Summary
Detaljerte undersøkelser om myggstadier av malariaparasitter er avgjørende for å designe effektive overføringsblokkeringsstrategier. Denne protokollen demonstrerer hvordan du effektivt kan dyrke smittsomme gametocytter og deretter mate disse gametocyttene til mygg for å generere myggstadier av P. falciparum.
Abstract
Malaria er fortsatt et av de viktigste folkehelseproblemene, noe som forårsaker betydelig sykelighet og dødelighet. Malaria er en myggbåren sykdom som overføres gjennom en smittsom bite fra den kvinnelige Anopheles mygg. Malariakontroll vil til slutt stole på en rekke tilnærminger, som inkluderer måter å blokkere overføring til, gjennom og fra mygg. For å studere myggstadier av malariaparasitter i laboratoriet, har vi optimalisert en protokoll for å dyrke svært smittsomme Plasmodium falciparum gametocytter, et parasittstadium som kreves for overføring fra den menneskelige verten til myggvektoren. P. falciparum gametocytes modnes gjennom fem morfologisk distinkte trinn, som tar ca 1-2 uker. Gametocyttkulturen beskrevet i denne protokollen er fullført på 15 dager og er smittsomme for mygg fra dag 15-18. Disse protokollene ble utviklet for å opprettholde en kontinuerlig syklus av infeksjon kompetente gametocytter og for å opprettholde uavbrutt tilførsel av mygg stadier av parasitten. Her beskriver vi metodikken til gametocyttkulturen og hvordan man infiserer mygg med disse parasittene ved hjelp av glassmembranmatere.
Introduction
Malaria er forårsaket av Plasmodium parasitter og overføres til vertebratvertene sine via smittsom bite av kvinnelige Anopheles mygg. Ifølge rapporten fra Verdens helseorganisasjon (WHO) for 2019 var det anslagsvis 405 000 dødsfall, fra totalt 228 millioner tilfeller av malaria1. De fleste malariarelaterte dødsfallene var konsentrert i den afrikanske regionen, spesielt blant barn under fem år. Mens den totale forekomsten av malaria har gått ned globalt fra 2010, har nedgangen de siste årene platået og det haster med ytterligere kontrollstrategier for å eliminere sykdommen.
Sykliske aseksuelle blodstadier av malariaparasitter forårsaker sykdomspatogenese og en liten undergruppe av disse skiller seg ut i kvinnelige og mannlige gametocytter. Plasmodium falciparum gametocytes er unike i naturen som de tar 7-10 dager å utvikle gjennom fem morfologisk distinkte stadier. Umodne gametocytter fra stadium I til IV er beslaglagt i benmargsparenchyma og forblir i stor grad fraværende fra perifersirkulasjon 2,3,4,5. Erytrocytter smittet med modne stadium V gametocytter frigjøres i blodet og sirkulerer fritt for å bli tatt opp av mygg. En gang inne i mygg midgut aktiveres gametocytter, gjennom en temperaturendring og eksponering for midgutmiljøet, forvandles til kvinnelige og mannlige gameter og begynner utviklingen av myggstadiene, som kulminerer med de smittsomnde stadiene av sporozoitter i myggspyttkjertlene6,7.
Siden Trager og Jenson8 beskrev en standardisert metode for kultur P. falciparum, studier på de aseksuelle blodstadiene har sterkt avansert. Mangelen på et pålitelig kultursystem for seksuelle stadier har imidlertid gjort det vanskelig å studere P. falciparum gametocytter, overføringsbiologi og myggstadier. De siste årene har det blitt publisert flere metoder som har hjulpet laboratorier med å etablere gametocyttkulturer9,10,11,12. Dette manuskriptet beskriver standardisert og pålitelig protokoll til kulturen P. falciparum gametocytes som kan representere en verdifull ressurs for malariaforskningssamfunnet. Denne metoden muliggjør robust produksjon av modne og smittsomme gametocytter som sammen med en standardisert myggfôringsprotokoll resulterer i svært pålitelig mygginfeksjonsevne. Disse metodene ble etablert for å opprettholde uavbrutt tilførsel av gametocytter og myggstadiumparasitter. I dette manuskriptet beskriver vi en grundig gametocyttkulturprotokoll (Figur 1), fremstilling av glassmembranmatere og infeksjon av mygg ved hjelp av disse membranmatere (figur 2), disseksjon av midgut (figur 3) og spyttkjertel av mygg (figur 4), og kvantifisering av infeksjon i mygg etter midgut og spyttkjertel disseksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Blodsamlinger beskrevet nedenfor er godkjent av Institutional Review Board ved Johns Hopkins University. P. falciparum dyrkes i ferske RBCer under sterile forhold i et biosikkerhetsanlegg på nivå 2 (BSL2), og forsiktighet brukes til å håndtere biologiske materialer. Etter hvert trinn som involverer blod eller blodprodukter, skylles hvert plasttøy eller glass med 10% blekemiddel i hetten før riktig avhending.
1. Reagenser og forberedelser
- Parasitten isolerer P. falciparum NF54 (se Materialfortegnelse) ble brukt, som kan produsere smittsomme gametocytter i opptil to måneder mens de er i kontinuerlig kultur.
