Summary
Nous décrivons la procédure de différenciation in vitro des cellules souches embryonnaires de souris en cellules neuronales en utilisant la méthode de la goutte suspendue. De plus, nous effectuons une analyse phénotypique complète par RT-qPCR, immunofluorescence, séquençage de l’ARN et cytométrie en flux.
Abstract
Nous décrivons la procédure étape par étape pour cultiver et différencier les cellules souches embryonnaires de souris en lignées neuronales, suivie d’une série de tests pour caractériser les cellules différenciées. Les cellules souches embryonnaires de souris E14 ont été utilisées pour former des corps embryoïdes par la méthode de la goutte suspendue, puis induites à se différencier en cellules progénitrices neurales par l’acide rétinoïque, et enfin différenciées en neurones. Des expériences quantitatives de réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse (RT-qPCR) et d’immunofluorescence ont révélé que les progéniteurs neuronaux et les neurones présentent des marqueurs correspondants (nestin pour les progéniteurs neuronaux et neurofilament pour les neurones) aux jours 8 et 12 après la différenciation, respectivement. Des expériences de cytométrie en flux sur une ligne E14 exprimant un rapporteur GFP piloté par le promoteur Sox1 ont montré qu’environ 60% des cellules au jour 8 sont GFP positives, indiquant la différenciation réussie des cellules progénitrices neurales à ce stade. Enfin, l’analyse ARN-seq a été utilisée pour profiler les changements transcriptomiques globaux. Ces méthodes sont utiles pour analyser l’implication de gènes et de voies spécifiques dans la régulation de la transition de l’identité cellulaire au cours de la différenciation neuronale.
Introduction
Depuis leur première dérivation à partir de la masse cellulaire interne des blastocystes de souris en développement1,2,les cellules souches embryonnaires de souris (CSM) ont été utilisées comme outils puissants pour étudier l’auto-renouvellement et la différenciation des cellules souches3. En outre, l’étude de la différenciation des CSM conduit à une compréhension approfondie des mécanismes moléculaires qui peuvent améliorer l’efficacité et la sécurité de la thérapie à base de cellules souches dans le traitement de maladies telles que les troubles neurodégénératifs4. Par rapport aux modèles animaux, ce système in vitro offre de nombreux avantages, notamment la simplicité dans la pratique et l’évaluation, le faible coût de maintien des lignées cellulaires par rapport aux animaux et la facilité relative des manipulations génétiques. Cependant, l’efficacité et la qualité des types de cellules différenciés sont souvent affectées par différentes lignées de cSM ainsi que par les méthodes de différenciation5,6. En outre, les tests traditionnels pour évaluer l’efficacité de la différenciation reposent sur un examen qualitatif de gènes marqueurs sélectionnés qui manquent de robustesse et ne parviennent donc pas à saisir les changements globaux dans l’expression des gènes.
Ici, nous visons à utiliser une batterie de tests pour l’évaluation systématique de la différenciation neuronale. En utilisant à la fois des analyses in vitro traditionnelles sur des marqueurs sélectionnés et des séquençages d’ARN, nous établissons une plate-forme pour mesurer l’efficacité de la différenciation ainsi que les changements transcriptomiques au cours de ce processus. Sur la base d’un protocole précédemment établi7,nous avons généré des corps embryoïdes (EB) grâce à la technique de la goutte suspendue, suivie d’une induction utilisant une quantité supraphysiologique d’acide rétinoïque (PR) pour générer des cellules progénitrices neurales (NPC), qui ont ensuite été différenciées en neurones avec un milieu d’induction neuronal. Pour examiner l’efficacité de la différenciation, en plus des tests traditionnels de RT-qPCR et d’immunofluorescence (FI), nous avons effectué une cytométrie d’ARN-seq et de cytométrie en flux. Ces analyses fournissent une mesure complète de la progression de la différenciation spécifique au stade.
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Protocol
1. Culture mESC
- Enduisez une plaque de 10 cm traitée par culture tissulaire de 0,1 % de gélatine et laissez la gélatine reposer pendant au moins 15 à 30 minutes avant de l’aspirer.
