Een eenvoudige droge sectiemethode voor het verkrijgen van hele zaad-sized hars sectie en de toepassingen ervan

Summary

Deze techniek maakt het mogelijk voor de snelle en eenvoudige voorbereiding van hele zaad-sized hars sectie voor de observatie en analyse van cellen, zetmeel korrels, en eiwitlichamen in verschillende regio's van het zaad.

Abstract

De morfologie, grootte en kwantiteit van cellen, zetmeelkorrels en eiwitlichamen in zaad bepalen het gewicht en de kwaliteit van zaad. Ze zijn aanzienlijk verschillend tussen de verschillende gebieden van zaad. Om de morfologieën van cellen, zetmeelkorrels en eiwitlichamen duidelijk te bekijken en hun morfologieparameters nauwkeurig te analyseren, is de sectie van hele zaadformaat nodig. Hoewel de hele zaad-sized paraffine sectie kan de accumulatie van opslagmaterialen in zaden te onderzoeken, is het zeer moeilijk om kwantitatief te analyseren de morfologie parameters van cellen en opslagmaterialen als gevolg van de lage resolutie van de dikke sectie. De dunne hars sectie heeft een hoge resolutie, maar de routine hars sectie methode is niet geschikt voor de hele zaad-sized sectie van volwassen zaden met een groot volume en een hoog zetmeelgehalte voor te bereiden. In deze studie presenteren we een eenvoudige droge sectiemethode voor het voorbereiden van de hele harssectie ter grootte van zaden. De techniek kan de dwars- en longitudinale hele-zaad-sized secties van ontwikkelende, rijpe, ontkiemde, en gekookte zaden ingebed in LR Witte hars, zelfs voor grote zaden met een hoog zetmeelgehalte. De hele-zaad-sized sectie kan worden gekleurd met fluorescerende brightener 28, jodium, en Coomassie briljante blauwe R250 om specifiek vertonen de morfologie van cellen, zetmeel korrels, en eiwit lichamen duidelijk, respectievelijk. Het verkregen beeld kan ook kwantitatief worden geanalyseerd om de morfologieparameters van cellen, zetmeelkorrels en eiwitlichamen in verschillende gebieden van het zaad te tonen.

Introduction

Plantenzaden bevatten opslagmaterialen zoals zetmeel en eiwitten en zorgen voor energie en voeding voor mensen. De vorm, grootte en hoeveelheid cel- en opslagmaterialen bepalen het gewicht en de kwaliteit van het zaad. De cellen en opslagmaterialen in verschillende gebieden van het zaad hebben aanzienlijk verschillende morfologieën, vooral voor sommige hoog-amylose graangewassen met remming van zetmeel vertakking enzym IIb^1,2,3. Daarom is het erg belangrijk om de morfologieën van cellen en opslagmaterialen in verschillende gebieden van zaad te onderzoeken.

Paraffinesectie is een goede methode om de hele zaai-en-kleiningssectie voor te bereiden en kan de weefselstructuur van zaad en de accumulatie van opslagmateriaal vertonen in verschillende gebieden van zaad^4,5,6. De paraffinesecties hebben echter meestal een dikte van 6-8 μm met een lage resolutie; het is dus erg moeilijk om de morfologie van cel- en opslagmaterialen duidelijk te observeren en kwantitatief te analyseren. De harssecties hebben meestal een dikte van 1-2 μm en een hoge resolutie en zijn zeer geschikt om de morfologie van cel- en opslagmaterialen te observeren en te analyseren⁷. De routinematige harssectiemethode heeft echter moeite met de voorbereiding van de hele sectie ter grootte van zaden, met name voor zaden met een groot volume en een hoog zetmeelgehalte; er is dus geen manier om de morfologie van cellen en opslagmaterialen in verschillende gebieden van het zaad te observeren en te analyseren. LR Witte hars is een acrylhars en vertoont een lage viscositeit en sterke doorlaatbaarheid, wat leidt tot de goede toepassingen bij de voorbereiding van de hars sectie van zaden, vooral voor granen volwassen pitten met een groot volume en een hoog zetmeelgehalte. Bovendien kan het monster ingebed in LR Witte hars gemakkelijk worden gekleurd met veel chemische kleurstoffen om duidelijk de morfologie van cellen en opslagmaterialen onder licht of fluorescerende microscoop⁷tentoon te stellen. In ons vorige artikel hebben we melding gemaakt van een droge sectiemethode voor de voorbereiding van de hele zaad-sized secties van volwassen granen pitten ingebed in LR witte hars. De methode kan ook de hele zaad-sized sectie van de ontwikkeling, ontkiemde en gekookte graanpit⁸bereiden. De verkregen hele-zaad-sized sectie heeft vele toepassingen in micromorfologie observatie en analyse, met name voor het duidelijk bekijken en kwantitatief analyseren van de morfologie verschillen van cel-en opslagmaterialen in verschillende regio's van zaad^8,9.

