroskop och pipett 100 μL PBS i mitten. Överför försiktigt en mygga med tång till PBS och lämna resten av myggorna i Petri-skålen på is.
- Använd finspetsade tångar, håll det tredje segmentet av buken från myggans bakre ände och med andra tång håller korsningen mellan bröstkorgen och buken. Dra försiktigt buken tills mittpistolen är helt exponerad.
- Kassera resten av myggvävnaden och överför midguten till en ren rutschkana som innehåller några droppar PBS.
- När önskat antal myggor har dissekerats, ta försiktigt bort PBS med en pipett och fläcka midguten med 0,2% mercurochrome i 2-5 min.
- Ta bort överflödiga mercurochrome och line-up midguts på bilden så att de enkelt kan visualiseras under ljusmikroskopet.
- Placera en täcklapp och räkna oocysts på varje midgut under 10x mål. Oocysts färgar rosa och är cirkulära i form (figur 6C).
6. Mygg salivkörtel dissekering och sporozoitbelastning kvantifiering
OBS: En schematisk dissekering av salivkörteln visas i figur 4.
- 14-18 dagar efter blodmatning, placera myggkoppar vid 4 °C i 10 min.
OBS: Det är viktigt att vänta tills myggor slutar röra sig. - I väntan på att myggor ska sluta röra sig, förbered verktyg för dissekering.
- Placera en glasplatta på ett dissekeringsmikroskopsteg. Förbered 2 uppsättningar 25 G nålar på 1 ml sprutor och en 9" Pasteur pipett och gummilampa. Placera 70% EtOH och dissekeringsmedium (HBSS, L-15 eller PBS) i en 6 brunnsplatta.
- I kylrummet överför sövda myggor i en 6 brunnsplatta som innehåller 70% EtOH. Flytta försiktigt myggor med tång för att se till att alla myggor blötläggs och överför sedan myggor till dissekeringsmediet genom att använda tång för att tvätta bort 70% EtOH.
- Flytta till dissekeringsrummet och placera myggor på ett dissekeringsmikroskopstadium.
- Ta bort överskott av medium från myggor, tillsätt nytt medium vid behov under dissekering. Undvik myggor från att torka ut men för mycket vätska gör dissekering svårare.
- Använd 2 sprutor med 25 G nålar, håll myggkorg och huvud och dra försiktigt huvudet uppåt för att dra salivkörtlar från bröstkorgen.
- Koppla bort salivkörtlar från huvud och bröstkorg med en nål.
- Tillfälligt placera salivkörtlar i en separat droppe medium på glasplattan.
- Efter dissekering av 15-20 salivkörtlar, samla dem i ett lågt retentionsrör med Pasteur pipetten.
OBS: När salivkörtlar kommer in i den stora delen av Pasteur pipetten kommer de att hålla fast vid glaset och det är svårt att få ut dem. - Pellet salivkörtlar genom kort puls spinn i en bordscentrifuger. Ta bort dissekeringsmediet utan att störa pelleten och tillsätt 100 μL nytt dissekeringsmedium.
- Mala salivkörtlar med en liten homogenisator i 1 min för att få sporozoiter.
- Placera 10 μL dissekeringsmedel som innehåller sporozoiter på en hemocytometer.
OBS: Beroende på antalet salivkörtlar kan man behöva späda sporozoitlösningen till 1:10 till 1:50 med medium innan man räknar. - Räkna antalet sporozoiter i två av de fyra kvadranterna och beräkna antalet sporozoiter / mygga:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här presenterar vi resultat från en serie membranmatningar med P. falciparum NF54 gametocytkulturer som genereras med hjälp av protokollet ovan (se (figur 5). Gametocytkulturen initierades med cirka 0,5% blandad asexuell kultur på dag 0, som växte till en toppparast på cirka 15% dag 4 och dag 5. Som visas i figur 5A vid denna höga parasitmi är parasiterna stressade och den asexuella scenkulturen kraschar. Denna stress resulterar dock samtidigt i induktion av gametocytogenes. Tidiga gametocytes dök upp efter dag 6 och dag 7 och asexuella parasitemia minskade långsamt men förblev på en låg nivå. Förekomsten av asexuella scenparasiter påverkade inte myggmatningsexperiment. Om gametocyter ska användas i experiment som kräver rena kulturer, såsom läkemedelskänslighetsanalyser och proteomiska eller transkriptomiska studier, kan dock kvarvarande asexuella stadier avlägsnas genom behandling med 50 mM N-acetyglucosamin. Majoriteten av gametocyter mognar till steg V vid dag 15 då de blir smittsamma för myggor och var redo att matas. Representativa bilder av Giemsa-färgade blodfläckar vid olika tidpunkter efter initiering av gametocytkultur visas i figur 5B.