- Graine γ fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) irradiés un jour avant la culture des CSM dans le milieu mESC préchauffé (milieu Eagle modifié de Dulbecco avec 15% de sérum fœtal bovin (FBS), acides aminés non essentiels, β-mercaptoéthanol, L-glutamine, pénicilline/streptomycine, pyruvate de sodium, LIF, PD0325901 (PD) et Chir99021 (CH)).
- Laissez les MEF irradiés par γ se déposer et se fixer à la surface de la plaque avant de cultiver des cellules E14.
- Décongeler les CSE E14 au bain-marie à 37 °C et transférer rapidement les cellules dans un tube conique de 15 cm avec un milieu mESC chaud. Abattez les cellules à 200 x g pendant 3 min et retirez le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules dans 10 mL de milieu mESC et plaquer les cellules sur la plaque de culture contenant les MEF γ irradiés précédemment. Incuber la culture cellulaire dans un incubateur à 37 °C sous 5% de CO2.
- Pour le passage de culture, aspirer le milieu et laver la plaque avec 1x PBS stérile. Ajouter suffisamment de trypsine à 0,05 % pour recouvrir la surface de la plaque et incuber à 37 °C pendant 3 min.
- Neutraliser la trypsine avec un milieu mESC et une pipette pour générer une suspension monocellulaire. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 3 min et retirer le surnageant.
- Comptez les cellules avec un hémocytomètre ou un compteur de cellules et ensemencez environ 5,0 x 105 cellules dans une plaque de culture de 10 cm.
- Remettre les cellules en suspension dans 10 mL de milieu mESC, plaquer les cellules sur la plaque de culture tissulaire recouverte de gélatine et incuber des cultures comme décrit précédemment.
REMARQUE: Il est recommandé que les CSM soient passés tous les 2 jours pour empêcher les cellules de se différencier dans leurs colonies. Le rouge de phénol dans le milieu fonctionne uniquement comme un indicateur de pH et en fonction de la densité cellulaire, il peut devenir jaunâtre (plus acide), plus tôt que 2 jours. Par conséquent, il peut être nécessaire de changer de support tous les jours. Les MEF γ irradiés finiront par mourir après quelques passages.
2. EB, PNJ et différenciation des neurones
- Effectuez le protocole de passage de culture mentionné précédemment et comptez les cellules (étapes 1.7-1.10).
- Méthode de la goutte suspendue (jour 0)
- Pour une plaque de culture cellulaire de 10 cm, comptez environ 2,5 x 104 cellules où 5,0 x 10 2 cellulesseront en suspension dans un milieu de différenciation de 20 μL (DMEM avec 15% de FBS, acides aminés non essentiels, β-mercaptoéthanol, L-glutamine, pénicilline/streptomycine et pyruvate de sodium). Environ cinquante gouttelettes de 20 μL contenant les cellules peuvent être plaquées sur une plaque de 10 cm.
- Aliquotez le nombre approprié de cellules, puis centrifugez les cellules à 200 x g pendant 3 min et retirez le surnageant.
- Remettre les cellules dans le volume approprié de milieu de différenciation pour une densité cellulaire de 5,0 x 102 cellules pour 20 μL (par exemple, 2,5 x 104 cellules dans 1 mL de milieu de différenciation).
- À l’aide d’une micropipette ou d’une pipette répéteur, placez 20 μL de gouttelettes de la suspension cellulaire sur le couvercle de la plaque de culture tissulaire. Assurez-vous que les gouttelettes ne sont pas trop proches les unes des autres pour les empêcher de fusionner.
REMARQUE: Les gouttelettes peuvent être plaquées sur une plaque de fixation traitée par culture tissulaire ou une plaque de suspension car elles seront placées sur le couvercle et non sur la plaque elle-même. Pour une approche plus réalisable et stérile, plaquez les gouttelettes sur une plaque de culture tissulaire de fixation et transférez-les sur une plaque de suspension comme décrit ci-dessous. - Remplissez la plaque avec 5 à 10 mL de 1x PBS et remettez soigneusement le couvercle sur la plaque. Incuber la culture dans l’incubateur à 37 °C.
REMARQUE: PBS est ajouté à la plaque de culture pour empêcher les gouttelettes de se dessécher.
