Artículo de método

Un protocolo para la inmunohistoquímica y la distribución in situ de ARN dentro del embrión temprano de Drosophila

DOI:

10.3791/61776

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6 de mayo de 2022

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1National Engineering Laboratory for Resource Development of Endangered Crude Drugs in Northwest of China/CGDB, Shaanxi Normal University College of Life Sciences, 2Shaanxi Key Laboratory of Ischemic Cardiovascular Disease, Shaanxi Key Laboratory of Brain disorders, Institute of Basic & Translational Medicine, Xi'an Medical University, 3Ohio State University College of Medicine, 4Hematology-Oncology Division, Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 5University of Pennsylvania ULAR, 6University of Maryland School of Medicine, 7Columbia University Medical Center

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Aquí, describimos un protocolo para la detección y localización de la proteína embrionaria de Drosophila y el ARN desde la recolección hasta la preincrustación e incrustación, la inmunotinción y la hibridación in situ de ARNm.

Resumen

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La señalización de liberación de calcio inducida por calcio (CICR) juega un papel crítico en muchos procesos biológicos. Todas las actividades celulares, desde la proliferación celular y la apoptosis, el desarrollo y el envejecimiento, hasta la plasticidad sináptica neuronal y la regeneración, se han asociado con los receptores de rianodina (RyR). A pesar de la importancia de la señalización del calcio, el mecanismo exacto de su función en el desarrollo temprano no está claro. Como organismo con un período gestacional corto, los embriones de Drosophila melanogaster son sujetos de estudio principales para investigar la distribución y localización de las proteínas asociadas a CICR y sus reguladores durante el desarrollo. Sin embargo, debido a sus embriones ricos en lípidos y corion rico en quitina, su utilidad está limitada por la dificultad de montar embriones en superficies de vidrio. En este trabajo, presentamos un protocolo práctico que mejora significativamente la unión del embrión de Drosophila en diapositivas y detallamos los métodos para una histoquímica, inmunohistoquímica e hibridación in situ exitosas. El método de recubrimiento deslizante de gelatina de alumbre de cromo y el método de preincrustación de embriones aumenta drásticamente el rendimiento en el estudio de la proteína embrionaria de Drosophila y la expresión de ARN. Para demostrar este enfoque, estudiamos DmFKBP12/Calstabina, un conocido regulador de RyR durante el desarrollo embrionario temprano de Drosophila melanogaster. Identificamos DmFKBP12 ya en la etapa de blastodermo sincitial e informamos el patrón de expresión dinámica de DmFKBP12 durante el desarrollo: inicialmente como una proteína distribuida uniformemente en el blastodermo sincitial, luego localizando preliminarmente en la capa basal de la corteza durante el blastodermo celular, antes de distribuirse en la arquitectura neuronal y de digestión primitiva durante la fase de la capa de tres gemas en la gastrulación temprana. Esta distribución puede explicar el papel crítico que desempeña RyR en los sistemas de órganos vitales que se originan en estas capas: el ganglio suboesofágico y supraesofágico, el sistema nervioso ventral y el sistema musculoesquelético.

Introducción

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La señalización de liberación de calcio inducida por calcio (CICR) desempeña un papel fundamental en muchos procesos biológicos, como el músculo esquelético/liso y la función vascular cardíaca, la proliferación celular y la apoptosis, el desarrollo, el envejecimiento, la plasticidad sináptica neuronal y la regeneración1,2,3,4,5,6 . Los receptores de rianodina (RyR) y los receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) son actores importantes en la vía de señalización del calcio controlada por sus reguladores proteína quinasa A (PKA), proteína quinasa II dependiente de Ca2+ / calmodulina (CaMKII), proteínas de unión a FK506 (FKBP), calsequestrina (CSQ), triadina y junctina1,2,3,4,5,6 . La expresión humana anormal y las mutaciones en estas proteínas pueden conducir a fisiología patológica como arritmias7 y proliferación oncogénica8,9.

