Summary
我々は、無針ウォータージェット技術による細胞注射の方法と、細胞生存率、増殖、および弾性測定の観点からの送達後調査の後遺症と組み合わせた方法を提示する。
Abstract
尿失禁(UI)は、尿道括約筋の欠乏を特徴とする非常に一般的な状態である。再生医療の枝、特に細胞療法は、尿道括約筋機能を改善および回復させるための新しいアプローチです。活性機能細胞の注射は、臨床現場で針および注射器によって日常的に行われているが、これらのアプローチには重大な欠点および限界がある。この文脈において、無針ウォータージェット(WJ)技術は、尿道括約筋に視覚的誘導膀胱鏡検査によって生細胞を注入することができる実現可能で革新的な方法である。本研究では、WJを用いてブタ脂肪組織由来間質細胞(pADSC)を死体尿道組織に送達し、その後、WJ送達が細胞収量および生存率に及ぼす影響を調査した。我々はまた、原子間力顕微鏡(AFM)測定によって生体力学的特徴(すなわち、弾性)を評価した。我々は、WJ送達されたpADSCsが細胞弾性において有意に低下することを示した。生存率は対照と比較して有意に低かったが、依然として80%を超えている。
Introduction
尿失禁(UI)は、ヨーロッパ集団1 における有病率が1.8〜30.5%の広範な疾患であり、主に尿道括約筋の機能不全によって特徴付けられる。臨床的観点からは、外科的治療は、保守的な治療法または理学療法が新たな症状に対処し、緩和できない場合に患者に提供されることが多い。
括約筋複合体の潜在的な再生修復のための細胞療法は、UI病理2、3の治療のための前衛的なアプローチとして浮上している。その主な目標は、損傷した組織の生物学的機能を置換、修復および回復させることである。UIのための動物モデルにおいて、幹細胞移植は、尿力学的転帰において有望な結果を示している2,4,5。幹細胞は、自己複製および多能性分化を受ける能力を有するため、最適な細胞候補として生じ、したがって、罹患組織再生6を補助する。来るべき再生の可能性にもかかわらず、細胞の低侵襲送達は依然として標的の注入精度およびカバレッジに関するいくつかの課題に直面しているため、細胞療法の実用化は依然として妨げられている。細胞送達に使用される現在のアプローチは、針注射器システム7を介した注射であるにもかかわらず、それは通常、生細胞の全体的な欠損をもたらし、移植後の生存率は1%〜31%と低いと報告されている8。加えて、針注射を介した細胞送達は、標的組織への移植細胞の配置、保持率、ならびに分布に影響を与えることも示されている9、10、11。上記の制限を克服する実現可能で斬新なアプローチは、ウォータージェット技術を介した無針細胞送達である。
ウォータージェット(WJ)技術は、尿道括約筋12、13における視覚的制御下での膀胱鏡による細胞のハイスループット送達を可能にする新しいアプローチとして浮上しつつある。WJは、E5からE8013までの異なる圧力(E = バーの効果)での細胞送達を可能にします。第1相では、等張溶液(組織浸透相)は、組織標的および開放された小さな相互連結マイクロラクナを囲む細胞外マトリックスを緩めるために高圧(すなわち、E60またはE80)で適用される。第2段階(注入段階)では、細胞を標的組織に穏やかに送達するために、圧力をミリ秒以内に(すなわち、E10まで)低下させる。この2つの段階的適用に続いて、細胞は、放出されるときに組織に対して追加の圧力を受けるのではなく、液体充填海綿状領域13に低圧流中に浮遊する。幹細胞をWJを介して死体尿道組織に注入したエキソビボモデル設定では、生存細胞をその後吸引して組織から取り出し、インビトロでさらに拡大することができた13。Weberらによる2020年の研究では、フットプリントのない心筋細胞を心筋14に送達するためのWJの実現可能性と適用可能性が実証されましたが、WJ技術はまだプロトタイプ段階にあることに留意する必要があります。
以下のプロトコルは、ブタ脂肪組織由来間質細胞(pADSC)を調製および標識する方法、およびWJ技術およびウィリアムズ膀胱鏡検査針(WN)を介してそれらを捕捉液および死体組織に送達する方法を説明する。細胞注射後、原子間力顕微鏡(AFM)を介して細胞の活力および弾性が評価される。ステップバイステップの手順により、プロトコルは信頼性の高いデータを取得するための明確で簡潔なアプローチを提供します。ディスカッションセクションでは、この技術の主な利点、制限、および将来の見通しを提示し、説明します。ここで報告されたWJ細胞送達および後遺症翻訳後分析は、標準的な針注射に取って代わり、標的組織の再生治癒のための固体細胞送達フレームワークを提供する。我々の最近の研究では、針注射と比較して、WJがより正確かつ少なくとも同等の生存率で細胞を送達したという証拠を提供しました15,16。
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Protocol
ブタ脂肪組織サンプルは、チュービンゲン大学の実験外科研究所から入手した。すべての手順は、動物実験番号CU1/16の下で地元の動物福祉当局によって承認された。
1. ブタ脂肪組織由来間質細胞の単離