- Le jour 2,utilisez une micropipette pour recueillir les gouttelettes du couvercle et placez-les dans une plaque de suspension de culture cellulaire de 10 cm remplie de 10 mL de milieu de différenciation. Incuber la culture sur un shaker orbital secouant à basse vitesse dans l’incubateur.
- Le jour 4,pour récolter les EB, prélever les cellules, centrifuger à 200 x g pendant 3 min, et retirer le surnageant.
REMARQUE: Les EB peuvent également être lavés avec 1x PBS selon les exigences des expériences ultérieures. - Pour poursuivre la procédure et induire la différenciation EB en cellules progénitrices neurales (NPC), préparez le milieu de différenciation avec de l’acide rétinoïque (PR) de 5 μM.
- Retirez l’ancien milieu en abattant les EB à 100 x g pendant 3 min ou laissez les EB se déposer avant d’aspirer l’ancien milieu. Ajouter 10 mL du milieu de différenciation contenant 5 μM RA à la plaque de culture.
- Le jour 6, remplacez au moins la moitié du milieu par un milieu frais contenant 5 μM de RA en inclinant la plaque et en pipetant le milieu comme décrit ci-dessus.
REMARQUE: Il est recommandé de remplacer au moins la moitié du milieu par un milieu frais contenant de la PR les jours 5 et 7. Prenez note de l’indicateur de rouge phénol; s’il devient jaunâtre, il est préférable de remplacer tout le milieu. - Le jour 8,récoltez les PNJ en collectant les cellules, en centrifugant à 200 x g pendant 3 min et en retirant le surnageant.
REMARQUE: Les PNJ peuvent également être lavés avec 1x PBS selon les besoins des expériences ultérieures. Si nécessaire, les PNJ peuvent être congelés et décongelés à nouveau pour une culture et une analyse ultérieures. Si les PNJ doivent être cultivés, l’accutase peut également être utilisée comme alternative à la trypsine. - Pour poursuivre la procédure et différencier les PNJ en neurones, prélever les NPC dans un tube conique de 15 mL par centrifugation, les dissocier avec de la trypsine et les incuber à 37 °C pendant 3 min. Pipettez les PNJ pour s’assurer que tous les agrégats de PNJ sont dissociés et neutralisez la trypsine avec le milieu.
- Filtrer les cellules avec une passoire à cellules en nylon de 40 μm et compter les cellules avant de les plaquer à une densité de 1,5 x10 5/cm2 dans un milieu N2 (milieu DMEM/F12 + 3 mg/mL de glucose + 3 mg/mL d’albumine sérique bovine riche en lipides (LBSA) + supplément de N2 de 1:100 + 10 ng/mL bFGF + 50 U/mL de stylo/streptocoque + 1 mM de L-glutamine) sur une plaque traitée par culture tissulaire pour des expériences ultérieures de PCR et de transfert western; ou sur une chambre de culture tissulaire pour des expériences d’immunofluorescence.
- Le jour 9,remplacez l’ancien milieu par un milieu N2 frais.
- Le jour 10,changez le milieu N2 avec le milieu N2/B27 (50 % de DMEM/F12 et 50 % de basale neurale, 3 mg/mL de LBA, supplément de 1:200 N2, supplément de 1:100 B27, 50 U/mL de stylo/streptocoque et 1 mM de L-glutamine).
- Aux jours 11 à 12,récoltez les neurones comme suit. Laver les cellules avec 1x PBS, ajouter la trypsine et incuber la culture dans l’incubateur à 37 °C pendant 3 min avant de neutraliser la trypsine avec un milieu et de centrifuger à 200 x g pendant 3 min.
3. Caractérisation des CSM et des cellules différenciées
- Dosage de la phosphatase alcaline (AP)
- Utilisez un kit pour évaluer l’activité de la phosphatase alcaline (voir le Tableau des matériaux).
- Retirez le milieu de la plaque de culture et lavez les ESC avec 1x PBS.
- Ajouter 1 mL de la solution fixe (composée de formaldéhyde et de méthanol) fournie avec le kit à la plaque et l’incuber à température ambiante pendant 2 à 5 min.
REMARQUE: Une sur-incubation dans la solution de réparation peut compromettre l’activité AP. - Retirez la solution fixe, lavez les ESC avec 1x PBS et laissez une certaine quantité de PBS dans la plaque.