Los FKBP regulan la liberación de calcio del reticular endoplásmico (RE) por los RyRs. Este proceso es esencial para el mecanismo de contracción y, por lo tanto, responsable de todo el movimiento mecánico generado por la contracción de miosina-actina a través de la liberación de calcio inducida por calcio junto con los RyR embrionarios1,2. En modelos de ratón, la falta de RyR2 y su regulador FKBP12/Calstabina es invariablemente letal, ya sea durante el desarrollo embrionario o en el período postnatal temprano10,11,12. Los ratones knockout FKBP12/Calstabin exhiben defectos cardíacos críticos con acoplamiento irregular excitación-contracción (CE) y edema cerebral durante el desarrollo embrionario. Esto indica que FKBP12/Calstabina juega un papel esencial en la regulación de la expresión del canal RyR2, que es importante tanto para el desarrollo cardíaco como cerebral10.

Las chispas de calcio conducidas por RyR se descubrieron inicialmente en la fase de formación de cigotos de los huevos de Medaka fertilizados13,14. Sin embargo, se han realizado pocas investigaciones sobre la función de la señalización del calcio en el desarrollo embrionario temprano. En Drosophila melanogaster, los resultados obtenidos de los mutantes DmFKBP12 S107 proporcionan una fuerte evidencia que respalda la importancia de este gen para el desarrollo larvario y una vida saludable, lo que se atribuye a su función contra el estrés oxidativo15,16. Recientemente, identificamos la localización dinámica de la proteína FKBP12/Calstabina y el ARN mensajero durante el desarrollo temprano de Drosophila melanogaster17. Utilizando los enfoques descritos en esta metodología, pudimos rastrear la expresión de FKBP12/Calstabina en D. melanogaster durante el blastodermo sincitial (0-2 h), blastodermo celular (2-3 h), gastrula temprana (3-12 h) y gastrula tardía (12-24 h). En este artículo, presentamos los protocolos detallados de cada enfoque en el estudio anterior, incluida la incrustación preembrionaria para la sección clásica de parafina, el tratamiento con diapositivas de pre-recubrimiento para secciones embrionarias, la tinción histoquímica y la inmunotinción, y la hibridación in situ de ARNm para la identificación de la expresión génica.

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Protocolo

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1. Preparación de platos de agar de jugo de uva

  1. Añadir 5 g de agar y 5 g de sacarosa a 150 ml de agua destilada. Hervirlo con un microondas hasta que el agar y la sacarosa se disuelvan por completo. Mezcle 50 ml de jugo de uva 100% y la solución juntos.
  2. Añadir 1 ml de ácido propiónico al 100% para hacer la concentración final al 0,5% de ácido propiónico. Vierta 25 ml de la solución preparada en cada plato. Después de que el agar se haya solidificado, guarde el medio a 4 °C.

2. Revestimiento de diapositivas

  1. Pretratar diapositivas con detergente. Lave los toboganes 3 veces con agua del grifo y una vez con agua destilada. Luego secan los portaobjetos en un horno de 45 °C durante 2 h.
  2. Sumerja los portaobjetos en aproximadamente 450 ml de solución de ácido sulfúrico de dicromato de potasio (20 g de dicromato de potasio, 40 ml de agua destilada y 400 ml de ácido sulfúrico concentrado) durante 24 horas. Lave los toboganes 3 veces con agua del grifo y una vez con agua destilada.
    1. Seque los toboganes en un horno de 45 °C durante dos horas. Sumergir en etanol al 95% durante más de 2 h.
  3. Añadir 0,5 g de sulfato de cromo potasio y 5 g de gelatina a 1 L de agua destilada. Disolver en un baño de agua a 60 °C antes de su uso. La gelatina de alumbre cromado se puede almacenar a 4 °C durante largos períodos.
  4. Deje caer 10 μL de gelatina de alumbre cromado en la diapositiva y cubra completa y uniformemente toda la superficie de la diapositiva con la solución. Coloque el portaobjetos con el lado de gelatina hacia arriba en un horno a 42 °C durante 48 h. Las diapositivas preparadas se pueden almacenar a 4 °C para su uso posterior.
    NOTA: Este es un paso crítico. El recubrimiento completo es necesario. Para la mosca de la fruta y su embrión, este enfoque de recubrimiento deslizante parece más eficiente que el recubrimiento de polilisina.

