Summary
Vi præsenterer en metode til celleinjektion via nålefri vandstråleteknologi kombineret med en efterfølger af undersøgelser efter levering med hensyn til cellulær levedygtighed, proliferation og elasticitetsmålinger.
Abstract
Urininkontinens (UI) er en meget udbredt tilstand karakteriseret ved manglen på urinrørets lukkemuskel. Regenerative medicingrene, især celleterapi, er nye tilgange til at forbedre og genoprette urinrørets lukkemuskelfunktion. Selvom injektion af aktive funktionelle celler rutinemæssigt udføres i kliniske omgivelser med nål og sprøjte, har disse tilgange betydelige ulemper og begrænsninger. I denne sammenhæng er nålefri vandstråleteknologi (WJ) en gennemførlig og innovativ metode, der kan injicere levedygtige celler ved visuel guidet cystoskopi i urinrørsfinkteren. I den foreliggende undersøgelse brugte vi WJ til at levere svinesvindvævsafledte stromalceller (pADSC'er) til kadaverisk urinrørsvæv og undersøgte efterfølgende effekten af WJ-levering på celleudbytte og levedygtighed. Vi vurderede også de biomekaniske egenskaber (dvs. elasticitet) ved hjælp af atomkraftmikroskopi (AFM) målinger. Vi viste, at WJ leverede pADSC'er blev signifikant reduceret i deres cellulære elasticitet. Levedygtigheden var signifikant lavere sammenlignet med kontroller, men er stadig over 80 %.
Introduction
Urininkontinens (UI) er en udbredt lidelse med en prævalens på 1,8 - 30,5% i europæiske populationer1 og er primært karakteriseret ved funktionsfejl i urinrørets lukkemuskel. Fra et klinisk perspektiv tilbydes kirurgisk behandling ofte til patienter, når konservative terapier eller fysioterapi ikke adresserer og lindrer de nye symptomer.
Celleterapi til potentiel regenerativ reparation af lukkemuskelkompleksets funktionsfejl er opstået som en avantgarde-tilgang til behandling af UI-patologi 2,3. Dets hovedmål er at erstatte, reparere og genoprette det beskadigede vævs biologiske funktionalitet. I dyremodeller for UI har stamcelletransplantation vist lovende resultater i urodynamiske resultater 2,4,5. Stamceller opstår som optimale cellulære kandidater, da de har evnen til at gennemgå selvfornyelse og multipotent differentiering, hvilket hjælper den berørte vævsregenerering6. På trods af det kommende regenerative potentiale er den praktiske anvendelse af celleterapi fortsat hæmmet, da minimalt invasiv levering af celler stadig står over for flere udfordringer med hensyn til injektionspræcision og dækning af målet. Selvom den nuværende tilgang, der anvendes til cellelevering, er injektion gennem et nålesprøjtesystem7, resulterer det normalt i et samlet underskud af levedygtige celler med rapporterede levedygtigheder så lave som 1% - 31% efter transplantation8. Derudover har cellelevering via nåleinjektion også vist sig at påvirke placeringen, retentionshastigheden samt fordelingen af transplanterede celler i det målrettede væv 9,10,11. En gennemførlig, ny tilgang, der overvinder ovennævnte begrænsning, er den nålefri cellelevering via vandstråleteknologi.
Waterjet (WJ) teknologi dukker op som en ny tilgang, der muliggør høj gennemstrømning levering af celler ved cystoskop under visuel kontrol i urinrøret sphincter12,13. WJ muliggør cellelevering ved forskellige tryk (E = effekter i bar) lige fra E5 til E8013. I den første fase påføres (vævsindtrængningsfase) isotonisk opløsning med højt tryk (dvs. E60 eller E80) for at løsne den ekstracellulære matrix, der omgiver vævet målrettet og åbne små sammenkoblede mikrolakuner. I anden fase (injektionsfasen) sænkes trykket inden for millisekunder (dvs. op til E10) for forsigtigt at levere cellerne ind i det målrettede væv. Efter denne totrinspåføring udsættes cellerne ikke for yderligere tryk mod vævet, når de skubbes ud, men flyder i en lavtryksstrøm ind i et væskefyldt hulrum13. I en ex vivo-modelindstilling, hvor stamceller blev injiceret via WJ i kadaverisk urinrørsvæv, kunne levedygtige celler efterfølgende aspireres og hentes fra vævet og udvides yderligere in vitro13. Selvom en undersøgelse fra 2020 af Weber et al. viste WJ's gennemførlighed og anvendelighed til at levere fodaftryksfrie kardiomyocytter i myokardiet14, skal man huske på, at WJ-teknologien stadig er i et prototypestadium.
Følgende protokol beskriver, hvordan man forbereder og mærker svineafledte stromalceller (pADSC), og hvordan man leverer dem til indfangningsvæske og kadavervæv via WJ-teknologi og Williams cystoskopi nåle (WN). Efter cellulær injektion vurderes den cellulære vitalitet og elasticitet via atomkraftmikroskopi (AFM). Via trinvise instruktioner giver protokollen en klar og kortfattet tilgang til at erhverve pålidelige data. Diskussionsafsnittet præsenterer og beskriver teknikkens store fordele, begrænsninger og fremtidsperspektiver. WJ-leveringen af celler såvel som de efterfølgende analyser efter oversættelse, der er rapporteret her, erstatter standardnålinjektionen og giver en solid celleleveringsramme til regenerativ heling af målvævet. I vores nylige undersøgelser fremlagde vi bevis for, at WJ leverede celler mere præcist og i det mindste med sammenlignelig levedygtighed sammenlignet med nåleinjektioner15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Svines fedtvævsprøverne blev opnået fra Institut for Eksperimentel Kirurgi ved universitetet i Tuebingen. Alle forsøg blev godkendt af de lokale dyrevelfærdsmyndigheder under dyreforsøgsnummer CU1/16.
