Summary
Descriviamo la procedura per la differenziazione in vitro di cellule staminali embrionali di topo in cellule neuronali utilizzando il metodo della goccia sospesa. Inoltre, eseguiamo un'analisi fenotipica completa attraverso RT-qPCR, immunofluorescenza, RNA-seq e citometria a flusso.
Abstract
Descriviamo la procedura passo-passo per la coltura e la differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in lignaggi neuronali, seguita da una serie di saggi per caratterizzare le cellule differenziate. Le cellule staminali embrionali di topo E14 sono state utilizzate per formare corpi embrioidi attraverso il metodo della goccia sospesa, e poi indotte a differenziarsi in cellule progenitrici neurali dall'acido retinoico e infine differenziate in neuroni. La reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (RT-qPCR) e gli esperimenti di immunofluorescenza hanno rivelato che i progenitori neurali e i neuroni mostrano marcatori corrispondenti (nestina per i progenitori neurali e neurofilamento per i neuroni) rispettivamente al giorno 8 e 12 post-differenziazione. Esperimenti di citometria a flusso su una linea E14 che esprime un reporter GFP guidato dal promotore Sox1 hanno mostrato che circa il 60% delle cellule al giorno 8 sono GFP positive, indicando la differenziazione di successo delle cellule progenitrici neurali in questa fase. Infine, l'analisi RNA-seq è stata utilizzata per profilare i cambiamenti trascrittomici globali. Questi metodi sono utili per analizzare il coinvolgimento di geni e percorsi specifici nella regolazione della transizione dell'identità cellulare durante la differenziazione neuronale.
Introduction
Fin dalla loro prima derivazione dalla massa cellulare interna delle blastocisti di topo in via di sviluppo1,2,le cellule staminali embrionali di topo (mESC) sono state utilizzate come potenti strumenti per studiare l'auto-rinnovamento e la differenziazione delle cellule staminali3. Inoltre, lo studio della differenziazione mESC porta a un'enorme comprensione dei meccanismi molecolari che possono migliorare l'efficienza e la sicurezza nella terapia basata sulle cellule staminali nel trattamento di malattie come i disturbi neurodegenerativi4. Rispetto ai modelli animali, questo sistema in vitro offre molti vantaggi, tra cui semplicità nella pratica e nella valutazione, basso costo nel mantenimento delle linee cellulari in contrasto con gli animali e relativa facilità nelle manipolazioni genetiche. Tuttavia, l'efficienza e la qualità dei tipi di cellule differenziate sono spesso influenzate da diverse linee di mESC e dai metodi di differenziazione5,6. Inoltre, i saggi tradizionali per valutare l'efficienza della differenziazione si basano sull'esame qualitativo di geni marcatori selezionati che mancano di robustezza e quindi non riescono a cogliere i cambiamenti globali nell'espressione genica.
Qui miriamo a utilizzare una batteria di saggi per la valutazione sistematica della differenziazione neuronale. Utilizzando sia le tradizionali analisi in vitro su marcatori selezionati che l'RNA-seq, stabiliamo una piattaforma per la misurazione dell'efficienza di differenziazione e dei cambiamenti trascrittomici durante questo processo. Sulla base di un protocollo precedentemente stabilito7,abbiamo generato corpi embrioidi (EB) attraverso la tecnica della goccia sospesa, seguita dall'induzione utilizzando la quantità soprafisiologica di acido retinoico (RA) per generare cellule progenitrici neurali (NPC), che sono state successivamente differenziate in neuroni con mezzo di induzione neurale. Per esaminare l'efficienza del differenziamento, oltre ai tradizionali test RT-qPCR e immunofluorescenza (IF), abbiamo eseguito RNA-seq e citometria a flusso. Queste analisi forniscono una misurazione completa della progressione della differenziazione specifica dello stadio.
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Protocol
1. Cultura mESC
- Rivestire una piastra di 10 cm trattata con coltura tissutale con lo 0,1% di gelatina e lasciare riposare la gelatina per almeno 15-30 minuti prima di aspirarla.
