Artículo de método

Refinado CLARIDAD Basada En La Limpieza De Tejidos Para La Organización De Fibroblastos TridimensionalEs En Corazones De Ratón Sanos Y Lesionados

DOI:

10.3791/62023

⸱

16 de mayo de 2021

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Biochemistry, and Microbiology, University of Cincinnati College of Medicine, 2Division of Molecular Cardiovascular Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Confocal Imaging Core, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un método refinado de claro del tejido fue desarrollado y aplicado al corazón adulto del ratón. Este método fue diseñado para despejar el tejido cardiaco denso, autofluorescente, mientras que mantiene la fluorescencia etiquetada del fibroblasto atribuida a una estrategia genética del reportero.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La enfermedad cardiovascular es la causa más frecuente de mortalidad en todo el mundo y a menudo se caracteriza por una fibrosis cardíaca aumentada que puede conducir a un aumento de la rigidez ventricular con una función cardíaca alterada. Este aumento en fibrosis ventricular cardiaca es debido a la activación de fibroblastos residentes, aunque cómo estas células funcionan dentro del corazón de 3 dimensiones (3-D), en la línea de fondo o después de la activación, no se entienda bien. Para examinar cómo los fibroblastos contribuyen a la enfermedad cardíaca y su dinámica en el corazón 3-D, un método refinado del claro y de la proyección de imagen CLARIDAD-basado del tejido fue desarrollado que muestra los fibroblastos cardiacos fluorescente etiquetados dentro del corazón entero del ratón. Los fibroblastos residentes del tejido fueron etiquetados genético usando los ratones florescentes del reportero de Rosa26-loxP-eGFP cruzados con el fibroblasto cardiaco que expresaba la línea knock-in de Tcf21-MerCreMer. Esta técnica fue utilizada para observar dinámica de la localización del fibroblasto a través del ventrículo izquierdo adulto entero en ratones sanos y en modelos fibróticos del ratón de la enfermedad cardíaca. Interesante, en un modelo de lesión, los patrones únicos de fibroblastos cardiacos fueron observados en el corazón dañado del ratón que siguió las vendas de fibras envueltas en la dirección contráctil. En modelos isquémicos de lesión, ocurrió la muerte del fibroblasto, seguida por la repoblación de la zona fronteriza del infarto. Colectivamente, esta técnica de clarificación de tejido cardíaco refinado y sistema de imágenes digitalizado permite la visualización en 3-D de fibroblastos cardíacos en el corazón sin las limitaciones de la falla de penetración de anticuerpos o problemas anteriores que rodean la fluorescencia perdida debido al procesamiento de tejidos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aunque los cardiomyocytes comprendan la fracción de volumen más grande del corazón, los fibroblastos cardiacos son más abundantes y están implicados críticamente en la regulación de las características estructurales y reparadoras de la línea de fondo de este órgano. Los fibroblastos cardiacos son altamente móviles, mecánicamente responsivos, y fenotípicamente que se extienden dependiendo del grado de su activación. Los fibroblastos cardíacos son necesarios para mantener los niveles normales de matriz extracelular (MEC), y muy poca o demasiada producción de MEC por estas células puede conducir a la enfermedad1,2,3. Dada su importancia en la enfermedad, los fibroblastos cardíacos se han convertido en un tema de investigación cada vez más importante hacia la identificación de nuevas estrategias de tratamiento, especialmente en el intento de limitar la fibrosis excesiva4,5,6,7. Tras la lesión, los fibroblastos se activan y se diferencian en un tipo de célula más sintética conocida como miofibroblasto, que puede ser proliferativa y secretar abundante ECM, así como tener actividad contráctil que ayuda a remodelar los ventrículos.

