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Artículo de método

Explantes de tumores derivados de pacientes como una plataforma preclínica "viva" para predecir la resistencia a los medicamentos en pacientes

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DOI:

10.3791/62130

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7 de febrero de 2021

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1Leicester Cancer Research Center, University of Leicester, 2MRC Toxicology Unit

En este artículo

Resumen

Este artículo describe métodos para la generación, el tratamiento farmacológico y el análisis de explantes derivados del paciente para evaluar las respuestas a los medicamentos tumorales en un sistema modelo preclínico vivo, relevante para el paciente.

Resumen

La comprensión de la resistencia a los medicamentos y el desarrollo de nuevas estrategias para sensibilizar a los cánceres altamente resistentes dependen de la disponibilidad de modelos preclínicos adecuados que puedan predecir con precisión las respuestas de los pacientes. Una de las desventajas de los modelos preclínicos existentes es la incapacidad de preservar contextualmente el microambiente tumoral humano (EMT) y representar con precisión la heterogeneidad intratumoral, limitando así la traducción clínica de los datos. Por el contrario, al representar el cultivo de fragmentos vivos de tumores humanos, la plataforma de explante derivado del paciente (PDE) permite examinar las respuestas a los medicamentos en un contexto tridimensional (3D) que refleja las características patológicas y arquitectónicas de los tumores originales lo más cerca posible. Informes previos con PDE han documentado la capacidad de la plataforma para distinguir tumores quimiosensibles de los quimiorresistentes, y se ha demostrado que esta segregación es predictiva de las respuestas de los pacientes a las mismas quimioterapias. Simultáneamente, las PDE permiten la oportunidad de interrogar las características moleculares, genéticas e histológicas de los tumores que predicen las respuestas a los medicamentos, identificando así biomarcadores para la estratificación del paciente, así como nuevos enfoques intervencionistas para sensibilizar a los tumores resistentes. Este documento informa sobre la metodología PDE en detalle, desde la recolección de muestras de pacientes hasta el análisis de punto final. Proporciona una descripción detallada de la derivación de explantes y los métodos de cultivo, destacando las condiciones a medida para tumores particulares, cuando corresponda. Para el análisis de endpoints, hay un enfoque en la inmunofluorescencia multiplexada y las imágenes multiespectrales para el perfil espacial de biomarcadores clave dentro de las regiones tumorales y estromales. Al combinar estos métodos, es posible generar datos cuantitativos y cualitativos de respuesta a los medicamentos que pueden relacionarse con diversos parámetros clínicopatológicos y, por lo tanto, potencialmente utilizarse para la identificación de biomarcadores.

Introducción

El desarrollo de agentes anticancerígenos eficaces y seguros requiere modelos preclínicos adecuados que también puedan proporcionar información sobre los mecanismos de acción que pueden facilitar la identificación de biomarcadores predictivos y farmacodinámicos. Se sabe que la heterogeneidad inter e intratumoral1,2,3,4,5 y la TME6, 7,8,9,10,11,12 influyen en las respuestas a los medicamentos contra el cáncer, y muchos modelos de cáncer preclínicos existentes, como líneas celulares, organoides y modelos de ratón, no pueden acomodar completamente estos modelos cruciales. Funciones. Un modelo "ideal" es aquel que puede recapitular las complejas interacciones espaciales de las células malignas con las no malignas dentro de los tumores, así como reflejar las diferencias regionales dentro de los tumores. Este artículo se centra en las PDE como una plataforma emergente que puede cumplir muchos de estos requisitos13.

El primer ejemplo del uso de PDE humanos, también conocidos como histocultivos, se remonta a finales de la década de 1980 cuando Hoffman et al. generaron rebanadas de tumores humanos recién resecados y los cultivaron en una matriz de colágeno14,15. Esto implicó el establecimiento de un sistema de cultivo 3D que preservó la arquitectura del tejido, asegurando el mantenimiento de los componentes del estroma y las interacciones celulares dentro de la EMT. Sin deconstruir el tumor original, Hoffman et al.16 anunciaron un nuevo enfoque de investigación traslacional, y desde entonces, muchos grupos han optimizado diferentes métodos de explante con el objetivo de preservar la integridad del tejido y generar datos precisos de respuesta al fármaco17,18,19,20,21,22,23,24 , aunque son evidentes algunas diferencias entre protocolos. Butler et al. cultivaron explantes en esponjas de gelatina para ayudar a la difusión de nutrientes y fármacos a través de los especímenes20,21,25,mientras que Majumder et al. crearon un ecosistema tumoral cultivando explantes sobre una matriz compuesta por proteínas tumorales y estromales en presencia de suero autólogo derivado del mismo paciente22, 23.