3. Incrustación de embriones de Drosophila

  1. Colección de embriones de Drosophila
    NOTA: Recolectamos embriones de Drosophila en cuatro períodos de 0-2 horas (blastodermo sincitial), 2-3 horas (blastodermo celular), 3-12 horas (gastrula temprana) y 12-24 horas (gastrula tardía)18. La proporción de los principales tipos de embriones en cada período se muestra en la Tabla 1.
    1. Coloque 400-500 moscas en una botella de recolección de plástico y cubra la botella con el plato de agar de jugo de uva que contiene extracto de levadura. Los embriones de Drosophila se colocan en el agar de jugo de uva a temperatura ambiente.
    2. Recolectar cuatro períodos de embriones, agregando suavemente 2 mL de PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) a cada placa para flotar los embriones. Transfiera alrededor de 200 embriones a un tubo de centrífuga de 50 ml y manténgalo en hielo durante 2 minutos para asentar los embriones.
  2. Pre-incrustación
    1. Transfiera 200 embriones de Drosophila a un tubo centrífugo de 1,5 ml. Mantenga el tubo en hielo durante 2 minutos para asentar los embriones y luego deseche el sobrenadante con pipeta con cuidado. Añadir 1 ml de lejía al 50% en el tubo y agitarlo suavemente durante 2 min.
      NOTA: El blanqueador debe prepararse fresco, y la cantidad de lejía puede variar dependiendo de la cantidad de embriones recolectados.
    2. Recolecte suavemente los embriones vertiéndolos en papel de filtro y lávelos 3 veces con 1 ml de PBS en cada momento.
    3. Transfiera los embriones con papel de filtro a aproximadamente 5 ml de n-heptano.
    4. Transfiera la mezcla a un tubo de centrífuga fresco de 1,5 ml. Agregue 1 ml de metanol y agítelo suavemente. Recolectar embriones después de la sedimentación.
    5. Retire el sobrenadante y lave los embriones en 1 ml de PBS 3-5 veces.
    6. Fijar los embriones con 400 μL de solución de Bouin (71% de ácido pícrico saturado, 24% de formalina, 5% de ácido acético) durante 30 min. Lave los embriones fijos 3 veces en 1 ml de PBS durante 5 minutos cada vez.
    7. Para agregar embriones, transfiera las muestras a un tapón de goma y retire el PBS.
    8. Preparar la solución de agarosa-PBS al 1,2% y mantener la solución a 60 °C. Agregue 200 μL de solución de agarosa-PBS al 1,2% sobre los embriones para fijarlos en un bloque de agar.
    9. Saque el bloque del tapón y guárdelo en PBS.
      NOTA: Durante el enfoque previo a la incrustación, el pro-calentamiento es fundamental para tener éxito. Sugerimos encarecidamente que los tubos de la centrífuga y las puntas de la micropipeta, que se utilizarán en este paso, deben calentarse completamente antes de operar.
  3. Incrustación de parafina
    1. Sumerja el bloque de agar preincrustado en etanol al 35%, etanol al 50%, etanol al 75% y etanol al 85% durante 15 minutos cada uno. Luego sumerja 2 veces en etanol al 95% y etanol al 100%.
      NOTAS: Aproximadamente 5-10x de volumen de bloque de cada uno seguido de un fijador graduado durante 15-30 minutos es necesario dependiendo del número de embriones en el bloque.
    2. Sumergir el bloque de embriones en solución 100% etanol y xileno (proporción 1:1) durante 15 min.
    3. Transfiera el bloque al xileno durante 1 minuto para que el tejido embrionario sea transparente.
    4. Sumerja el bloque en xileno y parafina (proporción 1:1) durante 30 min.
    5. Sumerja el bloque en parafina I, parafina II y parafina III durante 2 h cada vez.
    6. Llene la caja de incrustación con parafina de antemano y luego transfiera suave y horizontalmente el bloque a la parte inferior de la caja de incrustación. Después de que la parafina se solidifique naturalmente, el bloque de parafina solidificada se puede almacenar a 4 ° C.
      NOTAS: La muestra preincrustada se puede utilizar en la crioseccion siguiendo los siguientes pasos. Después de que los embriones están preincrustados con agarosa como se describió anteriormente, las muestras simplemente se incrustan en el compuesto OCT. Posteriormente, la criosección se puede llevar a cabo de acuerdo con el protocolo de criosección de rutina. Posteriormente, se pueden utilizar enfoques de tinción regulares en las secciones.

