Summary
Wir beschreiben das Verfahren zur In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in neuronale Zellen mit der Hanging-Drop-Methode. Darüber hinaus führen wir eine umfassende phänotypische Analyse durch RT-qPCR, Immunfluoreszenz, RNA-seq und Durchflusszytometrie durch.
Abstract
Wir beschreiben das schrittweise Verfahren zur Kultivierung und Differenzierung embryonaler Stammzellen von Mäusen in neuronale Linien, gefolgt von einer Reihe von Assays zur Charakterisierung der differenzierten Zellen. Die embryonalen Stammzellen der E14-Maus wurden verwendet, um embryoide Körper durch die Hängende-Drop-Methode zu bilden, und dann induziert, sich durch Retinsäure in neuronale Vorläuferzellen zu differenzieren und schließlich in Neuronen zu differenzieren. Quantitative Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) und Immunfluoreszenzexperimente zeigten, dass die neuronalen Vorläufer und Neuronen am Tag 8 bzw. 12 nach der Differenzierung entsprechende Marker (Nestin für neuronale Vorläufer und Neurofilament für Neuronen) aufweisen. Durchflusszytometrie-Experimente an einer E14-Linie, die einen Sox1-Promotor-gesteuerten GFP-Reporter exprimierte, zeigten, dass etwa 60% der Zellen an Tag 8 GFP-positiv sind, was auf die erfolgreiche Differenzierung neuronaler Vorläuferzellen in diesem Stadium hinweist. Schließlich wurde die RNA-seq-Analyse verwendet, um die globalen transkriptomischen Veränderungen zu profilieren. Diese Methoden sind nützlich, um die Beteiligung bestimmter Gene und Signalwege an der Regulierung des Zellidentitätsübergangs während der neuronalen Differenzierung zu analysieren.
Introduction
Seit ihrer ersten Ableitung aus der inneren Zellmasse der sich entwickelnden Mausblastozysten1,2, wurden embryonale Mausstammzellen (mESC) als leistungsfähige Werkzeuge zur Untersuchung der Selbsterneuerung und Differenzierung von Stammzellen verwendet3. Darüber hinaus führt die Untersuchung der mESC-Differenzierung zu einem enormen Verständnis molekularer Mechanismen, die die Effizienz und Sicherheit in der stammzellbasierten Therapie bei der Behandlung von Krankheiten wie neurodegenerativen Erkrankungen verbessern können4. Im Vergleich zu Tiermodellen bietet dieses In-vitro-System viele Vorteile, darunter Einfachheit in der Praxis und Bewertung, geringe Kosten bei der Pflege von Zelllinien im Gegensatz zu Tieren und relative Leichtigkeit bei genetischen Manipulationen. Die Effizienz und Qualität differenzierter Zelltypen wird jedoch häufig durch unterschiedliche Linien von mES-Zellen sowie die Differenzierungsmethoden5,6beeinflusst. Auch die traditionellen Assays zur Bewertung der Differenzierungseffizienz beruhen auf der qualitativen Untersuchung ausgewählter Markergene, denen es an Robustheit mangelt und die daher globale Veränderungen in der Genexpression nicht erfassen.
Hier wollen wir eine Batterie von Assays zur systematischen Beurteilung der neuronalen Differenzierung einsetzen. Mit traditionellen In-vitro-Analysen an ausgewählten Markern und RNA-seq etablieren wir eine Plattform zur Messung der Differenzierungseffizienz sowie der transkriptomischen Veränderungen während dieses Prozesses. Basierend auf einem zuvor etablierten Protokoll7erzeugten wir embryoide Körper (EBs) durch die Hanging-Drop-Technik, gefolgt von induktion unter Verwendung supraphysiologischer Mengen an Retinsäure (RA), um neuronale Vorläuferzellen (NPCs) zu erzeugen, die anschließend zu Neuronen mit neuronalem Induktionsmedium differenziert wurden. Um die Effizienz der Differenzierung zu untersuchen, haben wir zusätzlich zu den traditionellen RT-qPCR- und Immunfluoreszenz(IF)-Assays RNA-seq und Durchflusszytometrie durchgeführt. Diese Analysen liefern eine umfassende Messung des Verlaufs der stufenspezifischen Differenzierung.
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Protocol
1. mESC-Kultur
- Beschichten Sie eine 10 cm gewebekulturbehandelte Platte mit 0,1% Gelatine und lassen Sie die Gelatine mindestens 15-30 min aushärten, bevor Sie sie aussaugen.
- Samen γ-bestrahlten embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus einen Tag vor der Kultivierung der mESCs im vorgewärmten mESC-Medium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 15% fetalem Rinderserum (FBS), nicht-essentiellen Aminosäuren, β-Mercaptoethanol, L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin, Natriumpyruvat, LIF, PD0325901 (PD) und Chir99021 (CH)).
