Summary
Här presenterar vi raffinerade kirurgiska ingrepp på framgångsrikt utföra intraportal holme transplantation, en kliniskt relevant men tekniskt utmanande kirurgiska ingrepp, hos möss.
Abstract
Även om levern för närvarande accepteras som den primära transplantation platsen för mänskliga holmar i kliniska miljöer, holmar transplanteras under njurkapseln i de flesta gnagare prekliniska holme transplantation studier. Denna modell används ofta eftersom murin intrahepatic holme transplantation är tekniskt utmanande, och en hög andel möss kan dö av kirurgiska komplikationer, särskilt blödning från injektionsstället efter transplantation. I denna studie, två förfaranden som kan minimera förekomsten av post-infusion portal ven blödning visas. Den första metoden applicerar en absorberbar hemostatisk gelatinsvamp på injektionsstället, och den andra metoden innebär att man tränger in isinjektionsnålen genom fettvävnaden först och sedan in i portalvenen genom att använda fettvävnaden som en fysisk barriär för att stoppa blödningen. Båda metoderna kan effektivt förhindra blödning-inducerad mus död. Hela lever delen visar holme distribution och bevis på holme blodpropp efter transplantation, en typisk egenskap för intrahepatic holme transplantation, presenterades. Dessa förbättrade protokoll förfinar de intrahepatiska holmetransplantationsförfarandena och kan hjälpa laboratorier att inrätta förfarandet för att studera holmes överlevnad och funktion i prekliniska miljöer.
Introduction
Intraportal holmetransplantation (IIT) via portalvenen är den vanligaste metoden för human holmetransplantation i kliniska miljöer. Musen IIT-modellen erbjuder ett utmärkt tillfälle att studera holmetransplantation och testa lovande interventionella metoder som kan förbättra effekten av holmetransplantation1. IIT beskrevs första gången på 1970-talet och användes av flera grupper1,2,3,4,5. Det återfick popularitet efter genombrottet i människa holmetransplantation i året 20006,7. Emellertid, de flesta holme transplantation studier använde njurkapseln som en föredragen plats för experimentell holme transplantation på grund av dess lätt framgång. Tvärtom är IIT mer tekniskt utmanande och används mindre ofta för holmetransplantationsstudier8,9. Till skillnad från IIT lider dock holmar transplanterade under njurkapseln inte av den omedelbara blodmedierade inflammatoriska reaktionen som kännetecknas av trombos, inflammation och levervävnad ischemi, och har därmed bättre funktion än holmar transplanterade i levern. Njurkapselmodellen kanske därför inte helt efterliknar de påfrestningar som holmar möter i human holmetransplantation10,11,12.
En av de stora komplikationerna av IIT hos möss är blödning från injektionsstället efter transplantation, vilket kan orsaka 10-30% av dödligheten bland olika musstammar12. I detta dokument har två raffinerade metoder utvecklats för att stoppa blödning snabbare och säkrare och för att minska musdödligheten efter en IIT. Visuell demonstration av dessa raffinerade detaljer kommer att hjälpa forskare att identifiera de viktigaste stegen i denna tekniskt utmanande procedur. Dessutom fastställdes placeringen av holmetransplantat i mottagarens lever genom histologisk undersökning av Hematoxylin och Eosin (H&E) färgade levervävnad (hela sektionen) med transplanterade holmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer genomfördes med godkännande av Institutional Animal Care and Use Committees vid Medical University of South Carolina och Ralph H Johnson Medical Center i Charleston.
1. Diabetesinduktion med streptozotocin (STZ)
- Mottagarmösspreparat:
- Väg alla möss individuellt.
- Kontrollera blodsockernivåerna från ett svansve blodprov med hjälp av en glucometer.
- STZ-dosbestämning för tre olika scenarier:
- För möss med fettlever injicera en dos STZ [40 mg/kg/dag, intraperitoneal (i.p.) injektion] i 5 dagar i följd.
- För NOD- SCID-möss injicerar 125 mg/kg STZ, en injektion, dvs. efter fasta över natten.
- För C57BL/6 möss injicera 225 mg/kg STZ, en injektion, dvs.
- Beräkningar för STZ (13,5 mg/ml):
OBS: Denna beräkning är för fem C57BL/6 möss med kroppsvikt på 30 g:- Totala kroppsvikter: 5 möss x 30 g/mus = 150g
- STZ behövs: 150 g x 225 mg/1000g STZ = 33,75 mg
- STZ-förberedelse:
- Väg STZ efter den förberäknade dosen.