- 実験外科学研究所から50mLの遠沈管に入れて実験室に届けたブタ脂肪組織を使用してください。
- 組織を滅菌ベンチの下の滅菌ペトリ皿に移し、2つのメス(No.10)で小さな断片とマッシュにミンチします。
注:はさみは、小さな破片を得るためにも使用できます。断片が小さければ小さいほど、次の消化に良い。- 小断片/マッシュを50 mLの遠沈管に移し、5 mLのホモジナイザー溶液とともにシェーカー上で37°Cで30分間インキュベートします。ホモジナイザー溶液は、1%ウシ血清アルブミン(BSA)(原液:PBS中の1%(w/v)BSA)および0.1%コラゲナーゼタイプIを含むPBSである。
注:常にホモジナイザー溶液を新しく準備してください。シェーカーは、遅い速度25〜500rpmで円形の揺れ運動を有する。
- 小断片/マッシュを50 mLの遠沈管に移し、5 mLのホモジナイザー溶液とともにシェーカー上で37°Cで30分間インキュベートします。ホモジナイザー溶液は、1%ウシ血清アルブミン(BSA)(原液:PBS中の1%(w/v)BSA)および0.1%コラゲナーゼタイプIを含むPBSである。
- インキュベーションを停止するには、10 mLの増殖培地[ダルベッコの改変イーグル培地 - 低グルコース(DMEM-LG)、2.5%HEPESナトリウム塩溶液(1 M)、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%L-グルタミン(200 mM)、1%ペニシリン - ストレプトマイシン(10000 U/mLペニシリン;10,000 μg/mLストレプトマイシン)および1%アムホテリシンB(250 μg/mL)]を加える。
注:成長培地は事前に準備することができます。抗生物質および抗真菌薬は、細胞を汚染から保護するために細胞培養のための増殖培地の調製に必要である。 - 遠沈管を室温で10分間インキュベートする。
- より軽く、したがって液体の上を泳ぐ脂肪細胞で、10mLピペットで画分を吸引し、それを捨てる。
- 残りの間質画分を、重金属を含まないポリエチレンテレフタレート(PET)膜を備えた100μmの細胞篩を通して濾過し、脂肪組織断片を保留し、細胞懸濁液のみを取り出す。
- 濾過した細胞懸濁液を室温で630 x gで7分間遠心分離する。
- 細胞ペレットを2mLのPBSに再懸濁し、細胞を1回洗浄した。
- 細胞懸濁液を室温で630 x gで7分間再度遠心分離する。
- 遠心分離後、細胞ペレットをフラスコ当たり10mLの増殖培地に再懸濁し、75cm2細胞培養フラスコに細胞をシードした。
注:PBSによる洗浄工程後の細胞ペレットのサイズに応じて、細胞を1〜4つのフラスコに播種する。
ブタ脂肪組織由来間質細胞の細胞培養
- 細胞が70%コンフルエントに達したら回収および継代する。
- 10mLのPBSで細胞を2回洗浄し、PBSを完全に吸引する。
注: この手順は、10% FBS によって補完される残りの成長培地を除去するために必要です。FBSは、以下のトリプシン処理の機能を妨げる可能性があるいくつかのプロテアーゼ阻害剤を有する。 - フラスコあたり3mLの0.05%-トリプシン-EDTAを加え、細胞を剥離した。
- フラスコを37°Cで3分間インキュベートする。
- 細胞が剥離しているかどうかを顕微鏡で確認してください。
注: セルを切り離すのに時間がかかることがあります。この場合、フラスコを37°Cで最大5分間インキュベートする。 - インキュベーションおよび剥離プロセスを停止するには、3mLの成長培地を加える。
注:上記のように、成長培地は、プロテアーゼ阻害剤を含む10%FBSによって補完される。 - 剥離した細胞を遠心チューブに移し、室温で630 x gで7分間遠心分離した。
- 細胞を10mLの成長培地に再懸濁し、血球計数器でそれらを計数する。
- 75cm2フラスコ当たり3 x105個の接種密度を有する種子細胞。
3. カルセイン-AMによる細胞の標識
注:死体組織に注入された細胞は、緑色蛍光膜透過性生細胞染色および赤色蛍光膜不透過性生存率指標で染色され、抽出された細胞が注入された細胞と同じであり、尿道の組織断片ではないことを確認する。
- 細胞を10mLのPBSで2回洗浄する。
- 75cm2フラスコあたり5mLの色素溶液を加える。色素溶液は、2μMの緑色蛍光膜透過性生細胞色素および4μMの赤色蛍光膜不透過性生存率指標を有する増殖培地からなる。
- 暗所で室温で30分間インキュベートする。
- 染料溶液を吸引し、廃棄する。
- 細胞を10mLのPBSで再度2回洗浄する。
- 成長培地を追加し、蛍光顕微鏡によって緑色および赤色の蛍光シグナルを文書化する。
- 75 cm2フラ スコを顕微鏡テーブルの上に置き、10倍の対物レンズを使用し、蛍光フィルターを選択しないことを確認し、透過光路がアクティブであることを確認します。
メモ:これらの手順はすべて顕微鏡で手動で実行されます。 - ステップ 3.6.1 と並行して、ソフトウェア・プログラムを開きます。
- [検索]タブの下にある[ライブ]ボタンを押して、テーブル上のフラスコ内のセルのライブイメージを取得し、粗い調整ドライブと微調整ドライブでセルに焦点を合わせます。