Deze techniek is geschikt voor onderzoekers die de microstructuur van weefsel en de vorm en grootte van cellen, zetmeelkorrels en eiwitlichamen in verschillende gebieden van zaad met behulp van lichtmicroscoop willen observeren. De beelden van hele zaad-sized secties gekleurd specifiek voor het tentoonstellen van cellen, zetmeel korrels, en eiwitlichamen kunnen worden geanalyseerd door morfologie analyse software om kwantitatief te meten van de morfologie parameters van cellen, zetmeel korrels, en eiwit lichamen in verschillende gebieden van zaad. Om de technische toepasbaarheid en de hele zaad-sized sectie toepassingen aan te tonen, hebben we onderzocht de volwassen zaden van maïs en koolzaad en de ontwikkeling, ontkiemd, en gekookte pitten van rijst in deze studie. Het protocol bevat vier processen. Hier gebruiken we volwassen maïspit, wat het moeilijkst is bij het voorbereiden van de secties ter grootte van het hele zaad vanwege het grote volume en het hoge zetmeelgehalte, als een monster om de processen stap voor stap tentoon te stellen.

Protocol

1. Bereiding van in hars ingebed zaad (figuur 1)

1. Plaats zes maïsrijpe pitten in 10 mL van 2,5% fosfaatgebufferde glutaraldehyde (0,1 M, pH7.2) bij 4 °C voor 48 uur. De onderzoekers kunnen kiezen voor andere fixatieve mengsels, fixatieve concentraties, en fixatie voorwaarden op basis van hun onderzoeksdoelstellingen en weefseltypes.
2. Haal de pitten eruit en snijd ze in de lengterichting of dwars door een dikte van 2-3 mm met een scherp dubbelzijdig blad en bevestig ze in 10 mL van 2,5% fosfaatgefferde glutaraldehyde (0,1 M, pH 7.2) opnieuw voor 48 uur.
3. Was de monsters drie maal met 10 mL fosfaatbuffer van 0,1 M (pH 7.2) gedurende 30 minuten per keer.
4. Dehydrateer de monsters in toenemende soorten ethanol waterige oplossing (10 mL) van 30% tot 50%, 70%, 90% eenmaal, en 100% drie keer voor 30 min elke keer.
5. Infiltreren de monsters in 10 mL toenemende kwaliteiten van LR Witte hars oplossing verdund met ethanol van 25% tot 50%, 75% een keer, en 100% tweemaal bij 4 °C voor 12 uur elke keer.
6. Bereid de sokkels voor op monsters voordat u insluit. Voeg 0,25 mL LR-witte hars toe aan een 2 mL centrifugebuis en polymeriseer deze bij 60 °C gedurende 48 uur.
7. Voeg achtereenvolgens de zuivere LR Witte hars (0,5 mL) en het geïnfiltreerde monster toe aan de centrifugebuis met een voetstuk. Recht de monsters met de anatomische naald, en polymeriseren ze op 60 °C in een oven voor 48 uur.