Mellan 8 och 10 dagar efter blodmatning dissekerades myggor för att bestämma prevalensen och intensiteten av infektion. Prevalens är andelen matade myggor som har oocysts medan intensiteten är antalet oocyster som finns i varje mygga. Båda är viktiga indikatorer på foderets framgång. Data från 5 oberoende myggfoder visas i figur 6. Foder valdes för att visa den normala variationen i nivåerna av smittsamhet efter utfodring med 0,3% mogna gametocyter från dag 16 kultur av P. falciparum NF54. Oocyst intensiteter ger kvantitativa data för att bestämma mygginfektionsförmåga hos gametocyter och prevalensen visar andelen matade myggor som blev smittade. Dessa data kan användas för att utvärdera överföringsblockeringsmedel och för att identifiera och karakterisera mål för överföringsblockeringsvacciner och läkemedel. Antalet oocysts varierade både inom och mellan experiment och krävde 25-50 myggor per kohort för att bestämma effekten av olika experimentella tillstånd.
Oocyst intensiteter anses vara slutpunkten för de flesta överföringsblockerande analyser och strategier, men antalet sporozoiter är vanligtvis viktigt för sporozoitbiologi och för leverfasstudier. Tabell 1 visar det genomsnittliga antalet sporozoiter som erhålls per mygga från 12 oberoende blodfoder. Som framgår av tabellen var det genomsnittliga antalet sporozoiter konsekventa, men det fanns ett experiment där vi erhöll noll sporozoiter, vilket representerar enstaka fel i analysen.
Figur 1: Arbetsflöde för P. falciparum gametocytekultur och membranmatningsprotokoll. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Myggblodmatning. a)Glasmatare och rektangulär bit paraffinfilm (B) Två glasmatare som visas före och efter parafilmmembranfäste (C) Glasmatare ovanpå myggkoppen och som är anslutna till cirkulationsvattenbad. (D,E) Pipettering av blod matas in i glasmataren (F) Bottenvy av glasmatare som visar homogen fördelning av blodfoder (G) Flera myggor som matar genom parafilmmembranet. (H) Ovanifrån av myggkoppar efter utfodring, som visar droppar blod som utsöndras av de utfodringande myggorna längst ner i koppen. Skalstreck = 10 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Grafisk representation som visar steg av mygg midgut dissekering. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 4: Grafisk representation som visar steg av myggsalivkörtel dissekering. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: P. falciparum gametocyte kultur och oocyst visualisering på infekterad mygg midgut. (A) Tidsförlopp av 15 dagars gametocytkultur, som visar brant multiplikation av asexuella stadier till toppparasmi inom de första 4 dagarna, följt av gametocytogenes och mognad över tiden. (B) Geimsa-färgade tunna blod utstryk visar olika stadier av gametocyt kultur, dag 1 tidigt asexuellt stadium, dag 4 topp asexuell parasitemia, dag 6 stressad kultur på grund av hög parasitbelastning, dag 9 & 12 tidiga gametocyter och dag 15 visar mogna manliga och kvinnliga gametocyter. Morfologiskt tidiga stadium gametocytes var oskiljbara från asexuella stadier, men sent stadium II visade halvmåne form med spetsiga ändar och långsträckt som parasit utvecklats till steg III och IV. Mogna steg V gametocytes, dock, kännetecknades av klassisk halvmåne form med rundade ändar och minimal värd cell synlighet14. Skalstreck = 10 mm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: P. falciparum oocysts räknas per mygg midgut. (A) Diagram visar oocyst antal under åren, för varje experiment matades myggor med 0,3% gametocyter och midguts dissekerades dag 8 efter blodfoder. Varje dot representerar antalet oocysts från enskilda mellanbanker och den vågräta linjen representerar medianvärdet. (B)Tabellen visar genomsnittligt oocystantal, prevalens av infekterade myggor och infektionsintervall. (C) Bilder som visar oocysts på mygg midgut från två separata blodmatningsexperiment vid olika förstoringar. Skalstång = 150 μm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Experiment | Dag för dissekering (efter blodmatning) | Genomsnittlig sporozoit/mygga |
| 1 | 14 | 42, 000 |
| 2 | 14 | 40, 000 |
| 3 | 14 | 42, 750 |
| 4 | 15 | 25, 411 |
| 5 | 15 | 33, 750 |
| 6 | 14 | 15, 750 |
| 7 | 16 | 0 |
| 8 | 15 | 33, 200 |
| 9 | 14 | 56, 333 |
| 10 | 14 | 45, 333 |
| 11 | 17 | 43, 750 |
| 12 | 16 | 56, 000 |
Tabell 1: Genomsnittligt antal salivkörtlar sporozoiter per mygga i 12 oberoende cykler under en 2-årsperiod. A. stephensi myggor matades med 0,3% P. falciparum gametocytes och 15-20 myggor dissekerades mellan dag 14-17 efter blodmatning. Genomsnittliga sporozoiträkningar per mygga visas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoder som beskrivs här har framgångsrikt använts vid Johns Hopkins Malaria Research Institute i mer än 10 år15,16,17,18,19,20,21,22. Gametocyter som produceras med detta protokoll har använts för gametocytocidal-analyser med hög genomströmning22, för proteomiska15, samt för transkriptomiska23-studier. En viktig anledning att utveckla dessa metoder är dock att använda de mogna gametocyterna för att infektera myggor för studier på myggstadier och sporozoiter23,24,25,26. Detta manuskript beskriver ett detaljerat protokoll för att generera mogna P. falciparum gametocytes och infektion av myggor med hjälp av glasmembranmatare. Dessa metoder är kritiska för alla laboratorier som arbetar med överföringsblockeringsstrategier, sporozoitstadier och pre-erytrocytic lever stadier av P. falciparum.
Ifediba och Vanderberg beskrev 1981 den långsiktiga kulturen av P. falciparum, i närvaro av 50 μg/mL hypoxantin som producerade mycket smittsamma mogna gametocyter27. Sedan dess har det gjorts många publikationer som beskriver metoder för att producera gametocyter för olika tillämpningar9,10,11,12. De flesta av dessa publikationer använder tidigare beskrivna gametocytogenes-inducerande villkor för att öka avkastningen. Med hjälp av betingade medier, stressar kulturen genom plötslig parasitemi ökning, minskning av hematokrit för att efterlikna anemi, röda blodkroppar lys och log fas förtryck genom bulk upp, kan användas för att inducera gametocytogenes. Metoden som beskrivs här är enkel och tidstestad. Initiera gametocytkultur med 0,3-1% asexuell stadium parasitmi vid 4% hematokrit och ändra media varje dag fram till dag 15-18. För att uppnå konsekventa resultat är det viktigt att börja gametocytkultur med asexuella parasiter med låg passage, använda färska RBC (<1 vecka) och se till att kulturtemperaturen inte fluktuerar under medieförändring. Eftersom falciparum gametocyte utvecklingsprocessen sker beslagtas i statiska förhållanden av extravaskulära utrymmen i benmärg4,5, är det viktigt att inte störa avgjorda RBC-lager under hela kulturperioden.
