Summary
Denna teknik möjliggör snabb och enkel beredning av hela frö-storlek harts avsnitt för observation och analys av celler, stärkelse granulat, och protein organ i olika regioner av utsädet.
Abstract
Cellernas, stärkelsegranulatets och proteinkroppars morfologi, storlek och mängd i utsäde bestämmer utsädets vikt och kvalitet. De är betydligt olika mellan olika regioner av utsäde. För att visa morfologier av celler, stärkelse granulat och protein organ tydligt, och kvantitativt analysera deras morfologi parametrar exakt, hela frö-storlek avsnitt behövs. Även om hela frö-storlek paraffin avsnitt kan undersöka ansamling av lagringsmaterial i frön, är det mycket svårt att kvantitativt analysera morfologi parametrar för celler och lagringsmaterial på grund av den låga upplösningen av den tjocka delen. Den tunna harts avsnittet har hög upplösning, men rutin harts sectioning metod är inte lämplig att förbereda hela-frö-storlek avsnitt av mogna frön med en stor volym och hög stärkelse innehåll. I denna studie presenterar vi en enkel torr snittning metod för att förbereda hela frö-storlek harts avsnitt. Tekniken kan förbereda korset och längsgående hela frö-stora delar av utveckling, mogna, grodda, och kokta frön inbäddade i LR Vit harts, även för stora frön med hög stärkelsehalt. Hela frö-storlek avsnitt kan färgas med fluorescerande ljusare 28, jod, och Coomassie lysande blå R250 att specifikt uppvisa morfologi av celler, stärkelse granulat, och protein organ tydligt, respektive. Den erhållna bilden kan också analyseras kvantitativt för att visa morfologi parametrar för celler, stärkelse granulat och protein organ i olika regioner av utsäde.
Introduction
Växtfrön innehåller lagringsmaterial som stärkelse och protein och ger energi och näring för människor. Formen, storleken och kvantiteten av cell- och lagringsmaterial bestämmer utsädets vikt och kvalitet. Cellerna och lagringsmaterial i olika regioner av utsäde har betydligt olika morfologier, särskilt för vissa hög-amylose spannmålsgrödor med hämning av stärkelse förgrening enzym IIb1,2,3. Därför är det mycket viktigt att undersöka morfologier av celler och lagringsmaterial i olika regioner av utsäde.
Paraffin snittning är en bra metod för att förbereda hela-frö-storlek avsnitt och kan uppvisa vävnad struktur av utsäde och ackumulering av lagringsmaterial i olika regioner av utsäde4,5,6. Paraffinsektionerna har dock vanligen 6-8 μm tjocklek med låg upplösning; således är det mycket svårt att tydligt observera och kvantitativt analysera cell- och lagringsmaterialens morfologi. Hartssektionerna har vanligen 1-2 μm tjocklek och hög upplösning och är mycket lämpliga att observera och analysera morfologin hos cell- och lagringsmaterial7. Den rutinmässiga harts snittningsmetoden har dock svårt att förbereda hela frö-storlek avsnitt, särskilt för frön med en stor volym och hög stärkelse innehåll; således finns det inget sätt att observera och analysera morfologi av celler och lagringsmaterial i olika regioner av utsädet. LR Vit harts är en akrylharts och uppvisar låg viskositet och stark permeabilitet, vilket leder till dess goda tillämpningar i förberedelserna av harts delen av frön, särskilt för spannmål mogna kärnor med stor volym och hög stärkelse innehåll. Dessutom kan provet inbäddat i LR Vit harts färgas lätt med många kemiska färgämnen för att tydligt uppvisa morfologi av celler och lagringsmaterial under ljus eller fluorescerande mikroskop7. I vårt tidigare papper har vi rapporterat en torr snittning metod för att förbereda hela-frö-storlek avsnitt av mogna spannmålskärnor inbäddade i LR Vit harts. Metoden kan också förbereda hela frö-storlek avsnitt av utveckling, grodda och kokta spannmål kärna8. Den erhållna helfröstora sektionen har många tillämpningar inom mikromorfologi observation och analys, särskilt för tydligt visning och kvantitativt analysera morfologi skillnader cell och lagringsmaterial i olika regioner av utsäde8,9.