- Lassen Sie die γ bestrahlten MEFs sich absetzen und an der Plattenoberfläche befestigen, bevor Sie E14-Zellen kultivieren.
- E14 ESCs im 37 °C Wasserbad auftauen und die Zellen in einem 15 cm konischen Röhrchen mit warmem mESC-Medium schnell übertragen. Die Zellen bei 200 x g für 3 min pelletieren und den Überstand entfernen.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml mESC-Medium und platten Sie die Zellen auf der Kulturplatte, die die zuvor γ bestrahlten MEFs enthält. Inkubieren Sie die Zellkultur in einem 37 °C Inkubator unter 5%CO2.
- Für die Kulturübergabe das Medium ansaugen und die Platte mit sterilen 1x PBS waschen. Fügen Sie genügend 0,05% Trypsin hinzu, um die Plattenoberfläche zu bedecken, und inkubieren Sie bei 37 °C für 3 min.
- Neutralisieren Sie das Trypsin mit mESC-Medium und Pipette, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 3 min und entfernen Sie den Überstand.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder Zellzähler und säen Sie etwa 5,0 x 105 Zellen in eine 10 cm große Kulturplatte.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml mESC-Medium, platten Sie die Zellen auf die mit Gelatine beschichtete Gewebekulturplatte und inkubieren Sie Kulturen wie zuvor beschrieben.
HINWEIS: Es wird empfohlen, dass mESCs alle 2 Tage durchquert werden, um zu verhindern, dass sich die Zellen in ihren Kolonien differenzieren. Phenolrot im Medium fungiert ausschließlich als pH-Indikator und kann je nach Zelldichte früher als 2 Tage gelblich (saurer) werden. Daher kann es notwendig sein, das Medium jeden Tag zu wechseln. Die γ-bestrahlten MEFs werden schließlich nach ein paar Passagen absterben.
2. EB-, NPC- und Neuronendifferenzierung
- Führen Sie das bereits erwähnte Kultur-Passaging-Protokoll durch und zählen Sie die Zellen (Schritte 1.7–1.10).
- Hängende Tropfenmethode (Tag 0)
- Zählen Sie für eine 10 cm Große Zellkulturplatte etwa 2,5 x 104 Zellen, wobei 5,0 x10 2 Zellen in einem 20 μL-Differenzierungsmedium suspendiert werden (DMEM mit 15% FBS, nicht-essentiellen Aminosäuren, β-Mercaptoethanol, L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin und Natriumpyruvat). Etwa fünfzig 20 μL Tröpfchen, die die Zellen enthalten, können auf einer 10 cm großen Platte plattiert werden.
- Aliquotieren Sie die entsprechende Anzahl von Zellen und zentrifugieren Sie dann die Zellen bei 200 x g für 3 min und entfernen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie die Zellen im geeigneten Volumen des Differenzierungsmediums für eine Zelldichte von 5,0 x10 2 Zellen pro 20 μL (z. B. 2,5 x 104 Zellen in 1 ml Differenzierungsmedium).
- Mit einer Mikropipette oder einer Repeaterpipette 20 μL Tröpfchen der Zellsuspension auf den Deckel der Gewebekulturplatte geben. Stellen Sie sicher, dass die Tröpfchen nicht zu nahe beieinander liegen, um zu verhindern, dass sie verschmelzen.
HINWEIS: Die Tröpfchen können entweder auf einer mit Gewebekulturen behandelten Befestigungsplatte oder einer Suspensionsplatte plattiert werden, da sie auf dem Deckel und nicht auf der Platte selbst platziert werden. Für einen praktikableren und sterileren Ansatz plätten Sie die Tröpfchen auf einer Befestigungs-Gewebekulturplatte und übertragen Sie sie wie unten beschrieben auf eine Suspensionsplatte. - Füllen Sie die Platte mit 5–10 ml 1x PBS auf und setzen Sie den Deckel vorsichtig wieder auf die Platte. Inkubieren Sie die Kultur im 37 °C Inkubator.
HINWEIS: PBS wird der Kulturplatte zugesetzt, um zu verhindern, dass die Tröpfchen austrocknen.
- Am Tag 2sammeln Sie mit einer Mikropipette die Tröpfchen aus dem Deckel und legen Sie sie in eine 10 cm große Zellkultur-Suspensionsplatte, die mit 10 ml Differenzierungsmedium gefüllt ist. Inkubieren Sie die Kultur auf einem Orbitalschüttler, der mit niedriger Geschwindigkeit im Inkubator schüttelt.
- Am Tag 4,um die EBs zu ernten, sammeln Sie die Zellen, zentrifugieren Sie bei 200 x g für 3 min und entfernen Sie den Überstand.