Más recientemente, nuestro grupo estableció un protocolo por el cual los explantes se generan por fragmentación de tumores en piezas de 2 a 3 mm de tamaño 3 queluegose colocan sin componentes adicionales en membranas permeables en la interfaz aire-líquido de un sistema de cultivo24. Tomados en conjunto, estos numerosos estudios han demostrado que los PDE permiten el cultivo de fragmentos intactos y vivos de tumores humanos que conservan la arquitectura espacial y la heterogeneidad regional de los tumores originales. En los experimentos originales, los explantes o histocultivos generalmente se sometieron a homogeneización después del tratamiento farmacológico, después de lo cual se aplicaron varios ensayos de viabilidad a las muestras homogeneizadas, como el ensayo de respuesta al fármaco de histocultivo20,21, el ensayo MTT (3-(6)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), el ensayo de lactato deshidrogenasa o el ensayo basado en resazurina26,27,28 . Los avances recientes en las técnicas de análisis de endpoints, particularmente la patología digital, han ampliado el repertorio de pruebas y ensayos de endpoints que se pueden realizar en explantes29,30. Para aplicar estas nuevas tecnologías, en lugar de homogeneización, los explantes se fijan en formalina, se incrustan en parafina (FFPE) y luego se analizan mediante técnicas de inmunotinción, lo que permite el perfil espacial. Se han documentado ejemplos de este enfoque para el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), el cáncer de mama, el cáncer colorrectal y los explantes de mesotelioma mediante los cuales se utilizó tinción inmunohistoquímica para el marcador de proliferación, Ki67, y el marcador apoptótico, poli-ADP ribosa polimerasa escindida (cPARP), para monitorear los cambios en la proliferación celular y la muerte celular24,31,32,33,34.

La inmunofluorescencia multiplexada es particularmente susceptible de perfil espacial de las respuestas farmacológicas en explantes en el punto final35. Por ejemplo, es posible medir la relocalización y distribución espacial de clases específicas de células inmunes, como macrófagos o células T, dentro de la EMT tras el tratamiento farmacológico13,36,37,38,e investigar si un agente terapéutico puede favorecer la transición de "tumor frío" a "tumor caliente"39 . En los últimos años, este grupo se ha centrado en la derivación de PDE de diferentes tipos de tumores (NSCLC, cáncer renal, cáncer de mama, cáncer colorrectal, melanoma) y la prueba de una variedad de agentes anticancerígenos que incluyen quimioterapias, inhibidores de moléculas pequeñas e inhibidores del punto de control inmunitario (ICI). Los métodos de análisis de endpoints se han optimizado para incluir inmunofluorescencia multiplexada para permitir el perfil espacial de biomarcadores de viabilidad, así como biomarcadores para diferentes constituyentes de la EMT.

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Protocolo

1. Recolección de tejidos

  1. Después de la cirugía, transfiera muestras de tumores humanos recién resecados a un tubo que contenga 25 ml de medio de cultivo fresco (el medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con 4,5 g / L de glucosa y L-glutamina + 1% (v / v) suero fetal de pantorrilla + 1% de penicilina-estreptomicina) y almacenado en hielo. Procese el explante dentro de las 2 h de la cirugía en una campana estéril de clase II.

2. Preparación de Explant

  1. Limpie todo el equipo quirúrgico (cuchillas de injerto/superficie de cera dental/pinzas) con una solución de alcohol metilado industrial (IMS) al 70%.
  2. Llene un plato de cultivo de 10 cm (ver la Tabla de Materiales)con ~ 25 ml de medio fresco y colóquelo sobre un lecho de hielo.
  3. Usando pinzas, transfiera la muestra a una superficie de cera dental (consulte la Tabla de materiales)y corte el tejido en fragmentos de aproximadamente 2–3 mm3 usando dos cuchillas de injerto de piel.
    NOTA: Para obtener el mejor rendimiento, comience a cortar el tejido para obtener una tira individual de 2 a 3 mm de grosor, y luego corte la tira a lo largo de la longitud para obtener los explantes finales. Repita el proceso hasta que se corte toda la muestra.
  4. Transfiera los explantes rápidamente al medio de cultivo helado en el plato de 10 cm. Tome una proporción de los explantes (6-9 piezas), colóquelos en un tubo de 1 ml que contenga 10% de solución de formalina no tamponada y déjelos a temperatura ambiente (RT) durante 24 h.
    NOTA: Estos fragmentos representarán los explantes de control para la condición "no cultivada".
  5. Llene el número deseado de pocillos de placas de 6 pocillos con 1,5 ml de medio fresco por pozo, y coloque un disco de inserción de cultivo organotípico (consulte la Tabla de materiales)en cada pozo para que flote sobre el medio, evitando cuidadosamente las burbujas de aire en la interfaz de inserción de medios.
  6. Seleccione explantes al azar y colóquelos uno a la vez en la parte superior del disco de inserción. Para ser consistente con la condición "no cultivada", use de 6 a 9 explantes por pozo. Coloque la placa multipozo en una incubadora de CO2 a 37 °C y 5% co2,y permita que los explantes se recuperen durante 16 h.
    NOTA: Para evitar aplastar el tejido, se recomienda un manejo suave de las pinzas.