2. Droge doorsnede voor de voorbereiding van de gehele gedeelte zaadformaat (figuur 1)

1. Haal de ingebedde pitten uit de centrifugebuis en knip de overtollige hars rond het monster uit met een scherp mes.
2. Klem het harsblok in de monsterhouder van ultramicrotome (EM UC7) en snijd de overbodige hars op het oppervlak van het monster en rond het monster met een mes af.
3. Polijst het oppervlak van het monster fijn met een glazen mes tot een volledige sectie kan worden gevormd.
4. Plaats een kleine koperen haak ongeveer 2 mm boven de bladrand voor het snijden en snijd het monster in een 2 μm sectie. De rol van de haak is om te voorkomen dat de curling omhoog van de sectie.
5. Zet de haak onder de sectie om het te ondersteunen wanneer de sectie lang wordt.
6. Voeg 100 μL water toe op een onbehandelde glijbaan en breng het volledige en ongebroken gedeelte voorzichtig met de pincet over naar het water.
7. Om het gerimpelde gedeelte glad te strijken, verwarm en droog het monster op de afvlakkingstafel bij 50 °C 's nachts.
   1. Als de sectie afbrokkelt of scheurt, verlengt u de tijd voor elke harsinfiltratie van het monster van 12 uur tot 24 uur of 48 uur.
   2. Als de sectie een aantal lijnen parallel aan het mes heeft, klemt u het monsterblok stevig vast. Als de sectie heeft een aantal lijnen verticaal aan het mes, gebruik dan een nieuw mes.

3. Kleuring en observatie van de sectie

OPMERKING: Om de weefselstructuur en morfologie van cellen, zetmeelkorrels en eiwitlichamen te observeren, bevlekt u de secties met specifieke vlekken volgens het doel van het onderzoek. Hier gebruiken we de fluorescerende brightener 28, jodiumoplossing en Coomassie briljante blauwe R250 om respectievelijk de celwanden, zetmeelkorrels en eiwitlichamen te bevlekken.

1. Voor het observeren van de morfologie van cellen, vlek de sectie met 40 mL van 0,1% (w / v) fluorescerende brightener 28 waterige oplossing in een 70 mL compacte glazen kleurpot op 45 °C gedurende 10 minuten, en spoel het vervolgens met stromend water gedurende 5 minuten. Observeer en fotografeer de sectie onder een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een CCD-camera.
2. Voor het observeren van de morfologie van zetmeelkorrels bevlekt u de sectie met 40 μL jodiumoplossing (0,07% (w/v) I₂ en 0,14% (w/v) KI in 25% (v/v) glycerol) gedurende 1 min, en bedek het monster met jodiumoplossing met een dekenslip. Bekijk en fotografeer het monster onder een lichtmicroscoop uitgerust met een CCD-camera.
3. Voor het observeren van de morfologie van eiwitlichamen, dompel de sectie met 40 mL van 10% (v/v) azijnzuur in een 70 mL compacte glazen kleurpot gedurende 10 minuten bij 45 °C, en vervolgens vlek in 40 mL van 1% (w / v) Coomassie briljante blauwe R250 in 25% (v / v) isopropanol en 10% (v / v) azijnzuur voor 15 min bij 45 °C. Was de gekleurde delen met stromend water gedurende 5 minuten en droog het. Observeer en fotografeer de sectie onder een lichtmicroscoop uitgerust met een CCD-camera.

4. Kwantitatieve analyse van morfologieparameters

1. Proces en kwantitatief analyseren van de gefotografeerde beelden voor gebied, lange / korte as, en rondheid van cellen, zetmeel korrels, en eiwit lichamen in verschillende gebieden van zaad met behulp van morfologie analyse software (Image-Pro Plus 6.0 software) volgens de procedures van Zhao et al.⁹ precies.

Representative Results

Eenvoudige droge doorsnedemethode voor het verkrijgen van een hele zaai-gedekte sectie
We stellen een eenvoudige droogsectiemethode vast voor de voorbereiding van een hele zaadvormige sectie zaad die is ingebed in LR-witte hars(figuur 1). De methode kan transversale en langs-zaadsecties voorbereiden met een dikte van 2 μm (figuur 2-5, aanvullende figuur 1-4). Bijvoorbeeld, het rijpe zaad van koolzaad kan transversaal en langs-in-de-dag worden gesneed doorsneden(figuur 2). Voor graangewassen zitten hun rijpe pitten vol zetmeelkorrels, waardoor het erg moeilijk is om de hele zaadsector voor te bereiden. Met behulp van de huidige techniek zouden ook de transversale en langs-zaadgrote delen van rijpe maïs met een groot volume kunnen worden bereid (figuur 4, aanvullende figuur 1). Bovendien kunnen de zich ontwikkelende kernel (aanvullende figuur 2), ontkiemde kernel (aanvullende figuur 3) en gekookte pit (aanvullende figuur 4) van rijst met behulp van de methode worden onderzocht.