- I fibroblasti embrionali di topo (MEF) irradiati γ un giorno prima di coltivare le mESC nel mezzo mESC preriscaldato (Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) with 15% fetale bovine serum (FBS), aminoacidi non essenziali, β-mercaptoetanolo, L-glutammina, penicillina/streptomicina, piruvato di sodio, LIF, PD0325901 (PD) e Chir99021 (CH)).
- Consentire ai MEF irradiati γ di depositarsi e attaccarsi alla superficie della piastra prima di coltivare le cellule E14.
- Scongelare gli ESC E14 a bagnomaria a 37 °C e trasferire rapidamente le celle in un tubo conico di 15 cm con mezzo caldo mESC. Pellet le celle a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.
- Risospese le cellule in 10 mL di terreno mESC e placcare le cellule sulla piastra di coltura contenente i MEF irradiati γ seminati in precedenza. Incubare la coltura cellulare in un incubatore a 37 °C sotto il 5% di CO2.
- Per il passaggio in coltura, aspirare il mezzo e lavare la piastra con 1x PBS sterile. Aggiungere abbastanza 0,05% di tripsina per coprire la superficie della piastra e incubare a 37 °C per 3 minuti.
- Neutralizzare la tripsina con mezzo mESC e pipetta per generare sospensione monocellulare. Centrifugare le cellule a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.
- Contare le cellule con un emocitometro o un contatore cellulare e seminare circa 5,0 x 105 cellule in una piastra di coltura di 10 cm.
- Risospese le cellule in 10 mL di mezzo mESC, placcare le cellule sulla piastra di coltura tissutale rivestita di gelatina e incubare le colture come descritto in precedenza.
NOTA: Si raccomanda di passare le mESC ogni 2 giorni per evitare che le cellule si differenzino nelle loro colonie. Il rosso fenolo nel mezzo funziona esclusivamente come indicatore di pH e, a seconda della densità cellulare, può diventare giallastro (più acido), prima di 2 giorni. Quindi, potrebbe essere necessario cambiare il mezzo ogni giorno. I MEF irradiati γ alla fine moriranno dopo un paio di passaggi.
2. Differenziazione di EB, NPC e neuroni
- Eseguire il protocollo di passaggio di coltura menzionato in precedenza e contare le cellule (passaggi 1.7-1.10).
- Metodo di goccia sospesa (giorno 0)
- Per una piastra di coltura cellulare di 10 cm, contare circa 2,5 x 104 cellule in cui 5,0 x 102 cellule saranno sospese in un mezzo di differenziazione da 20 μL (DMEM con 15% FBS, aminoacidi non essenziali, β-mercaptoetanolo, L-glutammina, penicillina / streptomicina e piruvato di sodio). Circa cinquanta goccioline da 20 μL contenenti le cellule possono essere placcate su una piastra da 10 cm.
- Aliquotare il numero appropriato di cellule, quindi centrifugare le cellule a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.
- Risospese le cellule nel volume appropriato del mezzo di differenziazione per una densità cellulare di 5,0 x 102 cellule per 20 μL (ad esempio, 2,5 x 104 cellule in 1 mL di mezzo di differenziazione).
- Utilizzando una micropipetta o una pipetta ripetitore, posizionare 20 μL di goccioline della sospensione cellulare sul coperchio della piastra di coltura tissutale. Assicurati che le goccioline non siano troppo vicine l'una all'altra per impedire loro di fondersi.
NOTA: le goccioline possono essere placcate su una piastra di fissaggio trattata con coltura di tessuto o su una piastra di sospensione in quanto verranno posizionate sul coperchio e non sulla piastra stessa. Per un approccio più fattibile e sterile, piallare le goccioline su una piastra di coltura tissutale di attacco e trasferirle su una piastra di sospensione come descritto di seguito. - Riempire la piastra con 5-10 ml di 1x PBS e rimettere con cura il coperchio sulla piastra. Incubare la coltura nell'incubatore a 37 °C.
NOTA: PBS viene aggiunto alla piastra di coltura per evitare che le goccioline si secchino.
- Il giorno 2,utilizzare una micropipetta per raccogliere le goccioline dal coperchio e metterle in una piastra di sospensione per colture cellulari di 10 cm riempita con 10 ml di mezzo di differenziazione. Incubare la coltura su uno shaker orbitale che scuote a bassa velocità nell'incubatore.