注: ライブボタンが アクティブになると、右側のライブ画像が表示されます。 - サブタブの顕微鏡コンポーネントで、正しい対物レンズ(10x)を選択します。
- サブタブ 「カメラ」で、「 自動露出」にチェックマークを付けます。
- スナップボタンを押して、透過光で最初の写真を撮ります。
- スケール バーを挿入するには、メニュー バーの [ グラフィックス ] タブを使用し、[ スケール バー] を選択します。
- メニュー バーの [ ファイル ] タブを使用して画像を保存し、[ czi として保存] を選択します。
- 蛍光画像の場合、フィルターを緑色または赤色の蛍光に固有のものに変更し、反射光路を選択します。
メモ:これらの変更は、顕微鏡で手動で行う必要があります。 - [検索] タブの下にある [ライブ] ボタンをもう一度押して、セルのライブ イメージを取得します。
- [スナップ]ボタンを押して、緑または赤の蛍光で2番目の写真を撮ります。
- スケール バーを挿入するには、メニュー バーの [ グラフィックス ] タブを使用し、[ スケール バー] を選択します。
- メニュー バーの [ファイル] タブを使用して画像を保存し、[czi として保存] を選択します。
- 手順 3.6.9 ~ 3.6.13 を他の蛍光チャネルで繰り返します。
- 75 cm2フラ スコを顕微鏡テーブルの上に置き、10倍の対物レンズを使用し、蛍光フィルターを選択しないことを確認し、透過光路がアクティブであることを確認します。
4.注射用の尿道組織サンプルを準備する
- ブタから尿道と接続膀胱を解剖する。
注:成体雌のランドレースブタの新鮮な死体サンプルからの尿道組織サンプルを実験に使用した。 - それを保氷の上の袋に入れて実験室に運ぶ。
注:サンプルは、さらなる処理まで氷の上に残してください。サンプルに添加物は添加しなかった。 - 膀胱のある尿道をスポンジの上に置き、骨盤底の弾力性を模倣します。
- 膀胱を使用して、尿道の向き(近位、遠位、背側、腹側)を決定します。これは、尿管および腹腔および骨盤腔内の膀胱を固定する3つの靭帯の局在化のために可能である。3つの靭帯は、膀胱の側面にある2つの小胞側方靭帯と、膀胱の腹側表面から生じる小胞縦隔である(図1)。
- カテーテルの助けを借りて、尿道を背側で縦方向に切り開きます。
- 次の章で説明するように、開いた尿道に細胞を注入します。
5. 液体および組織サンプル中のウィリアムズ針による細胞の注射
- ステップ2で説明したように細胞を回収する。
- ステップ2.9とは対照的に、注射の細胞密度を1mLあたり2.4 x106 細胞に調整します。
注:組織サンプルへの注射の場合、緑色蛍光膜透過性生細胞で細胞を標識する。 - 細胞懸濁液をシリンジで吸引し、ウィリアムズ膀胱鏡注射針(WN)をそれに塗布する。
- 15 mL の遠心チューブで 2 mL の成長培地のすぐ上に針を保持するか、開いた尿道組織に針を挿入します。どちらの場合も、250 μLの細胞を手動で注入します。
注:死体尿道に注入された細胞は、注射ドームを形成する。 - 培地に注入した細胞を室温で630 x gで7分間遠心分離することによって直接集める。
- 死体尿道に注入された細胞については、注射器に塗布された18G針で注射ドームからそれらを吸引する。
- 注入および吸引した細胞を遠心チューブに移し、培地に注入した細胞と比較して室温で630 x gで7分間遠心分離する。
- 遠心分離後、いずれの場合も細胞を4mLの増殖培地に再懸濁する。
- 血球計数器によるトリパンブルー色素排除の補助により細胞収量および生存率を決定する。
- 20 μLの細胞懸濁液を20 μLのトリパンブルーと完全に混合する。
- この混合物を血球計器の各チャンバーに10μL充填する。
注:両方のチャンバが充填され、カウントされ、サンプリングを2倍にすることによって統計的最適化が得られます。 - 顕微鏡下で、四隅の四角すべての細胞を数えます。
注:白く輝く細胞(染色されていない)を生細胞としてカウントし、青色に輝く細胞(染色された)は死細胞としてカウントします。 - mLあたりの細胞数を計算するには、2つのチャンバーの平均を計算し、この数を2で除算し、104を掛けます。
6. 流体および組織サンプル中のウォータージェットによる細胞の注入
- ステップ2で説明したように細胞を回収する。
- ステップ2.9および5.2とは対照的に、注射の細胞密度を1mLあたり6 x106 細胞に調整する。
注:組織サンプルへの注射には、緑色蛍光膜透過性生細胞で標識された細胞を使用してください。 - 細胞懸濁液をWJ装置の投与ユニットに充填する。
- 噴射ノズルを15mLの遠心チューブ内の2mLの成長培地のすぐ上、または開いた尿道組織の少し上に保持する。
- どちらの場合も、組織浸透のために高圧を使用し、続いて細胞注入のために低圧相を使用する装置によって100μLの細胞を注入する。圧力設定E60-10を使用します。
注:死体尿道に注入された細胞は、注射ドームを形成する。 - 培地に注入した細胞を室温で630 x gで7分間遠心分離することによって直接集める。
- 死体尿道に注入された細胞については、注射器に塗布された18G針で注射ドームからそれらを吸引する。