Toepassingen van de gehele gedeelte zaadformaat
Observatie van de weefselstructuur van zaad
De hele-zaad-sized sectie kan worden gebruikt om de weefselstructuur van zaden te observeren. Bijvoorbeeld, het embryo van koolzaad bestaat uit radicle, hypocotyl, plumule, en twee cotyledons. De binnenste en buitenste cotyledons zijn in tweeën gebogen, verpakken de hypocotyl en radicle en maken het embryo bolvormig(figuur 2A,C). De langs- en transversale hele embryo-sized secties bevlekt met safranin duidelijk tentoongesteld de radicle, hypocotyl, innerlijke cotyledon, en buitenste cotyledon (Figuur 2B, D). De longitudinale hele embryo-sized sectie van oliehoudende kool wordt moeilijker bereid dan de transversale sectie. Daarom worden de transversale delen van embryo's op grote schaal gebruikt om de micromorfologie van embryo's in verwijzingen⁵,^10teonderzoeken .

Morfologie en analyse van cellen in verschillende gebieden van zaad
De hele-zaad-sized sectie kan worden gebruikt om te observeren en analyseren van de morfologie van cellen in verschillende gebieden van zaad. Zo werden de transversale hele embryo-sized secties van oliehoudende koolzaad bevlekt met fluorescerende brightener 28, en de celwanden werden specifiek gekleurd (Figuur 3A). De micromorfologie van cellen in alle embryogebieden kan duidelijk worden weergegeven bij een hoge vergroting(figuur 3B, C). De radicle bestaat uit opperhuid, cortex, en vasculaire weefsels. De epidermale cellen in de buitenste laag van radicle waren rechthoekig en radiaal gerangschikt. De corticale parenchymacellen waren rond van vorm en groot in grootte. Sommige verschillende ruimten werden waargenomen tussen corticale cellen. De corticale cellen werden gerangschikt in lagen van binnen naar buiten(figuur 3B). De epidermale cellen van cotyledon waren vierkant en hadden een klein volume. Er waren geen significante verschillen in vorm en grootte van epidermale cellen tussen de buitenste en binnenste oppervlakken van binnenste en buitenste cotyledons. Sommige vasculaire cilinders werden verspreid in het midden van mesophyll weefsels van binnenste en buitenste cotyledons. De mesophyll parenchyma cellen waren aanzienlijk groter dan de epidermale cellen en vasculaire cilindercellen in het cotyledon. De mesophyll parenchyma cellen toonden een typische palisading regeling in het binnenste gebied van buitenste cotyledon en het buitengebied van binnenste cotyledon (Figuur 3C). De parenchymacellen hadden aanzienlijk verschillende morfologieën in verschillende embryogebieden. Om hun verschillen in morfologie te onthullen, werden de gebieden 1, 2, 3, 4 en 5 gekozen in het radicle corticale weefsel, binnengebied van binnencotyledon, buitengebied van binnencotyledon, binnengebied van buitenste cotyledon en buitengebied van buitenste cotyledon, respectievelijk (Figuur 3B, C). De morfologieparameters van de parenchymacellen in de bovenstaande 5 regio's werden kwantitatief geanalyseerd met behulp van morfologieanalysesoftware(aanvullende tabel 1). Het gebied, de lengte van de lange as, de korte aslengte en de rondheid van parenchymacellen vertoonden enkele verschillen in verschillende gebieden van embryo's.