Denna teknik är lämplig för forskare som vill observera mikrostrukturen av vävnad och formen och storleken på celler, stärkelse granulat, och protein organ i olika regioner av utsäde med hjälp av ljusmikroskop. Bilderna av helfröstora sektioner färgas speciellt för uppvisar celler, stärkelse granulat och protein organ kan analyseras av morfologi analys programvara för att kvantitativt mäta morfologi parametrar av celler, stärkelse granulat och protein organ i olika regioner av utsäde. För att visa den tekniska tillämpligheten och hela fröstora sektionsapplikationer har vi undersökt de mogna fröna från majs och raps och utvecklande, grodda och kokta kärnor av ris i denna studie. Protokollet innehåller fyra processer. Här använder vi mogen majskärna, som är den svåraste i att förbereda helfröstora sektioner på grund av den stora volymen och hög stärkelsehalt, som ett prov för att ställa ut processerna steg för steg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av harts-inbäddat utsäde (figur 1)
- Fixera sex mogna kärnor av majs i 10 mL på 2,5 % fosfatbuffrad glutaraldehyd (0,1 M, pH7,2) vid 4 °C i 48 h. Forskarna kan välja andra fixerande blandningar, fixerande koncentrationer och fixeringsförhållanden enligt sina forskningsmål och vävnadstyper.
- Ta ut kärnorna och skiva dem längsgående eller transversalt till 2-3 mm tjocklek med hjälp av en skarp dubbelsidig blad, och fixera dem i 10 mL av 2,5% fosfatbuffrad glutaraldehyd (0,1 M, pH 7,2) igen för 48 h.
- Tvätta proverna tre gånger med 10 mL 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,2) i 30 min varje gång.
- Torka ut proverna i ökande kvaliteter av etanol vattenlösning (10 mL) från 30% till 50%, 70%, 90% en gång, och 100% tre gånger för 30 min varje gång.
- Infiltrera proverna i 10 mL ökande kvaliteter av LR Vit hartslösning utspädd med etanol från 25% till 50%, 75% en gång, och 100% två gånger vid 4 °C i 12 h varje gång.
- Förbered piedestalerna för prover före ingjutning. Tillsätt 0,25 mL av 100% LR Vit harts i ett 2-mL centrifugrör, och polymerisera det vid 60 °C i 48 h.
- Successivt tillsätt den rena LR White harts (0,5 mL) och det infiltrerade provet i centrifugröret med en piedestal. Räta ut proverna med den anatomiska nålen, och polymerisera dem vid 60 °C i en ugn i 48 h.
2. Torr snittning för att förbereda helfröstor sektion (Figur 1)
- Ta ut de inbäddade kärnorna från centrifugröret och skär ut överskottshartsen runt provet med hjälp av ett vasst blad.
- Kläm fast hartsblocket i provhållaren av ultramicrotome (EM UC7), och trimma av det överflödiga hartset på ytan av provet och runt provet med ett blad.
- Polera ytan av provet fint med en glaskniv tills en komplett sektion kan bildas.
- Sätt en liten kopparkrok ca 2 mm ovanför bladkanten innan du skär och skär provet i ett 2 μm-avsnitt. Krokens roll är att undvika att sektionens curling uppåt.
- Sätt kroken under sektionen för att stödja den när sektionen blir lång.
- Tillsätt 100 μL vatten på en icke förbehandlad rutschkana, och överför försiktigt den kompletta och obrutna delen till vattnet med pincetten.
- För att jämna till den skrynkliga sektionen, värm och torka provet på det platta bordet vid 50 °C över natten.
- Om sektionen smular eller revor, förläng tiden för varje hartsininfiltration av provet från 12 h till 24 h eller 48 h.
- Om sektionen har några linjer parallella med kniven, kläm fast provblocket ordentligt. Om sektionen har några linjer vertikala till kniven, använd gärna en ny kniv.
3. Färgning och observation av sektionen
OBS: För att observera vävnadsstrukturen och morfologin hos celler, stärkelsegranulat, och proteinkroppar, fläcka sektionerna med specifika fläckar enligt syftet med forskningen. Här använder vi lysrör brightener 28, jod lösning, och Coomassie lysande blå R250 att färga cellväggarna, stärkelse granulat, och protein organ, respektive.