4. Tinción de hematoxilina-eosina

  1. Preparar secciones embrionarias de Drosophila . Coloque las secciones preparadas en un horno a 60 ° C durante 15 minutos y luego sumerja las secciones en xileno 2 veces durante 10 minutos cada una. Sumergir las secciones una vez en etanol al 100% y xileno (proporción 1:1) durante 2 min.
  2. Hidratar las secciones en 100% etanol I, 100% etanol II, 95% etanol, 85% etanol, 75% etanol, 50% etanol, y en agua destilada durante 3 min.
  3. Manche las secciones con solución de hematoxilina durante 2 min. Sumerja los portaobjetos en una solución de alcohol ácido al 1% (1 ml de ácido clorhídrico, 100 ml de etanol al 70%) rápidamente y lave los portaobjetos en agua destilada.
  4. Sumerja las diapositivas en etanol al 50%, etanol al 75%, etanol al 85% y etanol al 95% secuencialmente.
  5. Manche las secciones con solución de eosina durante 1 min.
  6. Deshidrate los portaobjetos en 95% etanol I, 95% etanol II, 95% etanol III, 100% etanol I, 100% etanol II y 100% etanol III durante 1 min cada vez.
  7. Despeje las diapositivas en 100% xileno I, 100% xileno II y 100% xileno III durante 5 minutos cada vez.
  8. Monte las diapositivas con bálsamo neutro de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

5. Tinción periódica de metenamina ácido-plata

  1. Desparafinar e hidratar las secciones de parafina del embrión de Drosophila en agua destilada.
  2. Oxidar las secciones en ácido periódico al 1% durante 15 min a temperatura ambiente.
  3. Enjuague los toboganes en agua destilada 3 veces durante 1 minuto cada uno.
  4. Incubar los portaobjetos en aproximadamente 40 ml de solución de trabajo de metenamina de plata recién filtrada (3% de metenamina, 5% de nitrato de plata, solución de borato de sodio al 5%) durante 1 h y 20 minutos a 60 °C. Luego enjuague los toboganes en agua destilada durante 1 min.
  5. Tonifica las diapositivas en cloruro de oro al 0,2% durante 2 min y luego enjuaga las diapositivas en agua destilada durante 1 min.
  6. Coloque los portaobjetos en tiosulfato de sodio al 3% durante 3 minutos y luego enjuague los portaobjetos en agua destilada durante 1 minuto.
  7. Contramanten las diapositivas en hematoxilina durante 30 s. Lave los toboganes en agua corriente del grifo durante 3-5 minutos.
  8. Deshidrate los portaobjetos en etanol al 70%, etanol al 80%, 95% etanol I, 95% etanol II, 95% etanol III, 100% etanol I y 100% etanol II durante 5 minutos cada uno.
  9. Despeje las diapositivas en 100% xileno I, 100% xileno II y 100% xileno III durante 5 minutos cada uno.
  10. Monte las diapositivas en bálsamo neutro de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