Mientras que los fibroblastos cardiacos se han evaluado extensivamente para sus propiedades en las culturas 2-D6,8,9,10,mucho menos se entiende de sus propiedades y dinámica en el corazón vivo 3-D, en la línea de fondo o con el estímulo de la enfermedad. Aquí, un método refinado se ha descrito para despejar el tejido del corazón adulto del ratón mientras que mantiene la fluorescencia de fibroblastos etiquetados con un sistema genético del reportero de Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer. Dentro del corazón, Tcf21 es un marcador relativamente específico de fibroblastos quietos4. Después de que el tamoxifeno se administra para activar la proteína MerCreMer inducible, esencialmente todos los fibroblastos quietos expresarán permanentemente la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) del locus Rosa26, lo que permite su seguimiento in vivo.

Existen numerosos protocolos de limpieza de tejidos bien establecidos, algunos de los cuales se han aplicado alcorazón 11,12,13,14,15,16,17. Sin embargo, se ha encontrado que muchos de los reactivos utilizados en diferentes protocolos de limpieza de tejidos apagan las señales endógenas de fluorescencia18. Además, el corazón adulto es difícil de despejar debido a las abundantes proteínas que contienen el grupo heme que generan autofluorescencia19. Por lo tanto, la meta de este protocolo era preservar fluorescencia del marcador del fibroblasto con la inhibición simultánea del autofluorescence del heme en el corazón adulto dañado para la visualización óptima 3-D in vivo12,13,14,16,17,20.

Estudios previos que intentaban examinar el fibroblasto cardíaco in vivo emplearon anticuerpos perfundidos para etiquetar estas células, aunque tales estudios estuvieron limitados por la penetración de anticuerpos y la estructura vascular cardíaca14,16,17,20. Aunque Salamon et al. han demostrado un claro tisular con mantenimiento de la fluorescencia neuronal tópica en el corazón neonatal, y Nehrhoff et al. han demostrado mantenimiento de las células mieloides que marcan la fluorescencia, aún no se ha demostrado el mantenimiento de la fluorescencia endógena a través de toda la pared ventricular, incluida la visualización de fibroblastos cardíacos adultos al inicio o después de una lesión13,20. Este protocolo de limpieza de tejidos refina una mezcla de protocolos anteriores basados en el método CLARITY (hidrgel tisular rígido de acrilamida hibridada por lípidos claros) y PEGASOS (polietilenglicol (PEG)-sistema de disolvente asociado). Este protocolo refinado permitió una examinación más robusta de fibroblastos cardiacos en el corazón del ratón en la línea de fondo y de cómo responden a diversos tipos de lesión. El protocolo es sencillo y reproducible y ayudará a caracterizar el comportamiento de los fibroblastos cardíacos in vivo.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Cincinnati Children's Hospital Medical Center. La institución también cuenta con la certificación AAALAC (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care). Los ratones fueron eutanasiados a través de la dislocación cervical, y los ratones sometidos a procedimientos quirúrgicos de supervivencia recibieron alivio del dolor (ver más abajo). Todos los métodos utilizados para el manejo del dolor y la eutanasia se basan en las recomendaciones del Panel sobre Eutanasia de la Asociación Médica Veterinaria Americana. Todos los ratones fueron alojados en unidades de ropa de cama de mazorca de maíz con agua y alimentos disponibles en todo momento. Los ratones fueron alojados 4 en una jaula con el mismo sexo. Para la cirugía o la limpieza de tejidos no lesionados, se utilizó un número igual de ratones machos y hembras de 6 a 8 semanas de edad.

NOTA: Las condiciones quirúrgicas estériles fueron mantenidas en todas las cirugías. El cirujano se cambió a exfoliantes limpios y una bata estéril y luego se ró fundas de zapatos y una red para el cabello. Luego, el cirujano se frotó las manos con clorhexidina y se ció guantes quirúrgicos estériles. El cirujano fue asistido por un técnico que sedado, afeitado, y fregado el sitio de la incisión 3 veces cada uno, alternando entre el gluconato del chlorohexidine del 2% y el isopropanol del 70%. Los ratones entonces fueron llevados al cirujano, y la cirugía fue realizada. Entre los animales, los instrumentos fueron esterilizados en un esterilizador de cuentas.