1. Isolering af svines fedtvævsafledte stromalceller
- Brug svinediposevæv leveret fra Institut for Eksperimentel Kirurgi i et 50 ml centrifugerør til laboratoriet.
- Overfør vævet til en steril petriskål under den sterile bænk og hak det med to skalpeller (nr. 10) til små fragmenter og mos.
BEMÆRK: Saks kan også bruges til at få små fragmenter. Jo mindre fragmenterne er, desto bedre er det for den følgende fordøjelse.- De små fragmenter/mos overføres til et 50 ml centrifugerør og inkuberes med 5 ml homogenisatoropløsning i 30 minutter ved 37 °C på en ryster. Homogenisatoropløsningen er PBS med 1 % bovin serumalbumin (BSA) (stamopløsning: 1 % (w/v) BSA i PBS) og 0,1 % kollagenase type I.
BEMÆRK: Forbered altid homogenisatoropløsningen frisk. Rysteren har en cirkulær rystebevægelse ved en langsom hastighed 25-500 o / min.
- De små fragmenter/mos overføres til et 50 ml centrifugerør og inkuberes med 5 ml homogenisatoropløsning i 30 minutter ved 37 °C på en ryster. Homogenisatoropløsningen er PBS med 1 % bovin serumalbumin (BSA) (stamopløsning: 1 % (w/v) BSA i PBS) og 0,1 % kollagenase type I.
- For at stoppe inkubationen tilsættes 10 ml vækstmedier [Dulbecco's Modified Eagle's Medium - low glucose (DMEM-LG), 2,5% HEPES natriumsaltopløsning (1 M), 10% føtal bovin serum (FBS), 1% L-Glutamin (200 mM), 1% Penicillin-Streptomycin (10000 U/ml Penicillin; 10.000 μg/ml Streptomycin) og 1% Amphotericin B (250 μg/ml)].
BEMÆRK: Vækstmedier kan udarbejdes på forhånd. Antibiotika og svampedræbende stoffer er nødvendige til fremstilling af vækstmediet til cellekultur for at beskytte celler mod forureninger. - Inkuber centrifugerørene i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer fraktionen med adipocytter, som er lettere og derfor svømmer oven på væsken, med en 10 ml pipette og kassér den.
- Den resterende stromalfraktion filtreres gennem en cellesigte på 100 μm med en polyethylenterephthalatmembran (PET), der er fri for tungmetaller, for at tilbageholde fedtvævsfragmenter og for kun at hente cellesuspensionen.
- Centrifugering af den filtrerede cellesuspension i 7 minutter ved 630 x g ved stuetemperatur.
- Resuspend cellepillen i 2 ml PBS for at vaske cellerne en gang.
- Centrifugering af cellesuspensionen igen i 7 minutter ved 630 x g ved stuetemperatur.
- Efter centrifugering og gentagen resuspension af cellepillen i 10 ml vækstmedier pr. kolbe, frøceller i 75cm2 cellekulturkolber.
BEMÆRK: Afhængigt af cellepillens størrelse efter vasketrinnet med PBS, frøceller i en til fire kolber.
2. Celledyrkning af svines fedtvævsafledte stromalceller
- Høst- og passageceller, når de når 70% sammenløb.
- Vask celler med 10 ml PBS to gange og aspirer PBS helt.
BEMÆRK: Dette trin er nødvendigt for at fjerne resterende vækstmedier, som suppleres med 10% FBS. FBS har flere proteasehæmmere, som kan hindre funktionen af følgende trypsinisering. - Der tilsættes 3 ml 0,05 %-Trypsin-EDTA pr. kolbe for at løsne cellerne.
- Inkubere kolber i 3 min. ved 37 °C.
- Kontroller under mikroskopet, om cellerne løsnes.
BEMÆRK: Nogle gange tager det lidt mere tid at løsne cellerne. I dette tilfælde inkuberes kolber i højst 5 minutter ved 37 °C. - For at stoppe inkubations- og frigørelsesprocessen tilsættes 3 ml vækstmedier.
BEMÆRK: Som nævnt ovenfor suppleres vækstmedier med 10% FBS, der indeholder proteasehæmmere. - Overfør de løsrevne celler til et centrifugeringsrør og centrifuge i 7 minutter ved 630 x g ved stuetemperatur.
- Resuspend cellerne i 10 ml vækstmedier og tæl dem med et hæmocytometer.
- Frøceller med en podningstæthed på 3 x 105 celler pr. 75 cm2 kolbe.
3. Mærkning af celler med calcein-AM
BEMÆRK: Celler, der injiceres i kadavervæv, farves med en grøn-fluorescerende membranpermeabel levende celleplet og en rød-fluorescerende membran-impermeant levedygtighedsindikator for at kontrollere, at ekstraherede celler er de samme som de injicerede celler og ikke vævsfragmenter i urinrøret.
- Vask celler to gange med 10 ml PBS.
- Der tilsættes 5 ml farvestofopløsning pr. 75 cm2 kolbe. Farvestofopløsningen består af vækstmedier med 2 μM af den grøn-fluorescerende membranpermeable levende cellefarvestof og 4 μM rød-fluorescerende membran-impermeant levedygtighedsindikator.
- Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Aspirer og kassér farvestofopløsningen.
- Vask cellerne igen to gange med 10 ml PBS.
- Tilføj vækstmedier og dokumentér det grønne og røde fluorescenssignal ved fluorescensmikroskopi.
- Anbring kolben på 75 cm2 på mikroskopbordet, brug 10x-målet, vælg intet fluorescensfilter, og sørg for, at den transmitterede lysbane er aktiv.
BEMÆRK: Disse trin udføres alle manuelt på mikroskopet. - Parallelt med trin 3.6.1 skal du åbne softwareprogrammet.
- Tryk på knappen Live under fanen Find for at få et levende billede af cellerne i kolben på bordet og fokusere på dem med de grove og fine justeringsdrev.
BEMÆRK: På højre side vises livebilledet, når live-knappen er aktiveret. - Vælg det korrekte mål (10x) under fanen Mikroskopkomponenter.
- Anvend et flueben for Automatisk eksponering under fanen Kamera.
- Tryk på knappen Fastgør for at tage det første billede med transmitteret lys.
- Indsæt skaleringslinjen ved hjælp af fanen Grafik på menulinjen og vælge Skalalinje.
- Gem billedet ved at bruge fanen Filer på menulinjen og vælge Gem som czi.
- For fluorescensbillederne ændres filteret til det, der er specifikt for grøn eller rød fluorescens, og vælg den reflekterede lysbane.
BEMÆRK: Disse ændringer skal udføres manuelt på mikroskopet. - Tryk igen på knappen Live under fanen Find for at få et levende billede af cellerne.
- Tryk på knappen Snap for at tage det andet billede med enten grøn eller rød fluorescens.
- Indsæt skaleringslinjen ved hjælp af fanen Grafik på menulinjen og vælge Skalalinje.
- Gem billedet ved at bruge fanen Filer på menulinjen og vælge Gem som czi.
- Gentag trin 3.6.9 til 3.6.13 med den anden fluorescenskanal.
- Anbring kolben på 75 cm2 på mikroskopbordet, brug 10x-målet, vælg intet fluorescensfilter, og sørg for, at den transmitterede lysbane er aktiv.
4. Forbered urinrørsvævsprøver til injektioner
- Dissekere urinrøret og forbindelsesblæren ud af grisen.
BEMÆRK: Urinrørsvævsprøver fra friske kadaverprøver af voksne kvindelige landracesvin blev brugt til forsøgene. - Transporter det til laboratoriet i poser på våd is.
BEMÆRK: Prøverne skal efterlades på is indtil videre behandling. Der blev ikke tilsat tilsætningsstoffer til prøverne. - Placer urinrøret med blæren på en svamp, som efterligner elasticiteten af den nedre bækkenbund.
- Brug blæren til at bestemme orienteringen (proksimal, distal, dorsal og ventral) af urinrøret. Dette er muligt på grund af lokaliseringen af urinlederne og de tre ledbånd, der fastgør blæren i mave- og bækkenhulen. De tre ledbånd er de to vesicae lateralia ledbånd på blærens sider og vesicae medianum, som stammer fra blærens ventrale overflade (figur 1).
- Skær urinrøret i længderetningen på den dorsale side ved hjælp af et kateter.
- Injektion af cellerne i det åbnede urinrør som beskrevet i de følgende kapitler.
5. Injektioner af celler via en Williams-nål i væsker og vævsprøver
- Høstceller som beskrevet i trin 2.
- I modsætning til trin 2.9 justeres celletætheden for injektioner til 2,4 x 106 celler pr. Ml.
BEMÆRK: Til injektioner i vævsprøver mærkes cellerne med en grøn-fluorescerende membranpermeabel levende celle. - Aspirer cellesuspensionen med en sprøjte og påfør Williams cystoskopiske injektionsnål (WN) på den.
- Hold enten nålen kort over 2 ml vækstmediet i et 15 ml centrifugeringsrør eller indsæt nålen i det åbnede urinrørsvæv. I begge tilfælde injiceres 250 μL celler manuelt.
BEMÆRK: Celler injiceret i det kadaveriske urinrør danner en injektionskuppel. - Opsaml celler injiceret i medier direkte ved centrifugering i 7 minutter ved 630 x g ved stuetemperatur.
- For celler, der injiceres i det kadaveriske urinrør, aspirerer dem ud af injektionskuplen med en 18G-nål påført en sprøjte.
- Overfør de injicerede og aspirerede celler til et centrifugeringsrør og centrifuge i 7 minutter ved 630 x g ved stuetemperatur sammenlignet med de celler, der injiceres i medier.
- Efter centrifugering resuspenderes cellerne i 4 ml vækstmedier i begge tilfælde.
- Bestem celleudbytte og levedygtighed ved hjælp af Udelukkelse af Trypan blåt farvestof med et hæmocytometer.
- Bland 20 μL cellesuspension grundigt med 20 μL Trypan blå.
- Fyld 10 μL af denne blanding i hvert kammer i hæmocytometeret.
BEMÆRK: Begge kamre er fyldt og tælles for at opnå statistisk optimering ved at fordoble prøveudtagningen. - Under et mikroskop skal du tælle celler i alle fire hjørnefirkanter.
BEMÆRK: Tæl celler, der skinner i hvidt (ufarvet) som levedygtige celler, mens celler, der skinner blåt (farvet), tælles som døde celler. - For at beregne celletallet pr. ml skal du beregne gennemsnittet af de to kamre, dividere dette tal med to og multiplicere det med 104.