- 注入および吸引した細胞を遠心チューブに移し、培地に注入した細胞と比較して室温で630 x gで7分間遠心分離する。
- 遠心分離後、いずれの場合も細胞を4mLの成長培地に再懸濁する。
- 5.10に詳細に記載されているように、血球計数器によるトリパンブルー色素排除の補助によって細胞収量および生存率を決定する。
7. 原子間力顕微鏡(AFM)による細胞弾性の生体力学的評価
- サンプルの調製
注:注射後に回収された細胞は、AFMによるさらなる分析の対象となります。さらに、注射されなかった細胞が対照として使用される。- ディッシュあたり5 x 105個の密度を有する組織培養皿中の種子細胞。
注:1つの条件ごとに1つの組織培養皿を播種する。条件は、対照、WJまたはWNによって媒体に注入されたADSCおよび死体組織にWJまたはWNによって注入されたADSCである。 - 組織培養皿中の細胞を37°Cで3時間インキュベートする。
注:G1期および有糸分裂中の細胞による分散を避けるために、細胞播種ステップの3時間後にAFM測定を実施した。 - AFMによる測定の直前に、成長培地をL-グルタミンを含まない3mLのLeibovitzのL-15培地と交換してください。
- AFM装置のサンプルホルダーに組織培養皿を置き、37°Cに設定したシャーレヒーターをオンにする。
- ディッシュあたり5 x 105個の密度を有する組織培養皿中の種子細胞。
- AFMおよび片持ち梁校正の準備
- 液体中の測定用に指定されたガラスブロックを使用し、AFMホルダーで調整します。
メモ:ガラスブロックの上面は、AFMホルダーと平行にまっすぐでなければなりません。 - 片持ち梁をガラスブロックの表面に慎重に置きます。先端部Aは、研磨された光学面の上に横たわらなければならない。
メモ: ガラスブロックの研磨された光学面に傷をつけないでください。傷が原因で測定が干渉する可能性があるためです。先端Aは、AFMのレーザを光検出器に反射させることができないため、研磨された光学面上に突出しなければならない。 - ガラスブロックの片持ち梁を安定させるには、ピンセットの助けを借りて金属製のスプリングを追加します。
- 片持ち梁がガラスブロックに固定されたら、ブロックをAFMヘッドに置き、統合されたロック機構をロックします。
- AFM ヘッドを AFM デバイスに取り付けます。
メモ: 正しく配置するには、スプリングが左側を向いている必要があります。そうでない場合は、ガラスブロックの位置を修正し、AFMヘッドをもう一度調整してください。 - ソフトウェアのセットアップを初期化し、レーザーアライメントウィンドウとアプローチパラメータ設定とともにソフトウェアを開きます。さらに、ステッピングモーター、レーザー光、CCDカメラをオンにします。
- CCDカメラを使用して片持ち梁先端Aを特定します。
- 片持ち梁を培地に完全に浸すまで下げます。ステッピングモーター機能を使用して、この目的に到達します。
- 片持ち梁が媒体によって完全に覆われると、レーザーは調整ネジを使用して片持ち梁の上に整列されます。反射ビームは光検出器の中心に落ちなければならず、信号の合計は1V以上でなければなりません。横方向と垂直方向のたわみは 0 に近くなければなりません。
注:中心に達した場合は、信号値だけでなく、レーザーアライメント機能で監視することができます。信号値が正しくない場合は、さらに調整が必要です。 - ここで、アプローチ パラメーターを使用してスキャナー アプローチ を実行します (表 1)。
- 片持ち梁が底部に達したら、リトラクトボタンを押して100μm 後退させます 。
メモ: アプローチが行われた場合、キャリブレーションが改ざんされるため、そのフィールドにセルが取り付けられていないことを確認してください。 - 次の仕様に従って 実行 パラメータを設定します:セットポイント1 V、引っ張り長さ90 μm、速度:5 μm/s、サンプルレート:2000 Hz、遅延モードとして:一定力。
- 校正力-距離曲線の測定を開始するには、Run ボタンを押し ます。
メモ: ソフトウェアの [ 実行 ] ボタンをクリックすると、力-距離曲線が表示されます。 - 得られた較正力 - 距離曲線上のソフトウェアで後退曲線の線形適合領域を選択する。ソフトウェアによるばね定数測定を計算します。
- Danalache et al.17によって記述されているように、正確なパラメータと手順に従って片持ち梁を較正する。
- 液体中の測定用に指定されたガラスブロックを使用し、AFMホルダーで調整します。
- 個々の細胞の弾力性の測定
- 視覚的にセルを識別し、それに焦点を当てます。コンピュータマウスをセルの中央に置きます。測定精度を向上させるには、AFMチップを細胞核の真上に配置します。
メモ: コンピュータマウスは、くぼみのターゲット部位を識別するための視覚的なマーカーとして使用されます。 - カンチレバーに焦点を合わせ、コンピュータのマウスで動かします。
- 表2に示すパラメータを使用してRunで測定を開始します。
注:片持ち梁の較正によって得られたセットポイントパラメータが使用されます。さらに、1つの細胞を3回測定する。少なくとも 50 個のセルを測定します。