1. Recombinación de Cre

  1. Cruz Rosa26-loxP-eGFP ratones (Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) con ratones Tcf21-MerCreMer(Figura 1A)6,21.
  2. Cuando la descendencia de este cruce alcance las 6 semanas de edad, administrar una inyección intraperitoneal de 75 mg/kg de tamoxifeno disuelto en aceite de maíz. 22 Administrar este tamoxifeno dos veces, separadas 48 h (Figura 1B).
  3. Después de las inyecciones de tamoxifeno, ponga a los ratones en una dieta de alimentos de tamoxifeno (~ 0,4 g / kg de citrato de tamoxifeno) durante una semana. Después de una semana de tamoxifeno chow, devolver los ratones a una dieta normal de chow en autoclave durante una semana antes de realizar la cirugía (Figura 1B). Designe un número apropiado de ratones (3 por condición quirúrgica) para que sean controles ilesos. Sacrifique estos ratones y proceda al proceso de limpieza delineado a continuación después de la semana de dieta normal de chow.
  4. Después del régimen de tamoxifeno y recombinación, realice la cirugía.

2. Modelos quirúrgicos

  1. Isquemia/reperfusión (I/R)23,24
    1. Anestesiar ratones con gas isoflurano al 1,5% en aire ambiente en una caja ventilada; afeitarse el pecho y el cuello con cortadoras eléctricas, y luego frotar las áreas afeitadas con un hisopo empapado en gluconato de clorhexidina al 2%.
    2. Use ungüento lagrimal artificial para prevenir la sequedad durante la cirugía colocando ungüento en los ojos de los ratones sedados.
    3. Realice un corte de la mitad del cuello usando tijeras quirúrgicas para permitir la visualización de la tráquea. Intubar con un catéter de 20 G colocando el tubo de intubación en la tráquea y visualizar el catéter traqueal a través de la incisión de la mitad del cuello. Coloque los ratones en un ventilador mientras están sedados con gas isoflurano (1,5%) en el aire de la habitación.
    4. Haga una incisión debajo de la extremidad delantera izquierda con tijeras quirúrgicas y corte los músculos intercostales entre las costillas 3 y 4. Extienda las costillas abiertas usando un retractor.
    5. Coloque una pequeña esponja empapada en solución salina entre el pulmón y el corazón para evitar daños en el pulmón.
    6. Usando una aguja anzuelo (6.5 mm, 3/8 c), ate la arteria coronaria izquierda con un nudo de deslizamiento liberable usando 8-0 prolene.
    7. Retire la esponja con el tórceps.
    8. Suturar los músculos intercostales cerrados usando seda trenzada 4-0 y una sutura continua mientras que también exterioriza el final del 8-0 nudo de deslizamiento de prolene.
    9. Cierre las incisiones de la piel usando adhesivo de tejido tópico con el extremo del nudo de deslizamiento ocluyendo que sobresale.
    10. Después de una hora de oclusión, tire del extremo exterior del nudo de deslizamiento para liberar internamente la oclusión de la arteria coronaria, aliviando la isquemia y causando reperfusión.
    11. Administrar 0,02 mL de buprenorfina de liberación prolongada de 1 mg/mL mediante inyección subdérmica (liberación de 72 h) como analgésico, y colocar los ratones en una cámara de incubación oxigenada a 37 °C, separada de otros animales. Monitoree a los ratones al menos cada 15 minutos hasta que se hayan recuperado de la anestesia y puedan mantener una posición esternal o sentada. Devolver los ratones a su alojamiento regular.
    12. Evalúe a los animales para el dolor y la señal de socorro por 48 h después de cirugía, y monitoree el sitio de la incisión diariamente hasta que esté completamente curado.
    13. Observe a los ratones para la hidratación, la nutrición y el bienestar general después de la cirugía hasta el sacrificio.