De cellen in endosperm zaten vol met zetmeel en opslageiwit. Met behulp van de hele-zaad-sized hars sectie, is het gemakkelijk in het observeren en analyseren van de cellen in verschillende regio's van endosperm. Zo kan de morfologie van cellen in alle gebieden van maïs endosperm duidelijk worden bekeken nadat de transversale hele zaad-sized secties werden gekleurd met fluorescerende brightener 28. De perifere, middelste en centrale endosperms in dezelfde kernel vertoonden aanzienlijk verschillende vormen en grootte van cellen(aanvullende figuur 1). Om de morfologieparameters van cellen in verschillende regio's van endosperm kwantitatief te analyseren, werden de beelden van regio's geanalyseerd met behulp van morfologieanalysesoftware; de morfologieparameters van cellen worden weergegeven in aanvullende tabel 2. De endospermcellen in regio 1 hadden het kleinste gebied van vier regio's, die in regio 2 waren groter dan die in regio 3, maar kleiner dan die in regio 4.

Morfologie en analyse van zetmeelkorrels in verschillende zaadgebieden
De rijpe zaden van de meeste plantaardige hulpbronnen, met name voor graangewassen, bevatten een hoog zetmeelgehalte. De korrelmorfologie en de grootte van zetmeel hebben belangrijke effecten op zetmeeleigenschappen en spelen een rol in de kwaliteit van zaad. De hars sectie van zaad kan worden gekleurd met jodium oplossing om de morfologie van zetmeel korrels vertonen in verschillende gebieden van zaad. Zo werden de transversale en longitudinale delen van maïs ter grootte van gehele zaad met succes bereid. De secties bevlekt met jodium vertoonden de morfologie van zetmeel (figuur 4). Om de morfologie van zetmeelkorrel in verschillende regio's van endosperm aan te tonen, werden de vier regio's en negen regio's gekozen in respectievelijk de transversale en longitudinale secties van hele zaadformaat (figuur 4). De zetmeelkorrels in verschillende regio's vertoonden aanzienlijk verschillende morfologie, grootte en hoeveelheid in endospermcellen. Voor transversale sectie, regio 1 had bolvormige zetmeel korrels, regio 2 had veelhoekige korrels, en zetmeel korrels in beide regio's 3 en 4 waren bolvormig. Voor de longitudinale sectie waren zetmeelkorrels met veelhoekige vorm in de gebieden 1, 4, 5 en 8 groter dan die met bolvormige vorm in de gebieden 3, 7 en 9, en sommige samengestelde zetmeelkorrels werden waargenomen in de regio's 2 en 6.

De kwantitatieve analyse van morfologische parameters van zetmeelkorrels in vier transversale gebieden werd opgenomen in aanvullende tabel 3. Zetmeelkorrels in regio 1 hadden de kleinste maat, die in regio 2 hadden de grootste omvang en die in regio 3 waren groter dan in regio 4.

Micromorfologie en analyse van eiwitlichamen in verschillende zaadgebieden
De hele-zaad-sized sectie met een hoge opslag eiwit kan worden gebruikt om de morfologie van eiwitlichamen in verschillende gebieden van zaad te verdreed en te analyseren. Zo werd het transversale gedeelte van het embryo van koolzaad bevlekt met Coomassie briljante blauwe R250, en was het opslageiwit blauw gekleurd (figuur 5). De ruimtelijke verdeling van opslageiwit in het embryo kon duidelijk worden waargenomen bij de lage vergroting (figuur 5A). Opslageiwit is aanwezig in eiwitlichamen. Bij hoge vergroting vertoonde het eiwitlichaam een heterogene matrix met enkele zwarte korrels en een onvermeerde transparante structuur(figuur 5B). De eiwitlichamen in zaad hebben drie soorten: het eerste type bestaat uit een homogene eiwitmatrix en heeft geen insluitsels, het tweede type bevat bolvormige kristallen en het derde type bevat bolvormige kristallen en pseudokristallen¹¹. De bolvormige kristallen in het eiwitlichaam bestaan uit fytaat en andere anorganische zouten, die niet gekleurd zijn. Deze bolvormige kristallen zijn zwart als gevolg van dat het licht niet kan passeren door hen onder de microscoop. Bovendien is het bolvormige kristal fragiel en moeilijk te penetreren door het fixatieve en het inbeddingsmiddel. Bij het maken van de sectie barsten de bolvormige kristallen soms uit, wat resulteert in een transparante holte in het eiwitlichaam¹¹. Het eiwitlichaam van het embryo van oliehoudende koolverkrachting bevatte sferoïdale kristallen volgens de micromorfologie(figuur 5B). Om de ruimtelijke verdeling van eiwitlichamen in het embryo te onderzoeken, werden vijf regio's in het hele embryo-formaat sectie gekozen om het radicle corticale weefsel, binnengebied van binnencotyledon, buitengebied van binnencotyledon, binnengebied van buitenste cotyledon, en buitenste gebied van buitenste cotyledon (Figuur 5A, C-G) te vertegenwoordigen. De eiwitlichamen in alle embryogebieden waren bolvormig, ellipsoïdaal en onregelmatig van vorm (figuur 5C-G).