- Il giorno 4,per raccogliere gli EB, raccogliere le cellule, centrifugare a 200 x g per 3 min e rimuovere il surnatante.
NOTA: Gli EB possono anche essere lavati con 1x PBS secondo i requisiti degli esperimenti successivi. - Per continuare la procedura e indurre la differenziazione EB in cellule progenitrici neurali (NPC), preparare il mezzo di differenziazione con acido retinoico (RA) da 5 μM.
- Rimuovere il vecchio mezzo pellettizzando gli EB a 100 x g per 3 minuti o lasciare che gli EB si depositino prima di aspirare il vecchio mezzo. Aggiungere 10 ml del mezzo di differenziazione contenente 5 μM RA alla piastra di coltura.
- Il giorno 6, sostituire almeno la metà del mezzo con un mezzo fresco contenente 5 μM RA inclinando la piastra e pipettando il mezzo come descritto sopra.
NOTA: Si raccomanda di sostituire almeno la metà del mezzo con un mezzo fresco contenente RA nei giorni 5 e 7. Prendi nota dell'indicatore rosso fenolo; se diventa giallastro, è meglio sostituire tutto il mezzo. - Il giorno 8,raccogli gli NPC raccogliendo le cellule, centrifugando a 200 x g per 3 minuti e rimuovendo il surnatante.
NOTA: Gli NPC possono anche essere lavati con 1x PBS in base alle esigenze degli esperimenti successivi. Se necessario, gli NPC possono essere congelati e scongelati di nuovo per una successiva coltura e analisi. Se gli NPC devono essere coltivati, l'accutasi può anche essere usato come alternativa alla tripsina. - Per continuare la procedura e differenziare gli NPC in neuroni, raccogliere gli NPC in un tubo conico da 15 ml mediante centrifugazione, dissociarli con tripsina e incubarli a 37 °C per 3 min. Pipettare gli NPC per garantire che tutti gli aggregati NPC siano dissociati e neutralizzare la tripsina con il mezzo.
- Filtrare le cellule con un colino di cellule di nylon da 40 μm e contare le cellule prima di placcarle ad una densità di 1,5 x10 5/cm2 in mezzo N2 (DMEM/F12 medio + 3 mg/mL di glucosio + 3 mg/mL di albumina sierica bovina ricca di lipidi (LBSA) + supplemento di 1:100 N2 + 10 ng/mL bFGF + 50 U/mL penna/streptococco + 1 mM di L-glutammina) su una piastra trattata con colture tissutali per successivi esperimenti di PCR e western blot; o su una camera di coltura tissutale per esperimenti di immunofluorescenza.
- Il giorno 9, sostituire il vecchio mezzo con un mezzo N2 fresco.
- Il giorno 10,cambiare il mezzo N2 con il mezzo N2 / B27 (50% DMEM / F12 e 50% basale neurale, 3 mg / mL LBA, 1: 200 N2 supplemento, 1: 100 B27 supplemento, 50 U / mL penna / streptococco e 1 mM L-glutammina).
- Nei giorni 11-12, raccogliere i neuroni come segue. Lavare le cellule con 1x PBS, aggiungere tripsina e incubare la coltura nell'incubatore a 37 °C per 3 minuti prima di neutralizzare la tripsina con mezzo e centrifugare a 200 x g per 3 min.
3. Caratterizzazione di mESC e cellule differenziate
- Saggio della fosfatasi alcalina (AP)
- Utilizzare un kit per valutare l'attività della fosfatasi alcalina (vedere la Tabella dei materiali).
- Rimuovere il mezzo dalla piastra di coltura e lavare gli ESC con 1x PBS.
- Aggiungere 1 mL della soluzione fissa (composta da formaldeide e metanolo) fornita con il kit alla piastra e incubarla a temperatura ambiente per 2-5 minuti.
NOTA: l'eccessiva incubazione nella soluzione di correzione può compromettere l'attività pa. - Rimuovere la soluzione fissa, lavare gli ESC con 1x PBS e lasciare una certa quantità di PBS nella piastra.