MERK: Ikke alle kulturtilpassede parasittlinjer produserer gametocytter, og lavpassasje NF54-isolasjoner er mest konsistente. - O+ Erytrocytter: Fortynn hele blodet ved å legge til like mye RPMI 1640-medier og sentrifugering ved 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur i en utsvingrotor med deacceleration satt til 0. Fjern forsiktig den supernatante og buffy kappen (et hvitt bånd mellom plasma og pakkede erytrocytter, som inneholder de fleste hvite blodlegemer og blodplater) og tilsett like mye RPMI. Gjenta vasketrinnet to ganger, og etter den endelige vasken legger du til ett pelletsvolum av RPMI for å få 50% hematokrit til oppbevaring ved 4 °C.
MERK: Gametocytter modnes over en periode på to uker, noe som gjør det viktig å begynne kulturer med friske erytrocytter, vanligvis erytrocytter trukket innen en uke fungerer bra. - O+ Human Serum: Basseng minst 6 enheter serum sammen for å minimere effekten av normal variasjon i serum fra forskjellige individer. Steriliser samlet humant serum ved hjelp av 0,2 μm filtreringsflasker. Aliquot i porsjoner på 50 ml eller mindre basert på behov og oppbevaring ved -20 °C.
MERK: Erytrocytter og serum må være fra en kompatibel blodtype for P. falciparumkulturer. - 500x Hypoxanthine (100 ml) oppløsning: Løs opp 0,5 g hypoksantin i 100 ml 1 M NaOH. Filtrer steriliser og lag 5-10 ml aliquots for lagring. Lagre kan lagres opptil et år ved -20 °C og opptil 2 uker ved 4 °C.
- Natriumbikarbonat (valgfritt): Løs opp 7,5 g natriumbikarbonat i 100 ml deionisert, vevskultur klasse vann og filtrer steriliser med 0,2 μm filter.
MERK: Denne protokollen bruker stearinlyskrukkemetoden for å gi mikroaerofile forhold for P. falciparum in vitro-kultur og krever ikke natriumbikarbonat. Men hvis parasitter dyrkes ved hjelp av en malariagassblanding (5% O2, 5% CO2 og 90% N2), er det viktig å supplere kulturmedier med 0,2% natriumbikarbonat. - Komplette medier: For å forberede 500 ml komplette medier, tilsett 1 ml hypoksantinløsning og 50 ml samlet humant serum til 500 ml RPMI 1640. Tilsett 15 ml 7,5% natriumbikarbonat ved bruk av malariagassblanding. Oppbevar komplette medier ved 4 °C og kast dem hvis fargen på komplette medier endres fra oransje til rosa. For å unngå avfall, lag nok komplette medier som skal brukes innen tre dager.
- Exflagellation media (Valgfritt): Lag eksfoliering eller ookinete media ved å oppløse 200 mg NaHCO3, 5 mg Hypoxanthine og 100 μL xanthurenic acid (fra 100 mM lager i vann) til 100 ml ufullstendige medier (RPMI 1640 med glutamin og HEPES).
MERK: Exflagellation er prosessen med mannlig gamete formasjon inne i midgut av kvinnelige Anopheles mygg få minutter etter at det tar blodmel infisert med gametocytter. Mannlige gametocytter av Plasmodium gir opphav til 8 mannlige gameter etter en exflagellation hendelse. In vitro, denne prosessen skjer spontant når kulturtemperaturen senkes til romtemperatur (RT) og kan observeres i dyrkede modne gametocytter. - N-Acetylglucosamin (Valgfritt): Lag 500 mM lagerløsning av N-acetylglukosamin i vann eller ufullstendige medier, aliquot og oppbevar ved -20 °C.
- NaCl-løsninger: Løs opp 0,9 g, 1,6 g og 12 g NaCl i 100 ml av vevskulturkvalitet deionisert vann for å lage 0,9%, 1,6% og 12% NaCl-løsninger. Filtrer steriliser med 0,22 μm filter og oppbevar ved 4 °C.
2. P. falciparum aseksuell scenekultur
- For å begynne parasittkulturen, fjern et frossent hetteglass med P. falciparum NF54 med lav passasje, fra den flytende nitrogentanken og tin raskt i vannbad satt til 37 °C.
- Overfør innholdet (~1 ml) til et 50 ml sterilt sentrifugerør og tilsett 0,2 volum forhåndsvarslet 12% NaCl, mens du forsiktig rister på røret for å sikre jevn blanding. Inkuber i 5 min på RT med periodisk skånsom risting.
- Tilsett 9 volumer på 1,6% NaCl dropwise, mens du fortsetter forsiktig blanding. Sentrifuger innholdet på 500 x g i 5 minutter ved RT, kast forsiktig supernatanten. Tilsett 9 volumer på 0,9% NaCl dropwise, samtidig som du sørger for å konsekvent blande parasittpelleten. Sentrifuge igjen på 500 x g i 5 min på RT. Fjern de supernatante og resuspend parasittene i 5 ml komplette medier.
- Overfør innholdet til en brønn av en 6 brønnvevskulturplate og tilsett 100-200 μL pakkede RBCer.