- Överför det vägda STZ-pulvret till en 10 ml bägare på is.
- Tillsätt 3 ml natriumcitratlösning till bägaren för att lösa upp STZ.
- Blanda väl, filtrera sterilisera genom en por på 0,22 μm och använd STZ-lösningen inom 10 minuter från beredningen.
- STZ injektion:
- Ladda önskad mängd STZ-lösning (tillräckligt för en mus) i 1 ml spruta.
- Utför intraperitoneal injektion vid nedre högra kvadranten av mus buken.
- Observera möss i 5 min efter injektion och kontrollera om det finns tecken på obehag under denna tidsperiod innan du sätter tillbaka dem i burarna.
- Övervaka blodsockernivån från ett svansvensblodprov med hjälp av en glucometer dagligen efter STZ-injektionen.
OBS: I detta experiment betraktas möss som diabetiker när icke-fastande blodsocker > 350 mg/dL i två dagar i följd.
2. Isletberedning
OBS: Mänskliga holmar odlades i CMRL-1066 media kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin (P/S) med en densitet av 10 000 holme motsvarande antal (IEQ) per 100 mm cell kultur maträtt9. Mus holmar odlades i DMEM med 10% FBS och 1% P/S med samma densitet13. Manliga NOD-SCID och C57BL/7 möss mellan 6-10 veckor erhölls från kommersiella källor.
- Lossa odlade holmar från cellodlingsfat genom skonsam repor.
- Handplocka önskat antal holmar (t.ex. 300-350 holmar) med en 1cc spruta och lägg dem i sterila 1,5 ml mikrocentrifugerör på is.
- Snurra röret i 10 sekunder med mikrocentrifugen.
- Ta bort supernatanten och lämna lite vätska för att undvika att förlora pelleten.
- Återanvänd pelleten i 200 μL HBSS med 0,5% bovint serumalbumin (BSA).
- Aspirera de resuspended holmarna i en 0,5 ml insulinspruta.
- Placera sprutan i upprätt läge. Låt holmarna sjunka ner i 1 min.
- Tryck på sprutan för att ta bort alla bubblor och lämna ca 100-150 μL vätska som innehåller holmar.
- Placera ner spruthuvudet och knacka försiktigt på sidan av sprutan så att holmarna fördelas jämnt i vätskan. Holmar är nu redo för injektion.
3. Holmetransplantation
- Inducera och underhåll musen under generell anestesi med 2% isofluran. Kontrollera bristen på pedalreflexer för att säkerställa korrekt bedövning av djuret.
- Raka och ta bort pälsen i musens bukområde.
- Administrera en enda preoperativ dos buprenorfin (0, 1 mg/kg i.p.).
- Desinficera operationsområdet med tre alternerande våtservetter av 2% jod och 75% alkohol.
- Utför en laparotomi med mikrosax för att generera ett 1-1,5 cm snitt.
- Öppna peritonealhålan med ett upprullningsdon. Följ med antingen metod A eller metod B enligt nedan.
4. Metod A: (sluta blöda med gelskum, figur 1A)14,15,16
- Förberedelse av mus
- Placera en steril gasväv runt snittet.
- Dra försiktigt ut tarmen med en tång och håll den på gasväven.
- Identifiera portalvenen genom dess plats och exponera den väl.
- Täck tarmarna med en varm saltlösnings våt gasväv under hela operationen.
- För in den förinstallerade insulinsprutan i ålen via portalvenen nära tolvfingertarmen (figur 1B). För att göra det, håll nålen med hålet (avfasningen) vänd nedåt och placera öppningsytans vinkel parallellt med portalvenväggen innan du tränger in genom väggen.
- Dra kolven för att dra lite blod (20-50 μL) i sprutan för att blanda holmarna först.
- Infusera holmarna i portalvenen långsamt medan du upprepade gånger drar och trycker på doppet.
- Placera en bit gelskum (ca 0,5 cm x 0,5 cm i storlek) för att täcka injektionsstället.
- Tryck ner gelskummet med en bomullsspets samtidigt som du drar ut nålen från portalvenen.
- Fortsätt att trycka på gelén i ca 2 min för att bekräfta att det inte finns någon aktiv blödning.