6. Inmunohistoquímica

  1. Desparafinar y rehidratar secciones de parafina del embrión de Drosophila a PBS siguiendo el protocolo estándar19.
  2. Trate los portaobjetos con 0,3% de H2O2 en metanol durante 10 min a temperatura ambiente y evite la luz.
  3. Precaliente el tampón de recuperación de antígenos apropiado a aproximadamente 100 °C en un recipiente con los portaobjetos en el vaporizador de verduras. El recipiente también debe tener una tapa. Coloque las diapositivas en el contenedor. Cierre la tapa del vaporizador.
    1. Mantenga el recipiente en el vaporizador durante 20 minutos desde este punto. Tenga en cuenta que la tapa del recipiente deslizante no debe apretarse por completo para que el vapor de agua pueda entrar durante el proceso de vaporización.
  4. Permita que las diapositivas vuelvan a temperatura ambiente antes de enjuagarlas suavemente en PBS-T (PBS con Tween-20, pH 7.2) 3 veces durante 5 minutos cada una, y luego enjuague las diapositivas en PBS 3 veces durante 1 minuto cada una.
  5. Bloquee los portaobjetos con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en PBS durante 60 min a temperatura ambiente.
  6. Incubar los portaobjetos con anticuerpo primario (anti-FKBP12 a 1:1000) durante la noche a 4 °C o a temperatura ambiente durante 4 h.
  7. Lave las diapositivas en PBS-T 4 veces durante 5 minutos cada una.
  8. Aplique las diapositivas con polímero marcado con HRP conjugado con anticuerpos secundarios (anti-Conejo, 1:5.000) durante 90 min a temperatura ambiente. Haga esto en la oscuridad para evitar el blanqueamiento fotográfico.
  9. Lave las diapositivas en PBS-T 3 veces durante 5 minutos cada una.
  10. Incubar los portaobjetos con 5% 3,3'-diaminobenzidina-tetraclorhidrato (DAB) durante 2-10 min hasta que el color de los productos de reacción sea apropiado bajo microscopio.
  11. Contramante los portaobjetos en hematoxilina durante 30 s y lave los portaobjetos en agua destilada 2 veces durante 5 minutos cada uno.
  12. Deshidrate los portaobjetos en etanol al 50%, etanol al 70%, etanol al 90%, etanol al 95% y etanol al 100% durante 1 minuto cada uno.
  13. Despeje las diapositivas en 100% xileno I, 100% xileno II y 100% xileno III durante 5 minutos cada uno.
  14. Monte las diapositivas en bálsamo neutro de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

7. Hibridación in situ

NOTA: Las secciones embrionarias de Drosophila se prepararon con agua tratada con 0,01% de dietil pirocarbonato (DEPC). Todos los accesorios utilizados para la hibridación in situ aplican de DEPC durante la noche con antelación.