NOTA: mantenere le ESC umide in PBS per non compromettere l'attività AP. - Preparare la soluzione AP mescolando le soluzioni di substrato A, B e C con un rapporto 1:1:1. Mescolare prima le soluzioni A e B e incubare la miscela a temperatura ambiente per 2 minuti prima di aggiungere la soluzione C.
- Rimuovere il PBS 1x e aggiungere la soluzione AP preparata in precedenza.
- Incubare gli ESC per circa 15 minuti al buio avvolgendo la piastra di coltura con un foglio di alluminio o eseguendo il passaggio 3.5 in una stanza buia.
- Monitorare la reazione e rimuovere la soluzione di reazione quando la soluzione diventa luminosa per evitare macchie non specifiche.
- Lavare gli ESC due volte con 1x PBS.
- Evitare che il campione si asciughi coprendo gli ESC con 1x PBS o mezzo di montaggio.
NOTA: per l'espressione AP verrà visualizzata una macchia rossa o viola. La piastra può essere conservata in frigorifero a 4 °C.
- RT-qPCR
- Raccogliere le cellule in varie fasi seguendo i passaggi 1.6-1.7 e 2.4 rispettivamente per ESC ed EB e NPC.
- Isolare l'RNA utilizzando RNA, DNA e soluzione di estrazione proteica (vedere Tabella dei materiali).
- Genera cDNA con un kit di trascrittasi inversa (vedi la Tabella dei materiali)e segui il manuale del produttore.
- Fissazione e incorporamento
- Raccogliere EB e NPC come descritto sopra (fase 2.6) e fissarli con una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% in 1x PBS per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il PFA e lavare il campione con 1x PBS per 5 minuti.
- Posizionare il campione in una diluizione seriale di 1s PBS, 10%, 20% e 30% di saccarosio a 25\u201228 °C, dove il campione viene trasferito alla soluzione successiva dopo 30 minuti di incubazione.
NOTA: Il campione può essere conservato nella soluzione di saccarosio al 30% a 4 °C prima di continuare con la fase di incorporamento. - Bagnare la punta della pipetta con soluzione di saccarosio prima di posizionare il campione (senza impilarli) al centro del criostampo e pipettare il liquido in eccesso.
NOTA: la carta da filtro può essere utilizzata anche per rimuovere la soluzione in eccesso. Bagnare la punta della pipetta con una soluzione di saccarosio è importante per evitare che gli EB e gli NPC si attacchino alle pareti della punta. - Aggiungere con attenzione la soluzione a temperatura di taglio ottimale (OCT) allo stampo senza sospescere nuovamente i campioni e rimuovere le bolle in eccesso con una pipetta.
- Posizionare lo stampo con il campione su un miscelatore da laboratorio a bassa velocità per agitare leggermente il campione per 15 minuti. Questo aiuta a sistemare gli EB e gli NPC verso il basso se vengono risospesi nella soluzione OCT.
- Congelare rapidamente il campione posizionando lo stampo in azoto liquido o su ghiaccio secco.
NOTA: i campioni possono essere conservati in un congelatore a -70 °C prima di passare al passaggio successivo.
- Criosezione
- Impostare il criostato in modo che si raffreddi a -20--18 °C prima di trasferire il campione allo strumento.
- Staccare il blocco OCT congelato dallo stampo e fissarlo sul supporto con una piccola soluzione OCT posizionata sulla superficie del supporto.
- Allineare il blocco dello Strumento di personalizzazione di Office in modo che gli NB e gli NPC siano più vicini al pannello per garantire che il campione non vada perso durante il sezionamento.
- Sezionare con attenzione 10 μm del blocco e prestare molta attenzione alle fette che contengono il campione.
- Posizionare rapidamente la fetta OCT contenente il campione sul vetrino di vetro che incorpora il tessuto e lasciare asciugare all'aria le fette OCT per 1 ora a temperatura ambiente.
NOTA: I campioni possono essere conservati a -70 °C per un uso successivo.
- Immunofluorescenza (IF)
- Blocca sezioni OCT o camere di coltura contenenti neuroni in 10% di siero d'asino normale / 0,1% Triton X-100 in 1x PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
- Incubare i campioni in anticorpi primari diluiti in siero d'asino normale al 5% e Triton X-100 allo 0,05% in 1x PBS durante la notte a 4 °C.