- Välta bomullsspetsen om och bort från gelskummet för att se till att gelskummet täcker portalvenen väl.
5. Metod B: (sluta blöda med fettkudde, figur 1C)17
- Exponera portalvenen noggrant.
- Använd två bomullsspetsar för att hålla den exponerade portalvenen från både vänster och höger sida.
- Identifiera fettvävnadskudden mellan tolvfingertarmen och portalvenen.
- Penetrera genom fettkudden innan du för in nålen i portalvenen (figur 1D).
- Infusera holmarna enligt det liknande förfarande som beskrivs ovan i del 4.2.1 och 4.2.2 i metod A.
- Dra ut nålen medan du trycker ner fettet med en bomullsspets.
- Fortsätt att trycka på fettkudden i 1 min efter att nålen har tagits bort.
- Efter att ha bekräftat att det inte finns någon blödning från portalvenen, återför försiktigt tarmarna till peritonealhålan i sin ursprungliga position.
- Lämna 0,5 ml varm saltlösning (36-37 °C) i bukhålan före stängning.
OBS: Varm saltlösning underlättar tarmrörelser och återhämtning efter operationen och förhindrar tarmnekros. - Stäng muskelskiktet med en 5-0 sutur.
- Stäng hudskiktet med en 4-0 sutur.
- Placera musen i en ren bur på en värmeplatta tills den är helt återställd från anestesi.
- Fortsätt att ge ett smärtstillande medel (t.ex. buprenorfin 0,1 mg/kg i.p.) var 12:e timme och extra värme i 48 timmar efter operationen.
OBS: Holmetransplantationen tar cirka 15-20 min att slutföra.
6. H&E färgning och fotografi av hela leversektionen
- Leverperfusion
- Sätt musen under anestesi enligt beskrivningen ovan i del 3.1.
- Exponera försiktigt portalvenen och skär den sämre vena cava.
- Perfusera levern manuellt med 20 ml 10% paraformaldehyd via portalvenen i ca 5 minuter, med en 20 ml spruta med 25 G nål18.
OBS: Leverperfusion kan ta bort blod från levervävnad och förbättra leverfixeringen utan att störa holmetransplantaten. - Dissekera den perfunderade hela levern från andra organ.
- Fixera den perfunderade levervävnaden i 10% paraformaldehyd i 24 timmar.
- Bädda in vävnaden i paraffin.
- Skär vävnadssektioner med 5 μm tjocklek vardera och lägg dem på en glasrutschbana för färgning.
- Utför H&E, insulin, fibrin och polymorfonukleär neutrofil (PMN) färgning med standardmetoder15,16.
- Skanna hela leversektionen under ett mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi utförde syngeneic och xenogeneic holme transplantationer via portal ven. Holme graft funktion observerades på ett dosberoende sätt i båda holme transplantation modeller. I den syngeneiska holme transplantation modellen med C57BL/6 möss, transplantation av 250 holmar ledde till övergående normoglykemi innan möss återvände till hyperglykemi. Möss som fick 500 holmar nådde och bibehöll normoglykemi efter 30 dagar efter transplantation (figur 2A). Möss i båda grupperna visade ökade kroppsvikter (figur 2B).
På samma sätt jämfördes holmetransplantationsfunktionen i de mänskliga holmarna till diabetiker NOD-SCID-mush-holmetransplantationsfunktionen när 45, 85 eller 140 IQ/kg kroppsvikt transplanterades. Normoglykemi kunde inte uppnås när 45 IEQ/g (~225-275 holmar/mus) mänskliga holmar transplanterades. När holmetalet ökade till 85 IEQ/g (~ 400-450 holmar/mus) uppnådde 35,7% (10/28) av mottagarna normoglykemi (p =0,02 jämfört med 45 IEQ/g-grupp) dag 60 efter transplantation. Dessutom nådde 83,3% (5/6) av de mottagare som fick 140 IEQ/g (~ 600-650 holmar/mus) av mänskliga holmar normoglykemi (figur 2C). Dessutom dog majoriteten möss som hade blödning efter operation medan möss utan blödning överlevde (figur 2D).
När tillräckligt många mänskliga holmar är inympade till NOD-SCID mottagare, deras blodsockernivåer kan kontrolleras väl i det tidiga skedet efter transplantation och väl underhållna fram till slutet av studien. De ympade holmarna kan lätt identifieras genom H&E och insulinfärgning. Vid 28 dagar efter transplantation distribuerades transplanterade mänskliga holmar jämnt över hela levern, mestadels runt/nära ett blodkärl (figur 3).