3. Tratamiento farmacológico

  1. Después de 16 h, tome nuevas placas de 6 pocillos, agregue 1.5 ml de medio fresco a cada pozo, agregue los medicamentos relevantes a las concentraciones deseadas e incluya un pozo para el control del vehículo. Usando las pinzas, mueva cada inserto que contiene los explantes a las placas de 6 pocillos recién preparadas que contienen los medicamentos. Coloque las placas en la incubadora de CO2 a 37 °C y al 5% de CO2 durante 24-48 h.
  2. Transfiera los explantes no cultivados previamente fijados en formalina a un casete histológico (ver sección 4 a continuación) y guárdelo en un IMS al 70% hasta el final del experimento.

4. Procesamiento histológico

  1. Fijación tisular
    1. Después del tratamiento farmacológico, transfiera los discos de inserción que contienen los explantes a nuevas placas de 6 pocillos que contienen 10% de formalina y agregue unas gotas de formalina al 10% en la parte superior de los explantes para garantizar una cobertura completa con el fijador.
      PRECAUCIÓN: La formalina es peligrosa. Evite cualquier contacto con la piel y manipularlo dentro de un alimento de humo para evitar la inhalación.
    2. Deje que los explantes permanezcan durante la noche (20-24 h) en el 10% de formalina.
    3. Al día siguiente, remoje el número relevante de pequeñas esponjas histologías en un 70% de IMS y colóquelas dentro de casetes histológicos. Transfiera suavemente todos los explantes de una condición de tratamiento farmacológico dada a una sola esponja (mantenga la orientación de los explantes para que los lados de los explantes en contacto con los discos de inserción y, por lo tanto, las áreas tratadas con medicamentos, se pongan en contacto con la esponja). Coloque otra esponja presomada encima de los explantes y asegúrela dentro de un casete histológico (un casete por pozo/tratamiento).
    4. Sumergir los casetes en un 70% de IMS, y dejar en RT durante 24 h.
  2. Incrustación de parafina y seccionamiento de tejidos
    1. Al día siguiente, transfiera los casetes histológicos que contienen los explantes a la cesta de muestras del procesador de tejidos (consulte la Tabla de materiales)y asegure la tapa. Coloque la cesta en la retorta y ciérrela suavemente. Seleccione el programa deseado e inicie el procesador. Escurra la retorta, ábrala para quitar la cesta y transfiera la cesta al baño de cera central de incrustación.
    2. Después de incrustar, transfiera las tapas de cassette de metal a la canasta y regrese a la retorta del procesador de tejidos para el programa de limpieza. Limpie el sensor con un pañuelo seco, retire el exceso de cera de la tapa de la retorta y continúe con el programa de limpieza.
    3. Coloque un bloque de parafina en el microtomo rotativo, corte algunas secciones a 4 μm y devuelva el bloque al hielo. Reposicione el bloque y corte más secciones de 4 μm. Transfiera las secciones con un pequeño pincel y fórceps a un baño de agua para eliminar pliegues y burbujas.
    4. Coloque las secciones centralmente en los portaobjetos del microscopio, drene los portaobjetos durante unos minutos y colóquelos en un estante deslizante para que se sequen durante la noche en una incubadora a 37 ° C. Cuando las secciones estén secas, guárdelas en RT en una carpeta o caja deslizante para protegerlas del polvo.

5. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)

  1. Llene la manchadora (consulte la Tabla de materiales)con reactivos y establezca el programa requerido para la tinción de H&E: tiempo de incubación de hematoxilina: 5 min; Tiempo de incubación de eosina: 3 min.
  2. Conecte el bastidor deslizante al soporte, colóquelo en el primer contenedor con xileno e inicie el programa. Retire el soporte deslizante del bastidor y lleve el contenedor con el bastidor deslizante al área de montaje.
  3. Monte las diapositivas con xileno de ftalato de dibutilo (DPX) debajo de la campana de extracción. Coloque DPX en cada cubierta y baje la diapositiva sobre la cubierta con la sección hacia abajo, permitiendo que el DPX se extienda.
    NOTA: DPX es peligroso. Evite cualquier contacto con la piel y úselo en una campana de humos designada.