  2. Infarto de miocardio (IM)25,26,27
    1. Realice los pasos 2.1.1–2.1.7.
    2. Use una sutura continua para cerrar los músculos intercostales usando seda trenzada 4-0.
    3. Cierre la incisión de la piel usando adhesivo de tejido tópico.
    4. Realice los pasos 2.1.11–2.1.13.
  3. Infusión de bomba micro-osmótica de angiotensina II/fenilefrina
    1. Preparar Preparar preparar una solución de trabajo de 10 μg/μL de angiotensina II y 500 μg/μL de solución de trabajo de fenilefrina en condiciones estériles (es decir, en una campana de flujo laminar) añadiendo 1 mg de angiotensina II a 100 μL de solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS) y 250 mg de clorhidrato de fenilefrina en 500 μL de PBS.
    2. Calcular la dilución de cada solución de trabajo y el volumen final a dispensar a la bomba micro-osmótica en función del peso del ratón.
      NOTA: Por ejemplo, un ratón de 20 g requiere 20 g x 14 días x 1,5 μg/día = 420 μg de angiotensina, o 42 μL de solución de trabajo, así como 20 g x 14 días x 50 μg/día = 14000 μg de clorhidrato de fenilefrina, o 28 μL de solución de trabajo.
    3. Para el peso de cada ratón, diluya el stock de trabajo de la droga en PBS estéril y llene las bombas micro-osmóticas (0.25 μL/h, 14 días, aproximadamente 100 μL) usando una aguja de 27 G y una jeringa de 1 mL.
      NOTA: Esto generará un caudal de 1,5 μg∙g-1∙día-1 de angiotensina II y 50 μg∙g-1∙día-1 de clorhidrato de fenilefrina una vez colocado en los ratones.
    4. Anestesiar los ratones con inhalación de isoflurano al 1,5% (a efecto) en una cámara ventilada que contiene aire ambiente.
    5. Coloque los ratones anestesiados en una mesa quirúrgica estéril en posición de opina, y mantenga la anestesia con inhalación de gas isoflurano (1,5%) a través de un cono de la nariz.
    6. Use ungüento lagrimal artificial en los ojos del animal para prevenir la sequedad durante la cirugía.
    7. Afeitar el pelaje sobre el área de implantación con cortadoras de pelo eléctricas, y esterilizar el área a cortar usando etanol y un hisopo estéril. Haga una pequeña incisión (aproximadamente 1 cm) con tijeras quirúrgicas en la capa epidérmica de la piel del ratón en el lado lateral derecho de la espalda, debajo del omóplato. Use los lados apagados de un par de tijeras quirúrgicas para estirar suavemente la piel dentro y alrededor del área de implantación para insertar la minibomp.
    8. Coloque la bomba micro-osmótica dentro de la incisión y manioble físicamente a la izquierda de la línea media dorsal del ratón masajeando manualmente la bomba debajo de la piel.
    9. Cierre la incisión a través de la sutura continua usando seda 4-0 con una aguja de punto cónico.
    10. Después de la implantación de la bomba, administre buprenorfina de liberación lenta a una dosis de 0,1 mg/kg de peso corporal mediante inyección subdérmica para la analgesia (liberación lenta de 72 h). Coloque los ratones en una cámara de incubación oxigenada a 37 °C, separada de otros animales. Monitoree a los ratones al menos cada 15 minutos hasta que se recuperen de la anestesia y puedan mantener una posición esternal o sentada.
    11. Tras la recuperación de la anestesia en la cámara de calentamiento de 37 °C, coloque los ratones de nuevo en sus unidades de alojamiento estándar.
    12. Monitoree los ratones para el dolor y la señal de socorro por 48 h después de cirugía, y monitoree el sitio de la incisión diariamente hasta que esté completamente curado.
    13. Observe a los ratones para la hidratación, la nutrición y el bienestar general después de la cirugía hasta el sacrificio.