Kwantitatieve analyse van eiwitlichamen in de eerste en tweede leg parenchyma cellen dicht bij de opperhuid in de hierboven gekozen vijf regio's worden gepresenteerd in aanvullende tabel 4. Het gebied van eiwit lichaam had een klein verschil tussen de gekozen vijf regio's. De rondheid van eiwit lichaam was aanzienlijk lager in het buitenste gebied van buitenste cotyledon dan in de andere vier regio's, wat aangeeft dat het eiwit lichaam in de buitenste cotyledon was dicht bij de sfeer. Het aantal en de gebiedsindex van eiwitlichaam in cel waren aanzienlijk hoger in de radicle parenchymacel dan in de cotyledon parenchyma cel (Aanvullende tabel 4).

Figuur 1: Bereiding van de gehele deel van de hars van gehele zaad met behulp van een droge doorsnedemethode. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Weefselstructuur van embryo's in rijp zaad van koolzaadras Huashuang 5. a) Morfologie van embryo. (B) Weefselstructuur van de langs-in-embryo's. (C) Morfologie van transversale hele embryo-sized sectie. (D) Weefselstructuur van transversale hele embryo's. De secties waren bevlekt met safranin. H, hypocotyl; IC, innerlijke cotyledon; OC, buitenste cotyledon; R, radicle. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Morfologie van cellen in embryo van koolzaadras Huashuang 5. (A) Transversale hele embryo-sized sectie bevlekt met fluorescerende verhelderaar 28. (B) Versterking van gebied B in (A), met de celmorfologie en weefselstructuur van radicle. (C) Versterking van gebied C in (A), met de celmorfologie en weefselstructuur van binnen- en buitencotyledon. Schaalbalk = 500 μm voor (A) en 100 μm voor (B,C). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Morfologie van zetmeelkorrels in volwassen maïskorrel Zheng 58. De transversale (A) en longitudinale (B) hele-zaad-sized secties werden bevlekt met jodium oplossing, en hun regionale versterkingen vertonen de morfologie van zetmeel korrels in verschillende regio's van endosperm. Schaalbalk = 1 mm voor een hele zaai-grootte sectie en 20 μm voor regionale versterkingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Morfologie van eiwitlichamen in embryo van koolzaadras Huashuang 5. (A) Transversal hele embryo-sized sectie gekleurd met Coomassie briljante blauwe R250. (B) Versterking van eiwitlichamen, met hun microstructuur. C-G) Versterking van regio C-G in (A), met de morfologie van het eiwitlichaam in radicle(C), binnengebied van inner cotyledon(D),buitengebied van inner cotyledon (E), binnengebied van buitenste cotyledon(F), buitenste region van inner cotyledon (G). Schaalbalk = 500 μm voor (A), 5 μm voor (B) en 50 μm voor (C-G). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende Figuur 1: Morfologie van cellen in volwassen maïskorrel Zheng 58. De transversale hele-zaad-sized sectie was gekleurd met fluorescerende brightener 28, en de regionale versterkingen (1-4) vertonen de morfologie van endosperm cellen in verschillende regio's van endosperm. Schaalbalk = 1 mm voor een hele zaai-grootte sectie en 100 μm voor regionale versterkingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2: Morfologie van de ontwikkeling van de kern van rijstras 9311. De transversale hele zaad-sized secties op verschillende dagen na de bloei (DAF) werden tegengehouden met safranin O en jodium oplossing. Schaalbalk = 0,5 mm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Morfologie van ontkiemde kern van rijstras Te-qing. De longitudinale hele-zaad-sized sectie op 8 dagen na imbibition werd tegengegaan met periodieke zuur-Schiff's en toluidine blauwe O, en de regionale versterkingen vertonen de morfologie veranderingen van endosperm in verschillende gebieden van het zaad. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 4: De morfologie van gekookte kern van rijstras Te-qing. De transversale hele-zaad-sized sectie was bevlekt met jodium oplossing, en de buitenste, midden, en binnenste regio versterkingen vertonen de morfologie veranderingen van zetmeel korrels in zaad tijdens het kookproces voor 0, 10, 20, en 30 min. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Morfologie parameters van cellen in verschillende regio's van oliehoudende kool embryo^a Klik hier om deze tabel te downloaden.

