Un método refinado de claro del tejido fue desarrollado y aplicado al corazón adulto del ratón. Este método fue diseñado para despejar el tejido cardiaco denso, autofluorescente, mientras que mantiene la fluorescencia etiquetada del fibroblasto atribuida a una estrategia genética del reportero.
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Artículo de método
Refinado CLARIDAD Basada En La Limpieza De Tejidos Para La Organización De Fibroblastos TridimensionalEs En Corazones De Ratón Sanos Y Lesionados
En este artículo
Resumen
Resumen
La enfermedad cardiovascular es la causa más frecuente de mortalidad en todo el mundo y a menudo se caracteriza por una fibrosis cardíaca aumentada que puede conducir a un aumento de la rigidez ventricular con una función cardíaca alterada. Este aumento en fibrosis ventricular cardiaca es debido a la activación de fibroblastos residentes, aunque cómo estas células funcionan dentro del corazón de 3 dimensiones (3-D), en la línea de fondo o después de la activación, no se entienda bien. Para examinar cómo los fibroblastos contribuyen a la enfermedad cardíaca y su dinámica en el corazón 3-D, un método refinado del claro y de la proyección de imagen CLARIDAD-basado del tejido fue desarrollado que muestra los fibroblastos cardiacos fluorescente etiquetados dentro del corazón entero del ratón. Los fibroblastos residentes del tejido fueron etiquetados genético usando los ratones florescentes del reportero de Rosa26-loxP-eGFP cruzados con el fibroblasto cardiaco que expresaba la línea knock-in de Tcf21-MerCreMer. Esta técnica fue utilizada para observar dinámica de la localización del fibroblasto a través del ventrículo izquierdo adulto entero en ratones sanos y en modelos fibróticos del ratón de la enfermedad cardíaca. Interesante, en un modelo de lesión, los patrones únicos de fibroblastos cardiacos fueron observados en el corazón dañado del ratón que siguió las vendas de fibras envueltas en la dirección contráctil. En modelos isquémicos de lesión, ocurrió la muerte del fibroblasto, seguida por la repoblación de la zona fronteriza del infarto. Colectivamente, esta técnica de clarificación de tejido cardíaco refinado y sistema de imágenes digitalizado permite la visualización en 3-D de fibroblastos cardíacos en el corazón sin las limitaciones de la falla de penetración de anticuerpos o problemas anteriores que rodean la fluorescencia perdida debido al procesamiento de tejidos.
Introducción
Aunque los cardiomyocytes comprendan la fracción de volumen más grande del corazón, los fibroblastos cardiacos son más abundantes y están implicados críticamente en la regulación de las características estructurales y reparadoras de la línea de fondo de este órgano. Los fibroblastos cardiacos son altamente móviles, mecánicamente responsivos, y fenotípicamente que se extienden dependiendo del grado de su activación. Los fibroblastos cardíacos son necesarios para mantener los niveles normales de matriz extracelular (MEC), y muy poca o demasiada producción de MEC por estas células puede conducir a la enfermedad1,2,
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Protocolo
Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Cincinnati Children's Hospital Medical Center. La institución también cuenta con la certificación AAALAC (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care). Los ratones fueron eutanasiados a través de la dislocación cervical, y los ratones sometidos a procedimientos quirúrgicos de supervivencia recibieron alivio del dolor (ver más abajo). Todos los métodos utilizados para el manejo del dolor y la eutanasia se basan en las recomendaciones del Panel sobre Eutanasia de la Asociación Médica Veterinaria Americana. Todos los ratones fuer....
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Resultados
Los fibroblastos cardiacos son esenciales para la función de la línea de fondo del corazón así como para la respuesta a lesión cardiaca. Las tentativas anteriores de entender el arreglo y la morfología de estas células se han conducido en gran parte en ajustes 2-D. Sin embargo, se ha publicado una técnica de limpieza de tejido cardíaco refinada(Figura 2)y de imagen 3-D, que permite la visualización avanzada y más detallada de los fibroblastos cardíacos. Con esta técnica de imagen, se encontr.......
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Discusión
Este artículo presenta un método refinado para el claro del tejido que permita la visualización de fibroblastos cardiacos in vivo, en la línea de fondo y lesión siguiente, para caracterizar y para entender mejor los fibroblastos en el corazón del ratón. Este protocolo mejorado aborda las limitaciones en los protocolos de limpieza de tejidos existentes que han intentado identificar tipos específicos de células en el corazón adulto o neonatal12,13,
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Divulgaciones
Los autores no tienen revelaciones relacionadas con el contenido de este manuscrito.
Agradecimientos
A los autores les gustaría reconocer al CCHMC Confocal Imaging Core por su asistencia y orientación en el desarrollo de este modelo, así como a Matt Batie de Clinical Engineering por el diseño de todas las piezas impresas en 3D. Demetria Fischesser fue apoyada por una beca de capacitación de los Institutos Nacionales de Salud , (NHLBI, T32 HL125204) y Jeffery D. Molkentin fue apoyado por el Instituto Médico Howard Hughes.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 4-0 seda trenzada | Ethicon | K871H | |
| 8-0 prolene | Ethicon | 8730H | |
| 40% Acrylamida Solution | Bio-Rad | 1610140 | |
| Angiotensina II | Sigma | A9525-50G | |
| Pomada de lágrimas | artificiales Covetrus | 048272 | |
| DABCO (1,4-diazabiciclo[2.2. 2]octano) | Millipore Sigma | D27802-25G | |
| GLUtura adhesivo tisular tópico | World Precision Instruments | 503763 | |
| Heparina | Sigma | H0777 | |
| Imaris Start Software de análisis | Oxford Instruments | N/A Bombas | |
| microosmóticas | Alzet | Modelo 1002 | |
| Nikon Software de análisis de elementos | Nikon | N/A | |
| Microscopio vertical Nikon A1R HD | Nikon | N/A | |
| Normal chow en autoclave | Labdiet | 5010 | |
| Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihidroxipropilalacetamido)-2, 4, 6-tri-yodo-N, N'-bis (2, 3 dihidroxipropil) isofalamida | CosmoBio | AXS-1002424 | |
| Paraformaldehído | Microscopía Electrónica Ciencias | 15710 | |
| Clorhidrato de fenilefrina | Sigma | P6126-10G | |
| Fotoiniciador | Wako Chemicals | VA-044 | |
| Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-GT(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Nº de inventario:012429 | |
| Azida de sodio | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| solución de cloruro de sodio | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Tamoxifeno | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Tamoxifeno alimento | Envigo | TD.130860 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hidroxipropil)etilendiamina, agente decolorante | Millipore Sigma | 122262-1L | |
| X-Clarity cámara de limpieza electroforética | Logos Biosystems | C30001 | |
| X-Clarity solución de limpieza electroforética | Logos | Biosystems C13001 | |
| Cesta de pañuelos para electroforesis X-Clarity | Logos Biosystems | C12001 | |
| Soporte para cesta de pañuelos para electroforesis X-Clarity | Logos Biosystems | C12002 |
Referencias
- Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).
- Yoon, S., Eom, G. H.
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Reimpresiones y permisos