Odling P. falciparum gametocytes med konsistens är krävande men att få dem att infektera myggor presenterar en annan nivå av komplexitet. Membranmatning är föremål för flera andra variabler än gametocyter, såsom myggans ålder och kondition, midgut microbiota och utfodringsbeteende28,29. Vanligtvis visar SMFA-data en hög grad av variabilitet och kräver ett stort antal myggor för att identifiera effekter av olika experimentella tillstånd11,28. Med hjälp av lågpassagekultur för gametocyter kan friska 3 - 6-dagars gamla myggor och optimerat membranmatningsprotokoll hjälpa till med variationer i oocystantal.
Protokollet som beskrivs här för både gametocytodling och membranmatning har optimerats under många år. Dessa metoder ger en detaljerad beskrivning för att erhålla mogna överföring kompetenta gametocyter, standard membran utfodring analys, mygg midgut dissekering och oocyst kvantifiering samt salivary gland dissekering och sporozoite kvantifiering. Dessa protokoll är konsekventa när det gäller antalet gametocyter som behövs för att ge tillförlitlig mygginfektionsförmåga och robusta oocysträkningar och sporozoitutbyten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författare tackar Bloomberg Philanthropies för ekonomiskt stöd till Johns Hopkins Malaria Research Institute (JHMRI). Detta arbete skulle inte ha varit möjligt utan den expertis som tillhandahålls av JHMRI:s anläggningar för insekter och parasitologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Sugar solution | |||
| 10ml serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
| 1ml serological pipet | Falcon | 357521 | |
| 25 ml serological pipet | Falcon | 357535 | |
| 37°C Incubator | |||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml serological pipet | Falcon | 357543 | |
| 6 well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
| 70% Ethanol | |||
| 9" glass pipet | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Anopheles Mosquitoes | JHMRI, Insectary core | We use A. stephensi or A. gambiae (keele) | |
| cell counter | |||
| Circulating water bath | |||
| fine tip forceps | Fisherbrand | 12-000-122 | |
| Geimsa stain | Sigma | GS1L | |
| Glass desiccator | |||
| Glass membrane feeder | Chemglass Life Sciences | CG183570 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Human Blood O+ | JHU | Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit | |
| Human Serum O+ | Interstate blood bank | Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C. | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9337 | Make 500x stock in 1M NaOH |
| Mercurochrome | Sigma | M7011 | Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed |
| Micro Pipette | |||
| Microscope | Olympus | Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work. | |
| Mosquito cups | Neptune cups | ||
| N-acetylglucosamine | Sigma | A3286 | Optional and needed only when pure gametocytes are required. |
| Netting | Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding | ||
| Parafilm | |||
| PBS | |||
| Petri dish | Thermo Scientific | 249964 | |
| Pipet tips | |||
| Pipetman | |||
| Plasmodium falciparum NF54 | BEI Resources | MRA-1000 | Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply |
| RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Media contains glutamine and HEPES |
| Slide warmer | |||
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation |
| water bath | |||
| Xanthurenic Acid | Sigma | D120804 | For flagellation media |
References
- World Health Organization.
- Sinden, R. E., Smalley, M. E. Gametocytogenesis of Plasmodium falciparum in vitro: The cell-cycle. Parasitology. 79 (2), 277-296 (1979).
- Sinden, R. E.
- Joice, R., et al. Plasmodium falciparum transmission stages accumulate in the human bone marrow. Science Translational Medicine. 6 (244), 5 (2014).
- Abdulsalam, A. H., Sabeeh, N., Bain, B. J. Immature Plasmodium falciparum gametocytes in bone marrow. American Journal of Hematology. 85 (12), 943 (2010).
- Ghosh, A. K., Jacobs-Lorena, M. Plasmodium sporozoite invasion of the mosquito salivary gland. Current Opinion in Microbiology. 12 (4), 394-400 (2009).
- Bennink, S., Kiesow, M. J., Pradel, G. The development of malaria parasites in the mosquito midgut. Cellular Microbiology. 18 (7), 905-918 (2016).
- Trager, W., Jenson, J. B.
- Duffy, S., Loganathan, S., Holleran, J. P., Avery, V. M. Large-scale production of Plasmodium falciparum gametocytes for malaria drug discovery. Nature Protocols. 11 (5), 976-992 (2016).