- För observation av cellernas morfologi, färga sektionen med 40 mL på 0,1% (w/v) fluorescerande ljusmedel 28 vattenhaltig lösning i en 70 mL kompakt glasfärgningsburk vid 45 °C i 10 min, och skölj sedan den med rinnande vatten i 5 min. Observera och fotografera avsnittet under ett fluorescensmikroskop utrustat med en CCD-kamera.
- För observation av morfologi av stärkelsegranulat, fläcka avsnittet med 40 μL jodlösning (0,07% (w/v) I2 och 0,14% (w/v) KI i 25% (v/v) glycerol) i 1 min, och täck provet som innehåller jodlösning med ett täckkol. Visa och fotografera provet i ett ljusmikroskop utrustat med en CCD-kamera.
- För observation av morfologi av proteinkroppar, sänk sektionen med 40 mL på 10% (v/v) ättiksyra i en 70 mL kompakt glasfärgningsburk i 10 min vid 45 °C, och sedan fläcka den i 40 mL av 1% (w / v) Coomassie lysande blå R250 i 25% (v / v) isopropanol och 10% (v / v) ättiksyra för 15 min vid 45 °C . Tvätta de färgade sektionerna med rinnande vatten i 5 min, och torka den. Observera och fotografera avsnittet i ett ljusmikroskop utrustat med en CCD-kamera.
4. Kvantitativ analys av morfologiparametrar
- Bearbeta och kvantitativt analysera de fotograferade bilderna för område, lång/kort axel, och rundhet av celler, stärkelsegranulat och proteinkroppar i olika regioner av frö med hjälp av morfologi analysprogramvara (Image-Pro Plus 6.0 programvara) efter förfarandena i Zhao et al.9 exakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enkel torr snittningsmetod för att få en helfröstor sektion
Vi upprättar en enkel torr snittning metod för att förbereda en hel-frö-storlek avsnitt av utsäde inbäddade i LR-vit harts (Figur 1). Metoden kan bereda tvärgående och längsgående helfröstora sektioner med tjocklek på 2 μm (Figur 2-5, Kompletterande Figur 1-4). För exempel kan det mogna fröet av raps vara sektionerat transversalt och longitudinellt (figur 2). För spannmålsgrödor är deras mogna kärnor fulla av stärkelsegranulat, vilket leder till att det är mycket svårt att förbereda hela fröstora sektionen. Med hjälp av den föreliggande tekniken kunde de tvärgående och longitudinella helfröstora sektionerna av mogen majs med stor volym också beredas (Figur 4, Kompletterande figur 1). Dessutom kan den utvecklande kärnan (Supplementary Figure 2), grodd kärna (Supplementary Figure 3), och kokt kärna (Supplementary Figure 4) av ris undersökas med hjälp av metoden.
Tillämpningar av hela frö-storlek avsnitt
Observation av vävnadsstruktur av utsäde
Hela frö-storlek avsnitt kan användas för att observera vävnadsstrukturen av frön. För exempel, embryot till raps består av radik, hypocotyl, plumule, och två cotyledons. De inre och yttre cotyledonerna böjs i halva, inplastning av hypokotyl och radik och gör embryot sfäriskt (Figur 2A,C). De längsgående och transversala hel-embryo-stora sektionerna färgas med safranin uppvisade tydligt radikeln, hypocotyl, inre cotyledon, och yttre cotyledon (Figur 2B,D). Den längsgående hela embryostora delen av rapsen är beredd svårare än den transversala sektionen. Därför är de tvärgående avsnitten av embryon allmänt används för att undersöka mikromorfologi av embryon i referenser5,10.