- Inkuber parasittkultur ved 37 °C i en stearinlysburk eller i et modulært inkubatorkammer renset med en spesiell gassblanding på 5% O2,5% CO2 og 90% N2.
- Bytt ut medier hver dag og overvåk veksten ved å lage et tynt blodsmøring ved å trekke noen mikrolitere fra avgjort RBC-lag etter at kulturens supernatant har blitt aspirert under vanlig medieendring.
- Bruk sterilt glass Pasteur pipette til å tegne og deretter trykke i midten av glass lysbilde for å overføre en dråpe kultur til lysbildet. Plasser en annen glasssklie foran dråpen og trekk den tilbake for å komme i kontakt med RBC-ene, og skyv den raskt fremover i én bevegelse for å lage tynt smør av RBC-monolag.
- Plasser gliden horisontalt på et tørkestativ og la det lufttørke. Fest blodsmøret ved å slippe absolutt metanol på smøret. La det faste smøret tørke helt og hell deretter forsiktig 10% Geimsa-flekk fersk fortynnet i vann, til blodsmøret er helt dekket. La cellene flekke i ca. 15 min.
- Vask av overflødig flekk ved å skylle skredet under rent vann fra springen og la lysbildene tørke i vertikal stilling.
- Bestem parasittmia ved å se tynt blodsøl på et mikroskop ved hjelp av olje nedsenking 100x mål. Tell antall infiserte erytrocytter blant totalt minst 500 RBCer for å bestemme prosent parasittmi.
3. P. falciparum gametocyte kultur
MERK: Gametocyte kulturer tar to uker å produsere modne gametocytter smittsomme for mygg. Trinnene i gametocyte-kulturen er beskrevet i Figur 1. P. falciparum isolerer vanligvis mister evnen til å produsere gametocyte etter langsiktig in vitro kultur13. For å sikre kvaliteten på gametocytter, bør kulturen initieres fra lavpassasjematerkultur, ikke mer enn 2 måneder gammel siden opptining. Forvarm medium til 37 °C og utfør alle prosedyrene på et skyvevarmersett ved 38 °C. Sørg for at gametocyttkulturer ikke er ute av inkubatoren i lengre tid for å minimere temperatursvingninger.
- Frø gametocyttkulturen (dag 0) ved hjelp av blandet aseksuell scenematerkultur ved 0,3-1% parasittmi ved 4% hematokrit.
- For å sette opp en seks brønn gametocyte kultur, sentrifuge 5 ml mater kultur på 500 x g i 5 min på RT. Kast den supernatante og resuspend pellet i 30 ml komplette medier.
- Tilsett 1,2 ml pakkede RBCer, bland og dispenser 5 ml til hver brønn på de 6 brønnplatene og inkuber i en stearinlysburk ved 37 °C.
MERK: Gametocyte kultur satt opp beskrevet ovenfor er basert på en blandet aseksuell scenematerkultur ved 5% parasitemia. - Bytt media daglig i 15-18 dager, uten tilsetning av friskt blod, ved å forsiktig aspirere ca 70-80% kultur supernatant for å unngå å fjerne blodceller.
- Tilsett 5 ml ferske komplette medier til hver brønn. Mens du bytter medium, legg sakte til medier ved hjelp av en serologisk pipette mot brønnens vegg for å unngå å forstyrre det avgjorte RBC-laget.
MERK: Fordi 1-2 ml av kulturmediet vil bli stående under medieskiftet, vil det totale kulturvolumet være mellom 6-7 ml, etter dag 1 av gametocyttkulturen. Mens du tilpasser denne protokollen, er det tilrådelig å lage blodsmøring hver annen dag for å sikre at parasitter er sunne. Å lage et blodsmør kan ofte tømme antall celler i kulturen. For å unngå dette, tegn et veldig lite volum. - For å kvantifisere moden gametocytemi, gjør blodsmøring mellom dager 15-18 og telle antall modne gametocytter blant totalt antall celler.
MERK: Eldre gametocytter kan enkelt identifiseres med sin klassiske halvmåneform med glatte avrundede ender (Figur 5B). - Tell minst 1000 RBCer og beregn prosentandelen RBCer som er infisert med modne gametocytter.
- For å kvantifisere eksflagellasjonshendelser, ta 200 μL gametocyttkultur og sentrifuge på 500 x g i 5 min på RT i et forvarmet rør. Resuspend pellet i 20 μL eksflagellasjonsmedier og overfør til et glasssklie med dekselglidning.
- Etter 15 min inkubasjon ved romtemperatur, begynn å telle eksflagellasjonssentre i fasekontrastmodus ved hjelp av 10x mål. Tell eksflagellasjonssentre i minst fire felt for å beregne eksfolieringshendelser.
MERK: En detaljert metodikk for exflagellation analyse har blitt beskrevet tidligere av Delves et al10. Mer enn 20 eksfolieringshendelser per felt anses egnet for membranfôringsanalyse. - Gametocyttkulturer har vanligvis lave nivåer av gjenværende aseksuelle stadier. Hvis eksperimentet krever rene gametocytter, behandle kulturen med 50 mM N-acetylglucosamin.
- Tilsett 0,5 ml N-acetylglukosamin fra 10x lagerløsning per brønn (5 ml) i minst 3 dager mens du bytter medier for å fjerne gjenværende aseksuelle stadier.