^a. De gegevens zijn ± standaarddeviaties(n = 3) en de waarden in dezelfde kolom met verschillende letters zijn aanzienlijk verschillend(p < 0,05).

^b De regio's worden weergegeven in figuur 3B, C.

^c LAL: lengte met lange assen; SAL: korte aslengte; Rondheid: (omtrek ²)/(4×π×gebied).

Aanvullende tabel 2: Morfologie parameters van cellen in verschillende gebieden van maïs endosperm^a Klik hier om deze tabel te downloaden.

^a. Gegevens zijn middelen ± standaarddeviaties(n = 3). Waarden in dezelfde kolom met verschillende letters zijn aanzienlijk verschillend(p < 0,05).

^b De gebieden worden weergegeven in het transversale gedeelte van maïspit in aanvullende figuur 1.

^c LAL: lengte met lange assen; SAL: korte aslengte; Rondheid: (omtrek ²)/(4×π×gebied).

Aanvullende tabel 3: Morfologie parameters van zetmeelkorrels in verschillende gebieden van maïs endosperm^a Klik hier om deze tabel te downloaden.

^a. Gegevens zijn middelen ± standaarddeviaties(n = 3). Waarden in dezelfde kolom met verschillende letters zijn aanzienlijk verschillend(p < 0,05).

^b De gebieden worden weergegeven in het transversale gedeelte van maïspit in figuur 4A.

^c LAL: lengte met lange assen; SAL: korte aslengte; Rondheid: (omtrek ²)/(4×π×gebied).

Aanvullende tabel 4: Morfologie parameters van eiwitlichamen in verschillende gebieden van oliehoudende kool embryo^a Klik hier om deze tabel te downloaden.

^a. De gegevens zijn ± standaarddeviaties(n = 3) en de waarden in dezelfde kolom met verschillende letters zijn aanzienlijk verschillend(p < 0,05).

^b De regio's zijn weergegeven in figuur 5.

^c Rondheid: (omtrek ²)/(4×π×gebied); Gebiedsindex is de gebiedsverhouding van eiwitlichaam aan cel.

Discussion

De zaden zijn de belangrijkste hernieuwbare hulpbron voor voedsel, veevoer en industriële grondstoffen, en zijn rijk aan opslagmaterialen zoals zetmeel en eiwit. De morfologie en kwantiteit van cellen en de inhoud en configuratie van opslagmaterialen beïnvloeden het gewicht en de kwaliteit van zaden^7,12. Hoewel de stereologie- en beeldanalysetechnologie de grootte en hoeveelheid cellen in een weefselgebied kan meten, ontbreekt het in veel laboratoria. De paraffine- en harssecties geven een tweedimensionaal (2D)-beeld, wat leidt tot het analyseren van de ware grootte en hoeveelheid cellen. Echter, de cellen worden willekeurig gesneden op hun vlakken, de gemiddelde grootte van veel cellen (meer dan 100) uit ten minste drie verschillende delen van weefsel gebied kan de 2D morfologie parameters (lengte, breedte en gebied) van cellen weerspiegelen, en de verhouding van het gekozen gebied te betekenen celgebied kan de hoeveelheid cellen weerspiegelen. Daarom is het erg belangrijk voor het in situ bekijken en analyseren van de morfologie van cellen en opslagmaterialen in verschillende gebieden van zaad. De paraffine sectie is het meest geschikt voor de voorbereiding van de hele zaad-sized sectie, vooral voor grote zaden⁷. Echter, de cellen zijn vol met opslagmaterialen met zaad ontwikkeling, wat leidt tot dat het zeer moeilijk is bij het verkrijgen van de goede hele zaad-sized sectie van laat ontwikkelende zaden en rijpe zaden. Bovendien is de paraffinesectie te dik om de morfologie duidelijk tentoon te stellen en is het alleen geschikt voor het onderzoeken van de weefselstructuur van zaad⁷.