Morfologi och analys av celler i olika regioner av utsäde
Hela frö-storlek avsnitt kan användas för att observera och analysera morfologi av celler i olika regioner av utsäde. Till exempel var de transversala hel-embryo-stora avsnitten av raps färgas med fluorescerande ljusare 28, och cellväggarna var färgas specifikt (Figur 3A). Cellernas mikromorfologi i alla embryoregioner skulle kunna visas tydligt med hög förstoring (Bild 3B,C). Radikeln består av epiderm, cortex, och vaskulära vävnader. De epidermal celler som ligger i det yttersta lagret av radicle var rektangulära och radiellt ordnade. De kortikala parenchyma cellerna var runda i form och stora i storlek. Vissa distinkta utrymmen observerades mellan när celler. De kortikala cellerna var ordnade i lager från insidan till utsidan (Bild 3B). De epidermal cellerna av cotyledon var kvadratiska och hade liten volym. det fanns inga signifikanta skillnader i form och storlek av epidermal celler bland yttre och inre ytor av inre och yttre cotyledons. Vissa vaskulära cylindrar var utspridda i mitten av mesophyll vävnader av inre och yttre cotyledons. Mesophyll parenkyma cellerna var betydligt större än de epidermala celler och Vaskulär cylinder celler i cotyledon. Mesophyll parenkyma celler visade en typisk palisading arrangemang i inre regionen av yttre cotyledon och den yttre regionen av inre cotyledon (Figur 3C). Parenkyma cellerna hade betydligt olika morfologier i olika regioner av embryot. För att avslöja sina skillnader i morfologi valdes regionerna 1, 2, 3, 4 och 5 i radikalen när vävnad, inre regionen av inre cotyledon, yttre region av inre cotyledon, inre region av yttre cotyledon, respektive yttre region av yttre cotyledon (figur 3B,C). Parenkyma-cellernas morfologiparametrar i ovanstående 5 regioner analyserades kvantitativt med hjälp av morfologianalysprogramvara (Kompletterande tabell 1). Området, lång axel längd, kort axel längd och roundness av parenkym celler visade vissa skillnader i olika regioner av embryon.
Cellerna i endosperm var fulla av stärkelse och lagring protein. Med hjälp av hela frö-storlek harts avsnitt, är det lätt att observera och analysera cellerna i olika regioner av frövita. Till exempel kan morfologi av celler i alla regioner av majs frövita ses tydligt efter den tvärgående hela frö-storlek avsnitten var färgas med fluorescent ljusare 28. Den perifera, mellersta, och centrala endosperms i samma kärna uppvisade betydligt olika former och storlekar av celler (Kompletterande Figur 1). För att kvantitativt analysera cellernas morfologiparametrar i olika regioner av frövita analyserades bilderna av regioner med hjälp av morfologianalysprogram; cellernas morfologiparametrar presenteras i Kompletterande tabell 2. Frövitan celler i region 1 hade den minsta ytan bland fyra regioner, de i region 2 var större än de i region 3, men mindre än de i region 4.
Morfologi och analys av stärkelsegranulat i olika regioner av utsäde
De mogna fröna från de flesta växtresurserna, särskilt för spannmålsgrödor, innehåller hög stärkelsehalt. Stärkelsens granulmorfologi och storlek har viktiga effekter på stärkelseegenskaperna och spelar en roll för utsädets kvalitet. Harts delen av utsäde kan färgas med jod lösning för att uppvisa morfologi av stärkelse granulat i olika regioner av utsäde. Till exempel förbereddes de tvärgående och longitudinella helfröstora sektionerna av majs framgångsrikt. De avsnitt som färgas med jod uppvisade morfologin av stärkelse (Figur 4). För att visa morfologin hos stärkelsegranulat i olika regioner i frövita valdes de fyra regionerna och nio regionerna i de tvärgående och longitudinella helfröstora sektionerna (figur 4). Stärkelsegranulatet i olika regioner visade signifikant olika morfologi, storlek och kvantitet i endosperm celler. För tvärgående avsnitt hade region 1 sfäriska stärkelse granulat, region 2 hade polygonal granulat och stärkelse granulat i båda regionerna 3 och 4 var sfärisk. För längsgående avsnitt var stärkelsegranulat med polygonal form i regionerna 1, 4, 5 och 8 större än de med sfärisk form i regionerna 3, 7 och 9, och vissa sammansatta stärkelsegranulat observerades i regionerna 2 och 6.
Den kvantitativa analysen av morfologiska parametrar av stärkelsegranulat i fyra regioner i tvärgående sektion visades i Kompletterande tabell 3. Stärkelsegranulat i region 1 hade den minsta storleken, de i region 2 hade den största storleken, och de i region 3 var större än i region 4.