6. Injektioner af celler via Waterjet i væsker og vævsprøver
- Høstceller som beskrevet i trin 2.
- I modsætning til trin 2.9 og 5.2 justeres celletætheden for injektioner til 6 x 106 celler pr. Ml.
BEMÆRK: Til injektioner i vævsprøver anvendes celler mærket med en grøn-fluorescerende membranpermeabel levende celle. - Fyld cellesuspensionen i doseringsenheden på WJ-enheden.
- Hold enten injektionsdysen kort over 2 ml vækstmediet i et 15 ml centrifugeringsrør eller kort over det åbnede urinrørsvæv.
- I begge tilfælde injiceres 100 μL celler af enheden ved hjælp af et højt tryk til vævsindtrængning efterfulgt af en lavtryksfase til celleinjektioner. Brug trykindstillingerne E60-10.
BEMÆRK: Celler injiceret i det kadaveriske urinrør danner en injektionskuppel. - Opsaml celler injiceret i medier direkte ved centrifugering i 7 minutter ved 630 x g ved stuetemperatur.
- For celler, der injiceres i det kadaveriske urinrør, aspirerer dem ud af injektionskuplen med en 18G-nål påført en sprøjte.
- Overfør de injicerede og aspirerede celler til et centrifugeringsrør og centrifuge i 7 minutter ved 630 x g ved stuetemperatur sammenlignet med de celler, der injiceres i medier.
- Efter centrifugering resuspend celler i 4 ml vækstmedier i begge tilfælde.
- Celleudbytte og levedygtighed bestemmes ved hjælp af udelukkelse af Trypan blåt farvestof med et hæmocytometer som beskrevet detaljeret i 5.10.
7. Biomekanisk vurdering af cellulær elasticitet ved hjælp af atomkraftmikroskopi (AFM)
- Forberedelse af prøver
BEMÆRK: De hentede celler efter injektion er nu genstand for yderligere analyser af AFM. Derudover anvendes celler, der ikke blev injiceret, som kontroller.- Frøceller i vævskulturretter med en densitet på 5 x 105 celler pr. Skål.
BEMÆRK: Frø en vævskulturskål pr. Tilstand. Betingelserne er kontroller, ADSC'er injiceret af WJ eller WN i medier og ADSC'er injiceret af WJ eller WN i kadavervæv. - Inkubere celler i vævskulturretter i 3 timer ved 37 °C.
BEMÆRK: For at undgå afvigelser på grund af celler i G1-fase og under mitose udførte vi AFM-målinger 3 timer efter cellesåningstrinnet. - Lige før målingen med AFM erstattes vækstmediet med 3 ml Leibovitz' L-15-medier uden L-glutamin.
- Anbring vævskulturskålen i prøveholderen på AFM-enheden, og tænd petriskålsvarmeren, der er indstillet til 37 °C.
- Frøceller i vævskulturretter med en densitet på 5 x 105 celler pr. Skål.
- Forberedelse af AFM- og cantileverkalibrering
- Brug en glasblok, der er specificeret til målinger i væsker, og juster den på AFM-holderen.
BEMÆRK: Glasblokkens øverste overflade skal være lige og parallel med AFM-holderen. - Placer forsigtigt udkragningen på overfladen af glasblokken. Spidsen A skal ligge over det polerede optiske plan.
BEMÆRK: Rids ikke den polerede optiske overflade på glasblokken, da ridser kan føre til interferens i målingerne. Spidsen A skal stikke ud over det polerede optiske plan, fordi det ellers ikke er muligt at reflektere AFM-laseren til fotodetektoren. - For at stabilisere udkragningen på glasblokken skal du tilføje en metallisk fjeder ved hjælp af pincet.
- Når udkragningen er fastgjort på glasblokken, skal du placere blokken på AFM-hovedet og låse den integrerede låsemekanisme.
- Monter AFM-hovedet på AFM-enheden.
BEMÆRK: Fjederen skal vende mod venstre side for at blive placeret korrekt. Hvis dette ikke er tilfældet, skal du korrigere glasblokkens position og justere AFM-hovedet igen. - Initialiser softwareopsætningen, og åbn softwaren sammen med laserjusteringsvinduet og indstillingerne for tilgangsparameteren. Tænd desuden stepmotoren, laserlyset og CCD-kameraet.
- Identificer udkragningsspids A ved hjælp af CCD-kameraet.
- Sænk udkragningen, indtil den er helt dyppet i mediet. Brug stepmotorfunktionen til at nå dette mål.
- Når udkragningen er helt dækket af medium, justeres laseren oven på udkragningen ved hjælp af justeringsskruerne. Den reflekterede stråle skal falde ned på midten af fotodetektoren, og summen af signalerne skal være 1 V eller højere. De laterale og lodrette afbøjninger skal være tæt på 0.
BEMÆRK: Hvis midten er nået, kan den overvåges i laserjusteringsfunktionen samt signalværdierne. Hvis signalværdierne ikke er korrekte, er yderligere justeringer nødvendige. - Kør nu scanneren Approach med indflyvningsparametrene (tabel 1).
- Træk udkragningen tilbage med 100 μm, når den når bunden, ved at trykke på knappen Træk tilbage .
BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er fastgjort nogen celle i det felt, hvor fremgangsmåden udføres, fordi dette ville forfalske kalibreringen. - Konfigurer Run-parametrene i henhold til følgende specifikationer: Setpunkt 1 V, Træklængde 90 μm, Hastighed: 5 μm/s, Samplingshastighed: 2000 Hz og som forsinkelsestilstand: Konstant kraft.