- 視覚的にセルを識別し、それに焦点を当てます。コンピュータマウスをセルの中央に置きます。測定精度を向上させるには、AFMチップを細胞核の真上に配置します。
- データ処理
- Danalache17 で以前に説明したとおり、正確な手順とパラメーターに従ってデータを処理します。
- ファイルを保存してエクスポートします。
8. 統計解析
- 統計ソフトウェアを開きます。
- [ 新しいデータセット] を選択します。
メモ: 2 つのファイルが開かれます。1つは「データセット」で、もう1つは「出力」ファイルです。 - データセットファイルを選択し、「変数ビュー」タブを開きます。
- 部位注入(流体または死体組織のキャプチャ)、カテゴリ(コントロール、WJ注射、WN注射)、および弾力性の数値変数を挿入します。
- 測定された弾性データを、対応する部位注入およびカテゴリー番号とともに 「データビュー 」タブに挿入します。
- メニュー バー タブの [ |の分析] を選択してデータを分析します。記述統計量 を選択し、[ 探索的データ分析] を選択します。
- 従属変数として、 弾性 を選択し、因子リストが カテゴリーを選択します。
メモ:結果は、結果セクションに使用される箱ひげ図を含む「出力」ファイルに表示されます。 - 統計検定を実行するには、メニューバーのタブ分析の下にあるノンパラメトリック検定内の独立標本を選択します。
- 新しく開いたファイルで、[目的と設定]タブの設定を保持します。
- [フィールド] タブを開き、[テストフィールドとして弾力性] を選択し、[グループとしてカテゴリ] を選択します。
- 実行を押します。
メモ:結果は「出力」ファイルに表示されます。これらの分析のために、マン-U-ホイットニー検定が実行されます。 - 探索的データ分析の箱ひげ図にノンパラメトリック検定の結果を含めます。
- メニュー バーの [ ファイル ] を選択し、[保存] を選択してファイル を保存します。
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Representative Results
2つのアプローチによる細胞送達に続いて、WN(97.2 ± 2%、n=10、p<0.002)を介して送達された細胞の生存率は、E60-10設定(85.9 ± 0.16%、n=12)を用いたWJによる注射と比較して高かった(図2)。生体力学的評価結果は、以下のことを示した:捕捉液中の細胞のWN注射は、対照(1.176kPa; 図3A)、WJ注射は細胞EMの有意な減少を誘発したが(0.440kPa、p<0.001、 図3B)。WJ注射後のEMの40〜50%の減少が認められた。死体尿道組織におけるWN注射は細胞EMに有意差をもたらさなかったが(図4A)、組織サンプルにおけるWJ注射後にEMの有意な減少が認められた(0.890kPa〜0.429kPa;p<0.00、 図4B)。したがって、WJ注入後の絶対EM値は51%減少した。全体として、結果は、WJ細胞送達が、送達後の80%以上の生細胞が18 、WJ送達後の細胞弾性率が影響を受ける臨床実施のための絶対要件を満たすことを示している。より低い細胞EMは、WJ送達後の細胞の特徴の遊走を促進するかもしれない。このようなより広い分布および所望の領域19における再生能力の範囲において。
図1.ブタの膀胱および尿道および注射部位の解剖学。A)ブタ膀胱および尿道の腹側と、腹腔および骨盤腔内の膀胱を固定する3つの靭帯とが示されている。さらに、膀胱の背側で終わる尿管が示されている。 B)WJおよびWN注射に使用した死体尿道の代表画像。縦方向には、黒で丸で囲まれた注射ドームを有する背側開放尿道が示されている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2.WNおよびWJを介した細胞生存率決定注射。 WNまたはWJを介して注射されたpADSCsを注射後に収集し、トリパン排除を介して計数して生存率を決定した。WNを介して送達された細胞と比較した場合、WJ注射後の細胞生存率は有意に低下した。p<0.001.データは、標準偏差のある平均としてグラフィカルに表示されます。略語:WJ - ウォータージェット、WN - ウィリアムズ針。Danalache et al. 202119から適応した図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3.WJ送達細胞をそれぞれ捕捉培地およびそれらの対応する対照に定量化したWNのヤング率の比較。 対照(未処理)細胞単層およびWN送達細胞(A)についての箱ひげ図においてEMの顕著な差は観察されなかった。対照的に、対照細胞とWJ群(B)の箱ひげ図の間に弾性の有意な減少が認められ得る。ns - 有意ではなく、p > 0.05、***p<0.001。略語:WJ - ウォータージェット、WN - ウィリアムズ針。Danalache et al. 202119から適応した図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4.WJが細胞を死体尿道およびそれらに対応する対照にそれぞれ送達したWNの定量化されたヤング率の比較。 WN細胞を介して送達された細胞とそれらに対応する対照(A)との間に顕著な差は観察されなかった。弾性の有意な減少は、WJ送達細胞と対照細胞単層(B)との間に認められた。ns - 有意ではなく、p > 0.05、***p<0.001。略語:WJ - ウォータージェット、WN - ウィリアムズ針。Danalache et al. 202119から適応した図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| アプローチパラメータ | 価値 |