HINWEIS: Die EBs können auch mit 1x PBS gemäß den Anforderungen nachfolgender Experimente gewaschen werden. - Um das Verfahren fortzusetzen und die EB-Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen (NPCs) zu induzieren, bereiten Sie das Differenzierungsmedium mit 5 μM Retinsäure (RA) vor.
- Entfernen Sie das alte Medium, indem Sie die EBs bei 100 x g für 3 min pelletieren oder lassen Sie die EBs absetzen, bevor Sie das alte Medium aussaugen. 10 mL des Differenzierungsmediums, das 5 μM RA enthält, in die Kulturplatte geben.
- Ersetzen Sie am Tag 6mindestens die Hälfte des Mediums durch ein frisches Medium, das 5 μM RA enthält, indem Sie die Platte kippen und das Medium wie oben beschrieben pipettieren.
HINWEIS: Es wird empfohlen, an den Tagen 5 und 7 mindestens die Hälfte des Mediums durch frisches RA-haltiges Medium zu ersetzen. Beachten Sie den phenolroten Indikator; Wenn es gelblich wird, ist es am besten, das gesamte Medium zu ersetzen. - Am Tag 8erntet ihr die NPCs, indem ihr die Zellen sammelt, 3 min lang bei 200 x g zentrifugiert und den Überstand entfernt.
HINWEIS: Die NPCs können auch mit 1x PBS gewaschen werden, je nach den Bedürfnissen nachfolgender Experimente. Bei Bedarf können NPCs eingefroren und für die spätere Kultur und Analyse wieder aufgetaut werden. Sollen die NPCs kultiviert werden, kann Accutase auch als Alternative zu Trypsin verwendet werden. - Um das Verfahren fortzusetzen und NPCs zu Neuronen zu differenzieren, sammeln Sie NPCs in einem 15 ml konischen Rohr durch Zentrifugation, dissoziieren Sie sie mit Trypsin und inkubieren Sie sie bei 37 ° C für 3 min. Pipettieren Sie die NPCs, um sicherzustellen, dass alle NPC-Aggregate dissoziiert sind und neutralisieren Sie das Trypsin mit dem Medium.
- Filtern Sie die Zellen mit einem 40 μm Nylon-Zellsieb und zählen Sie die Zellen, bevor Sie sie mit einer Dichte von 1,5 x 105/ cm2 in N2-Medium (DMEM / F12-Medium + 3 mg / ml Glukose + 3 mg / ml lipidreiches Rinderserumalbumin (LBSA) + 1:100 N2-Präparat + 10 ng / ml bFGF + 50 U / ml Pen / Streptokokken + 1 mM L-Glutamin) auf einer mit Gewebekultur behandelten Platte für nachfolgende PCR- und Western-Blot-Experimente plattieren; oder auf einer Gewebekulturkammer für Immunfluoreszenzexperimente.
- Ersetzen Sie am Tag 9das alte Medium durch ein frisches N2-Medium.
- Wechseln Sie am Tag 10das N2-Medium mit N2/B27-Medium (50% DMEM/F12 und 50% neural basal, 3 mg/ml LBA, 1:200 N2-Präparat, 1:100 B27-Präparat, 50 U/ml Pen/Streptokokken und 1 mM L-Glutamin).
- An den Tagen 11-12ernten Sie die Neuronen wie folgt. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS, fügen Sie Trypsin hinzu und inkubieren Sie die Kultur im 37 ° C-Inkubator für 3 min, bevor Sie das Trypsin mit Medium neutralisieren und 3 min bei 200 x g zentrifugieren.
3. Charakterisierung von mES-Zellen und differenzierten Zellen
- Alkalischer Phosphatase (AP) Assay
- Verwenden Sie ein Kit, um die alkalische Phosphataseaktivität zu beurteilen (siehe Materialtabelle).
- Entfernen Sie das Medium von der Kulturplatte und waschen Sie die ESCs mit 1x PBS.
- 1 ml der fixen Lösung (besteht aus Formaldehyd und Methanol), die mit dem Kit geliefert wurde, auf die Platte geben und bei Raumtemperatur für 2–5 min inkubieren.
HINWEIS: Eine Überinkubation in der Fixlösung kann die AP-Aktivität beeinträchtigen. - Entfernen Sie die Fixlösung, waschen Sie die ESCs mit 1x PBS und lassen Sie eine gewisse Menge PBS in der Platte.
HINWEIS: Halten Sie die ESCs in PBS feucht, um die AP-Aktivität nicht zu beeinträchtigen. - Bereiten Sie die AP-Lösung vor, indem Sie die A-, B- und C-Substratlösungen im Verhältnis 1:1:1 mischen. Mischen Sie zuerst A- und B-Lösungen und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 2 min, bevor Sie die C-Lösung hinzufügen.