- Lavare i campioni in 1x PBS/0,1% Triton X-100 tre volte per 5 minuti ogni lavaggio.
- Incubare i campioni con anticorpi secondari diluiti in siero d'asino normale al 5% / Triton X-100 allo 0,05% in 1x PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare i campioni in 1x PBS/0,1% Triton X-100 tre volte per 5 minuti ogni lavaggio, quindi incubare i campioni in 1 μg/mL DAPI.
- Montare i campioni con un coperchio e un mezzo di montaggio e lasciarlo asciugare.
- Osservare i campioni al microscopio a fluorescenza.
- Analisi RNA-seq
- Raccogliere le cellule in varie fasi ed eseguire l'estrazione dell'RNA (vedere il passaggio 3.2).
- Preparare le librerie di cDNA, eseguire il sequenziamento profondo e l'analisi dei dati secondo il protocollo descritto in Wang et al.8.
- Eseguire l'analisi gene ontology (GO) utilizzando il pacchetto R, clusterProfiler.
- Citometria a flusso
- Raccogliere le ESC seguendo i passaggi 1.6-1.7 e risospensionare le celle nel mezzo. Raccogliere gli EB e gli NPC seguendo il passaggio 2.4 e risospensionare le cellule nel mezzo.
- Filtrare la sospensione cellulare utilizzando il filtro per celle di nylon da 40 μm in un nuovo tubo conico da 15 ml.
- Misurare il segnale GFP dei campioni utilizzando il citometro a flusso (eseguito dalla struttura principale dell'istituzione).
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Representative Results
Come rappresentazione del nostro metodo, abbiamo eseguito un esperimento di differenziazione EB, NPC e neuroni su cellule E14. Le cellule E14 sono state coltivate su MEF irradiati γ (Figura 1A) fino a quando la popolazione meF irradiata γ non si è diluita. Abbiamo confermato la pluripotenza delle cellule E14 eseguendo la colorazione della fosfatasi alcalina (AP)(Figura 1B)e successivamente RT-qPCR (vedi sotto) per i marcatori Nanog e Oct4. Le cellule E14 prive di MEF irradiate γ sono state quindi indotte per la differenziazione utilizzando il protocollo delineato nella Figura 2A. In breve, goccioline di mezzi di differenziazione di 20 μL contenenti 500 cellule sono state seminate sul coperchio della piastra di coltura (vedere il protocollo sezione 2 per i dettagli). Gli EB formati sono stati quindi raccolti e messi in sospensione in nuovi mezzi di differenziazione. Dal giorno 4 al giorno 8 di differenziazione, 5 μM RA sono stati aggiunti alle piastre di coltura per indurre NPC. Gli EB differenziati hanno mostrato una forma rotonda e le loro dimensioni hanno continuato ad aumentare durante la differenziazione (Figura 2B). Al giorno 8, gli NPC sono stati raccolti e tripsinizzati, e quindi la sospensione monocellulare risultante è stata placcata in una camera di coltura tissutale in mezzo DMEM / F12 con supplemento N2 e successivamente in supplemento B27. Al giorno 10, gli NPC che si differenziano in neuroni sembrano avere una forma a cellule allungate (Figura 2B).