  1. Preparación de ribosonda
    1. Linearice el ADN de la plantilla cortando en un sitio de enzima de restricción aguas abajo del inserto clonado utilizando una enzima de restricción que crea voladizos de 5 '. Después de la linealización, purifique el ADN de la plantilla mediante extracción de fenol / cloroformo y posterior precipitación de etanol. Utilice protocolos estándar.
    2. Agregue 1 μg de ADN de plantilla purificado a un tubo de centrífuga sin RNasa. Coloque el tubo de la centrífuga sobre hielo. Agregue suficiente agua tratada con DEPC al volumen total de 13 μL.
      1. Luego agregue los siguientes reactivos en orden: 2 μL de 10x mezcla de etiquetado NTP, 2 μL de tampón de transcripción 10x, 1 μL de inhibidor protector de RNasa, 2 μL de ARN polimerasa SP6 o ARN polimerasa T7.
    3. Mezclar la reacción mediante pipeteo y centrifugación en breve. Incubar durante 2 h a 37 °C.
      NOTA: Las incubaciones más largas no aumentan el rendimiento del ARN marcado. Un giro corto (~ 800 rpm) aplicado en el tubo de reacción es crítico antes de continuar con el siguiente paso. Este giro permitirá que todo el contenido, que podría generarse a partir de la incubación, llegue al fondo del tubo.
    4. Añadir 2 μL de DNasa I sin RNasa para eliminar el ADN de la plantilla e incubar durante 15 min a 37 °C.
    5. Añadir 2 μL de 200 mM de EDTA (pH 8.0) para detener la reacción.
      NOTA: Las sondas de ARN marcadas con DIG se pueden almacenar a -15 a -25 °C en etanol durante un año.
  2. Prehibridación de la sección embrionaria de Drosophila
    1. Coloque las secciones del embrión de Drosophila en un horno de 42 °C durante 48 h.
    2. Desparafinar los portaobjetos en 100% xileno durante 10 min dos veces.
    3. Hidratar los portaobjetos sumergiéndolos secuencialmente en etanol al 100%, etanol al 95%, etanol al 90%, etanol al 70% y etanol al 50% durante 5 min.
    4. Incubar los portaobjetos en PBS durante 5 min 3 veces para eliminar la solución fijadora/solución de Bouin del tejido.
    5. Lave los portaobjetos con 100 mmol/L de solución de glicina/PBS 2 veces durante 5 min cada uno.
    6. Lave las diapositivas con PBS 2 veces durante 5 minutos cada una.
    7. Incubar los portaobjetos con Tritón X-100 al 0,3% en PBS durante 15 min para permeabilizar las membranas.
    8. Lave las diapositivas con PBS 3 veces durante 5 minutos cada una.
    9. Incubar los portaobjetos en 15 μg/ml de proteinasa K libre de RNasa durante 30 minutos a 37 °C.
    10. Incubar los portaobjetos con paraformaldehído al 4% en PBS durante 3 min para detener la digestión.
    11. Lave las diapositivas con PBS 2 veces durante 5 minutos cada una.
    12. Incubar los portaobjetos en tampón de trietanolamina de 100 mM (pH 8.0) con anhídrido acético al 0.25% (v/v) 2 veces durante 5 min cada uno.
    13. Agregue agua DEPC en la cámara de humedad del portaobjetos. Añadir 20 μL de solución de prediridación (que contenga 100 μg/ml de ADN de espermatozoides de salmón) en los portaobjetos. Coloque las diapositivas en la cámara de humedad de la diapositiva. Incubar los portaobjetos a 42 °C durante 4 h.
      NOTA: Es necesario asegurar la estanqueidad de la tapa de la caja húmeda y que la caja húmeda se mantenga siempre en horizontal para evitar la volatilización y la desviación del tejido de la solución de prehibridación y la solución de hibridación seguida.
  3. Hibridación de la sección embrionaria de Drosophila