6. Inmunotinción

NOTA: Los siguientes pasos deben llevarse a cabo en RT a menos que se indique lo contrario.

  1. Desparafinación y rehidratación
    1. Coloque los portaobjetos en un bastidor deslizante y caliente a 65 °C durante 10 minutos antes de desparafinar las secciones en xileno durante 3 minutos (2x). Minimice la cantidad de solución de arrastre.
      NOTA: El xileno es inflamable, peligroso e irritante. Manipule dentro de la campana de humos mientras usa guantes de doble capa. Evite el contacto con la piel y los ojos. Deseche los residuos dentro de un contenedor sellado.
    2. Rehidrate los portaobjetos en un gradiente de alcohol de la siguiente manera: 99% IMS durante 1 min (2x) y 95% IMS durante 1 min. Minimice la cantidad de solución de arrastre.
      NOTA: IMS es altamente inflamable, volátil e irritante. Manipule dentro de la campana de humos y evite el contacto con la piel y los ojos.
    3. Sumerja completamente el bastidor deslizante en agua ultrapura (UP) durante 5 minutos.
  2. Recuperación de antígenos
    1. Prepare el tampón de recuperación de antígenos de acuerdo con las pautas del fabricante para el anticuerpo particular utilizado.
      NOTA: El tampón de citrato 0.2 M, pH 6 o tris(hidroximetil) aminometano (Tris)-ácido tetraacético de etilendiamina (EDTA) 0.1 M, pH 9, son los tampones comunes utilizados para condiciones ácidas o alcalinas, respectivamente. El ácido cítrico monohidrato y Tris son agentes irritantes. Prepare todas las soluciones de stock en la campana extractora. Evite el contacto con la piel y los ojos.
    2. Sumerja el bastidor que contiene las correderas en el búfer de recuperación de antígenos y microondas (consulte la Tabla de materiales)a plena potencia (800 W) durante 20 minutos.
      NOTA: Mantenga las diapositivas completamente sumergidas en el búfer durante todo el proceso. Para evitar una reducción excesiva del volumen del tampón, coloque una tapa en la parte superior del recipiente utilizado.
  3. Inmunofluorescencia multiplex (mIF)
    NOTA: Este proceso tarda de 1 a 2 días.
    1. Llene un recipiente limpio con 250 ml de agua UP y sumerja completamente la rejilla deslizante durante 2 minutos (2x). Proceda a ensamblar cada diapositiva en una placa de cubierta de diapositiva (consulte la Tabla de materiales).
      1. Para montar un tobogán en una placa de cubierta, prepare un abrevadero de vidrio con agua. Sumerja tanto la placa de cubierta como el deslizamiento en el agua, colocando la sección de tejido hacia el lado frente a la placa de cubierta.
      2. Coloque el borde inferior de la corredera en la parte superior de las protuberancias en la parte inferior de la placa de cubierta y, finalmente, alinee la diapositiva con la placa de cubierta, permitiendo que el agua llene el espacio intermedio sin que el aire quede atrapado. Sostenga la placa de cubierta y deslícela junta, y colóquela en un estante de placa de cubierta.
    2. Llene la placa de cubierta con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y espere a que el tampón lave las diapositivas, fluyendo por gravedad (2x). Pipete 110 μL de tampón de bloqueo (consulte la Tabla de materiales)en cada placa de cubierta e incube durante 10 min.
    3. Prepare la dilución de anticuerpos primarios deseada en PBS o tampón de bloqueo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Incubar los portaobjetos con anticuerpo primario (110 μL cada portaobjetos) durante 30 min. Lave las diapositivas con 5 ml de PBS (2x), como se describe en 6.3.2.
    4. Incubar los portaobjetos con 110 μL de polímero de peroxidasa de rábano picante durante 30 min. Lave las diapositivas con 5 ml de PBS (2x), como se describe en 6.3.2.
    5. Preparar la dilución de fluoróforos en diluyente de amplificación 1:100 (v/v), e incubar los portaobjetos con fluoróforo (110 μL cada portaobjetos) durante 10 min. Lave las diapositivas con 5 ml de PBS (2x), como se describe en 6.3.2.
      NOTA: Para el uso de fluoróforo 780, siga las pautas del fabricante. El experimento puede detenerse aquí si los portaobjetos se incuban en el lavado final de PBS y se almacenan a 4 ° C durante la noche.
    6. Desenganche las diapositivas de las placas de cubierta y vuelva al paso de recuperación de antígenos para comenzar la tinción con un anticuerpo diferente. Repita la tinción para obtener el número deseado de anticuerpos que se analizarán.
    7. Siguiendo el paso 6.3.5 para el último fluoróforo en uso, mantenga las diapositivas en las placas de cubierta, prepare una solución de 6 μM de dilatación de 4'-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) con agua UP y contramante las diapositivas durante 5 min (110 μL cada diapositiva). Lave los portaobjetos con agua UP (2x) y elimine el exceso de agua secando los bordes de los toboganes. Ensamble las cubiertas en las diapositivas utilizando el medio de montaje y guárdelas en RT en la oscuridad.