REMARQUE: Gardez les CES humides dans PBS pour ne pas compromettre l’activité AP. - Préparez la solution AP en mélangeant les solutions de substrat A, B et C au rapport 1:1:1. Mélanger d’abord les solutions A et B et incuber le mélange à température ambiante pendant 2 minutes avant d’ajouter la solution C.
- Retirez le PBS 1x et ajoutez la solution AP préparée précédemment.
- Incuber les ESC pendant environ 15 minutes dans l’obscurité en enveloppant la plaque de culture avec du papier d’aluminium ou en effectuant l’étape 3.5 dans une pièce sombre.
- Surveillez la réaction et retirez la solution réactionnelle lorsque la solution devient brillante pour éviter toute coloration non spécifique.
- Lavez les ESC deux fois avec 1x PBS.
- Empêchez l’échantillon de sécher en recouvrant les ESC de 1x PBS ou d’un support de montage.
REMARQUE: Une tache rouge ou violette apparaîtra pour l’expression AP. La plaque peut être conservée dans un réfrigérateur à 4 °C.
- RT-qPCR
- Prélever des cellules à différentes étapes en suivant les étapes 1.6 à 1.7 et 2.4 pour les CES et les EB et les PNJ, respectivement.
- Isoler l’ARN à l’aide d’une solution d’extraction d’ARN, d’ADN et de protéines (voir Tableau des matériaux).
- Générez de l’ADNc avec un kit de transcriptase inverse (voir la table des matériaux)et suivez le manuel du fabricant.
- Fixation et intégration
- Récoltez les EB et les PNJ comme décrit ci-dessus (étape 2.6) et fixez-les avec une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4% dans 1x PBS pendant 30 min à température ambiante.
- Retirez le PFA et lavez l’échantillon avec 1x PBS pendant 5 min.
- Placer l’échantillon dans une dilution en série de 1x PBS, 10%, 20% et 30% de solutions de saccharose à 25\u201228 °C où l’échantillon est transféré à la solution suivante après 30 min d’incubation.
REMARQUE: L’échantillon peut être conservé dans la solution de saccharose à 30% à 4 ° C avant de poursuivre l’étape d’incorporation. - Mouiller l’embout de la pipette avec une solution de saccharose avant de placer l’échantillon (sans les empiler) au centre du cryo-moule et pipeter l’excès de liquide.
REMARQUE: Le papier filtre peut également être utilisé pour éliminer l’excès de solution. Mouiller la pointe de la pipette avec une solution de saccharose est important pour empêcher les EB et les PNJ de coller aux parois de la pointe. - Ajoutez soigneusement une solution de température de coupe optimale (OCT) au moule sans remettre les échantillons en suspension et éliminez les bulles en excès avec une pipette.
- Placez le moule avec l’échantillon sur un mélangeur de laboratoire à basse vitesse pour agiter légèrement l’échantillon pendant 15 min. Cela aide à régler les EB et les PNJ au fond s’ils sont remis en suspension dans la solution OCT.
- Congelez rapidement l’échantillon en plaçant la moisissure dans de l’azote liquide ou sur de la glace carbonique.
REMARQUE: Les échantillons peuvent être conservés dans un congélateur à -70 ° C avant de passer à l’étape suivante.
- Cryosection
- Réglez le cryostat pour qu’il refroidisse à -20 à -18 °C avant de transférer l’échantillon dans l’instrument.
- Détachez le bloc OCT congelé du moule et fixez-le sur le support avec une petite solution OCT placée sur la surface du support.
- Alignez le bloc OPO de sorte que les EB et les PNJ soient les plus proches de la lame pour vous assurer que l’échantillon n’est pas perdu pendant la section.
- Coupez soigneusement 10 μm du bloc et portez une attention particulière aux tranches qui contiennent l’échantillon.
- Placez rapidement la tranche d’OCT contenant l’échantillon sur la lame de verre d’incorporation de tissu et laissez les tranches d’OCT sécher à l’air libre pendant 1 h à température ambiante.
REMARQUE: Les échantillons peuvent être conservés à -70 °C pour une utilisation ultérieure.