- Entfernen Sie die 1x PBS, und fügen Sie die zuvor vorbereitete AP-Lösung hinzu.
- Inkubieren Sie die ESCs für ca. 15 min im Dunkeln, indem Sie die Kulturplatte mit Alufolie umwickeln oder Schritt 3.5 in einem dunklen Raum durchführen.
- Überwachen Sie die Reaktion und entfernen Sie die Reaktionslösung, wenn die Lösung hell wird, um unspezifische Flecken zu vermeiden.
- Waschen Sie die ESCs zweimal mit 1x PBS.
- Verhindern Sie das Austrocknen der Probe, indem Sie die ESCs mit 1x PBS oder Montagemedium abdecken.
HINWEIS: Für den AP-Ausdruck erscheint ein roter oder violetter Fleck. Der Teller kann in einem 4 °C Kühlschrank aufbewahrt werden.
- RT-qPCR
- Sammeln Sie Zellen in verschiedenen Stadien, indem Sie die Schritte 1.6-1.7 und 2.4 für ES-Zellen bzw. EBs bzw. NPCs ausführen.
- Isolieren Sie RNA mit RNA, DNA und Proteinextraktionslösung (siehe Tabelle der Materialien).
- Generieren Sie cDNA mit einem Reverse-Transkriptase-Kit (siehe Materialtabelle)und folgen Sie dem Handbuch des Herstellers.
- Fixierung und Einbettung
- Ernten Sie EBs und NPCs wie oben beschrieben (Schritt 2.6) und fixieren Sie sie mit 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung in 1x PBS für 30 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie die PFA und waschen Sie die Probe mit 1x PBS für 5 min.
- Die Probe wird in eine serielle Verdünnung von 1x PBS-, 10%-, 20%- und 30%-Saccharoselösungen bei 25°u201228 °C gegeben, wobei die Probe nach 30 min Inkubation in die nächste Lösung überführt wird.
HINWEIS: Die Probe kann in der 30%igen Saccharoselösung bei 4 °C gelagert werden, bevor mit dem Einbettungsschritt fortgefahren wird. - Befeuchten Sie die Pipettenspitze mit Saccharoselösung, bevor Sie die Probe (ohne sie zu stapeln) in die Mitte der Kryoform geben und die überschüssige Flüssigkeit auspipetieren.
HINWEIS: Filterpapier kann auch verwendet werden, um die überschüssige Lösung zu entfernen. Die Benetzung der Pipettenspitze mit Saccharoselösung ist wichtig, um zu verhindern, dass die EBs und NPCs an den Wänden der Spitze haften bleiben. - Geben Sie der Form vorsichtig eine optimale Schneidtemperaturlösung (OCT) hinzu, ohne die Proben erneut zu verwenden, und entfernen Sie überschüssige Blasen mit einer Pipette.
- Legen Sie die Form mit der Probe bei niedriger Geschwindigkeit auf einen Labormischer, um die Probe 15 Minuten lang leicht zu rühren. Dies hilft, die EBs und NPCs unten zu platzieren, wenn sie in der OCT-Lösung resuspendiert werden.
- Frieren Sie die Probe schnell ein, indem Sie die Form in flüssigen Stickstoff oder auf Trockeneis legen.
HINWEIS: Die Proben können in einem Gefrierschrank von -70 °C gelagert werden, bevor sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Kryosektion
- Stellen Sie den Kryostaten auf -20 bis -18 °C ab, bevor Sie die Probe auf das Gerät übertragen.
- Lösen Sie den gefrorenen OCT-Block von der Form und befestigen Sie ihn mit einer kleinen OCT-Lösung auf der Oberfläche des Halters.
- Richten Sie den OAT-Block so aus, dass die EBs und NPCs dem Blade am nächsten sind, um sicherzustellen, dass die Probe während des Schneidens nicht verloren geht.
- Schneiden Sie vorsichtig 10 μm des Blocks und achten Sie genau auf die Scheiben, die die Probe enthalten.
- Legen Sie die OCT-Scheibe, die die Probe enthält, schnell auf den Glasträger mit Gewebeeinbettung und lassen Sie die OCT-Scheiben 1 h bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.
HINWEIS: Die Proben können bei -70 °C für die spätere Verwendung gelagert werden.
- Immunfluoreszenz (IF)
- Blockieren Sie OCT-Abschnitte oder Kulturkammern, die Neuronen in 10% normalem Eselserum / 0,1% Triton X-100 in 1x PBS für 1 h bei Raumtemperatur enthalten.
- Inkubieren Sie die Proben in primären Antikörpern, verdünnt in 5% normalem Eselserum/0,05% Triton X-100 in 1x PBS über Nacht bei 4 °C.