MERK: N-acetylglucosamin kan blokkere invasjon av seksuelt begåtte merozoitter også, behandling bør også initieres etter dag 7 av gametocyttkulturen.
4. Mygginfeksjon ved bruk av standard membranfôringsanalyse (SMFA)
MERK: Gametocytter dyrket in vitro kan mates til mygg ved hjelp av glassmembranmatere. Oppsett av blodfôringsapparatet er vist i figur 2. Som beskrevet ovenfor, må du alltid opprettholde gametocytter ved 37 °C for å unngå aktivering før de inntas av mygg. Prewarm plasttøy, reagenser og utstyr brukes med gametocyttkultur til 37 °C.
- Sult 3-7-dagers gamle kvinnelige Anopheles mygg ved å fjerne sukkervannet i 6,5 timer eller over natten før membranfôring.
- Overfør dem ved hjelp av motoriserte eller munndrevne aspiratorer til papirkopper dekket med dobbelt lag med fint nettingstoff. Alternativt kan du slå ned mygg i et kaldt rom eller kjøleskap for å overføre dem til papirkoppene.
MERK: Kopp i en halvliterstørrelse kan brukes til å mate opptil 100 mygg. - Sentrifuge vasket blod ved 500 x g i 5 min ved RT og kast supernatant. Tilsett et likt volum ny tint menneskelig serum for å rekonstituere hele blodet. Overfør blod- og serumblandingen til vannbadet som er satt til 37 °C i 30 minutter.
- Overfør gametocyttkulturen til forvarmet 15 ml plastrør og sentrifuger ved 600 x g i 5 minutter ved 37 °C. Aspirer kulturen forsiktig supernatant og gjør tynt blodsmør for å bestemme moden gametocytemi som beskrevet ovenfor.
- For å få det endelige blodfôret, fortynn gametocyttpellet til ønsket konsentrasjon ved hjelp av rekonstituert fullblod. Hold blodfôret ved 37 °C til mygg og glassmatere er klare.
MERK: Modne gametocyttkonsentrasjoner mellom 0,02 og 0,3% vil gi konsistent mygginfeksjonsevne. Det er imidlertid tilrådelig å optimalisere gametocytemi ved å mate ulike konsentrasjoner til forskjellige kopper mygg. - Sørg for at glassmembranmaterne har to åpninger, en smal toppåpning for å pipette det infiserte blodet og en bunnåpning for membranfeste. Klipp en parafinfilm i firkanter, strekk til en jevn tykkelse og hold fast på åpningen av materen for å skape forseglet rom for blodmatet.
- Fest membranmatere til et sirkulasjonsvannbad ved å koble rør på hver side for å tillate passasje av varmt vann gjennom jakken rundt membranmatere.
MERK: Flere glassmatere kan kobles sammen i serie for å imøtekomme flere fôringsforhold. - Etter at alle matere er koblet til vannbadet, slå den på og inspiser for eventuelle lekkasjer.
- Plasser matere i midten av netting på myggkopper med membranside ned og sikre matere ved hjelp av klemmer eller tape. Pass på at membranmatere ikke vippes til noen side for å tillate jevn fordeling av blodmateren og nær kontakt med hele materen med netting på kopper, slik at mygg får tilgang fra innsiden av koppen.
- Pipette ca 200-1000 μL blodfôr i membranmatere.
MERK: Volumet av blodmatet vil variere basert på antall mygg og størrelsen på membranmateren. For 14 mm glassmater og 50 mygg bruk 200 μL blodfôr. - Pass på at lastingen ble gjort riktig og blodfôret ble lagt over på parafinfilmen.
- La mygg mate i ca 30 min med periodisk overvåking.
MERK: Blås mygg forsiktig med munnen for å gi CO2 som vil indusere forbedret blodfôring. - Fjern ufed mygg ved å slå dem ned i et kaldt rom. Kontroller mygg for bulge og rødhet i magen som et tegn på friskt blodmåltid. Alternativt kan du bruke en munndrevet aspirator for å selektivt fjerne ufed mygg.
- Kast unfed mygg, etter å ha gjennomvåt dem i 70% etanol og legg matet mygg tilbake i myggkoppen.
- Dobbelt bur mygg kopper og overføre dem til høy inneslutning inkubator spesifisert for mygg smittet med menneskelig malaria parasitt P. falciparum.
- Legg bomullsputer gjennomvåt i 10% sukrose på myggkoppene for å gi dem sukkermel. Bytt ut bomullsputer annenhver dag, til mygg er dissekert.
5. Mygg midt-tarm disseksjon og oocyst belastning kvantifisering
MERK: En skjematisk midgut disseksjon er vist i figur 3.
- 7-8 dager etter blodfôring, overfør myggkopper til 4 °C i 10 minutter for å slå ned mygg.
- Overfør mygg som skal dissekeres til en Petri-tallerken på is ved hjelp av finspissede tang.
- Soak mygg i 70% etanol i 1-2 min for å avlive dem. Tilsett PBS til Petri-parabolen for å vaske av etanol etter at alle myggene er euthanized.