- Delves, M. J., et al. Routine in vitro culture of P. Falciparum gametocytes to evaluate novel transmission-blocking interventions. Nature Protocols. 11 (9), 1668-1680 (2016).
- Habtewold, T., et al. Streamlined SMFA and mosquito dark-feeding regime significantly improve malaria transmission-blocking assay robustness and sensitivity. Malaria Journal. 18 (1), 24 (2019).
- Demanga, C. G., et al. The development of sexual stage malaria gametocytes in a Wave Bioreactor. Parasites and Vectors. 10 (1), 216 (2017).
- Brockelman, C. R. Conditions favoring gametocytogenesis in the continuous culture of Plasmodium falciparum. Journal of Eukaryotic Microbiology. 29, 454-458 (1982).
- Meibalan, E., Marti, M. Biology of malaria transmission. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 7, (2017).
- Essuman, E., et al. A novel gametocyte biomarker for superior molecular detection of the plasmodium falciparum infectious reservoirs. Journal of Infectious Diseases. 216 (10), 1264-1272 (2017).
- Simões, M. L., Mlambo, G., Tripathi, A., Dong, Y., Dimopoulos, G. Immune regulation of plasmodium is anopheles species specific and infection intensity dependent. mBio. 8 (5), 01631 (2017).
- Oakley, M. S., et al. Transcriptome analysis based detection of Plasmodium falciparum development in Anopheles stephensi mosquitoes. Scientific Reports. 8, 11568 (2018).
- Saraiva, R. G., et al. Chromobacterium spp. mediate their anti-Plasmodium activity through secretion of the histone deacetylase inhibitor romidepsin. Scientific Reports. 8, 6176 (2018).
- Tao, D., et al. Sex-partitioning of the Plasmodium falciparum stage V gametocyte proteome provides insight into falciparum-specific cell biology. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (10), 2705-2724 (2014).
- Grabias, B., Zheng, H., Mlambo, G., Tripathi, A. K., Kumar, S. A sensitive enhanced chemiluminescent-ELISA for the detection of Plasmodium falciparum circumsporozoite antigen in midguts of Anopheles stephensi mosquitoes. Journal of Microbiological Methods. 108, 19-24 (2015).
- Ferrer, P., Vega-Rodriguez, J., Tripathi, A. K., Jacobs-Lorena, M., Sullivan, D. J. Antimalarial iron chelator FBS0701 blocks transmission by Plasmodium falciparum gametocyte activation inhibition. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (3), 1418-1426 (2015).
- Sanders, N. G., Sullivan, D. J., Mlambo, G., Dimopoulos, G., Tripathi, A. K. Gametocytocidal screen identifies novel chemical classes with Plasmodium falciparum transmission blocking activity. PLoS One. 9 (8), 105817 (2014).
- Lindner, S. E., et al. Transcriptomics and proteomics reveal two waves of translational repression during the maturation of malaria parasite sporozoites. Nature Communications. 10, 4964 (2019).
- McLean, K. J., et al. Generation of Transmission-Competent Human Malaria Parasites with Chromosomally-Integrated Fluorescent Reporters. Scientific Reports. 9, 13131 (2019).
- Espinosa, D. A., et al. Proteolytic Cleavage of the Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein Is a Target of Protective Antibodies. Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1111-1119 (2015).
- Swearingen, K. E., et al. Interrogating the Plasmodium Sporozoite Surface: Identification of Surface-Exposed Proteins and Demonstration of Glycosylation on CSP and TRAP by Mass Spectrometry-Based Proteomics. PLoS Pathogens. 12 (4), 1005606 (2016).
- Ifediba, T., Vanderberg, J. P. Complete in vitro maturation of Plasmodium falciparum gametocytes. Nature. 294 (5839), 364-366 (1981).
- Miura, K., et al. An inter-laboratory comparison of standard membrane-feeding assays for evaluation of malaria transmission-blocking vaccines. Malaria Journal. 15, 463 (2016).
- Miura, K., et al. Qualification of Standard Membrane-Feeding Assay with Plasmodium falciparum Malaria and Potential Improvements for Future Assays. PLoS One. 8 (3), 57909 (2013).