- Start målingen af kalibreringskraft-afstandskurven ved at trykke på knappen Kør.
BEMÆRK: Ved at klikke på knappen Kør i softwaren opnås en kraftafstandskurve. - Vælg området for lineær tilpasning af den tilbagetrukne kurve i softwaren på den opnåede kalibreringskraft-afstandskurve. Beregn fjederkonstantmålingen af softwaren.
- Kalibrer udkragningen ved at følge de nøjagtige parametre og trin som beskrevet af Danalache et al.17.
- Brug en glasblok, der er specificeret til målinger i væsker, og juster den på AFM-holderen.
- Måling af elasticiteten af de enkelte celler
- Identificer visuelt en celle og fokuser på den. Placer computermusen midt i cellen. For at forbedre målepræcisionen skal du placere AFM-spidsen direkte over cellekernen.
BEMÆRK: Computermusen bruges som visuel markør til at identificere målstedet for indrykning. - Fokuser nu på udkragningen og flyt den på computermusen.
- Start målingen med Kør med parametrene i tabel 2.
BEMÆRK: Sætpunktsparameteren opnået ved kalibrering af udkragningen anvendes. Desuden måles en celle tre gange. Mål mindst 50 celler.
- Identificer visuelt en celle og fokuser på den. Placer computermusen midt i cellen. For at forbedre målepræcisionen skal du placere AFM-spidsen direkte over cellekernen.
- Databehandling
- Behandle dataene ved at følge nøjagtige trin og parametre som tidligere beskrevet af Danalache17.
- Gem og eksporter filen.
8. Statistisk analyse
- Åbn den statistiske software.
- Vælg valget af Nyt datasæt.
BEMÆRK: To filer åbnes. Den ene er "DataSet", og den anden er "Output" -filen. - Vælg filen DataSet , og åbn fanen Variabelvisning .
- Indsæt de numeriske variabler for injektion på stedet (indfangningsvæske eller kadavervæv), kategori (kontrol, WJ-injektion, WN-injektion) og elasticitet.
- Indsæt de målte elasticitetsdata med deres tilsvarende stedinjektion og kategorinummer under fanen Datavisning .
- Analysér dataene ved at vælge fanen Analysér | Beskrivende statistik , og vælg Sonderende dataanalyse.
- Som den afhængige variabel skal du vælge Elasticitet og faktorliste vælg Kategori.
BEMÆRK: Resultaterne vises i filen "Output", herunder et boksplot, der bruges til resultatafsnittet. - Hvis du vil udføre en statistisk test, skal du vælge de uafhængige prøver i den ikke-parametriske test under fanen Analysér på menulinjen.
- I den nye åbnede fil skal du holde indstillingerne i fanen Mål og Indstillinger.
- Åbn fanen Felter, og vælg Elasticitet som testfelter og Kategori som grupper.
- Tryk på Kør.
BEMÆRK: Resultaterne vises i filen "Output". Til disse analyser udføres en Mann-U-Whitney-test. - Medtag resultatet af den ikke-parametriske test i boksplottet i den sonderende dataanalyse.
- Gem filerne ved at vælge Filer på menulinjen og vælge Gem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter cellelevering via de to tilgange var levedygtigheden af celler leveret gennem WN (97,2 ± 2%, n = 10, p<0,002) højere sammenlignet med injektioner fra WJ ved hjælp af E60-10-indstillingerne (85,9 ± 0,16%, n = 12) (figur 2). Biomekaniske vurderingsresultater viste, at: WN-injektioner af celler i indfangningsvæske viste ingen signifikant forskel med hensyn til det elastiske modul (EM; 0,992 kPa) sammenlignet med kontrollerne (1,176 kPa; Figur 3A), mens WJ-injektioner udløste en signifikant reduktion af den cellulære EM (0,440 kPa, s<0,001, figur 3B). Et fald på 40-50% af EM efter WJ-injektioner blev noteret. Selvom WN-injektioner i kadaverisk urinrørsvæv ikke gav nogen signifikant forskel i cellulær EM (figur 4A), blev der konstateret en signifikant reduktion i EM efter WJ-injektioner i vævsprøver (0,890 kPa til 0,429 kPa; p<0,00, figur 4B). Således blev de absolutte EM-værdier efter WJ-injektionen derved reduceret med 51%. Samlet set viser resultaterne, at mens WJ-cellelevering opfylder et absolut krav til en klinisk implementering, hvor mere end 80% levedygtige celler efter levering18 , efter WJ-levering påvirkes det celleelastiske modul. En lavere cellulær EM kan lette migrationen af cellernes funktioner efter WJ-levering. I en sådan bredere fordeling og vifte af regenerative kapaciteter i den ønskede region19.