MERK: Før du legger til PBS, må du sørge for at alle myggene er døde. - Monter et glasssklie på dissekering av mikroskop og pipette 100 μL PBS i midten. Overfør forsiktig en mygg ved hjelp av tang inn i PBS og la resten av myggene i Petri-parabolen på is.
- Bruk finspisset tang, hold det tredje segmentet av magen fra den bakre enden av mygga og med andre tang holder krysset mellom thorax og mage. Trekk forsiktig magen til midgut er fullt utsatt.
- Kast resten av myggvevet og overfør midgut til et rent lysbilde som inneholder noen dråper PBS.
- Når ønsket antall mygg har blitt dissekert, fjern FORSIKTIG PBS ved hjelp av en pipette og flekk midgut med 0,2% mercurochrome i 2-5 min.
- Fjern overflødig mercurochrome og line-up midguts på lysbildet slik at de lett kan visualiseres under lysmikroskopet.
- Plasser en cover slip og telle oocysts på hver midgut under 10x mål. Oocystene flekker rosa og er sirkulære i form (Figur 6C).
6. Mygg spyttkjertel disseksjon og sporozoitt belastning kvantifisering
MERK: Et skjematisk spyttkjertel disseksjon er vist i figur 4.
- 14-18 dager etter blodfôring, plasser myggkopper ved 4 °C i 10 minutter.
MERK: Det er viktig å vente til myggene slutter å bevege seg. - Mens du venter på at mygg skal slutte å bevege seg, forberede verktøy for disseksjon.
- Plasser en glassplate på et disseksjonsmikroskopstadium. Forbered 2 sett med 25 G nåler på 1 ml sprøyter og en 9" Pasteur pipette og gummipære. Plasser 70% EtOH og disseksjonsmedium (HBSS, L-15 eller PBS) i en 6 brønnplate.
- I det kalde rommet, overfør bedøvede mygg i en 6 brønnplate som inneholder 70% EtOH. Flytt forsiktig mygg med tang for å sikre at alle mygg er gjennomvåt, og overfør deretter mygg til disseksjonsmediet ved å bruke tang til å vaske av 70% EtOH.
- Flytt til disseksjonsrommet og legg mygg på et disseksjonsmikroskopstadium.
- Fjern overflødig medium fra mygg, legg til nytt medium etter behov under disseksjon. Unngå mygg fra å tørke ut, men for mye væske gjør disseksjon vanskeligere.
- Bruk 2 sprøyter med 25 G nåler, hold mygg thorax og hode, og trekk forsiktig hodet oppover for å trekke spyttkjertler fra thorax.
- Koble spyttkjertler fra hodet og thorax med en nål.
- Midlertidig sted spyttkjertler i en separat dråpe medium på glassplaten.
- Etter dissekering av 15-20 spyttkjertler, samle dem i et lavt oppbevaringsrør ved hjelp av Pasteur pipette.
MERK: Når spyttkjertlene kommer inn i den brede delen av Pasteur-pipetten, vil de holde seg til glasset, og det er vanskelig å få dem ut. - Pellet spyttkjertler ved kort puls spinn i en bord-topp sentrifuge. Fjern disseksjonsmediet uten å forstyrre pelletsen og tilsett 100 μL nytt disseksjonsmedium.
- Grind spyttkjertler med en liten homogenisator i 1 min for å oppnå sporozoitter.
- Plasser 10 μL disseksjonsmedium som inneholder sporozoitter på et hemocytometer.
MERK: Avhengig av antall spyttkjertler, kan det hende man må fortynne sporozoittoppløsningen til 1:10 til 1:50 med medium før telling. - Tell antall sporozoitter i to av de fire kvadrantene og beregn antall sporozoitter/mygg:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her presenterer vi resultater fra en rekke membranfôr ved hjelp av P. falciparum NF54 gametocyttkulturer generert ved hjelp av protokollen ovenfor (se figur5). Gametocyttkulturen ble initiert med omtrent 0,5% blandet stadium aseksuell kultur på dag 0, som vokste til en topp parasittmia på omtrent 15% ved dag 4 og dag 5. Som vist i figur 5A på denne høye parasittmien, er parasittene stresset og den aseksuelle scenekulturen krasjer. Imidlertid resulterer dette stresset samtidig i induksjonen av gametocytogenesis. Tidlige gametocytter dukket opp etter dag 6 og dag 7 og aseksuell parasittmi falt sakte, men forble på et lavt nivå. Tilstedeværelse av aseksuelle sceneparasitter påvirket ikke myggfôringseksperimenter. Men hvis gametocytter skal brukes i eksperimenter som krever rene kulturer, for eksempel legemiddelfølsomhetsanalyser og proteomiske eller transkripsjonsstudier, kan gjenværende aseksuelle stadier fjernes ved behandling med 50 mM N-acetylglucosamin. De fleste gametocytter modnes til trinn V ved dag 15, da de blir smittsomme for mygg og var klare til å bli matet. Representative bilder av Giemsa-farget blod smører på forskjellige tidspunkter etter initiering av gametocyttkultur vises i figur 5B.