De hars sectie is dun, en kan vertonen de morfologie van cellen, zetmeel korrels, en eiwit lichamen duidelijk⁷. Echter, de routine hars is niet geschikt voor hele zaad-sized sectie. De hier gepresenteerde techniek vertegenwoordigt een snelle, eenvoudige en scherpe benadering van de voorbereiding van transversale en longitudinale hele zaad-sized secties van volwassen zaden ingebed in hars voor het bekijken van de morfologie van cellen, zetmeel korrels, en eiwitlichamen in verschillende gebieden van zaad met behulp van lichte microscopie (Figuur 2-5,Aanvullendefiguur 1). Bovendien kan de techniek ook de sectie van het ontwikkelen, ontkiemde, en gekookte zaden voorbereiden om in situ de morfologieveranderingen van cel, zetmeel, en eiwitorganismen in verschillende gebieden van zaad te onderzoeken. 

Een ander duidelijk voordeel dat deze techniek biedt is de toepassing van hele zaad-sized secties. In het nieuwe tijdperk van fenomics en metabolomics is het belangrijk om kwantitatief de morfologieparameters van cellen, zetmeelkorrels en eiwitlichamen in verschillende gebieden van zaden te meten. De nieuwe techniek, in combinatie met morfologie analyse software, stelt de onderzoeker in staat om kwantitatief te analyseren van de morfologie parameters van cellen, zetmeelkorrels, en eiwitlichamen in verschillende gebieden van zaad (Aanvullende tabel 1-4).

Hoewel de huidige droge sectie methode met succes kan voorbereiden van de hele-zaad-sized hars sectie, het heeft een aantal beperkingen en tekortkomingen. Voor de paraffinesectie kan de paraffine gemakkelijk uit de sectie worden verwijderd; maar voor de harssectie kan de hars niet uit de sectie worden verwijderd, wat leidt tot het plantenmonster dat in hars is ingebed. Daarom is de huidige harssectie van een geheel zaadformaat niet geschikt om de histochemie en immunohistochemie uit te voeren. Bovendien kan de routinematige harssectiemethode monsters in 0,5-2 μm vloeiende secties snijden als gevolg van het monsterblok met een klein volume. Maar de huidige droge sectie methode is moeilijk voor te bereiden de gladde secties met dikte minder dan 2 μm, vooral voor volwassen zaden met een groot volume en een hoog zetmeelgehalte.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A501931
Compact glass staining jar (5-Place)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	E678013
Coomassie brilliant blue R-250	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A100472
Coverslip	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	F518211
Double-sided blade	Gillette Shanghai Co., Ltd.	74-S
Ethanol absolute	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A500737
Flattening table	Leica	HI1220
Fluorescence microscope	Olympus	BX60
Fluorescent brightener 28	Sigma-Aldrich	910090
Glass strips	Leica	840031
Glutaraldehyde 50% solution in water	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600875
Glycerol	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600232
Iodine	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A500538
Isopropanol	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A507048
Light microscope	Olympus	BX53
LR White resin	Agar Scientific	AGR1281A
Oven	Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd.	9023A
Potassium iodide	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A100512
Slide	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	F518101
Tweezers	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	F519022
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A607793
Sodium phosphate monobasic dihydrate	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A502805
Ultramicrotome	Leica	EM UC7