Figur 1. Anatomi af svineblære og urinrør og injektionssteder. A) Den ventrale side af svineblæren og urinrøret med de tre ledbånd, der fastgør blæren i mave- og bækkenhulen, er vist. Derudover vises urinlederne, der slutter på blærens dorsale side. B) Repræsentativt billede af det kadaveriske urinrør, der anvendes til WJ- og WN-injektion. I længderetningen vises den dorsale åbnede urinrør med injektionskupler cirklet i sort. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Injektioner til bestemmelse af cellulær levedygtighed via WN og WJ. pADSC'er injiceret via WN eller WJ blev indsamlet efter injektion og talt via Trypan-udelukkelse for at bestemme levedygtigheden. Den cellulære levedygtighed blev signifikant reduceret efter WJ-injektion sammenlignet med celler leveret via WN. s<0.001. Dataene vises grafisk som middelværdi med standardafvigelse. Forkortelser: WJ - waterjet, WN - Williams nål. Figur tilpasset fra Danalache et al. 202119. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Sammenligning af den kvantificerede Youngs modul af WN henholdsvis WJ leverede celler til capture media og deres tilsvarende kontroller. Der blev ikke observeret nogen bemærkelsesværdig forskel i EM i boxplottene for kontrol (ubehandlet) cellemonolag og WN-leverede celler (A). I modsætning hertil kan der konstateres et signifikant fald i elasticiteten mellem kontrolcellernes boksplotter og WJ-gruppen (B). ns - ikke signifikant, p > 0,05, ***p<0,001. Forkortelser: WJ - waterjet, WN - Williams nål. Figur tilpasset fra Danalache et al. 202119. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4. Sammenligning af de kvantificerede Youngs moduler af WN henholdsvis WJ leverede celler i kadaverisk urinrør og deres tilsvarende kontroller. Der blev ikke observeret nogen bemærkelsesværdig forskel mellem celler leveret via WN-celler og deres tilsvarende kontroller (A). Et signifikant fald i elasticiteten blev noteret mellem de WJ-leverede celler og kontrolcellemonolaget (B). ns - ikke signifikant, p > 0,05, ***p<0,001. Forkortelser: WJ - waterjet, WN - Williams nål. Figur tilpasset fra Danalache et al. 202119. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Parameter for tilgang | Værdi |
| Fremgangsmåde IGain | 3,0 Hz |
| Fremgangsmåde PGain | 0.0002 |
| Indflyvning målhøjde | 10,0 μm |
| Sætpunkt for tilgang | 3,00 V |
| Tilgang baseline | 0,00 V |
Tabel 1. Tilgang parametre.
| Kør parameter | Værdi |
| Sætpunkt | 10 nN |
| Z Bevægelse/ Udvid hastighed | Konstant hastighed/ |
| 5,0 μm/s | |
| Kontakttid | 0,0 s |
| Træk længde | 90 μm |
| Forsinkelsestilstand | Konstant kraft |
| Samplingsfrekvens | 2000 Hz |
Tabel 2. Kør parametre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den foreliggende undersøgelse demonstrerede og præsenterede vi en trinvis tilgang til WJ-celleleveringsprocedure og anvendte en efterfølger af kvantitative undersøgelser for at vurdere effekten af WJ-levering på cellulære egenskaber: cellulær levedygtighed og biomekaniske egenskaber (dvs. EM). Efter WJ-injektion var 85,9% af de høstede celler levedygtige. Med hensyn til WN-injektion bevarede 97,2% af cellerne deres levedygtighed efter injektion. WJ-tilgangen opfylder således et absolut krav til en klinisk implementering: mere end 80% levedygtige celler efter levering18. Mens en standardiseret og reproducerbar protokol opnås med WJ-tilgangen, er resultatet af nåleinjektionslevering meget afhængig af sprøjtens og nålens størrelse og dyse, tryk, strømningshastighed og den læge, der selv udfører injektionen19.
Undersøgelser, der anvendte WJ-cellelevering i levende dyremodeller, viste, at penetrationsdybden ved at variere udstødningstrykket kan tilpasses det målrettede væv og som sådan til den ønskede kliniske anvendelse13,16. Transuretrale celleinjektioner hos levende dyr under visuel kontrol rapporterede fejlplacering eller tab af celler hos ca. 50% af de behandlededyr 20, mens WJ-injektioner rapporterede præcise celleinjektionshastigheder over 90% (Linzenbold et al.16 og upubliceret observation). Den nuværende gyldne standard for cellelevering (nåleinjektioner) kræver indtrængning af kanylen i et målrettet væv. Derfor forårsager nålecelleoversættelse skade og traumer i alle tilfælde. I urinrøret kan dette faktisk forårsage betændelse ad toxificering på grund af kim og toksiner, der findes i selv i sund urin. Derudover er brugerdriftstiden ved WJ-injektion signifikant kortere sammenlignet med en nåleinjektion: celler placeres inden for millisekunder i det tilsigtede vævslag ved at forudindstille trykniveauerne. I modsætning hertil er penetrationsdybden på nåleinjektion i fjerntliggende områder ved endoskopi afhængig af kirurgens færdigheder og erfaring. Reproducerbarheden af WJ-injektion forventes også at være overlegen, men i øjeblikket findes der kun prækliniske data 15,16,20 og mindre end 200 dyr blev undersøgt. I vores nylige undersøgelse bemærkede vi, at cellulær elasticitet reduceres ved WJ-anvendelse sammenlignet med nåleinjektioner21. Dette kan tilskrives forskydningsspændingen af celler i højere hastighed under WJ-levering. Desuden kan et eventuelt celletab kompenseres af en højere præcision af celleplacering og udstødning inden for interesseområdet som opnået med WJ-styret levering ved visuel guidet cystoskopi22.