7. Escaneo

NOTA: El escaneo de diapositivas se realizó utilizando un sistema de imágenes automatizado multiespectral (consulte la Tabla de Materiales).

  1. Ensamble las diapositivas en el soporte y cárguelas en el escáner en el orden deseado.
    NOTA: Se recomienda incluir una diapositiva de control en la que no se utilice fluoróforo o DAPI durante la tinción inmunohistoquímica. Esta diapositiva se utilizará como control de la florescencia intrínseca (autofluorescencia [AF]) del tejido.
  2. Después de iniciar el software del escáner de diapositivas, seleccione Editar protocolo en la página de inicio. Cree un nuevo protocolo que aborde el nombre,el modo de imagen,el tipo de escaneo multiespectral que se realizará(4–7 canales)y el estudio(directorio).
    NOTA: Para modificar la configuración predeterminada de las bandas analizadas, seleccione o anule la selección de los filtros deseados mediante la función Seleccionar bandas de escaneo
  3. Continúe con Scan Exposure and Load carriery, finalmente, seleccione el portador para la configuración del protocolo. Seleccione Tomar visión general para detectar el tejido de la diapositiva. Elija una diapositiva que se muestre en el portadory seleccione un área específica del tejido con el cursor rojo para que se vea en vivo en la ventana izquierda de la pantalla.
  4. Seleccione el filtro DAPIy haga clic en Enfoque automático o ajuste manualmente el control deslizante Altura del escenario para enfocar el campo de interés. Haga clic en Autoexpose para permitir que el sistema encuentre la mejor exposición para ese filtro / banda.
    NOTA: El tiempo de exposición para cada filtro se establece en 12 ms. Después de autoexponer el sistema, refine el tiempo de exposición a una mejor estimación. También es posible anular el valor de autoexposición escribiendo un valor manualmente en la celda resaltada.
  5. Repita los pasos anteriores para todos los filtros del protocolo. Si es necesario, cambie las ubicaciones y / o diapositivas para encontrar las mejores señales para configurar las exposiciones.
    NOTA: Si el tejido está resaltado en rojo a la vista en vivo, la señal fluorescente del filtro analizado está saturada, y se debe repetir la autoexposición.
  6. Una vez que se haya establecido la configuración de exposición, haga clic en el botón Atrás y guarde el protocolo. En la página de inicio del software (consulte la Tabla de materiales),seleccione Escanear diapositivas.
  7. Apile todos los transportistas que se escanearán en el Slide Carrier Hotely tome nota del orden de los portaobjetos para asignar su ID al sistema.
    NOTA: En la pantalla del software, cada operador estará relacionado con una ranura que contiene 4 diapositivas.
  8. Para configurar varias diapositivas con los mismos parámetros, haga clic en Configurar tareasy seleccione una o más ranuras con la opción Ucante las mismas reglas para las mismas diapositivas. Una vez que se abra Editar diapositivas, configure: Tareas, Estudioy Protocolo,y haga clic en Aceptar.
  9. Etiquete cada diapositiva haciendo clic en el icono Ranura y escriba un nombre en la celda ID de diapositiva. Haga clic en Escanear para comenzar a escanear.
    NOTA: Una vez que el icono de la ranura se vuelve azul y las diapositivas se marcan con una flecha azul, el portador tiene todas las reglas y está listo para ser escaneado. Es posible guardar los ID de diapositivas, estudios, protocolos y tareas haciendo clic en el botón Guardar configuración.

8. Análisis

NOTA: El siguiente protocolo ilustra el método para el análisis de fenotipos.