| アプローチ IGain | 3.0ヘルツ |
| アプローチ PGain | 0.0002 |
| アプローチ目標の高さ | 10.0 μm |
| アプローチ設定値 | 3.00 V |
| アプローチのベースライン | 0.00 V |
表 1.アプローチ パラメーター。
| 実行パラメータ | 価値 |
| セットポイント | 10 nN |
| Z ムーブメント/エクステンドスピード | 定速/ |
| 5.0 μm/秒 | |
| 連絡時間 | 0.0秒 |
| 引っ張り長さ | 90 μm |
| 遅延モード | 一定の力 |
| サンプルレート | 2000ヘルツ |
表 2.パラメーターを実行します。
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Discussion
本研究では、WJ細胞送達手順の段階的なアプローチを実証および提示し、WJ送達が細胞特性に及ぼす影響を評価するために定量的調査の後遺症を採用した:細胞生存率および生体力学的特徴(すなわち、EM)。WJ注射後、回収された細胞の85.9%が生存可能であった。WN注射に関しては、細胞の97.2%が注射後に生存率を保持していた。したがって、WJアプローチは、臨床実施のための絶対的な要件を満たす:送達後の生細胞の80%以上18。標準化された再現性のあるプロトコルがWJアプローチによって達成される一方で、針注射送達の結果は、注射器および針のサイズおよびノズル、圧力、流量、ならびに注射を自ら行う医師に大きく依存する19。
生きた動物モデルにおけるWJ細胞送達を採用した研究は、放出圧力を変えることによって、浸透深さを標的組織に適合させ、そのようにして所望の臨床応用に適合させることができることを示した13、16。視覚的制御下の生きた動物における経尿道細胞注射は、20匹の治療を受けた動物の約50%において細胞の置き忘れまたは喪失を報告したが、WJ注射は90%を超える正確な細胞注入率を報告した(Linzenboldら16および未発表の観察)。細胞送達(針注射)のための現在のゴールデンスタンダードは、標的組織におけるカニューレの浸透を必要とする。したがって、針細胞翻訳は、すべての場合において傷害および外傷を引き起こす。尿道では、これは実際に健康な尿中にも見られる細菌や毒素による炎症広告毒素を引き起こす可能性があります。さらに、WJ注射のユーザー操作時間は、針注射と比較して大幅に短く、細胞は圧力レベルをプリセットすることによって、意図した組織層にミリ秒以内に配置される。対照的に、内視鏡検査による遠隔地での針注射時の浸透深さは、外科医の技能および経験に依存する。WJ注射の再現性も優れていると予想されるが、現在、調査した動物は15、16、20および200匹未満の前臨床データのみが存在する。我々の最近の研究では、針注射と比較してWJ適用によって細胞弾性が低下することに注目した21。これは、WJ送達中のより高い速度における細胞の剪断応力に起因する可能性がある。さらに、最終的な細胞損失は、視覚誘導膀胱鏡検査22によるWJ誘導送達によって達成されるように、関心領域内での細胞配置および駆出のより高い精度によって補償され得る。
機械的力が幹細胞の挙動、再生可能性、ならびに移植後のその後の生存率および機能性を指示することはよく知られている10,23。原子AFMの出現は、水性条件24、25、26、27におけるナノスケールの分解能で単一生細胞の機械的特性を定量化するための強力なツールを提供しました。AFMは、100Pa未満から106Paの範囲の剛性を検出して記録することができる信頼性が高く高感度な方法であり、したがって、大多数の組織および細胞28について広い範囲をカバーする。実際、細胞力学は、細胞状態および生理学的および病理学的状態の両方における29および細胞弾性を評価するための標識のないバイオマーカーとして浮上しており、細胞弾性は、核−細胞骨格クロストークの相乗的および累積的応答である。細胞が外力を受けると、これらの力は原形質膜から細胞骨格を介して核に伝達され、核内の変形および再編成をもたらすことは十分に確立されている30、31、32。したがって、核は、ゲノム材料および転写装置として長い間見られ、同様に細胞メカノトランスダクション32において重要なプレーヤーである。実際、核力学および核細胞骨格結合の重要性は、すべての細胞機能および突然変異において、細胞骨格(LINC)複合体に対する核骨格のラミンおよびリンカーにおいて、いくつかの病状33、34の発症基礎にある。これらの力はまた、細胞の人工物を示している可能性があります。具体的には、外部で発生した力は実際に細胞骨格フィラメントに沿って伝播し、さらにLINC複合体を横切って核薄層に伝達される。これらの力に応答して、核は、実際には、より硬くなり35、36、したがって、2つの密接に絡み合い、接続されたプロセスをマージする。これはまた、私たちのアプローチと原子力力学測定の理論的根拠でもあります。さらに、核表面の上に片持ち梁を正確に配置することで、高度な再現性が保証され、細胞の不均一性や基層への付着によるばらつきが軽減されます。