    1. Retire la solución de prediridación y lave las diapositivas con 0,2 veces SSC (cloruro de sodio de 150 mM, citrato de sodio de 15 mM, pH 7,0) 3 veces durante 5 min cada una. Limpie el exceso de 0.2x SSC alrededor de las muestras de tejido.
    2. Aplique 30 μL de solución de hibridación de sonda (que contiene 2-6 ng de sonda de ARN marcada con digoxina diluyéndola en solución de prediridación) con una pipeta. Incubar los portaobjetos en la cámara de humedad del portaobjetos a 42 °C durante aproximadamente 20 h.
      NOTA: Asegúrese de la estanqueidad de la tapa como sugerencia de la última nota. De lo contrario, el secado causado por la fuga de pre-hibridación o pre-hibridación generará fondo sucio incluyendo pseudo-positivo en diapositivas.
  4. Hibridación
    1. Retire la solución de hibridación y lave las diapositivas con 4x solución SSC 4 veces durante 15 min cada una a 37 °C.
    2. Lave los portaobjetos en 2x solución SSC con 20 μg/ml de RNasa A durante 30 min a 37 °C.
    3. Lave los portaobjetos en 1 solución SSC durante 15 min a 37 °C.
    4. Lave las diapositivas en solución 0.5x SSC durante 15 min a 37 °C.
    5. Lave los portaobjetos en solución 0.1x SSC durante 15 min a 37 °C.
    6. Lave las diapositivas con PBS 3 veces durante 5 minutos cada una.
    7. Lave los portaobjetos en tampón de lavado (100 mM de ácido maleico, 150 mM de NaCl, 0,3% (v/v) de Tween 20, pH 7,5) durante 1 min.
    8. Incubar los portaobjetos en 100 ml de solución de bloqueo recién preparada (suero de oveja al 2% en tampón de ácido maleico sin Tween 20) durante 30 minutos.
    9. Incubar los portaobjetos en 20 ml de solución de anticuerpos durante 45 minutos.
      1. Centrifugar el anticuerpo durante 5 min a 10.000 rpm en el vial original antes de cada uso, y pipetear la cantidad necesaria cuidadosamente desde la superficie. Diluir anti-digoxigenina-AP 1:5000 (150 mU/mL) en solución de bloqueo.
    10. Lave las diapositivas en 100 ml de tampón de lavado 2 veces durante 15 minutos cada una para eliminar el conjugado de anticuerpos no unidos.
    11. Equilibre las diapositivas en 20 mL de tampón de detección (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9.5) durante 2-5 min.
    12. Incube los portaobjetos con 10 ml de solución de sustrato de color recién preparada en la cámara de humedad del portaobjetos. La reacción comienza en unos pocos minutos y se completa después de 16 h. No agite ni mezcle mientras se desarrolla el color.
    13. Lave los portaobjetos con 50 ml de agua destilada durante 5 minutos para detener la reacción.
    14. Seque la muestra durante la noche en la oscuridad.
    15. Deshidrate los portaobjetos en etanol al 70%, 80% etanol, 90% etanol, 95% etanol, 100% etanol I y 100% etanol II durante 3 min cada uno.
    16. Despeje las diapositivas en 100% xileno I, 100% xileno II y 100% xileno III durante 20 minutos cada uno.
    17. Monte las diapositivas con bálsamo neutro.
    18. Documente las imágenes y analícelas con la microscopía invertida y el software del fabricante. Realizar análisis de distribución utilizando ImageJ según densidad de señal positiva ya sea a lo largo del eje longitudinal o dentro de la zona diferencial de embriones.
      NOTA: Durante la incubación con la solución de sustrato de color recién preparada en el paso 7.4.12, el color de reacción se puede ver incluso con un ojo desnudo. Esta observación sobre cómo se puede inspeccionar el desarrollo del color bajo estereoscopio. Una vez que el color de la reacción es razonable y se puede llevar a cabo el paso 7.4.13 para detener la reacción.