  1. Preparación de imágenes
    1. Para preparar las imágenes para el análisis, abra el software del visor (consulte la Tabla de materiales)y seleccione Cargar diapositivas. Seleccione los escaneos deseados para el proyecto de entrenamiento en el lado derecho de la pantalla.
    2. Para cada escaneo, haga clic en Selloy elija Proyecto en el cuadro Seleccionar para: Definir un sello con tamaño 1 x 1 en el campo de imagen que se utilizará más adelante como plantilla para el análisis de entrenamiento. Observe que este sello estará marcado como un cuadrado rojo.
      NOTA: El número de anotaciones de sellos para el proyecto es arbitrario. Se recomienda generar uno para la exploración de fluorescencia intrínseca y algunos más que generalmente son representativos de la distribución de la señal dentro del tejido.
    3. Finalmente, abra todos los escaneos del experimento. Para cada uno, haga clic en Sello,y esta vez, elija la opción Lote en el cuadro Seleccionar para: Coloque un sello circunscribiendo cada explante.
      NOTA: Esta vez, los sellos se marcarán como cuadrados verdes y se requerirán una vez que se inicie el análisis por lotes. Elija el tamaño adecuado para los sellos (1 x 1, 2 x 2, 3 x 3) y evite la superposición de los sellos, lo que generaría datos duplicados en el archivo exportado.
  2. Análisis de la formación
  3. Inicie el software para el análisis (consulte la Tabla de materiales)y cree un nuevo proyecto: Seleccione Archivo | Nuevas | Proyecto.
  4. Escriba un nombre en el cuadro Nombre del proyecto y configure el tipo de proyecto.
    NOTA: Los experimentos se realizaron utilizando las siguientes especificaciones: segmentación de tejido entrenable; segmentación celular adaptativa; fenotipado.
  5. Cargue los escaneos que contienen los sellos para la capacitación: Archivo | Abrir | Imagen. En la vista de modo único,navegue por las imágenes y seleccione los escaneos con fluorescencia intrínseca.
  6. Haga clic en el botón Autofluorescencia (AF) y, con el selector de autofluorescencia,dibuje una porción de tejido sin teñir. Haga clic en Preparar imágenes para permitir que el software reste la intensidad de la fluorescencia intrínseca de todas las imágenes cargadas para el entrenamiento.
  7. Haga clic en el botón Editar marcadores y colores, e introduzca los nombres de los marcadores en el cuadro asociado a su fluoróforo. Haga clic en el paso Segmentar tejido en la parte superior de la pantalla para abrir la ventana Entrenamiento de segmentación de tejidos.
  8. En la ventana Categorías de tejidos, escriba el nombre de las categorías de tejidos en las que se segmentarán las imágenes (por ejemplo, Tumor, Estroma, Fondo, Necrosis).
  9. En la ventana Entrenamiento de segmentación de tejidos, haga clic en el botón Dibujar y dibuje regiones alrededor de grupos de células para definir una categoría de tejido de interés. Por ejemplo, para definir un área tumoral, dibuje una región alrededor de un grupo de células tumorales. Cambie a la siguiente categoría y repita el proceso de dibujo.
    NOTA: Se recomienda dibujar regiones en la mayoría de las imágenes cargadas para el entrenamiento. También es posible refinar el entrenamiento editando la Escala de Patrones y la Resolución de Segmentación cuyos detalles se describen mejor en el manual del usuario.
  10. Una vez definidas las regiones de entrenamiento, proceda con Entrenar al segmentador de tejidos.
    NOTA: Durante el proceso de entrenamiento, el software muestra el porcentaje de precisión de la segmentación de tejidos. Para obtener resultados óptimos, se recomienda que la segmentación del tejido tenga al menos un 90% de precisión. Una vez que el segmentador se haya estabilizado, haga clic en el botón Listo.