細胞弾性は、細胞状態を評価するための標識のないバイオマーカーとして、また生理学的状態および病理学的状態の両方において出現しつつあるが29、測定された弾性率は、同じ細胞型37においても大きな変動によって特徴付けられる。Schillersらによって示唆されているような変動に対抗する方法は、様々な状態の細胞に対する信頼できる定量マーカーとして弾性測定の高い再現性および適用性を保証する標準化されたナノメカニカルAFM手順(SNAP)の実施である38。また、押し込み速度、圧子の形状およびサイズ、ならびにモデルフィッティング39における先端形状の正確な表現など、AFM解析において使用される実験パラメータが絶対測定値40、41に影響を与えるとしても、これらのパラメータは、1つの研究内の結果または測定傾向に影響を与えてはならない。
ただし、AFMくぼみは細胞の外表面の分析に限定されているため、細胞膜の内部または特定の細胞内構造をスキャンすることができないことに留意してください。Usukuraらは、細胞膜を破壊し、細胞質可溶性成分42を除去する「アンルーフィング」法を提案し、したがってAFM-細胞内調査を可能にする。しかし、我々の研究では、明確で選択的な細胞内成分をプロービングするのではなく、平均弾性率の評価に焦点が当てられました。
集合的に、得られたAFMデータの一貫性および信頼性は、それぞれのオペレータの技術的経験に強く依存し、生物学的変動性38によって偏り得る。実際のAFM結果に影響を与える可能性のあるすべての敏感な変数を考慮すると、この研究で報告された絶対弾性値は一般化できず、実験セットアップにかなり具体的です。
全体として、我々の研究は、再生細胞療法レジメンのための針注射に対するWJ注射の優位性に関する証拠21 および段階的なプロトコルを提供する。
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Disclosures
著者J.K.、M.D.、T.A.、A.S.、W.K. A.は開示するものは何もありません。著者W.L.とMDEは、ERBEJet2とこの研究で採用されたWJプロトタイプのプロデューサーであるERBE Medizintechnik Lt. Tübingenの従業員です。
Acknowledgments
元の出版物の共著者の助けとサポートに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 227261 | |
| 1 mL BD Luer-LokTM Syringe | BD Plastik Inc | n.a. | |
| 100 µm cell sieve | Greiner BioOne | 542000 | |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 188271 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Incorporated | 353136 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| AFM processing software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM system Cell Hesion 200 | Bruker | JPK00518 | |
| All-In-One-Al cantilever | Budget Sensors | AIO-10 | tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) Length: 500 µm (490 - 510 µm) Width: 30 µm (35 - 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm) |
| Amphotericin B solution | Sigma | A2942 | 250 µg/ml |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| BD Microlance 3 18G | BD | 304622 | |
| bovine serum albumin | Gibco | A10008-01 | |
| Cantilever | All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | tip A, k ¼ 0.2 N/m |