- Proben in 1x PBS/0,1% Triton X-100 dreimal für 5 min pro Wäsche waschen.
- Inkubieren Sie die Proben mit sekundärem Antikörper, verdünnt in 5% normalem Eselserum/0,05% Triton X-100 in 1x PBS für 1 h bei Raumtemperatur.
- Proben in 1x PBS/0,1% Triton X-100 dreimal für jeweils 5 min waschen und die Proben dann in 1 μg/ml DAPI inkubieren.
- Montieren Sie die Proben mit einem Deckglas und etwas Montagemedium und lassen Sie sie trocknen.
- Beobachten Sie die Proben unter einem Fluoreszenzmikroskop.
- RNA-seq-Analyse
- Sammeln Sie die Zellen in verschiedenen Stadien und führen Sie eine RNA-Extraktion durch (siehe Schritt 3.2).
- Bereiten Sie die cDNA-Bibliotheken vor, führen Sie eine tiefe Sequenzierung und Datenanalyse gemäß dem in Wang et al.8beschriebenen Protokoll durch.
- Führen Sie die GO-Analyse (Gene Ontology) mit dem R-Paket clusterProfiler durch.
- Durchflusszytometrie
- Sammeln Sie ES-Zellen, indem Sie die Schritte 1.6-1.7 ausführen und die Zellen in Medium resuspendieren. Sammle die EBs und NPCs, indem du Schritt 2.4 befolgest, und resuspendiere die Zellen in Medium.
- Filtern Sie die Zellsuspension mit dem 40 μm Nylon-Zellsieb in ein neues 15 mL konisches Rohr.
- Messen Sie das GFP-Signal der Proben mit dem Durchflusszytometer (durchgeführt von der Core Facility der Institution).
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Representative Results
Als Darstellung unserer Methode führten wir ein EB-, NPC- und Neuronendifferenzierungsexperiment an E14-Zellen durch. E14-Zellen wurden auf γ-bestrahlten MEFs kultiviert (Abbildung 1A), bis die γ-bestrahlte MEF-Population verdünnt war. Wir bestätigten die Pluripotenz der E14-Zellen durch alkalische Phosphatase (AP) Färbung (Abbildung 1B) und später RT-qPCR (siehe unten) für Nanog- und Oct4-Marker. Die γ-bestrahlten MEF-freien E14-Zellen wurden dann unter Verwendung des in Abbildung 2Adargestellten Protokolls zur Differenzierung induziert. Kurz gesagt, Differenzierungsmedientröpfchen von 20 μL, die 500 Zellen enthielten, wurden auf den Deckel der Kulturplatte gesät (siehe Protokollabschnitt 2 für Details). Die gebildeten EBs wurden dann gesammelt und in frische Differenzierungsmedien suspendiert. Von Tag 4 bis Tag 8 der Differenzierung wurden den Kulturplatten 5 μM RA zugesetzt, um NPCs zu induzieren. Differenzierte EBs zeigten eine runde Form und ihre Größe nahm während der Differenzierung weiter zu (Abbildung 2B). An Tag 8 wurden die NPCs geerntet und trypsinisiert, und dann wurde die resultierende Einzelzellsuspension in einer Gewebekulturkammer in DMEM / F12-Medium mit N2-Präparat und später in B27-Präparat plattiert. Am Tag 10 scheinen NPCs, die sich in Neuronen unterscheiden, eine längliche Zellform zu haben (Abbildung 2B).