Per valutare ulteriormente il nostro esperimento di differenziazione, abbiamo eseguito esperimenti di immunofluorescenza (IF) su NPC E14 al giorno 8 e neuroni E14 al giorno 12. Abbiamo osservato una colorazione positiva per la nestin nelle NPC e il segnale del neurofilamento (NF) per i neuroni (Figura 3A). In alternativa, RT-qPCR e RNA-seq hanno confermato l'induzione di geni marcatori NPC e la perdita di geni pluripotenza negli NPC (Figura 3B,D,F). Come metodo quantitativo per testare il successo della differenziazione ESC, abbiamo differenziato una linea ESC di topo che esprime un reporter GFP9guidato dal promotore Sox1, seguito da un'analisi citometrica a flusso su ESC e NPC. Abbiamo scoperto che il 58,7% delle cellule totali allo stadio NPC sono GFP-positive mentre il segnale GFP è dello 0,0% allo stadio ESC (Figura 3C). Per profilare i cambiamenti trascrittomici durante la differenziazione, sono stati eseguiti esperimenti RNA-seq per ESC E14, EB giorno 3 e NPC giorno 8 e hanno rivelato cluster genici associati ai rispettivi stadi (Figura 3D). I geni nella mappa di calore RNA-seq sono stati ordinati in base ai loro livelli di espressione per identificare i geni differenzialmente espressi nelle diverse fasi durante la differenziazione. L'analisi dell'ontologia genica (GO) per i quattro cluster di geni ha mostrato che questi cluster corrispondono a funzioni o percorsi cellulari distinti indicando che i tre stadi cellulari della differenziazione neuronale mESC hanno ciascuno un gruppo di geni che sono altamente espressi nel rispettivo stadio ma non in altri (Figura 3E). Ad esempio, i geni nel Cluster 3 sono altamente espressi negli NPC E14 rispetto ad altri stadi e corrispondono a percorsi legati allo sviluppo neuronale. I cluster 1, 2 e 4 non contengono geni altamente espressi relativi a specifiche di lignaggio dello strato germinale, ma sono correlati alla crescita e alla proliferazione cellulare. Pertanto, l'RNA-seq e l'analisi GO di accompagnamento hanno mostrato che le cellule E14 si sono differenziate nel lignaggio neuronale entro il giorno 8 della differenziazione.
Figura 1: ESC E14 in cultura. (A) Le immagini al microscopio ottico mostrano cellule E14 (freccia nera) che crescono in colonie in cima ai MEF irradiati γ. Le colonie di E14 continuano a proliferare come si vede nella differenza di dimensioni della colonia tra le culture del giorno 1 e del giorno 3. (B) Conferma della pluripotenza delle ESC E14 mediante la colorazione alcalina di fosfatasi (AP). Le frecce viola indicano le mESC che erano positive per la macchia AP. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Differenziazione E14 in EB, NPC e neuroni. (A) Lo schema riassume i principali passaggi per differenziare le cellule E14 in EB, NPC e neuroni. (B) E14 ESC coltivati in terreno senza LIF e 2i in una piastra di sospensione formano singole sfere di EB visibili al giorno 2 dove continuano a crescere ed espandersi di dimensioni nei giorni successivi. L'AR viene aggiunto al giorno 4 della differenziazione per indurre la differenziazione in NPC. Dopo 4 giorni di induzione, questi NPC sono placcati per la differenziazione in neuroni, che sono mostrati nel pannello inferiore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Caratterizzazione di cellule differenziate. (A) Le immagini di immunofluorescenza nel pannello superiore mostrano EB contenenti NPC al giorno 8 sondati per la nestina (verde) e i nuclei (DAPI, blu). Il pannello inferiore mostra immagini di immunofluorescenza per i neuroni al giorno 12 sondati per il neurofilamento (verde). La casella rossa nelle immagini unite viene ingrandita di 3 volte per una migliore visualizzazione. (B) Analisi RT-qPCR che mostra i marcatori di pluripotenza (Nanog e Oct4) e I marcatori NPC (Pax6, NeuroD1e Nes) di ESC e NPC E14. Le barre di errore sono medie ± SD. (C) Le cellule E14 che esprimono un reporter GFP guidato dal promotore Sox1 sono state differenziate in NPC. Sia le ESC che le NPC al giorno 8 sono state quantificate per il segnale fluorescente GFP positivo con citometria a flusso. (D) La mappa di calore mostra gli z-score per il determinato FPKM dei geni espressi negli stadi ESC, EB e NPC. Sono stati identificati quattro distinti cluster di geni che significano gruppi di geni che sono espressi in modo differenziale nello stadio ESC, EB o NPC. (E) L'analisi GO è stata eseguita utilizzando il pacchetto R, clusterProfiler, sui quattro cluster identificati nell'RNA-seq. (F) Il grafico mostra i valori FPKM per altri tre marcatori di pluripotenza, Sox2, Klf4e Myc così come i marcatori neurali, NeuN, Map2e Tubb3 per le cellule E14 agli stadi ESC, EB giorno 3 e NPC giorno 8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo per la differenziazione neurale delle cellule staminali embrionali di topo è stato stabilito per decenni e i ricercatori hanno continuato a modificare i protocolli precedenti o crearne di nuovi per vari scopi7,10,11. Abbiamo utilizzato una serie di saggi per analizzare in modo completo l'efficienza e il progresso delle fasi di differenziazione delle mESC ai neuroni, che possono essere utilizzate nell'analisi di altre differenziazioni di lignaggio di ESC murini o umani. Inoltre, i nostri approcci si sono rivelati strumenti utili per valutare l'impatto di specifici geni o percorsi sul differenziamento neuronale in vitro8.