Intrahepatic modellen användes för att visa omedelbara blod medierade inflammatorisk reaktion som ses i mänskliga holme transplantation. I vår vävnad avsnitt observerade vi uttryck av insulin och närvaro av fibrin och polymorphonuclear leukocytes infiltration i transplanterade holmar (figur 4A-D).
Figur 1: Illustration av intrahepatiska holmetransplantationsprocedurer. Scheman över viktiga steg som används i metod A och metod B (B, D). Holmar injicerades direkt via portalvenen (C) eller indirekt via fettplapp (D). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Representativa resultat av intraportal holmetransplantation. (A, B). Syngeneic mus holme intraportal transplantation. Bukspottskörteln holmar (250 eller 500) från C57BL/6 möss transplanterades till manliga C57BL/6 möss som blev diabetiker av STZ. (A) Seriella blodsockernivåer mättes. Normoglykemi definierades som glukosnivåer <200 mg/dL i >2 dagar i följd. (B) Ökning av mottagarnas kroppsvikt observerades efter holmetransplantation. C) Procentandel av diabetiker NOD-SCID möss når normoglykemi hos möss som får ett annat antal mänskliga holmar vid 45 IEQ/g (n=7), 85 IEQ/g (n=28) och 140 IEQ/g (n=6). (D) Procentandel av överlevnaden efter IIT hos blödande och icke-blödande möss (n=14 vardera). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: H&E färgning av leverdelar av NOD-SCID leverbärande human holme ympning 28 dagar efter transplantation. Holmar är markerade med svarta cirklar. Diametern på varje cirkel motsvarar positivt storleken på varje holme. Skalstång =1 000 μm i hela leversektionen och 100 μm infälld. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Representativa histologiska bilder av intraportal transplanterade mus holmar i lever 6 h efter intraportal transplantation. (A) H&E, (B) insulin (röd) (C) Fibrin och (D) PMN fläckar. Skalstång = 100 μm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie har två förbättrade förfaranden som kan förhindra blödning och kan minska musdödligheten under musen IIT visats. Denna studie gör det möjligt för forskare att visualisera holmetransplantationsmodellen som är unik för att studera det omedelbara blodmedierade inflammatoriska svaret efter transplantation. IIT-modellen är en distinkt modell för att studera holmecellens överlevnad och lever ischemiska skador som svar på holmetransplantation19. Här förfinade vi förfarandet baserat på tidigare studier och minskade tidig komplikation-inducerad mus dödlighet. Både metod A14,15,16 och metod B8,9 användes i flera studier. Vi visade att holmar distribueras bland hela levern, och neutrophil infiltration och blodpropp vanligtvis associeras med IIT var framträdande i moderplantor omedelbart efter transplantation.
Det finns flera viktiga steg i mus lever holme transplantation. Eftersom både mänskliga och mus holmar kan vara så stora som 200 μm i storlek, måste en nålstorlek på minst 27G användas för transplantation för att säkerställa holmeprodukternas smidiga flöde. Detta skulle dock generera ett stort hål i portalvenen som kan orsaka blödning efter nålborttagning. Genom att injicera holmar via rätt vinkel och använda en tandsvamp för att blockera injektionsstället eller injektionen genom fettvävnaden kan risken för blödning minimeras och möss har högre överlevnad efter transplantation. Dessa steg kan också hjälpa till att undvika lever varm ischemi-reperfusion skador orsakas av blockering av portal ven blodflödet när du utför denna procedur19. De kan också minska skadorna på levern och tarmarna som kan bidra till musdödlighet efter operationen.