3. Limpieza de corazones de ratón adultos utilizando un protocolo CLARITY activo modificado

  1. Prepare un área quirúrgica limpia esterilizando la superficie de la cirugía y todas las herramientas quirúrgicas con etanol al 70%. Preparar una solución de PBS frío 1x y paraformadehído al 4% (PFA) en PBS (100 mL cada uno). Use guantes, bata de laboratorio, máscara facial y protección para los ojos.
  2. Prepare el almacenador intermediario de la heparina diluyendo 10 unidades de heparina en la solución del cloruro de sodio del 0,9% w/v. Inyecte a cada ratón por vía intraperitoneal 60 μL de heparina-NaCl usando una jeringa de 1 mL y una aguja de 27 G.
  3. Cinco minutos después de la inyección de heparina-NaCl solución, anestesiar los ratones utilizando 1.5% isoflurano inhalación (a efecto) en una cámara ventilada que contiene aire ambiente.
  4. Eutanasiar a los ratones por dislocación cervical, en la que la parte posterior de la cabeza se sostiene con el extremo plano y cerrado de las medidas de sudadera, mientras que la columna vertebral se disloca tirando de la cola.
  5. Limpie la superficie ventral del ratón con etanol al 70% en un hisopo de algodón. Haga una incisión transversal de 3 cm aproximadamente 3 cm por debajo del proceso xifoideo usando tijeras quirúrgicas.
  6. Separe la piel del tejido subyacente de la pared abdominal desgastando el abdomen hasta el proceso xifoides (sostenga la piel más cercana a la cola y tire de la piel más cercana a la cabeza hacia arriba hacia la caja torácica). Haga una incisión transversal de 2 cm en el tejido subcutáneo de la pared abdominal 3 cm por debajo del proceso xifoideo usando tijeras quirúrgicas. Haga un corte vertical de esta incisión transversal, hasta la línea media y a través de la caja torácica. Fije la caja torácica hacia atrás, exponiendo el corazón.
  7. Use una aguja de 27 G y una jeringa de 10 ml para inyectar PBS frío en la vena cava superior y la aorta (cualquier manipulación posicional del corazón debe hacerse cuidadosamente con fórceps contundentes para evitar la punción) para eliminar la sangre del corazón.
    NOTA: La perfusión suficiente se puede observar por la contracción de la cola y la decoloración de los pulmones.
  8. Use una aguja de 27 G y una jeringa de 10 ml para inyectar PFA fría al 4% en la vena cava superior y la aorta para comenzar el proceso de fijación.
  9. Extirpar los corazones. Las aurículas, el ventrículo derecho y el tabique, y el ventrículo izquierdo deben separarse usando un bisturí de hoja recta. Coloque este tejido en un tubo centrífugo de 15 mL lleno de PFA frío al 4%, y colóquelo en un nutator a 4 °C durante la noche.
  10. Lave el corazón 3 veces durante 1 h cada una con 1x PBS frío para eliminar el exceso de PFA.
  11. Prepare el hidrogel (denominado A4P0 para la composición relativa de acrilamida / poliacrilamida) mezclando los siguientes productos químicos en un tubo de centrífuga de 15 mL: 10% de acrilamida al 40%, 10% 1x PBS, 80% de agua destilada.