- Immunofluorescence (FI)
- Bloquer les sections OCT ou les chambres de culture contenant des neurones dans 10% de sérum d’âne normal / 0,1% de Triton X-100 dans 1x PBS pendant 1 h à température ambiante.
- Incuber les échantillons dans un anticorps primaire dilué dans du sérum d’âne normal à 5 % / 0,05 % de Triton X-100 dans 1x PBS pendant la nuit à 4 °C.
- Lavez les échantillons dans 1x PBS/0,1 % Triton X-100 trois fois pendant 5 min chaque lavage.
- Incuber les échantillons avec un anticorps secondaire dilué dans 5 % de sérum d’âne normal /0,05 % de Triton X-100 dans 1x PBS pendant 1 h à température ambiante.
- Laver les échantillons dans 1x PBS/0,1 % Triton X-100 trois fois pendant 5 min chaque lavage puis incuber les échantillons dans 1 μg/mL DAPI.
- Montez les échantillons avec un couvercle et un support de montage et laissez-le sécher.
- Observez les échantillons au microscope à fluorescence.
- Analyse de séquençage de l’ARN
- Prélever les cellules à différents stades et effectuer une extraction de l’ARN (voir étape 3.2).
- Préparer les bibliothèques d’ADNc, effectuer un séquençage approfondi et une analyse des données selon le protocole décrit dans Wang et al.8.
- Effectuez l’analyse d’ontologie génique (GO) à l’aide du package R, clusterProfiler.
- Cytométrie en flux
- Collectez les CSE en suivant les étapes 1.6 à 1.7 et remettez en suspension les cellules dans un milieu. Collectez les EB et les PNJ en suivant l’étape 2.4 et remettez en suspension les cellules dans un milieu.
- Filtrer la suspension cellulaire à l’aide de la passoire à cellules en nylon de 40 μm dans un nouveau tube conique de 15 mL.
- Mesurer le signal GFP des échantillons à l’aide du cytomètre en flux (effectué par l’installation centrale de l’établissement).
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Representative Results
En tant que représentation de notre méthode, nous avons effectué une expérience de différenciation EB, NPC et neuronale sur des cellules E14. Les cellules E14 ont été cultivées sur des MEF γ irradiés(figure 1A)jusqu’à ce que la population de MEF irradiés par γ se dilue. Nous avons confirmé la pluripotence des cellules E14 en effectuant une coloration à la phosphatase alcaline (AP)(Figure 1B)et plus tard rt-qPCR (voir ci-dessous) pour les marqueurs Nanog et Oct4. Les cellules E14 sans MEF irradiées γ ont ensuite été induites pour différenciation à l’aide du protocole décrit à la figure 2A. En bref, des gouttelettes de milieu de différenciation de 20 μL contenant 500 cellules ont été ensemencées sur le couvercle de la plaque de culture (voir la section 2 du protocole pour plus de détails). Les EB formés ont ensuite été collectés et mis en suspension dans de nouveaux milieux de différenciation. Du jour 4 au jour 8 de la différenciation, 5 μM de RA ont été ajoutés aux plaques de culture pour induire des PNJ. Les EB différenciés ont montré une forme ronde et leur taille a continué à augmenter pendant la différenciation (Figure 2B). Au jour 8, les PNJ ont été récoltés et trypsinisés, puis la suspension unicellulaire résultante a été plaquée dans une chambre de culture tissulaire en milieu DMEM / F12 avec supplément de N2 et plus tard dans un supplément de B27. Au jour 10, les PNJ se différenciant en neurones semblent avoir une forme de cellule allongée(Figure 2B).