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Resultados

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Las figuras describen los protocolos utilizados para superar el desafío de unir embriones de Drosophila de corion con alto contenido de lípidos y quitina (Tabla 1) a la superficie del portaobjetos de vidrio para su examen y experimentación. Utilizando el método de recubrimiento deslizante de gelatina de alumbre de cromo que se muestra en la Figura 1, mejoramos la unión de embriones de Drosophila a la superficie de los portaobjetos, mientras que el método de...

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Discusión

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La señalización de calcio mediada por RyRs e IP3Rs es una vía fundamental en muchos procesos fisiológicos y patológicos de animales vertebrados e invertebrados1,2,3,4. En humanos, las mutaciones puntuales, como la mutación R4496C asociada a CPVT, en el gen RyR2 conducen a la fuga de calcio del retículo sarcoplásmico del cardiomiocito, lo que resulta en disfunción cardíaca. Estas mutaciones se p...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (# 31771377 / 31571273 / 31371256), el Programa de Científicos Distinguidos Extranjeros del Departamento Nacional de Educación (#MS2014SXSF038), el Fondo de Investigación de universidades centrales del Departamento Nacional de Educación (#GK201301001/201701005 / GERP-17-45), y XZ cuenta con el apoyo del Fondo de Tesis Doctoral Sobresaliente (#2019TS082 / 2019TS079), Programa Clave del Departamento de Educación Provincial de Shaanxi (#20JS138), el Proyecto Juvenil del Programa de Investigación Básica en Ciencias Naturales del Departamento Provincial de Ciencia y Tecnología de Shaanxi (#2020JQ-885).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
-20 grados; C RefrigeradorMeiling Biology & MédicoDW-YL270Utilizado para el almacenamiento regente-80
y grados; C Refrigerador de temperatura ultra bajaThermo Forma 90 SeriesUtilizado para el almacenamiento de regente
AgarSigma-AldrichWXBB6360VPreparación de placas de agar de jugo de uva
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentosRoche11093274910Para la detección de compuestos marcados con digoxigenina
Incubadora bioquímicaShanghai Bluepard InstrumentsLRH-250Hibridación Hibridación
Solución de BouinReactivo químico Sinopharm en Pekín69945460inclusión de embriones de Drosophila
Eppendorf540BH07808In-situ Tubo
centrífugaDenvilleC-2170Colección de embriones de Drosophila
Alumbre de cromoReactivo químico Sinopharm en Beijing10001018Recubrimiento Portaobjetos Baño de
agua a temperatura constanteJintan Henfeng InstrumentsKW-1000DCTinción de hematoxilina-eosina, inmunohistoquímica, hibridación in situ y tinción de ácido peryódico-plata metenamina
Dako REAL Sistema de detección EnVisionDakoK5007En la reacción inmunohistoquímica o en la reacción de hibridación in situ, se une al anticuerpo antígeno primario y el objetivo se marca mediante tinción.
DEPCSigma-AldrichD5758Kit
de marcaje de ARN DIG de11093274910 Marcaje de ARN con diagoxigenina-UTP por transcripción in vitro con ARN polimerasa SP6 y T7
Drosophila melanogasterBloomington Stock CenterBDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664Las existencias de Drosophila melanogaster mutante
Horno de secado rápido eléctricoTianjin Taiste Instruments101-0ABPara el recubrimiento de portaobjetos y la inclusión de parafina
EosinaSigma-Aldrich230251Tinción de hematoxilina-eosina
EtanolReactivo químico Sinopharm en Beijing100092680Inclusión de parafina, tinción de hematoxilina-eosina, inmunohistoquímica, hibridación in situ y tinción
de ácido peryódico-plata metenaminaGelatinaSinopharm Reactivo químico en Pekín10010328recubrimiento Portaobjetos
Cloruro de oroSigma-Aldrich379948Ácido peryódico-plata Tinción de metenamina
HematoxilinaSigma-AldrichH3136Tinción de hematoxilina-eosina Kit
purificación de productos PCR de alta purezaRoche 11732668001Para la purificación de productos
PCRCaja inteligente de temperatura y humedad constantesNingbo Jiangnan InstrumentsHWSPara el mantenimiento de moscas
LE AgaroseHyAgarose14190108029Pre-incrustación
MetanolSinopharm Reactivo Químico en Beijing10014108 MicroscopioRecolección de Embriones de Drosophila
ZEISSObserver.A1Tinción de hematoxilina-eosina, inmunohistoquímica, hibridación in situ y tinción de ácido peryódico-plata metenamina
Portaobjetos de microscopio MeVidLabware FabricaciónP105-2001portaobjetos de recubrimiento
Goma neutraReactivo químico Sinopharm en Pekín10004160Tinción de hematoxilina-eosina
N-heptanoReactivo químico Sinopharm en Pekín40026768Embrión de Drosophila Colección
Cortadora de parafinaInstrumento científico HuahaiHH-2508IIIem>In-situ Parafina de hibridación
Reactivo químico Sinopharm en Pekín69019461inclusión de parafina
SartoriusPB-10Para determinar el valor de pH de una solución
Nitrato de plataReactivo químico Sinopharm en Beijing10018461Tinción de ácido peryódico-plata metenamina
Medidor de agua ultrapuraThermoAFXI-0501-PIn-situ Hibridación
XilenoReactivo químico Sinopharm en la 10023418 de BeijingIncrustación de parafina
Centrífuga de de de hibridación hibridación in situ Roche de de < Medidor de pH / mV de

Referencias

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