  12. Añadir la solución al 0,25% del fotoiniciador (2,2-Azobis[2-(2-imidazolina-2il)propano)dihidrocloruro) a la solución de hidrogel justo antes de sumergir el corazón en el hidrogel.
  13. Coloque el corazón en un tubo cónico que contenga el hidrogel. Envuelva el tubo cónico en papel de aluminio e incube durante la noche a 4 °C sin molestias físicas.
  14. Después de aproximadamente 14 h a 4 °C, mueva el tubo cónico que contiene el corazón a un baño de cuentas de 37 °C.
  15. Después de 2.5 h en el baño de cuentas, retire el corazón del hidrogel cuidadosamente con fórceps.
  16. Lave los corazones 3 veces durante 1 h cada uno en un tubo cónico de 15 mL que contenga 1x PBS a 37 °C en un nutator.
  17. Coloque los corazones en la cesta de la máquina de electroforesis activa usando pórceps, y coloque la tapa en la cesta. Asegúrese de que la tapa esté bien en su lugar.
  18. Llene el depósito de la cámara de electroforesis activa con una solución de limpieza electroforética vertiendo la solución en la cámara.
  19. Una vez que la cámara está llena de solución de limpieza electroforética, la cesta que contiene el corazón se puede sumergir. Coloque la tapa en la máquina de electroforesis de forma segura.
  20. Haga funcionar la máquina de electroforesis a 1,5 A, 37 °C durante 1,5 h.
  21. Después de 1,5 h de electroforesis, revise los corazones visualmente para asegurarse de que no queda tejido opaco. Si las regiones del tejido todavía son opacas, vuelva a sumergir el corazón en una solución de electroforesis en la cámara electroforética y continúe con la electroforesis durante 0,5 h a la vez.
    NOTA: La electroforesis debe interrumpirse ante los primeros signos de daño tisular (por ejemplo, deshilachamiento tisular).
  22. Lave los corazones en un tubo cónico de 15 mL que contenga 1x PBS durante 1 h, 3 veces cada uno, a 37 °C en un nutator.
  23. Sumerja los corazones en un tubo cónico de 15 mL que contenga N,N,N′, N′-Tetrakis(2-Hidroxipropil)etilendiamina, un agente decolorante que reduce la autofluorescencia del heme.
    NOTA: Esta solución debe cambiarse cada 24 h hasta que los corazones estén completamente claros (aproximadamente 2 días).
  24. Lave los corazones en un tubo cónico de 15 mL con 1x PBS 3 veces durante 1 h cada uno para eliminar el exceso de agente decolorante.
  25. Prepare la solución de emparejamiento del índice de refracción (RIMS) combinando 30 mL de tampón de fosfato de 0,02 M, 40 g de 5-(N-2, 3-dihidroxipropilacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,N'-bis (2, 3 dihidroxipropil) isoftalamida con agitación (debe disolverse por completo, esto puede tardar hasta una hora), 5 mg de azida de sodio, 50 μL de Tween20 y 1 g de 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano, y ajuste el pH a 7.5.
  26. Equilibre los corazones en RIMS durante 48 h antes de la toma de imágenes.