Mellom 8 og 10 dager etter blodfôring ble mygg dissekert for å bestemme utbredelsen og intensiteten av infeksjon. Prevalens er prosentandelen av matede mygg som har oocytter, mens intensitet er antall oocytter som finnes i hver mygg. Begge er viktige indikatorer på fôrets suksess. Data fra 5 uavhengige myggfôr er vist i figur 6. Feeds ble valgt for å vise den normale variasjonen i nivåene av infektivitet etter fôring med 0,3% modne gametocytter fra dag 16 kultur av P. falciparum NF54. Oocyst-intensiteter gir kvantitative data for å bestemme mygginfeksjon av gametocytter og utbredelse viser prosentandelen av matede mygg som ble smittet. Disse dataene kan brukes til å evaluere overføringsblokkeringsmidler og identifisere og karakterisere mål for overføringsblokkering av vaksiner og legemidler. Antall oocyster varierte både innenfor og mellom eksperimenter og krevde 25-50 mygg per kohort for å bestemme effekten av ulike eksperimentelle forhold.
Oocyst-intensiteter betraktes som sluttpunkt for de fleste overføringsblokkerende analyser og strategier, men antall sporozoitter er vanligvis viktig for sporozoittbiologi og for leverfasestudier. Tabell 1 viser gjennomsnittlig antall sporozoitter oppnådd per mygg fra 12 uavhengige blodfôr. Som vist i tabellen var gjennomsnittlig antall sporozoitter konsistente, men det var ett eksperiment der vi fikk null sporozoitter, som representerer sporadisk svikt i analysen.
Figur 1: Arbeidsflyten til P. falciparum gametocyttkultur og membranfôringsprotokoll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oppsett av myggblodfôring. (A) Glassmater og rektangulært stykke parafinfilm (B) To glassmatere vist før og etter parafilmmembranfeste (C) Glassmater på toppen av myggkoppen og forbundet med sirkulasjonsvannbad. (D,E) Pipettering av blod mates inn i glassmateren (F) Bunnvisning av glassmater som viser homogen fordeling av blodfoder (G) Flere mygg som mates gjennom parafilmmembran. (H) Topp utsikt over myggkopper etter fôring, som viser dråper blod utskilt av fôringsmyggene på bunnen av koppen. Skalastang = 10 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Grafisk fremstilling som viser trinnene i myggmidt disseksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Grafisk fremstilling som viser trinn i spyttdefekt disseksjon av mygg. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: P. falciparum gametocyte kultur og oocyst visualisering på infisert mygg midgut. (A) Tidsforløp for 15 dagers gametocyttkultur, som viser bratt multiplikasjon av aseksuelle stadier for å toppe parasittmi innen de første 4 dagene, etterfulgt av gametocytogenesis og modning over tid. (B) Geimsa-farget tynn blodsmøring som viser ulike stadier av gametocyttkultur, dag 1 tidlig asexuell stadium, dag 4 topp aseksuell parasittmi, dag 6 stresset kultur på grunn av høy parasittbelastning, dag 9 og 12 tidlige gametocytter og dag 15 som viser modne mannlige og kvinnelige gametocytter. Morfologisk tidlige stadium gametocytter var uutslettelig fra aseksuelle stadier, men sen stadium II viste halvmåneformen med spisse ender og langstrakt som parasitt utviklet seg til trinn III og IV. Moden scene V gametocytes var imidlertid preget av klassisk halvmåneform med avrundede ender og minimal vertscellesynlighet14. Skalastang = 10 mm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: P. falciparum oocysts teller per mygg midgut. (A) Graf viser oocyst teller gjennom årene, for hvert eksperiment, mygg ble matet med 0,3% gametocytter og midguts ble dissekert på dag 8 post blod feed. Hver prikk representerer antall oocytter fra individuelle midguts, og den vannrette linjen representerer medianverdien. (B) Tabellen viser gjennomsnittlig oocysttall, utbredelse av infiserte mygg og infeksjonsområde. (C) Bilder som viser oocytter på mygg midgut fra to separate blodfôringseksperimenter ved forskjellige forstørrelser. Skalastang = 150 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Eksperiment | Disseksjonsdagen (postblodfôr) | Gjennomsnittlig sporozoitt/mygg |
| 1 | 14 | 42, 000 |
| 2 | 14 | 40, 000 |
| 3 | 14 | 42, 750 |
| 4 | 15 | 25, 411 |
| 5 | 15 | 33, 750 |
| 6 | 14 | 15, 750 |
| 7 | 16 | 0 |
| 8 | 15 | 33, 200 |
| 9 | 14 | 56, 333 |
| 10 | 14 | 45, 333 |
| 11 | 17 | 43, 750 |
| 12 | 16 | 56, 000 |
Tabell 1: Gjennomsnittlig antall spyttkjertler sporozoitter per mygg i 12 uavhengige sykluser over en 2-års periode. A. stephensi mygg ble matet med 0,3% P. falciparum gametocytter og 15-20 mygg ble dissekert mellom dager 14-17 etter blodfôring. Gjennomsnittlig sporozoitt teller per mygg er vist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoder beskrevet her har blitt vellykket brukt ved Johns Hopkins Malaria Research Institute i mer enn 10 år15,16,17,18,19,20,21,22. Gametocytter produsert ved hjelp av denne protokollen har blitt brukt til høy gjennomstrømning gametocytocidal analyser22, for proteomisk15, samt for transcriptomiske23 studier. En viktig grunn til å utvikle disse metodene er imidlertid å bruke de modne gametocyttene til å infisere mygg for studier på myggstadier og sporozoitter23,24,25,26. Dette manuskriptet beskriver en detaljert protokoll for å generere modne P. falciparum gametocytter og infeksjon av mygg ved hjelp av glassmembranmatere. Disse metodene er avgjørende for ethvert laboratorium som arbeider med overføringsblokkeringsstrategier, sporozoittstadier og pre-erytrocytiske leverstadier av P. falciparum.