Det er velkendt, at mekaniske kræfter styrer stamcelleadfærd, regenereringspotentiale samt deres efterfølgende levedygtighed og funktionalitet efter transplantation 10,23. Fremkomsten af atomisk AFM gav et kraftfuldt værktøj til kvantificering af de mekaniske egenskaber af enkelte levende celler i nanoskala opløsning under vandige forhold 24,25,26,27. AFM er en pålidelig og meget følsom metode, der kan detektere og registrere stivheder fra mindre end 100 Pa til 106 Pa og dermed dække en bred vifte for de fleste væv og celler28. Faktisk fremstår cellemekanik som etiketfri biomarkør til evaluering af celletilstand og i både fysiologisk og patologisk tilstand29 og celleelasticitet er den synergiske og kumulative respons af kernen - cytoskelet crosstalk. Det er veletableret, at når en celle udsættes for eksterne kræfter, overføres disse kræfter fra plasmamembranen via cytoskelettet til kernen, hvilket resulterer i intra-nukleare deformationer og omorganisering 30,31,32. Derfor er kernen, der længe har været betragtet som det genomiske materiale og transkriptionsapparat, også en nøglespiller i den cellulære mekanotransduktion32. Faktisk er betydningen af nuklear mekanik og nukleo-cytoskeletale forbindelser i alle cellulære funktioner og mutationer i laminer og linkere af nukleoskeletet til cytoskeletet (LINC) komplekset - ved begyndelsen af grundlaget for flere patologier 33,34. Disse kræfter kunne også indikere cellulære artefakter. Specifikt formerer eksternt genererede kræfter sig faktisk langs cytoskeletale filamenter og overføres yderligere til den nukleare lamina over LINC-komplekset; som reaktion på disse kræfter bliver kernen faktisk stivere35,36, hvilket fusionerer de to tæt sammenflettede og forbundne processer. Dette er også begrundelsen for vores tilgang og vores nukleare mekanikmålinger. Desuden sikrer en præcis placering af udkragningen oven på den nukleare overflade også en høj grad af reproducerbarhed og reducerer variationer på grund af celleheterogenitet og fastgørelse til underlaget.
Selvom celleelasticitet fremstår som etiketfri biomarkør til evaluering af celletilstanden og i både fysiologiske og patologiske tilstande29, er de målte elastiske moduler præget af store variationer selv i samme celletype37. En metode til at modvirke sådanne variationer som foreslået af Schillers et al. er implementeringen af standardiserede nanomekaniske AFM-procedurer (SNAP), der sikrer en høj reproducerbarhed og anvendelighed af elasticitetsmålinger som en pålidelig kvantitativ markør for celler i forskellige tilstande38. Selv om eksperimentelle parametre, der anvendes i AFM-analyserne, såsom indrykningshastighed, indenterform og -størrelse samt nøjagtig repræsentation af spidsgeometri i modeltilpasning 39, påvirker de absolutte målte værdier40,41, bør disse parametre ikke påvirke resultaterne inden for en undersøgelse eller en målt tendens.
Husk dog, at AFM-indrykninger er begrænset til analyse af den ydre overflade af celler og dermed ikke er i stand til at scanne indersiden af en cellemembran eller bestemte intracellulære strukturer. Usukura et al. foreslog en "unroofing" -metode, der bryder den cellulære membran og fjerner de cytoplasmatiske opløselige komponenter42, hvilket muliggør AFM-intracellulære undersøgelser. I vores undersøgelse blev der imidlertid fokuseret på vurderingen af gennemsnitlige elastiske moduler snarere end at undersøge forskellige og selektive intracellulære komponenter.
Samlet set afhænger konsistensen og pålideligheden af de leverede AFM-data i høj grad af den pågældende operatørs tekniske erfaring og kan være forudindtaget af biologisk variabilitet38. Når man tager højde for alle de følsomme variabler, der kan påvirke de faktiske AFM-resultater, kan de absolutte elastiske værdier, der er rapporteret i denne undersøgelse, ikke generaliseres og er ret specifikke for vores eksperimentelle opsætning.
Samlet set giver vores undersøgelse bevis21 samt en trinvis protokol for WJ-injektionernes overlegenhed over nåleinjektioner til regenerativ celleterapiregime.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne J.K., M.D, T.A., A.S., W.K. A. har intet at afsløre. Forfatterne W.L. og M.D.E. er ansatte hos ERBE Medizintechnik Lt. Tübingen, producenten af ERBEJet2 og WJ-prototypen, der er anvendt i denne undersøgelse.
Acknowledgments
Vi takker vores medforfattere fra de originale publikationer for deres hjælp og støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 227261 | |
| 1 mL BD Luer-LokTM Syringe | BD Plastik Inc | n.a. | |
| 100 µm cell sieve | Greiner BioOne | 542000 | |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 188271 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Incorporated | 353136 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| AFM processing software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM system Cell Hesion 200 | Bruker | JPK00518 | |
| All-In-One-Al cantilever | Budget Sensors | AIO-10 | tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) Length: 500 µm (490 - 510 µm) Width: 30 µm (35 - 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm) |
| Amphotericin B solution | Sigma | A2942 | 250 µg/ml |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| BD Microlance 3 18G | BD | 304622 | |
| bovine serum albumin | Gibco | A10008-01 | |
| Cantilever | All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | tip A, k ¼ 0.2 N/m |
| C-chip disposable hemocytometer | NanoEnTek | 631-1098 | |
| centrifuge: Rotina 420R | Hettich Zentrifugen | ||
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17100-017 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose | Sigma | D5546 | |
| Feather disposable scalpel (No. 10) | Feather | 02.001.30.010 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| HEPES sodium salt solution (1 M) | Sigma | H3662 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| laboratory bags | Brand | 759705 | |
| Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine | Merck | F1315 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| L-glutamine | Lonza | BE 17-605C1 | 200 mM |
| LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | L3224 | Calcein AM and EthD-1 are used from this kit. |
| Microscope software: Zen 2.6 | Zeiss | ||
| Microscope: AxioVertA.1 | Zeiss | ||
| Nelaton-Catheter female | Bicakcilar | 19512051 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin |
| Petri dish heater associated with AFM | Bruker | T-05-0117 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Statistical Software: SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Sterile Petri dish - CellStar | Greiner BioOne | 664160 | |
| Tissue culture dishes | TPP AG | TPP93040 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl |
Lonza | 17-942E | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
| Waterjet: ERBEJET2 device | Erbe Elektromedizin GmbH | ||
| Williams Cystoscopic Injection Needle | Cook Medical | G14220 | 23G, 5.0 Fr, 35 cm |
References
- Milsom, I., et al. Global prevalence and economic burden of urgency urinary incontinence: a systematic review. European Urology. 65 (1), 79-95 (2014).