Pour évaluer davantage notre expérience de différenciation, nous avons effectué des expériences d’immunofluorescence (FI) sur des PNJ E14 au jour 8 et des neurones E14 au jour 12. Nous avons observé une coloration positive pour la nestine dans les PNJ et un signal de neurofilament (NF) pour les neurones(Figure 3A). Alternativement, RT-qPCR et ARN-seq ont confirmé l’induction de gènes marqueurs NPC et la perte de gènes de pluripotence dans les PNJ(Figure 3B, D, F). En tant que méthode quantitative pour tester le succès de la différenciation ESC, nous avons différencié une ligne ESC de souris exprimant un rapporteur GFP piloté par le promoteur Sox1 9,suivie d’une analyse de cytométrie en flux sur les ESC et les PNJ. Nous avons constaté que 58,7 % du total des cellules au stade NPC sont GFP-positives tandis que le signal GFP est de 0,0% au stade ESC(Figure 3C). Pour profiler les changements transcriptomiques au cours de la différenciation, des expériences ARN-seq pour les CSE E14, EB jour 3 et NPC jour 8 ont été réalisées et ont révélé des groupes de gènes associés aux stades respectifs(Figure 3D). Les gènes de la carte thermique ARN-seq ont été triés en fonction de leurs niveaux d’expression afin d’identifier les gènes exprimés différemment aux différents stades de la différenciation. L’analyse de l’ontologie génique (GO) pour les quatre groupes de gènes a montré que ces groupes correspondent à des fonctions ou des voies cellulaires distinctes indiquant que les trois stades cellulaires de la différenciation neuronale mESC ont chacun un groupe de gènes qui sont fortement exprimés à leur stade respectif mais pas d’autres (Figure 3E). Par exemple, les gènes du groupe 3 sont fortement exprimés dans les PNJ E14 par rapport à d’autres stades et correspondent à des voies liées au développement neuronal. Les groupes 1, 2 et 4 ne contiennent pas de gènes hautement exprimés liés à des spécifications de lignée de couche germinale, mais ils sont liés à la croissance et à la prolifération cellulaires. Ainsi, l’analyse ARN-seq et l’analyse GO qui l’accompagne ont montré que les cellules E14 se sont différenciées en lignée neuronale au jour 8 de la différenciation.
Figure 1 : CSE E14 dans la culture. (A) Les images au microscope optique montrent des cellules E14 (flèche noire) se développant en colonies au sommet des MEF γ irradiés. Les colonies E14 continuent de proliférer, comme en témoigne la différence de taille des colonies entre les cultures du jour 1 et du jour 3. (B) Confirmation de la pluripotence des CES E14 par la coloration alcaline phosphatase (AP). Les flèches violettes indiquent les CSM qui étaient positifs pour la coloration AP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Différenciation de l’E14 en EB, PNJ et neurones. (A) Le schéma résume les principales étapes pour différencier les cellules E14 en EB, PNJ et neurones. (B) Les CSE E14 cultivés en milieu sans LIF et 2i dans une plaque de suspension forment des sphères individuelles d’EB visibles au jour 2 où elles continuent de croître et de grossir les jours suivants. La PR est ajoutée au jour 4 de la différenciation pour induire la différenciation en PNJ. Après 4 jours d’induction, ces PNJ sont plaqués pour la différenciation en neurones, qui sont montrés dans le panneau inférieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Caractérisation des cellules différenciées. (A) Les images d’immunofluorescence dans le panneau supérieur montrent des EB contenant des PNJ au jour 8 sondés pour la nestine (vert) et les noyaux (DAPI, bleu). Le panneau inférieur montre des images d’immunofluorescence pour les neurones au jour 12 sondés pour le neurofilament (vert). La zone rouge dans les images fusionnées est agrandie en 3x pour une meilleure vue. (B) Analyse RT-qPCR montrant les marqueurs de pluripotence (Nanog et Oct4) et les marqueurs NPC (Pax6, NeuroD1et Nes) des CSE et des PNJ E14. Les barres d’erreur sont moyennes ± SD. (C) Les cellules E14 exprimant un rapporteur GFP piloté par le promoteur Sox1 ont été différenciées en PNJ. Les CSE et les PNJ au jour 8 ont été quantifiés pour le signal fluorescent GFP positif avec cytométrie en flux. (D) La carte thermique montre les scores z pour le FPKM déterminé des gènes exprimés dans les stades ESC, EB et NPC. Quatre groupes de gènes distincts ont été identifiés, ce qui signifie des groupes de gènes exprimés différemment au stade ESC, EB ou NPC. (E) L’analyse GO a été effectuée à l’aide du package R, clusterProfiler, sur les quatre clusters identifiés dans le séquençage de l’ARN. (F) Le graphique montre les valeurs FPKM pour trois autres marqueurs de pluripotence, Sox2, Klf4et Myc ainsi que les marqueurs neuronaux, NeuN, Map2et Tubb3 pour les cellules E14 aux stades ESC, EB jour 3 et NPC jour 8. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La méthode de différenciation neuronale des cellules souches embryonnaires de souris est établie depuis des décennies et les chercheurs ont continué à modifier les protocoles précédents ou à en créer de nouveaux à des fins diverses7,10,11. Nous avons utilisé une série de tests pour analyser de manière exhaustive l’efficacité et la progression des étapes de différenciation des CSM en neurones, qui peuvent être utilisés dans l’analyse d’autres différenciations de lignée de CSE de souris ou d’humains. De plus, nos approches se sont avérées être des outils utiles pour évaluer l’impact de gènes ou de voies spécifiques sur la différenciation neuronale in vitro8.