Um unser Differenzierungsexperiment weiter zu bewerten, führten wir Immunfluoreszenzexperimente (IF) an E14-NPCs an Tag 8 und E14-Neuronen an Tag 12 durch. Wir beobachteten eine positive Färbung für Nestin in NPCs und neurofilament (NF) Signal für Neuronen (Abbildung 3A). Alternativ bestätigten RT-qPCR und RNA-seq die Induktion von NPC-Markergenen und den Verlust von Pluripotenzgenen in NPCs (Abbildung 3B,D,F). Als quantitative Methode zum Testen des Erfolgs der ESC-Differenzierung differenzierten wir eine Maus-ESC-Linie, die einen Sox1-Promotor-gesteuerten GFP-Reporter9exprimierte, gefolgt von einer Durchflusszytometrie-Analyse an ESCs und NPCs. Wir fanden heraus, dass 58,7% der gesamten Zellen im NPC-Stadium GFP-positiv sind, während das GFP-Signal im ESC-Stadium 0,0% beträgt (Abbildung 3C). Um die transkriptomischen Veränderungen während der Differenzierung zu profilieren, wurden RNA-seq-Experimente für E14 ESCs, EB Tag 3 und NPC Tag 8 durchgeführt und zeigten Gencluster, die mit den jeweiligen Stadien assoziiert sind (Abbildung 3D). Die Gene in der RNA-seq-Heatmap wurden basierend auf ihren Expressionsniveaus sortiert, um differentiell exprimierte Gene in den verschiedenen Stadien während der Differenzierung zu identifizieren. Die Analyse der Genontologie (GO) für die vier Gencluster zeigte, dass diese Cluster unterschiedlichen zellulären Funktionen oder Signalwegen entsprechen, was darauf hindeutet, dass die drei Zellstadien der neuronalen mESC-Differenzierung jeweils eine Gruppe von Genen aufweisen, die in ihrem jeweiligen Stadium stark exprimiert werden, andere jedoch nicht (Abbildung 3E). Zum Beispiel sind Gene in Cluster 3 in E14-NPCs im Vergleich zu anderen Stadien stark exprimiert und entsprechen Signalwegen, die mit der neuronalen Entwicklung zusammenhängen. Die Cluster 1, 2 und 4 enthalten keine hochexprimierten Gene, die sich auf Spezifikationen der Keimschichtlinie beziehen, aber sie beziehen sich auf das Wachstum und die Proliferation von Zellen. So zeigten die RNA-seq und die begleitende GO-Analyse, dass sich die E14-Zellen bis zum Tag 8 der Differenzierung in die neuronale Linie differenziert haben.
Abbildung 1: E14 ESS-Zellen in der Kultur. (A) Die Lichtmikroskopbilder zeigen E14-Zellen (schwarzer Pfeil), die in Kolonien auf den γ bestrahlten MEFs wachsen. E14-Kolonien vermehren sich weiter, wie der Größenunterschied der Kolonie zwischen Den Kulturen von Tag 1 und Tag 3 zeigt. (B) Bestätigung der Pluripotenz von E14 ES-Zellen durch die alkalische Phosphatase (AP)-Färbung. Violette Pfeile zeigen die mESCs an, die positiv auf AP-Färbung waren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: E14-Differenzierung in EBs, NPCs und Neuronen. (A) Der Schaltplan fasst die wichtigsten Schritte zur Differenzierung von E14-Zellen in EBs, NPCs und Neuronen zusammen. (B) E14 ES-Zellen, die in Medium ohne LIF kultiviert werden, und 2i in einer Suspensionsplatte bilden einzelne Kugeln von EBs, die am Tag 2 sichtbar sind, wo sie in den folgenden Tagen weiter wachsen und sich in ihrer Größe ausdehnen. RA wird am Tag 4 der Differenzierung hinzugefügt, um die Differenzierung in NPCs zu induzieren. Nach 4 Tagen Induktion werden diese NPCs zur Differenzierung in Neuronen plattiert, die im unteren Bereich dargestellt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Charakterisierung differenzierter Zellen. (A) Immunfluoreszenzbilder im oberen Bereich zeigen NPC-haltige EBs am Tag 8, die auf Nestin (grün) und Kerne (DAPI, blau) untersucht werden. Das untere Feld zeigt Immunfluoreszenzbilder für Neuronen an Tag 12, die auf Neurofilament untersucht wurden (grün). Das rote Kästchen in den zusammengeführten Bildern wird zur besseren Ansicht 3x vergrößert. (B) RT-qPCR-Analyse, die die Pluripotenzmarker (Nanog und Oct4) und NPC-Marker (Pax6, NeuroD1und Nes) von E14 ESCs und NPCs zeigt. Fehlerbalken sind mittelmäßig ± SD. (C) E14-Zellen, die einen Sox1-Promotor-gesteuerten GFP-Reporter exprimieren, wurden in NPCs differenziert. Sowohl die ES-Zellen als auch die NPCs an Tag 8 wurden für ein positives GFP-Fluoreszenzsignal mit Durchflusszytometrie quantifiziert. (D) Die Heatmap zeigt die Z-Scores für die ermittelte FPKM der Gene, die in den Stufen ESC, EB und NPC exprimiert werden. Es wurden vier verschiedene Gencluster identifiziert, die Gruppen von Genen bezeichnen, die entweder im ESC-, EB- oder NPC-Stadium differentiell exprimiert werden. DieGO-Analyse wurde unter Verwendung des R-Pakets clusterProfiler an den vier in der RNA-seq identifizierten Clustern durchgeführt. (F) Die Grafik zeigt die FPKM-Werte für drei weitere Pluripotenzmarker, Sox2, Klf4und Myc , sowie neuronale Marker, NeuN, Map2und Tubb3 für E14-Zellen an den Stufen ESC, EB Tag 3 und NPC Tag 8. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Methode zur neuronalen Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus ist seit Jahrzehnten etabliert, und die Forscher haben die vorherigen Protokolle weiter modifiziert oder neue für verschiedene Zwecke geschaffen7,10,11. Wir verwendeten eine Reihe von Assays, um die Effizienz und den Fortschritt der Differenzierungsstufen von mESCs zu Neuronen umfassend zu analysieren, die bei der Analyse anderer Abstammungsdifferenzierungen von Maus- oder menschlichen ESCs verwendet werden können. Darüber hinaus haben sich unsere Ansätze als nützliche Werkzeuge erwiesen, um den Einfluss bestimmter Gene oder Signalwege auf die neuronale Differenzierung in vitro zu bewerten8.