Con i nostri metodi, le ESC pluripotenti non impegnate trattate con acido retinoico (RA) si impegnano nel lignaggio neurale con un'alta efficienza e sono ulteriormente indotte a generare neuroni7. Per migliorare la differenziazione di successo delle cellule ES in cellule neurali e ridurre l'eterogeneità, è importante mantenere le cellule ES in uno stato indifferenziato12. I MEF non proliferativi, trattati con γ-irradiazione o mitomicina C, funzionano per mantenere la pluripotenza degli ESC e fornire un'impalcatura per la lorocrescita 13,14. Per ottenere risultati coerenti, iniziamo ogni esperimento di differenziazione con mESC coltivate su MEF irradiati γ. Dopo alcuni passaggi, i MEF irradiati γ si estinguono e la coltura alla fine diventa omogenea per le cellule mESC. In alternativa, le MESC possono essere pre-placcate su gelatina per circa 45 minuti prima che i MEF irradiati γ vengano seminati per rimuoverli meglio al passaggio successivo. Il fattore inibitorio della leucemia (LIF) è stato a lungo utilizzato per mantenere lo stato di pluripotenza delle cellule ES di topo in coltura attivando la via JAK/STAT15,16,17. Più recentemente, PD0325901 (PD, un inibitore MEK) e CHIR99021 (CH, un inibitore GSK) sono stati trovati per fornire un ulteriore mantenimento della pluripotenza delle cellule ES3,18. Nel nostro protocollo, coltiviamo mESC con questi inibitori insieme a LIF per mantenere un'elevata pluripotenza di mESC.
Un altro fattore critico per ottenere una differenziazione di successo è la qualità degli EB. Eseguiamo la differenziazione delle cellule E14 con il metodo della goccia sospesa, che è stato applicato da altri investigatori5,19,20. Con questo metodo, le singole cellule ES sono autorizzate a sospendere nella goccia del mezzo di differenziazione per 2 giorni dove si aggregano spontaneamente e formano EB. Gli EB risultanti sono in genere più ben definiti in termini di morfologia (Figura 2B) rispetto al metodo di sospensione delle mESC isolate nel mezzo, il che si traduce in dimensioni EB in un intervallo molto più ampio nella nostra esperienza (dati non mostrati). Per evitare che gli EB si attacchino alle piastre, è importante eseguire una rotazione a bassa velocità a partire dal giorno 3 continuando attraverso il processo di differenziazione. Gli EB sono indotti a differenziarsi in NPC trattandoli con RA. Gli NPC risultanti dal trattamento RA al giorno 4 dell'EB sono tipicamente eterogenei per le cellule neurali come gli oligodendrociti e gli astrociti21. Utilizzando RT-qPCR o immunofluorescenza, la popolazione NPC può essere sondata per neuroni e altri marcatori di lignaggio neurale come Gfap per gli astrociti e Olig2 per gli oligodendrociti. Per indurre ulteriormente la differenziazione degli NPC in neuroni, gli NPC vengono coltivati in un mezzo neuronale ottimale dove i componenti più importanti sono gli integratori N2 e B27. L'integratore N2 funziona principalmente per aiutare gli NPC a impegnarsi nel lignaggio neuronale mentre il supplemento B27 funziona per mantenere la longevità dei neuroni.