  11. Para ver la máscara categoría de tejido en todas las imágenes, haga clic en el botón Segmentar todo.
  12. Después de verificar la calidad de la segmentación del tejido, vuelva a dibujar las regiones de entrenamiento alrededor de las áreas que se clasificaron incorrectamente y vuelva a entrenar el segmentador de tejidos hasta que el proceso sea exitoso.
  13. Haga clic en el paso Segmentación de celdas en la barra de pasos en la parte superior de la ventana para continuar con el análisis.
  14. Elija los compartimentos celulares a segmentar: Núcleos, Citoplasmay/o Membrana.
    NOTA: Como la segmentación celular adaptativa solo puede detectar células con señal nuclear, no anule la selección de Núcleos. Aunque también es posible segmentar el citoplasma y / o la membrana, se recomienda elegir primero el componente nuclear más fuerte y abundante (por ejemplo, DAPI).
  15. Configure el componente nuclear mediante el control deslizante Intensidad típica para ajustar el umbral utilizado para detectar píxeles nucleares. Tome nota de la ventana de vista previa que se abre y proporciona comentarios en vivo a medida que se ajusta el umbral.
    NOTA: Este umbral es adaptativo y se mide en relación con el fondo circundante. Aumente este valor si se detecta demasiado fondo como nuclear. Reduzca este valor si se pierden núcleos débiles. Utilice el botón Mostrar/Ocultar regiones para encender y apagar las máscaras de segmentación y comprobar si los píxeles correctos se detectan como nucleares.
  16. Para dividir grupos de píxeles nucleares, utilice el panel División de componentes nucleares. Elija el botón que mejor describa la calidad de tinción de los núcleos. Luego, use la barra deslizante para ajustar la sensibilidad de división,teniendo en cuenta que los valores más bajos darán como resultado una mayor división.
  17. Haga clic en el botón Segmentar todo para segmentar todas las imágenes. Si el resultado no es preciso, modifique la configuración y vuelva a entrenar el software hasta que se logre una segmentación satisfactoria.
  18. Proceda al último paso del análisis: Fenotipado. En el panel Fenotipos, agregue la lista de fenotipos que se van a detectar y escriba el nombre en el cuadro de texto correspondiente. Haga clic en el botón Editar fenotipos, seleccione una celda en particular para abrir un menú desplegable y elija el fenotipo correspondiente.
    NOTA: Se necesitan al menos cinco celdas para cada fenotipo para entrenar al clasificador. Desactivar la visualización de los núcleos permite una mejor visualización del fenotipo celular que necesita ser asignado.
  19. Una vez completada la selección para el entrenamiento, haga clic en el botón Clasificador de trenes.
    NOTA: El software clasificará cada celda de la imagen, y siempre que ocurran errores en la clasificación, es posible editar el fenotipo de las células y repetir el entrenamiento del clasificador. Guarde el proyecto antes de proceder al análisis por lotes y haga clic en Exportar en la barra de herramientas en la parte superior de la pantalla.
  20. Seleccione la pestaña Análisis de baño en el menú de la izquierda y cargue el proyecto en el cuadro Algoritmo por lotes o Proyecto.
  21. Haga clic en Opciones de exportación para crear directorios separados para cada imagen y, con el botón Examinar, navegue hasta encontrar la ubicación para exportar los datos. Haga clic en todas las opciones de las Imágenes y Tablas para exportar.
  22. En el lado derecho de la pantalla, haga clic en Agregar diapositivas y cargue todas las imágenes que contienen sellos para lotes previamente preparados (paso 7.3). Haga clic en el botón Ejecutar para iniciar el análisis por lotes y procesar un sello a la vez, exportando los datos correspondientes.