Mit unseren Methoden binden sich pluripotente ungebundene ESCs, die mit Retinsäure (RA) behandelt werden, mit hoher Effizienz in die neuronale Linie ein und werden weiter zur Erzeugung von Neuronen induziert7. Um die erfolgreiche Differenzierung von ES-Zellen in Nervenzellen zu verbessern und die Heterogenität zu reduzieren, ist es wichtig, die ES-Zellen in einem undifferenzierten Zustand zu halten12. Nichtproliferative MEF, die mit γ-Bestrahlung oder Mitomycin C behandelt werden, haben die Funktion, die Pluripotenz der WSR aufrechtzuerhalten und ein Gerüst für ihr Wachstum zu schaffen13,14. Um konsistente Ergebnisse zu erhalten, starten wir jedes Differenzierungsexperiment mit mESCs, die auf γ-bestrahlten MEFs kultiviert wurden. Nach einigen Passagen sterben die γ-bestrahlten MEFs ab und die Kultur wird schließlich homogen für mESC-Zellen. Alternativ können die mESCs für ca. 45 min auf Gelatine vorbeschichtet werden, bevor γ-bestrahlte MEFs ausgesät werden, um sie bei der nächsten Passage besser zu entfernen. Der Leukämie-inhibitorische Faktor (LIF) wird seit langem verwendet, um den Pluripotenzzustand von kultivierten Maus-ES-Zellen durch Aktivierung des JAK/STAT-Signalwegs aufrechtzuerhalten15,16,17. In jüngerer Zeit wurde festgestellt, dass PD0325901 (PD, ein MEK-Inhibitor) und CHIR99021 (CH, ein GSK-Inhibitor) eine zusätzliche Pluripotenzerhaltung der ES-Zellenermöglichen 3,18. In unserem Protokoll kultivieren wir mESCs mit diesen Inhibitoren zusammen mit LIF, um eine hohe Pluripotenz von mES-Zellen aufrechtzuerhalten.
Ein weiterer kritischer Faktor für eine erfolgreiche Differenzierung ist die Qualität der EBs. Wir führen die Differenzierung von E14-Zellen durch die Hängetropfenmethode durch, die von anderen Forschern5,19,20angewendet wurde. Bei dieser Methode können einzelne ES-Zellen 2 Tage lang im Differenzierungsmedium Tröpfchen suspendieren, wo sie sich spontan aggregieren und EBs bilden. Die resultierenden EBs sind in bezug auf ihre Morphologie typischerweise besser definiert (Abbildung 2B) im Vergleich zur Methode der Suspendierung isolierter mES-Zellen im Medium, was nach unserer Erfahrung zu EB-Größen in einem viel breiteren Bereich führt (Daten nicht gezeigt). Um zu verhindern, dass sich EBs an den Platten anheften, ist es wichtig, ab Tag 3 eine Rotation mit niedriger Geschwindigkeit durchzuführen und den Differenzierungsprozess fortzusetzen. Die EBs werden dazu gebracht, sich in NPCs zu differenzieren, indem sie mit RA behandelt werden. Die resultierenden NPCs aus der RA-Behandlung am EB-Tag 4 sind typischerweise heterogen für Nervenzellen wie Oligodendrozyten und Astrozyten21. Mit RT-qPCR oder Immunfluoreszenz kann die NPC-Population auf Neuronen und andere neuronale Linienmarker wie Gfap für Astrozyten und Olig2 für Oligodendrozyten untersucht werden. Um die Differenzierung von NPCs in Neuronen weiter zu induzieren, werden die NPCs in optimalem Neuronenmedium kultiviert, wobei die wichtigsten Komponenten die N2- und B27-Ergänzungen sind. Das N2-Supplement dient hauptsächlich dazu, den NPCs zu helfen, sich auf die neuronale Linie festzulegen, während das B27-Supplement die Langlebigkeit der Neuronen aufrechterhält.