4. Imágenes despejó los corazones usando un microscopio confocal de fotón único vertical

NOTA: El aparato de imágenes consiste en la mitad inferior de una placa de Petri de vidrio de 10 cm, un depósito inferior impreso en 3D, una cubierta de vidrio redonda y un depósito superior impreso en 3D(Figura 1C-E). Los materiales impresos en 3D fueron hechos internamente por el Departamento de Ingeniería Clínica del Hospital de Niños de Cincinnati.

  1. Utilice la grasa de vacío para sellar el depósito inferior impreso en 3D en una placa de Petri de vidrio colocando una capa delgada de grasa de vacío en la parte inferior de la pieza impresa en 3D (Figura 1C).
    NOTA: El depósito debe tener la misma altura que la muestra que se está tomando la imagen (es decir, la muestra no debe ser comprimida por la cubierta de vidrio colocada encima de ella, y la muestra tampoco debe ser capaz de flotar y moverse dentro del depósito).
  2. Llene el depósito con RIMS y retire todas las burbujas con una punta de pipeta. Coloque el corazón en el RIMS cuidadosamente con la pared ventricular izquierda hacia arriba, asegurándose de que no se introduzcan burbujas en la solución.
  3. Adhiera una tapa de vidrio a la superficie inferior de la pieza de depósito superior impresa en 3D(Figura suplementaria 1A)utilizando grasa de vacío (de nuevo colocando una capa delgada de grasa de vacío sobre la pieza impresa en 3D y colocándola en el resguardo de la cubierta) (Figura 1D).
  4. Coloque la tapa de vidrio y el depósito superior, el lado de la cubierta hacia abajo, sobre el depósito inferior(Figura suplementaria 1B),sin la introducción de burbujas. La adhesión entre las LLANTAS y el deslizamiento de la cubierta proporcionará un sello entre las piezas del depósito superior e inferior (Figura 1E).
  5. Llene el depósito superior con glicerol para su uso con un objetivo de inmersión de glicerol 10x.
  6. Utilice un solo microscopio de fotones equipado con un cabezal de exploración confocal multifotón para obtener imágenes de los corazones despejados.
  7. Baje la etapa del microscopio de fotón único y coloque la placa de Petri que contiene la muestra en el centro del escenario. Eleve el escenario y baje el objetivo de inmersión de glicerol 10x en el glicerol en el depósito superior del aparato de la muestra. Asegúrese de que la muestra esté enfocada mirando el borde de la muestra usando los oculares.
  8. Cambie de la vista del ocular a la vista de la cámara en la computadora haciendo clic en el botón en vivo.
    1. Establezca los parámetros X e Y localizando primero la parte más ancha de la muestra de tejido, que debe estar en la parte inferior de la placa de Petri.
    2. Haga clic en Adquisición de ND y multipunto personalizado. Cree multipuntos encontrando primero el centro de la muestra de tejido utilizando el joystick para barrer de izquierda a derecha y de arriba a abajo.
    3. Luego, según el tamaño del tejido, determine el tamaño de mosaico necesario (generalmente 6 x 5 para un corazón de ratón de 6 a 8 semanas de edad). Para ello, ejecute imágenes de prueba capturando solo los parámetros X e Y (desmarque z en la pestaña Adquisición de ND)para comprobar si se capturó toda la longitud y anchura del tejido.
  9. Para establecer los parámetros z, abra la navegación XYZy haga clic en los iconos arriba y abajo hasta encontrar la parte superior e inferior de la muestra.
    1. Abra el panel de corrección de intensidad Z y ajuste la fluorescencia en la parte superior, media e inferior del tejido para corregir la densidad del tejido aumentando o disminuyendo la potencia del láser en cada punto z. Configúrándolos haciendo clic en la flecha de conjunto a la derecha del panel Corrección de intensidad Z.
    2. Establezca el tamaño del paso Z en el panel Adquisición de ND en 5 μm.
  10. Después de que se delineen los parámetros X, Y y Z del corazón y se establezca la corrección de la intensidad z, utilice el microscopio vertical automatizado con un objetivo de inmersión de glicerol 10x con un escáner resonante y tubos fotomultiplicadores de fosfuro de arseniuro de galio (PMP GaAsP) para obtener imágenes de los corazones despejados. Asegúrese de que las fichas XY y Z estén marcadas en Adquisición de NDy pulse Ejecutar corrección Z.
  11. Cose, desenrede y denoise las imágenes resultantes abriendo la imagen multipunto en el software de procesamiento y haciendo clic en el botón de puntada. En imagen, haga clic en desmezclado ciego, 2 canales, y luego encontrar. y debajo de la imagen,haga clic en denoise.ai,luego haga clic en el canal fluorescente de elección (es decir, GFP).
    NOTA: Este proceso da como resultado una imagen 3D de fibroblastos GFP positivos en todo el ventrículo izquierdo.
  12. Utilice un software de análisis secundario para identificar aún más los patrones y tendencias en la dispersión de los fibroblastos cardíacos. Utilice la función Spots ejecutando el programa del asistente de spots.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los fibroblastos cardiacos son esenciales para la función de la línea de fondo del corazón así como para la respuesta a lesión cardiaca. Las tentativas anteriores de entender el arreglo y la morfología de estas células se han conducido en gran parte en ajustes 2-D. Sin embargo, se ha publicado una técnica de limpieza de tejido cardíaco refinada(Figura 2)y de imagen 3-D, que permite la visualización avanzada y más detallada de los fibroblastos cardíacos. Con esta técnica de imagen, se encontr...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo presenta un método refinado para el claro del tejido que permita la visualización de fibroblastos cardiacos in vivo, en la línea de fondo y lesión siguiente, para caracterizar y para entender mejor los fibroblastos en el corazón del ratón. Este protocolo mejorado aborda las limitaciones en los protocolos de limpieza de tejidos existentes que han intentado identificar tipos específicos de células en el corazón adulto o neonatal12,13,