Avec nos méthodes, les ESC pluripotents non engagés traités à l’acide rétinoïque (PR) s’engagent dans la lignée neurale avec une grande efficacité et sont en outre incités à générer des neurones7. Pour améliorer la différenciation réussie des cellules ES en cellules neurales et réduire l’hétérogénéité, il est important de maintenir les cellules ES dans un état indifférencié12. Les MEF non prolifératifs, traités par γ-irradiation ou mitomycine C, fonctionnent pour maintenir la pluripotence des CES et fournir un échafaudage pour leur croissance13,14. Pour obtenir des résultats cohérents, nous commençons chaque expérience de différenciation avec des CSM cultivés sur des MEF irradiés γ. Après quelques passages, les MEF γ irradiés disparaissent et la culture finit par devenir homogène pour les cellules mESC. Alternativement, les CSEm peuvent être pré-plaqués sur de la gélatine pendant environ 45 minutes avant que les MEF irradiés par γ ne soient ensemencés pour mieux les éliminer au passage suivant. Le facteur inhibiteur de la leucémie (LIF) a longtemps été utilisé pour maintenir l’état de pluripotence des cellules ES de souris cultivées en activant la voie JAK / STAT15,16,17. Plus récemment, PD0325901 (PD, un inhibiteur de meK) et CHIR99021 (CH, un inhibiteur de GSK) se sont avérés fournir un maintien supplémentaire de la pluripotence des cellules ES3,18. Dans notre protocole, nous cultivons des CSM avec ces inhibiteurs avec des LIF pour maintenir une pluripotence élevée des CSM.
Un autre facteur essentiel pour réussir la différenciation est la qualité des EB. Nous effectuons la différenciation des cellules E14 par la méthode de la goutte suspendue, qui a été appliquée par d’autres chercheurs5,19,20. Avec cette méthode, les cellules ES simples sont autorisées à se suspendre dans la gouttelette du milieu de différenciation pendant 2 jours où elles s’agrègent spontanément et forment des EB. Les EB résultants sont généralement mieux définis en termes de morphologie(Figure 2B)par rapport à la méthode de suspension des CSEm isolés dans un milieu, ce qui donne des tailles EB dans une gamme beaucoup plus large dans notre expérience (données non montrées). Pour éviter que les EB ne se fixent aux plaques, il est important d’effectuer une rotation à basse vitesse à partir du jour 3 et en continuant tout au long du processus de différenciation. Les EB sont incités à se différencier en PNJ en les traitant avec la PR. Les PNJ résultant du traitement de la PR au jour EB 4 sont généralement hétérogènes pour les cellules neurales telles que les oligodendrocytes et les astrocytes21. En utilisant la RT-qPCR ou l’immunofluorescence, la population de NPC peut être sondée pour les neurones et d’autres marqueurs de lignée neuronale tels que Gfap pour les astrocytes et Olig2 pour les oligodendrocytes. Pour induire davantage la différenciation des PNJ en neurones, les PNJ sont cultivés dans un milieu neuronal optimal où les composants les plus importants sont les suppléments de N2 et B27. Le supplément N2 fonctionne principalement pour aider les PNJ à s’engager dans la lignée neuronale tandis que le supplément B27 fonctionne pour maintenir la longévité des neurones.