Ifediba og Vanderberg i 1981 beskrev langsiktig kultur av P. falciparum, i nærvær av 50 μg / ml hypoksantin som produserte svært smittsomme modne gametocytter27. Siden da har det vært mange publikasjoner som beskriver metoder for å produsere gametocytter for forskjellige applikasjoner9,10,11,12. De fleste av disse publikasjonene benytter tidligere beskrevne gametocytogenesis-induserende forhold for å øke utbyttet. Ved hjelp av betingede medier, stresse kulturen ved plutselig parasittmia økning, slippe i hematokrit for å etterligne anemi, rød blodcelle lysis og loggfase undertrykkelse ved bulk opp, kan brukes til å indusere gametocytogenesis. Metoden som er beskrevet her er enkel og tidstestet. Start gametocyttkultur med 0,3-1% aseksuell sceneparasittmi ved 4% hematokrit og bytt media hver dag til dag 15-18. For å oppnå konsistente resultater er det viktig å begynne gametocyttkultur med lavpassasje aseksuelle sceneparasitter, bruke friske RBCer (<1 uke) og sørge for at kulturtemperaturen ikke svinger under medieendring. Siden falciparum gametocyte utviklingsprosess oppstår beslaglagt i statiske forhold av ekstravaskulære rom i benmarg4,5, er det viktig å ikke forstyrre avgjorte RBC-lag gjennom kulturperioden.
Culturing P. falciparum gametocytes med konsistens er krevende, men å få dem til å infisere mygg presenterer et annet nivå av kompleksitet. Membranfôring er underlagt flere andre variabler enn gametocytter, for eksempel myggens alder og kondisjon, midgutmikrobiota og fôringsadferd28,29. Vanligvis viser SMFA-data en høy grad av variasjon og krever et stort antall mygg for å identifisere effekter av forskjellige eksperimentelle forhold11,28. Bruk av lav passasjekultur for gametocytter, sunne 3 - 6-dagers gamle mygg og optimalisert membranfôringsprotokoll kan hjelpe med variasjoner i oocysttall.
Protokollen som er beskrevet her for både gametocyttdyrking og membranfôring, har blitt optimalisert over mange år. Disse metodene gir en detaljert beskrivelse for å oppnå modne overføring kompetente gametocytter, standard membranfôringsanalyse, mygg midgut disseksjon og oocyst kvantifisering samt spyttkjertel disseksjon og sporozoitt kvantifisering. Disse protokollene er konsistente når det gjelder antall gametocytter som trengs for å gi pålitelig mygginfeksjonsevne og robuste oocysttall og sporozoittutbytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfattere takker Bloomberg Philanthropies for økonomisk støtte til Johns Hopkins Malaria Research Institute (JHMRI). Dette arbeidet ville ikke vært mulig uten ekspertisen fra JHMRI insekt- og parasitologikjerneanlegg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Sugar solution | |||
| 10ml serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
| 1ml serological pipet | Falcon | 357521 | |
| 25 ml serological pipet | Falcon | 357535 | |
| 37°C Incubator | |||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml serological pipet | Falcon | 357543 | |
| 6 well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
| 70% Ethanol | |||
| 9" glass pipet | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Anopheles Mosquitoes | JHMRI, Insectary core | We use A. stephensi or A. gambiae (keele) | |
| cell counter | |||
| Circulating water bath | |||
| fine tip forceps | Fisherbrand | 12-000-122 | |
| Geimsa stain | Sigma | GS1L | |
| Glass desiccator | |||
| Glass membrane feeder | Chemglass Life Sciences | CG183570 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Human Blood O+ | JHU | Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit | |
| Human Serum O+ | Interstate blood bank | Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C. | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9337 | Make 500x stock in 1M NaOH |
| Mercurochrome | Sigma | M7011 | Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed |
| Micro Pipette | |||
| Microscope | Olympus | Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work. | |
| Mosquito cups | Neptune cups | ||
| N-acetylglucosamine | Sigma | A3286 | Optional and needed only when pure gametocytes are required. |
| Netting | Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding | ||
| Parafilm | |||
| PBS | |||
| Petri dish | Thermo Scientific | 249964 | |
| Pipet tips | |||
| Pipetman | |||
| Plasmodium falciparum NF54 | BEI Resources | MRA-1000 | Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply |
| RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Media contains glutamine and HEPES |
| Slide warmer | |||
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation |
| water bath | |||
| Xanthurenic Acid | Sigma | D120804 | For flagellation media |
References
- World Health Organization.
- Sinden, R. E., Smalley, M. E. Gametocytogenesis of Plasmodium falciparum in vitro: The cell-cycle. Parasitology. 79 (2), 277-296 (1979).