Det finns också flera begränsningar av musen intrahepatic holme transplantation modell jämfört med den mänskliga holme transplantationer inställningen. För det första kan vi inte övervaka musportalens ventryck under holmeinfusion som vi gör i klinikinställningar. För det andra kan volymen som kan transplanteras till mössen inte återspegla den höga mängden holmeprodukt som transplanteras till en människa. Därför kan omfattningen av trombos vara annorlunda. För det tredje kommer mus holmetransplantat efter transplantation tillfälligt att utsättas för en hyperglykemisk miljö eftersom inget insulin kommer att ges till möss, medan hos människor20 skulle insulin ges under peritransplantationsperioden för att minska stressen hos transplanterade holmar20. Ändå erbjuder den intrahepatiska holmemodellen en unik preklinisk modell som kan användas för att studera human holmetransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare förklarar att de inte har intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Institutionen för veteranfrågor (VA-ORD BLR&D Merit I01BX004536) och National Institute of Health grants # 1R01DK105183, DK120394, DK118529, till HW. Vi vill tacka er Mr. Michael Lee och Ms Lindsay Swaby för språkredigering
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| 1 mL Syringe with needle | AHS | AH01T | |
| 20 mL Syringe | BD | 301031 | |
| 25G x 5/8" hypodermic needles | BD | 305122 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| CMRL-1066 | Corning | 15110CV | |
| DMEM | Corning | 10013CV | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35011CV | |
| FreeStyle Glucose meter | Abbott | Lite | |
| FreeStyle Blood Glucose test strips | Abbott | Lite | |
| Gelfoam (absorbable gelatin sponge, USP) | Pharmacia & Upjohn Company | 34201 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 27-gauge needle | BD | 879588 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | HyClone | SV30010 | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Streptozocin (STZ) | Sigma | S0130 | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 |
References
- Pellegrini, S., Cantarelli, E., Sordi, V., Nano, R., Piemonti, L. The state of the art of islet transplantation and cell therapy in type 1 diabetes. Acta Diabetology. 53 (5), 683-691 (2016).
- Ballinger, W. F., Lacy, P. E. Transplantation of intact pancreatic islets in rats. Surgery. 72 (2), 175-186 (1972).
- Wright, J. R., Hauptfeld, V., Lacy, P. E., et al. Induction of Ia antigen expression on murine islet parenchymal cells does not diminish islet allograft survival. American Journal of Pathology. 134 (2), 237-242 (1989).
- Toyofuku, A., et al. Natural killer T-cells participate in rejection of islet allografts in the liver of mice. Diabetes. 55 (1), 34-39 (2006).
- Goss, J. A., Nakafusa, Y., Finke, E. H., Flye, M. W., Lacy, P. E. Induction of tolerance to islet xenografts in a concordant rat-to-mouse model. Diabetes. 43 (1), 16-23 (1994).
- Hara, M., et al. A mouse model for studying intrahepatic islet transplantation. Transplantation. 78 (4), 615-618 (2004).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Wang, J., et al. Alpha-1 antitrypsin enhances islet engraftment by suppression of instant blood-mediated inflammatory reaction. Diabetes. 66 (4), 970-980 (2017).
- Gou, W., et al. Alpha-1 antitrypsin suppresses macrophage activation and promotes islet graft survival after intrahepatic islet transplantation. American Journal of Transplantation. , (2020).
- Contreras, J. L., et al. Activated protein C preserves functional islet mass after intraportal transplantation: A novel link between endothelial cell activation, thrombosis, inflammation, and islet cell death. Diabetes. 53 (11), 2804-2814 (2004).
- Moberg, L., et al. Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. Lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).
- Melzi, R., et al. Intrahepatic islet transplant in the mouse: functional and morphological characterization. Cell Transplantation. 17 (12), 1361-1370 (2008).
- Wang, H., et al. Donor treatment with carbon monoxide can yield islet allograft survival and tolerance. Diabetes. 54 (5), 1400-1406 (2005).
- Desai, C. S., et al. Effect of liver histopathology on islet cell engraftment in the model mimicking autologous islet cell transplantation. Islets. 9 (6), 140-149 (2017).
- Cui, W., Angsana, J., Wen, J., Chaikof, E. L. Liposomal formulations of thrombomodulin increase engraftment after intraportal islet transplantation. Cell Transplantation. 19 (11), 1359-1367 (2010).
- Cui, W., et al. Thrombomodulin improves early outcomes after intraportal islet transplantation. American Journal of Transplantation. 9 (6), 1308-1316 (2009).
- Proto, C., Grasso, G., Fassio, P. G. Hepatoparenchymal clearance of indocyanine green in infectious hepatitis. Giornale di Malattie Infettive e Parassitarie. 20 (9), 845-851 (1968).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments. (132), e56993 (2018).
- Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. Intraportal transplantation of pancreatic islets in mouse model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57559 (2018).
- Wang, H., et al. Autologous mesenchymal stem cell and islet cotransplantation: Safety and efficacy. Stem Cells Translational Medicine. 7 (1), 11-19 (2018).