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen revelaciones relacionadas con el contenido de este manuscrito.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A los autores les gustaría reconocer al CCHMC Confocal Imaging Core por su asistencia y orientación en el desarrollo de este modelo, así como a Matt Batie de Clinical Engineering por el diseño de todas las piezas impresas en 3D. Demetria Fischesser fue apoyada por una beca de capacitación de los Institutos Nacionales de Salud , (NHLBI, T32 HL125204) y Jeffery D. Molkentin fue apoyado por el Instituto Médico Howard Hughes.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
4-0 seda trenzadaEthiconK871H
8-0 proleneEthicon8730H
40% Acrylamida SolutionBio-Rad1610140
Angiotensina IISigmaA9525-50G
Pomada de lágrimasartificiales Covetrus048272
DABCO (1,4-diazabiciclo[2.2. 2]octano)Millipore SigmaD27802-25G
GLUtura adhesivo tisular tópicoWorld Precision Instruments503763
HeparinaSigmaH0777
Imaris Start Software de análisisOxford InstrumentsN/A Bombas
microosmóticasAlzetModelo 1002
Nikon Software de análisis de elementosNikonN/A
Microscopio vertical Nikon A1R HDNikonN/A
Normal chow en autoclaveLabdiet5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihidroxipropilalacetamido)-2, 4, 6-tri-yodo-N,
N'-bis (2, 3 dihidroxipropil) isofalamida		CosmoBioAXS-1002424
ParaformaldehídoMicroscopía Electrónica Ciencias15710
Clorhidrato de fenilefrinaSigmaP6126-10G
FotoiniciadorWako ChemicalsVA-044
Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-GT(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]Jackson LaboratoriesJax Nº de inventario:012429
Azida de sodioSigma AldrichS2002-5G
solución de cloruro de sodioHospira, Inc.NDC 0409-4888-10
TamoxifenoSigma AldrichT5648
Tamoxifeno alimentoEnvigoTD.130860
Tween-20Thermo Fisher ScientificBP337-500
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hidroxipropil)etilendiamina, agente decoloranteMillipore Sigma122262-1L
X-Clarity cámara de limpieza electroforéticaLogos BiosystemsC30001
X-Clarity solución de limpieza electroforéticaLogosBiosystems C13001
Cesta de pañuelos para electroforesis X-ClarityLogos BiosystemsC12001
Soporte para cesta de pañuelos para electroforesis X-ClarityLogos BiosystemsC12002

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).
  2. Yoon, S., Eom, G. H. Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions. Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).
  3. Borlaug, B. A., Redfield, M. M. Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum. Circulation. 123, 2006-2014 (2011).
  4. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the cardiac fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
  5. Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).
  6. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260(2016).
  7. Sadeghi, A. H., et al. Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling. Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434(2017).
  8. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  9. Bruns, D. R., et al. The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation. PLoS One. 14 (8), 0220573(2019).
  10. Skiöldebrand, E., et al. Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion. Heliyon. 3 (10), 00406(2017).
  11. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  12. Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
  13. Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).
  14. Wang, Z., et al. Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution. Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).
  15. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  16. Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12 (7), 0182072(2017).
  17. Perbellini, F., et al. Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue. Scientific Reports. 7, 5188(2017).
  18. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
  19. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  20. Nehrhoff, I., et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).
  21. Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).
  22. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  23. Means, C. K., et al. Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).
  24. Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).
  25. Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
  26. Patten, R. D., et al. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).
  27. Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).
  28. Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2020).
  29. Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).
  30. Arts, T., et al. Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle. Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).
  31. Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).
  32. Hashmi, S., Al-Salam, S. Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Tissue ClearingCardiac FibroblastsCLARITY ProtocolThree Dimensional ImagingMouse HeartCardiac InjuryConfocal MicroscopyFibrosis ModelElectrophoretic ClearingFluorescent Labeling

Artículos relacionados