- Lee, J. Y., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 14 (1), 31-37 (2003).
- Tran, C., Damaser, M. S. The potential role of stem cells in the treatment of urinary incontinence. Therapeutic Advances in Urology. 7 (1), 22-40 (2015).
- Fu, Q., Song, X. F., Liao, G. L., Deng, C. L., Cui, L. Myoblasts differentiated from adipose-derived stem cells to treat stress urinary incontinence. Urology. 75 (3), 718-723 (2010).
- Corcos, J., et al. marrow mesenchymal stromal cell therapy for external urethral sphincter restoration in a rat model of stress urinary incontinence. Neurourology and Urodynamics. 30 (3), 447-455 (2011).
- Smaldone, M. C., Chen, M. L., Chancellor, M. B. Stem cell therapy for urethral sphincter regeneration. Minerva Urologica e Nefrologica. 61 (1), 27-40 (2009).
- Perin, E. C., López, J. Methods of stem cell delivery in cardiac diseases. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 3, Suppl 1 110-113 (2006).
- Zhang, M., et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
- Amer, M. H., Rose, F. R. A. J., Shakesheff, K. M., Modo, M., White, L. J. Translational considerations in injectable cell-based therapeutics for neurological applications: concepts, progress and challenges. NPJ Regenerative Medicine. 2, 23-23 (2017).
- Linzenbold, W., Fech, A., Hofmann, M., Aicher, W. K., Enderle, M. D. Novel Techniques to Improve Precise Cell Injection. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6367 (2021).
- Adamo, A., Roushdy, O., Dokov, R., Sharei, A., Jensen, K. F. Microfluidic jet injection for delivering macromolecules into cells. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 23, 035026 (2013).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Weber, M., et al. Hydrojet-based delivery of footprint-free iPSC-derived cardiomyocytes into porcine myocardium. Scientific Reports. 10 (1), 16787 (2020).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Linzenbold, W., et al. Rapid and precise delivery of cells in the urethral sphincter complex by a novel needle-free waterjet technology. BJU International. 127 (4), 463-472 (2021).
- Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
- Gálvez-Martín, P., Hmadcha, A., Soria, B., Calpena-Campmany, A. C., Clares-Naveros, B. Study of the stability of packaging and storage conditions of human mesenchymal stem cell for intra-arterial clinical application in patient with critical limb ischemia. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (3), 459-468 (2014).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), (2021).
- Amend, B., et al. Precise injection of human mesenchymal stromal cells in the urethral sphincter complex of Göttingen minipigs without unspecific bulking effects. Neurourology and Urodynamics. 36 (7), 1723-1733 (2017).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 3958 (2021).
- Strasser, H., et al. 328: Transurethral Ultrasound Guided Stem Cell Therapy of Urinary Incontinence. Journal of Urology. 175 (4), 107 (2006).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
- Ding, Y., Xu, G. -K., Wang, G. -F. On the determination of elastic moduli of cells by AFM based indentation. Scientific Reports. 7 (1), 45575 (2017).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Carl, P., Schillers, H. Elasticity measurement of living cells with an atomic force microscope: data acquisition and processing. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 457 (2), 551-559 (2008).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
- Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic Force Microscopy in Characterizing Cell Mechanics for Biomedical Applications: A Review. IEEE Trans Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
- Morimoto, A., et al. A conserved KASH domain protein associates with telomeres, SUN1, and dynactin during mammalian meiosis. The Journal of Cell Biology. 198 (2), 165 (2012).
- Lombardi, M. L., et al. The interaction between nesprins and sun proteins at the nuclear envelope is critical for force transmission between the nucleus and cytoskeleton. Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26743-26753 (2011).
- Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear Mechanics and Mechanotransduction in Health and Disease. Current Biology. 23 (24), 1113-1121 (2013).
- Méjat, A. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1 (1), 40-52 (2010).
- Folker, E. S., Östlund, C., Luxton, G. G., Worman, H. J., Gundersen, G. G. Lamin A variants that cause striated muscle disease are defective in anchoring transmembrane actin-associated nuclear lines for nuclear movement. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 131-136 (2011).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature cell biology. 16 (4), 376-381 (2014).
- Fischer, T., Hayn, A., Mierke, C. T. Effect of Nuclear Stiffness on Cell Mechanics and Migration of Human Breast Cancer Cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 393 (2020).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), 5117 (2017).
- Costa, K. D., Yin, F. C. Analysis of indentation: implications for measuring mechanical properties with atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 462-471 (1999).
- Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), (2004).
- Park, S., Costa, K. D., Ateshian, G. A., Hong, K. S. Mechanical properties of bovine articular cartilage under microscale indentation loading from atomic force microscopy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 223 (3), 339-347 (2009).
- Usukura, E., Narita, A., Yagi, A., Ito, S., Usukura, J. An Unroofing Method to Observe the Cytoskeleton Directly at Molecular Resolution Using Atomic Force Microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 27472 (2016).