Die Proben können über den Differenzierungszeitraum (z. B. ESC-Stadium, EB-Tag 2, EB-Tag 4, NPC-Tag 6, NPC-Tag 8, Neuronen Tag 10 und Neuronen Tag 12) gesammelt werden, um den Differenzierungsprozess zu verfolgen, indem RT-qPCR für Pluripotenz- und Ektodermmarker durchgeführt wird. Der Vergleich der Pluripotenzmarker wie Oct4, Nanog, Sox2, Klf4und Myc zwischen den verschiedenen Zellstadien wird die Pluripotenz der mESCs überprüfen (Abbildung 3B, F). Um die Effizienz der neuronalen Differenzierung zu untersuchen, wurden Marker für die Mesodermschicht wie Hand1, Snai1und Tbxt; und Endodermschichten wie Eomes und Gata4 können ebenfalls untersucht werden (Daten nicht gezeigt). Eine weitere Verifizierung kann mit Immunfluoreszenz (IF) -Sondierung auf NPC oder neuronale Marker durchgeführt werden (Abbildung 3A). Diese Methoden sind jedoch nicht quantitativ und auf die ausgewählten Marker ausgerichtet. Um diese Einschränkungen zu überwinden, integrieren wir Durchflusszytometrie und RNA-seq-Analysen (Abbildung 3C\u2012F). Die im Durchflusszytometrie-Experiment verwendete Zelllinie ist eine Sox1-GFP E14-Zelllinie, die speziell in diesem Experiment verwendet wurde, um die Qualität des NPC-Differenzierungsverfahrens zu beurteilen. Sox1 ist einer der frühesten spezifischen neuronalen Marker während der Neuroektodermenentwicklung22 und damit ein ausgezeichneter Marker für die NPC-Linie. Sox1 kann für die Verwendung von RT-qPCR oder Western Blot zur Bewertung der NPC-Population untersucht werden. Diese Analysen sind besonders vorteilhaft, um den Differenzierungsdefekt zu untersuchen, der durch Genmanipulation oder chemische Behandlung verursacht wird.
Es ist wichtig zu beachten, dass es einige Einschränkungen für unser hier vorgestelltes Protokoll gibt. Zunächst einmal stellen wir nur die umfassende Analyse für eine Wildtyp-mESC-Zelllinie vor. Andere ESC-Linien, die von Mäusen oder Menschen stammen, erfordern möglicherweise Änderungen und weitere Optimierungen im Protokoll, um eine erfolgreiche und effiziente Neuronendifferenzierung zu gewährleisten. Zweitens stellen wir eine In-vitro-Neuronendifferenzierungsmethode vor, die natürlich ihre eigenen Einschränkungen aufweist. Wie bereits erwähnt, werden EBs mit einem supraphysiologischen RA-Niveau behandelt, um sie in Richtung der NPC-Linie zu treiben. Die resultierenden NPCs werden dann in neuronenoptimale Medien platziert, um die physiologischen Bedingungen nachzuahmen und das Engagement, das Wachstum und die Langlebigkeit der Neuronenlinie zu fördern. Hier werden N2- und B27-Ergänzungen verwendet, um Neuronen zu kultivieren, aber auch andere Ergänzungen wie NS2123 für ähnliche Zwecke sind verfügbar, was den Erfolg und die Effizienz der Neuronendifferenzierung verändern kann. Diese Bedingungen werden in den Zellkulturassays synthetisch rekonstituiert, die physiologische Bedingungen möglicherweise nicht vollständig darstellen. Die Qualität der EBs, NPCs und Neuronen hängt stark von den startenden mESCs ab. mESCs, die zu oft durchlaufen und länger als 1 Woche in Kultur gehalten wurden, beginnen typischerweise an Pluripotenz zu verlieren und werden möglicherweise nicht erfolgreich differenziert. Daher ist die Aufrechterhaltung der mESCs in einem optimalen Zustand der Schlüssel, um sicherzustellen, dass sie sich effektiv in EBs, NPCs und Neuronen differenzieren können. Andere Neuronenkulturmethoden wie 3D-Modelle wurden ebenfalls vorgeschlagen, um die physiologischenBedingungen 24,25,26 besser nachzuahmen, manchmal auf Kosten des Durchsatzes und der Machbarkeit27, 28. Wir glauben, dass unsere Protokolle nützlich sind, um diese 3D-Kulturmodelle zu charakterisieren.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden finanziellen Interessen gibt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des NIH (1R35GM133496-01) an Z. Gao unterstützt. Wir danken Dr. Ryan Hobbs für die Unterstützung bei der Sektionierung. Wir danken den Kerneinrichtungen des Penn State College of Medicine, einschließlich der Genomwissenschaften und Bioinformatik, der Advanced Light Microscopy Imaging und der Durchflusszytometrie. Wir danken auch Dr. Yuka Imamura für die Unterstützung bei der RNA-seq-Analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
| 40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
| m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
| MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
| mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
| mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
| mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
| - Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
| - Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
| - Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| - Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
| Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
| TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
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