- Sinden, R. E.
- Joice, R., et al. Plasmodium falciparum transmission stages accumulate in the human bone marrow. Science Translational Medicine. 6 (244), 5 (2014).
- Abdulsalam, A. H., Sabeeh, N., Bain, B. J. Immature Plasmodium falciparum gametocytes in bone marrow. American Journal of Hematology. 85 (12), 943 (2010).
- Ghosh, A. K., Jacobs-Lorena, M. Plasmodium sporozoite invasion of the mosquito salivary gland. Current Opinion in Microbiology. 12 (4), 394-400 (2009).
- Bennink, S., Kiesow, M. J., Pradel, G. The development of malaria parasites in the mosquito midgut. Cellular Microbiology. 18 (7), 905-918 (2016).
- Trager, W., Jenson, J. B.
- Duffy, S., Loganathan, S., Holleran, J. P., Avery, V. M. Large-scale production of Plasmodium falciparum gametocytes for malaria drug discovery. Nature Protocols. 11 (5), 976-992 (2016).
- Delves, M. J., et al. Routine in vitro culture of P. Falciparum gametocytes to evaluate novel transmission-blocking interventions. Nature Protocols. 11 (9), 1668-1680 (2016).
- Habtewold, T., et al. Streamlined SMFA and mosquito dark-feeding regime significantly improve malaria transmission-blocking assay robustness and sensitivity. Malaria Journal. 18 (1), 24 (2019).
- Demanga, C. G., et al. The development of sexual stage malaria gametocytes in a Wave Bioreactor. Parasites and Vectors. 10 (1), 216 (2017).
- Brockelman, C. R. Conditions favoring gametocytogenesis in the continuous culture of Plasmodium falciparum. Journal of Eukaryotic Microbiology. 29, 454-458 (1982).
- Meibalan, E., Marti, M. Biology of malaria transmission. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 7, (2017).
- Essuman, E., et al. A novel gametocyte biomarker for superior molecular detection of the plasmodium falciparum infectious reservoirs. Journal of Infectious Diseases. 216 (10), 1264-1272 (2017).
- Simões, M. L., Mlambo, G., Tripathi, A., Dong, Y., Dimopoulos, G. Immune regulation of plasmodium is anopheles species specific and infection intensity dependent. mBio. 8 (5), 01631 (2017).
- Oakley, M. S., et al. Transcriptome analysis based detection of Plasmodium falciparum development in Anopheles stephensi mosquitoes. Scientific Reports. 8, 11568 (2018).
- Saraiva, R. G., et al. Chromobacterium spp. mediate their anti-Plasmodium activity through secretion of the histone deacetylase inhibitor romidepsin. Scientific Reports. 8, 6176 (2018).
- Tao, D., et al. Sex-partitioning of the Plasmodium falciparum stage V gametocyte proteome provides insight into falciparum-specific cell biology. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (10), 2705-2724 (2014).
- Grabias, B., Zheng, H., Mlambo, G., Tripathi, A. K., Kumar, S. A sensitive enhanced chemiluminescent-ELISA for the detection of Plasmodium falciparum circumsporozoite antigen in midguts of Anopheles stephensi mosquitoes. Journal of Microbiological Methods. 108, 19-24 (2015).
- Ferrer, P., Vega-Rodriguez, J., Tripathi, A. K., Jacobs-Lorena, M., Sullivan, D. J. Antimalarial iron chelator FBS0701 blocks transmission by Plasmodium falciparum gametocyte activation inhibition. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (3), 1418-1426 (2015).
- Sanders, N. G., Sullivan, D. J., Mlambo, G., Dimopoulos, G., Tripathi, A. K. Gametocytocidal screen identifies novel chemical classes with Plasmodium falciparum transmission blocking activity. PLoS One. 9 (8), 105817 (2014).
- Lindner, S. E., et al. Transcriptomics and proteomics reveal two waves of translational repression during the maturation of malaria parasite sporozoites. Nature Communications. 10, 4964 (2019).
- McLean, K. J., et al. Generation of Transmission-Competent Human Malaria Parasites with Chromosomally-Integrated Fluorescent Reporters. Scientific Reports. 9, 13131 (2019).
- Espinosa, D. A., et al. Proteolytic Cleavage of the Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein Is a Target of Protective Antibodies. Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1111-1119 (2015).
- Swearingen, K. E., et al. Interrogating the Plasmodium Sporozoite Surface: Identification of Surface-Exposed Proteins and Demonstration of Glycosylation on CSP and TRAP by Mass Spectrometry-Based Proteomics. PLoS Pathogens. 12 (4), 1005606 (2016).
- Ifediba, T., Vanderberg, J. P. Complete in vitro maturation of Plasmodium falciparum gametocytes. Nature. 294 (5839), 364-366 (1981).
- Miura, K., et al. An inter-laboratory comparison of standard membrane-feeding assays for evaluation of malaria transmission-blocking vaccines. Malaria Journal. 15, 463 (2016).
- Miura, K., et al. Qualification of Standard Membrane-Feeding Assay with Plasmodium falciparum Malaria and Potential Improvements for Future Assays. PLoS One. 8 (3), 57909 (2013).