Mikromorfologi och analys av proteinkroppar i olika regioner av utsäde
Hela frö-storlek avsnitt med hög lagring protein kan användas för att obverse och analysera morfologi av protein organ i olika regioner av utsäde. Till exempel var den transversala delen av embryot av raps färgas med Coomassie lysande blå R250, och lagring proteinet var färgas blå (Figur 5). Den rumsliga fördelningen av lagringsprotein i embryot kunde tydligt observeras vid den låga förstoringen (Figur 5A). Lagring protein finns i protein organ. Vid hög förstoring uppvisade proteinkroppen en heterogen matris med några svarta granulat och viss obefläckad transparent struktur (Figur 5B). Proteinkropparna i utsäde har tre typer: den första typen består av en homogen proteinmatris och har inga inneslutningar, den andra typen innehåller klotformiga kristaller, och den tredje typen innehåller klotformiga kristaller och pseudokristaller11. De klotformiga kristallerna i proteinkroppen är sammansatta av fytate och andra oorganiska salter, som inte färgas. Dessa klotformiga kristaller är svarta på grund av att ljuset inte kan passera genom dem under mikroskop. Dessutom är den sfäriska kristallen ömtålig och svår att penetreras av fixativet och inbäddningsmedlet. När du gör avsnittet, de sfäriska kristallerna ibland brast ut, vilket resulterar i en transparent hålighet inuti proteinkroppen11. Proteinkroppen av rapsembryo innehöll sfäroidala kristaller enligt dess mikromorfologi (Figur 5B). För att undersöka den rumsliga fördelningen av proteinkroppar i embryot valdes fem regioner i sektionen med hela embryostorlek för att representera radikeln när vävnad, inre regionen av inre cotyledon, yttre regionen av inre cotyledon, inre region i yttre cotyledon, och yttre region av yttre cotyledon (figur 5A,C-G). Proteinkropparna i embryots alla regioner var sfäriska, ellipsoidala och oregelbundna till formen (Figur 5C-G).
Kvantitativ analys av proteinkroppar i den första och andra lekparenkymaceller nära epidermis i ovan valda fem regioner presenteras i kompletterande tabell 4. Området proteinkroppen hade liten skillnad mellan de valda fem regionerna. Den roundness av protein kroppen var betydligt lägre i yttre regionen av yttre cotyledon än i de andra fyra regionerna, som anger proteinkroppen i yttre cotyledon var nära sfär. Antalet och area index för proteinkropp i cell var betydligt högre i radikeln parenkym cellen än i cotyledon parenkym cellen (Tilläggstabell 4).
Figur 1: Beredning av helfröstort hartssemitinavsnitt med hjälp av torr snittningsmetod. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Embryots vävnadsstruktur i mogna frön av rapssort Huashuang 5. (A) Morfologi av embryo. (B) Vävnadsstruktur av longitudinell hel-embryo-storlek avsnitt. (C) Morfologi av transversal hela-embryo-storlek avsnitt. (D) Vävnadsstruktur av tvärgående hel-embryo-storlek avsnitt. Sektionerna var fläckade med safranin. H, hypocotyl; IC, inre cotyledon; OC, yttre cotyledon; R, radikeln. Skala bar = 1 mm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Morfologi av celler i embryot av raps sort Huashuang 5. (A) Transversal hel-embryo-storlek avsnitt färgas med fluorescerande ljusare 28. (B) Förstärkning av region B i (A), som visar cellmorfologi och vävnadsstruktur av radik. (C) Förstärkning av region C i (A), som visar cellmorfologi och vävnadsstruktur av inre och yttre cotyledon. Skala bar = 500 μm för (A) och 100 μm för (B,C). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Morfologi av stärkelsegranulat i mogen kärna av majs sort Zheng 58. De transversala (A) och längsgående (B) hel-frö-storlek avsnitten var färgas med jod lösning, och deras regionala amplifierings uppvisar morfologi av stärkelse granulat i olika regioner av frövita. Skalastång = 1 mm för helfröstor sektion och 20 μm för regionala amplifieringar. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Morfologi av proteinkroppar i embryo av rapssort Huashuang 5. (A) Transversal hela-embryo-storlek avsnitt färgas med Coomassie lysande blå R250. (B) Förstärkning av proteinkroppar, som visar deras mikrostruktur. (C-G) Förstärkning av region C-G i (A), som visar morfologin av proteinkropp i radik (C), inre region av inre cotyledon (D), yttre region av inre cotyledon (E), inre region av yttre cotyledon (F), yttre region av inre cotyledon (G). Skala bar = 500 μm för (A), 5 μm för (B) och 50 μm för (C-G). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande Figur 1: Morfologi av celler i mogen kärna av majs sort Zheng 58. Den transversala hela-frö-storlek avsnitt var färgas med fluorescent ljusare 28, och dess regionala amplifierings (1-4) uppvisar morfologi av endosperm celler i olika regioner av endosperm. Skalastång = 1 mm för sektion i hela fröstorlek och 100 μm för regionala amplifieringar. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande Figur 2: Morfologi av utvecklande kärna av ris sort 9311. De transversala helfröstora avsnitten vid olika dagar efter blomningen (DAF) var counterstained med safranin O och jod lösning. Skala bar = 0,5 mm. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande figur 3: Morfologi av grodd kärna av ris sort Te-qing. Den längsgående hela frö-storlek avsnitt på 8 dagar efter imbibition var motverkas med periodiska syra-Schiffs och toluidin blå O, och dess regionala förstärkningar uppvisar morfologi förändringar av frövita i olika regioner av utsäde. Skala bar = 20 μm. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande Figur 4: Morfologin av kokt kärna av ris sort Te-qing. Den transversala hela-frö-storlek avsnitt var färgas med jod lösning, och dess yttre, mellersta och inre regionen förstärkningar uppvisa morfologi förändringar stärkelse granulat i utsäde under tillagningsprocessen för 0, 10, 20 och 30 min. Skala bar = 20 μm. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande tabell 1: Morfologi parametrar av celler i olika regioner av oljeflagrad raps embryoa Klicka här för att ladda ner denna tabell.
ett Data är betyder ± standardavvikelser (n = 3), och värdena i samma kolumn med olika bokstäver är betydligt olika (p < 0,05).
b Regionerna visas i figur 3B,C.
c. LAL: lång axellängd; SAL: kort axellängd; Rundhet: (omkrets 2)/(4×π×area).
Kompletterande tabell 2: Morfologi parametrar av celler i olika regioner av majs endosperma Klicka här för att ladda ner denna tabell.
ett Data är ± standardavvikelser (n = 3). Värden i samma kolumn med olika bokstäver är betydligt olika (p < 0,05).
b Regionerna visas i tvärgående avsnitt av majskärnan i kompletterande figur 1.
c. LAL: lång axellängd; SAL: kort axellängd; Rundhet: (omkrets 2)/(4×π×area).
Kompletterande tabell 3: Morfologi parametrar av stärkelse granulat i olika regioner av majs endosperma Vänligen klicka här för att ladda ner denna tabell.
ett Data är ± standardavvikelser (n = 3). Värden i samma kolumn med olika bokstäver är betydligt olika (p < 0,05).
b Regionerna visas i tvärgående avsnitt av majskärnan i figur 4A.
c. LAL: lång axellängd; SAL: kort axellängd; Rundhet: (omkrets 2)/(4×π×area).
Kompletterande tabell 4: Morfologi parametrar av protein organ i olika regioner av oljeflagrad raps embryoa Klicka här för att ladda ner denna tabell.
ett Data är betyder ± standardavvikelser (n = 3), och värdena i samma kolumn med olika bokstäver är betydligt olika (p < 0,05).
b Regionerna visas i diagram 5.
c. Rundhet: (omkrets 2)/(4×π×area); Områdesindex är areakvoten mellan proteinkroppen och cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fröna är den viktigaste förnybara resursen för livsmedel, foder och industriell råvara, och är rika på lagringsmaterial som stärkelse och protein. Cellernas morfologi och kvantitet samt lagringsmaterialens innehåll och konfigurering påverkar vikten och kvaliteten påfröna 7,12. Även om stereologi och bildanalys teknik kan mäta storlek och mängd av celler i en vävnad region, de saknas i många laboratorier. Den paraffin och harts avsnitt ger en tvådimensionell (2D) bild, vilket leder till något sätt att analysera den verkliga storleken och kvantiteten av celler. Cellerna skärs dock slumpmässigt på deras alla plan, medelstorleken på många celler (över 100) från minst tre olika sektioner av vävnadsregionen kan återspegla 2D-morfologiparametrarna (längd, bredd och område) för celler och förhållandet mellan det valda regionområdet till medelcellsområdet kan återspegla mängden celler. Därför är det mycket viktigt för in situ visning och analysera morfologi av celler och lagringsmaterial i olika regioner av utsäde. Paraffinsektionen är den mest lämpliga för att förbereda hela fröstora sektionen, särskilt för stora stora frön7. Cellerna är dock fulla av lagringsmaterial med utsäde utveckling, vilket leder till att det är mycket svårt att få den goda hela frö-storlek avsnitt från sent utveckla frön och mogna frön. Dessutom är paraffinsektionen för tjock för att uppvisa morfologin tydligt, och är endast lämplig för att undersöka vävnadsstrukturen hos frö7.