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Resultados

La imagen multiespectral de secciones histológicas teñidas con mIF permite la identificación y fenotipado de poblaciones celulares individuales y la identificación de componentes tumorales y estromales en el explante TME (Figura 2). La imagen multiespectral es particularmente útil para el análisis de tejidos con alta autofluorescencia intrínseca, como tejidos con un alto contenido de colágeno, ya que permite que la señal de autofluorescencia se desconecte de otras señales y se excluya del an...

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Discusión

Este artículo describe los métodos para la generación, el tratamiento farmacológico y el análisis de las PDE y destaca las ventajas de la plataforma como sistema modelo preclínico. El cultivo ex vivo de un tumor recién resecado, que no implica su deconstrucción, permite la retención de la arquitectura tumoral13,24 y, por lo tanto, las interacciones espaciales de los componentes celulares en la EMT, así como la heterogeneidad intratumoral. Este método demuestra có...

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Divulgaciones

Nada que revelar

Agradecimientos

Agradecemos a los cirujanos y patólogos de University Hospitals of Leicester NHS Trust por proporcionar tejido tumoral resecado quirúrgico. También agradecemos a la instalación de Histología dentro de Core Biotechnology Services por su ayuda con el procesamiento de tejidos y la seccionamiento de bloques de tejido FFPE y a Kees Straatman por su apoyo con el uso de Vectra Polaris. Esta investigación fue apoyada y financiada por el Consorcio Explant compuesto por cuatro socios: la Universidad de Leicester, la Unidad de Toxicología MRC, los Laboratorios de Descubrimiento Terapéutico de Cancer Research UK y LifeArc. El CRUK-NIHR Leicester Experimental Cancer Medicine Centre (C10604/A25151) proporcionó apoyo adicional. El financiamiento para GM, CD y NA fue proporcionado por el Programa Catalyst de Breast Cancer Now (2017NOVPCC1066), que cuenta con el apoyo de fondos de Pfizer.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
<Ácido acético fuerte>>Sigma320099 Reactivo de tinción
Diluyente de anticuerpo / Bloque, 1xPerkin ElmerARD1001EADiluyente de anticuerpos/tampón de bloqueo
Barnstead NANOpure DiamondBarnsteadUltra Pure (UP) H2O máquina
Ácido cítrico monohidratoSigma-AldrichC7129Reactivo para tampón de citrato
Costar Placas de cultivo celular de pocillos múltiplesCorning Incorporated3516placas multipocillos
DAPI DilactatoLife TechnologiesD3571
100 x 17 mm Plato, Nunclon DeltaThermoFisher Scientific150350Plato de 100 mm de diámetro para cultivo de tejidos
DMEM (1x) Medio Eagle modificado de Dubelcco + 4,5 g/L de D-glucosa + 110 mg/ml de piruvato de sodioGibco (Life Technologies)10569-010Medio de cultivo de tejidos (500 mL)
Montaje DPXVWR360294HMontaje medio
Montaje DPXMerck6522Montaje < mediofuerte
>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)Sigma-Aldrich3609Reactivo para tampón
TEEosinaCellPathRBC-0100-00AReactivo de tinción
Suero bovino fetalGibco10500-064Para uso en cultivo de tejidos medio
37% FormaldehídoFisher (Acros)11969001010% Formalina
iGenix, horno de microondas IG2095iGenixIG2095Microondas utilizado para la retreivación de antígenos
alcohol metilado industrial (IMS)Genta Medical19905099% Alcohol desnaturalizado industrial (IDA)
InForm Software de análisis de imágenes avanzadoAkoya BiosciencesInForm
Leica ASP3000 Tissue ProcessorLeica BiosystemsAutomated Vacuum Tissue Processor
Leica Arcadia H y CLeica BiosystemsBaño de cera incrustante
Leica RM2125RTLeica BiosystemsMicrotomo rotativo
Leica ST4040 Tinción linealLeica BiosystemsH& E stainer
Mayer's HaematoxylinSigmaGHS132-1LReactivo de tinción
Millicell Cell Cell Culture Inserts, 30 mm, PTFE hidrófilo, 0,4 y micro; mMerck MiliporePICMORG50Inserto de cultivo organotípico en disco
Sistema de detección de polímeros NovolinkLeica BiosystemsRE7150-K Kit detinción DAB
OPAL 480Akoya BiosciencesFP1500001KT Fluoróforo con diluyente de dimetilsulfóxido (DMSO)
OPAL 520Akoya BiosciencesFP1487001KTFluoróforo con diluyente de dimetilsulfóxido (DMSO<
fuerte>OPAL 570Akoya BiosciencesFP1488001KTFluoróforo con diluyente de dimetilsulfóxido (DMSO)
OPAL 620AkoyaBiosciencesFP1495001KTFluoróforo con diluyente de dimetilsulfóxido (DMSO)
OPAL 650 Akoya BiosciencesFP1496001KTFluoróforo con diluyente de dimetilsulfóxido (DMSO<
fuerte>OPAL 690Akoya BiosciencesFP1497001KTFluoróforo con diluyente de dimetilsulfóxido (DMSO)
OPAL 780 / OPAL Reactivo TSA-DIGAkoya BiosciencesFP1501001KTFluoróforo con diluyente de dimetilsulfóxido (DMSO) y reactivo TSA-DIG
Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1xPerkin ElmerARH1001EAsolución
> penicilina/estreptomicina fuerteFisher Scientific11548876Para uso en cultivo de tejidos medianamente
PhenoChart Whole Slide Contextual ViewerAkoya BiosciencesPhenoChartViewer software para imágenes escaneadas
Phosphate Buffered Saline TabletsThermo Scientific OxoidBR0014GPBS
strong>1x Plus Amplification DiluyentePerkin ElmerFP1498Diluyente de fluoróforo
Prolong Diamond Antifade MountantInvitrogenP36961Montaje medio
Portaobjetos PortaobjetosPerkin ElmerPara cargar portaobjetos en el Slide Carrier Hotel para escanearlos con Vectra Polaris
Sodium ChlorideFisher ScientificS/3160/6310% Formalina
Hidróxido de sodio pelletsFisher ScientificS/4920/53Reactivo para citrato tampón
Tenatex Cera endurecida - Rosa (500 g)KEMDENT1-601 Superficie decera dental
Thermo Scientific  Shandon Sequenza Slide Rack para centro de inmunotinciónFisher Scientific10098889 Soporte para portaobjetos y clips de portaobjetos
Thermo Scientific Shandon Plastic CoverplatesFisher Scientific11927774Clips de portaobjetos
Tris(hidroximetil)aminometano (Tris)Sigma-Aldrich252859 Reactivo para tampón TE
VectaShieldVecta LaboratoriesH-1000-10Montaje medio
Vectra Polaris Slide ScannerPerkin ElmerVectra PolarisSlide scanner
XyleneGenta MedicalXYL050Agente desparafinante
fuerte 6 <<

Referencias

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