I campioni possono essere raccolti durante il periodo di differenziazione (ad esempio, stadio ESC, EB giorno 2, EB giorno 4, NPC giorno 6, NPC giorno 8, neuroni giorno 10 e neuroni giorno 12) per tracciare il processo di differenziazione eseguendo RT-qPCR per marcatori di pluripotenza ed ectoderma. Confrontando i marcatori di pluripotenza come Oct4, Nanog, Sox2, Klf4e Myc tra i diversi stadi cellulari si verificherà la pluripotenza delle mESC(Figura 3B,F). Per studiare l'efficienza della differenziazione neurale, marcatori per lo strato mesoderma come Hand1, Snai1e Tbxt; e lo strato endoderma come Eomes e Gata4 può anche essere sondato (dati non mostrati). Ulteriori verifiche possono essere eseguite con sondaggi di immunofluorescenza (IF) per NPC o marcatori neuronali (Figura 3A). Tuttavia, questi metodi non sono quantitativi e orientati verso i marcatori selezionati. Per superare queste limitazioni, incorporiamo la citometria a flusso e le analisi RNA-seq (Figura 3C\u2012F). La linea cellulare utilizzata nell'esperimento di citometria a flusso è una linea cellulare Sox1-GFP E14, che è stata utilizzata specificamente in questo esperimento per valutare la qualità della procedura di differenziazione NPC. Sox1 è uno dei primi marcatori neuronali specifici durante lo sviluppo del neuroectoderma22, rendendolo quindi un eccellente marcatore per il lignaggio NPC. Sox1 può essere sondato per l'utilizzo di RT-qPCR o Western blot per valutare la popolazione di NPC. Queste analisi sono particolarmente utili per indagare il difetto di differenziazione causato dalla manipolazione genica o dal trattamento chimico.
È importante notare che ci sono alcune limitazioni al nostro protocollo presentate qui. Prima di tutto, stiamo solo presentando l'analisi completa per una linea cellulare mESC wild-type. Altre linee ESC provenienti da topi o esseri umani potrebbero richiedere modifiche e un'ulteriore ottimizzazione del protocollo per garantire una differenziazione neuronale efficace ed efficiente. In secondo luogo, presentiamo un metodo di differenziazione neuronale in vitro, che porta naturalmente una serie di limitazioni. Come accennato in precedenza, gli EB sono trattati con un livello soprafisiologico di RA per guidarli verso il lignaggio NPC. Gli NPC risultanti vengono quindi collocati in mezzi ottimali per imitare le condizioni fisiologiche e incoraggiare l'impegno, la crescita e la longevità del lignaggio neuronale. Qui, gli integratori N2 e B27 sono utilizzati per coltivare i neuroni, ma sono disponibili anche altri integratori come NS2123 per scopi simili, che possono alterare il successo e l'efficienza della differenziazione dei neuroni. Queste condizioni sono ricostituite sinteticamente nei saggi di coltura cellulare, che potrebbero non rappresentare pienamente le condizioni fisiologiche. La qualità degli EB, degli NPC e dei neuroni dipende fortemente dalle MESC di partenza. Le mESC che sono state passate per troppe volte e mantenute in coltura per più di 1 settimana in genere iniziano a perdere pluripotenza e potrebbero non subire con successo la differenziazione. Pertanto, mantenere le mESC in una condizione ottimale è fondamentale per garantire che possano differenziarsi efficacemente in EB, NPC e neuroni. Altri metodi di coltura neuronale come i modelli 3D sono stati anche proposti per imitare meglio le condizioni fisiologiche24,25,26 a volte a scapito della produttività e della fattibilità27,28. Riteniamo che i nostri protocolli siano utili per caratterizzare questi modelli di cultura 3D.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non ci sono interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del NIH (1R35GM133496-01) a Z. Gao. Vorremmo ringraziare il Dr. Ryan Hobbs per l'assistenza nel sezionamento. Ringraziamo le strutture principali del Penn State College of Medicine, tra cui le scienze del genoma e la bioinformatica, l'Advanced Light Microscopy Imaging e la citometria a flusso. Ringraziamo anche il Dr. Yuka Imamura per l'assistenza nell'analisi RNA-seq.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
| 40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
| m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
| MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
| mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
| mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
| mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
| - Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
| - Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
| - Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| - Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
| Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
| TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
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