Hartset avsnitt är tunn, och kan uppvisa morfologi av celler, stärkelse granulat, och protein organ klart7. Den rutinmässiga hartsen är dock inte lämplig för hela frö-storlek avsnitt. Tekniken som presenteras här representerar en snabb, enkel och angelägen strategi för att förbereda transversal och längsgående hela-frö-stora avsnitt av mogna frön inbäddade i harts för visning avmorfologiav celler, stärkelse granulat, och protein organ i olika regioner av utsäde med hjälp av ljusmikroskopi (Figur 2-5,Kompletterande Figur 1 ). Dessutom kan tekniken också förbereda avsnittet för att utveckla, grodda, och kokta frön att in situ undersöka morfologi förändringar av cell, stärkelse, och protein organ i olika regioner av utsäde.
En annan distinkt fördel som denna teknik ger är tillämpningen av hela frö-stora avsnitt. I den nya eran av fenomenik och metabolomik, är det viktigt att kvantitativt mäta morfologi parametrarna för celler, stärkelse granulat, och protein organ i olika regioner av frön. Den nya tekniken, i samband med morfologi analys programvara, gör det möjligt för forskaren att kvantitativt analysera morfologi parametrarna för celler, stärkelse granulat, och protein organ i olika regioner av utsäde (Tilläggstabell 1-4).
Även om den nuvarande torra snittmetoden framgångsrikt kan förbereda hela frö-storlek harts avsnitt, har det vissa begränsningar och brister. För paraffinsektionen kan paraffinen tas bort enkelt från sektionen; men för hartsdelen kan kådan inte tas bort från sektionen, vilket leder till att växtprovet är inbäddat i harts. Jämfört med paraffinsektionen är därför den nuvarande sektionen med hela fröstorleksstorlek inte lämplig att utföra histokemin och immunohistokemin. Dessutom kan rutinhartssektioneringsmetoden skära prover i 0,5-2 μm släta sektioner på grund av provblocket med liten volym. Men den nuvarande torra snittningsmetoden är svår att förbereda de släta sektionerna med tjocklek mindre än 2 μm, särskilt för mogna frön med stor volym och hög stärkelsehalt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Finansiering tillhandahölls av National Natural Science Foundation of China (32071927), Talent Project of Yangzhou University och den prioriterade akademiska programutvecklingen av Jiangsu högre utbildningsinstitutioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501931 | |
| Compact glass staining jar (5-Place) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E678013 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100472 | |
| Coverslip | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518211 | |
| Double-sided blade | Gillette Shanghai Co., Ltd. | 74-S | |
| Ethanol absolute | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500737 | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX60 | |
| Fluorescent brightener 28 | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| Glass strips | Leica | 840031 | |
| Glutaraldehyde 50% solution in water | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600875 | |
| Glycerol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600232 | |
| Iodine | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500538 | |
| Isopropanol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A507048 | |
| Light microscope | Olympus | BX53 | |
| LR White resin | Agar Scientific | AGR1281A | |
| Oven | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd. | 9023A | |
| Potassium iodide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100512 | |
| Slide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518101 | |
| Tweezers | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F519022 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A607793 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A502805 | |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 |
References
- Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
- He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
- Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
- Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
- Hu, Z. Y., et al. Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed. PLoS One. 8 (4), 62099 (2013).
- Huang, Y., et al. Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development. Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).
- Xu, A., Wei, C. Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels. Plant Methods. 16, 8 (2020).
- Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
- Zhao, L., Cai, C., Wei, C. An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells. Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).
- Borisjuk, L., et al. Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape. The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).
- Lott, J. N. A.
- Jing, Y. P., et al. Development of endosperm cells and starch granules in common wheat. Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).