Les échantillons peuvent être prélevés tout au long de la période de différenciation (par exemple, stade ESC, EB jour 2, EB jour 4, NPC jour 6, NPC jour 8, neurones jour 10 et neurones jour 12) pour suivre le processus de différenciation en effectuant RT-qPCR pour les marqueurs de pluripotence et d’ectoderme. La comparaison des marqueurs de pluripotence tels que Oct4, Nanog, Sox2, Klf4et Myc entre les différents stades cellulaires permettra de vérifier la pluripotence des csem(Figure 3B, F). Pour étudier l’efficacité de la différenciation neuronale, des marqueurs de la couche mésodermique tels que Hand1, Snai1et Tbxt; et la couche endodermique telle que Eomes et Gata4 peuvent également être sondées (données non présentées). Une vérification supplémentaire peut être effectuée avec un sondage par immunofluorescence (FI) pour les NPC ou les marqueurs neuronaux(Figure 3A). Cependant, ces méthodes ne sont pas quantitatives et biaisées en faveur des marqueurs sélectionnés. Pour surmonter ces limites, nous incorporons la cytométrie en flux et les analyses de séquençage de l’ARN (Figure 3C\u2012F). La lignée cellulaire utilisée dans l’expérience de cytométrie en flux est une lignée cellulaire Sox1-GFP E14, qui a été utilisée spécifiquement dans cette expérience pour évaluer la qualité de la procédure de différenciation NPC. Sox1 est l’un des premiers marqueurs neuronaux spécifiques au cours du développement du neuroectoderme22, ce qui en fait un excellent marqueur pour la lignée des PNJ. Sox1 peut être sondé pour l’utilisation de RT-qPCR ou Western blot pour évaluer la population de NPC. Ces analyses sont particulièrement utiles pour étudier le défaut de différenciation causé par la manipulation génique ou le traitement chimique.
Il est important de noter qu’il y a quelques limites à notre protocole présenté ici. Tout d’abord, nous ne présentons l’analyse complète que pour une lignée cellulaire mESC de type sauvage. D’autres lignées d’ESC provenant de souris ou d’humains pourraient nécessiter des modifications et une optimisation supplémentaire du protocole pour assurer une différenciation neuronale réussie et efficace. Deuxièmement, nous présentons une méthode de différenciation des neurones in vitro, qui supporte naturellement son propre ensemble de limites. Comme mentionné précédemment, les EB sont traités avec un niveau supraphysiologique de PR pour les conduire vers la lignée NPC. Les PNJ qui en résultent sont ensuite placés dans des milieux optimaux pour imiter les conditions physiologiques et encourager l’engagement, la croissance et la longévité de la lignée neuronale. Ici, les suppléments de N2 et B27 sont utilisés pour cultiver des neurones, mais d’autres suppléments sont également disponibles tels que NS2123 à des fins similaires, ce qui peut altérer le succès et l’efficacité de la différenciation des neurones. Ces conditions sont reconstituées synthétiquement dans les tests de culture cellulaire, ce qui peut ne pas représenter pleinement les conditions physiologiques. La qualité des EB, des PNJ et des neurones dépend fortement des CSM de départ. Les CSM qui ont été passés trop souvent et maintenus en culture pendant plus de 1 semaine commencent généralement à perdre de la pluripotence et peuvent ne pas subir de différenciation avec succès. Ainsi, le maintien des CSM dans un état optimal est essentiel pour s’assurer qu’ils peuvent se différencier efficacement en EB, PNJ et neurones. D’autres méthodes de culture de neurones telles que les modèles 3D ont également été proposées pour mieux imiter les conditions physiologiques24,25,26 parfois au détriment du débit et de la faisabilité27,28. Nous pensons que nos protocoles sont utiles pour caractériser ces modèles de culture 3D.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH (1R35GM133496-01) à Z. Gao. Nous tenons à remercier le Dr Ryan Hobbs pour son aide dans le sectionnement. Nous remercions les installations de base du Penn State College of Medicine, notamment les sciences du génome et la bioinformatique, l’imagerie par microscopie optique avancée et la cytométrie en flux. Nous remercions également le Dr Yuka Imamura pour son aide dans l’analyse de l’ARN-seq.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
| 40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
| m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
| MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
| mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
| mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
| mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
| - Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
| - Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
| - Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| - Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
| Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
| TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
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