| C-chip disposable hemocytometer | NanoEnTek | 631-1098 | |
| centrifuge: Rotina 420R | Hettich Zentrifugen | ||
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17100-017 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose | Sigma | D5546 | |
| Feather disposable scalpel (No. 10) | Feather | 02.001.30.010 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| HEPES sodium salt solution (1 M) | Sigma | H3662 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| laboratory bags | Brand | 759705 | |
| Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine | Merck | F1315 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| L-glutamine | Lonza | BE 17-605C1 | 200 mM |
| LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | L3224 | Calcein AM and EthD-1 are used from this kit. |
| Microscope software: Zen 2.6 | Zeiss | ||
| Microscope: AxioVertA.1 | Zeiss | ||
| Nelaton-Catheter female | Bicakcilar | 19512051 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin |
| Petri dish heater associated with AFM | Bruker | T-05-0117 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Statistical Software: SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Sterile Petri dish - CellStar | Greiner BioOne | 664160 | |
| Tissue culture dishes | TPP AG | TPP93040 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl |
Lonza | 17-942E | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
| Waterjet: ERBEJET2 device | Erbe Elektromedizin GmbH | ||
| Williams Cystoscopic Injection Needle | Cook Medical | G14220 | 23G, 5.0 Fr, 35 cm |
References
- Milsom, I., et al. Global prevalence and economic burden of urgency urinary incontinence: a systematic review. European Urology. 65 (1), 79-95 (2014).
- Lee, J. Y., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 14 (1), 31-37 (2003).
- Tran, C., Damaser, M. S. The potential role of stem cells in the treatment of urinary incontinence. Therapeutic Advances in Urology. 7 (1), 22-40 (2015).
- Fu, Q., Song, X. F., Liao, G. L., Deng, C. L., Cui, L. Myoblasts differentiated from adipose-derived stem cells to treat stress urinary incontinence. Urology. 75 (3), 718-723 (2010).
- Corcos, J., et al. marrow mesenchymal stromal cell therapy for external urethral sphincter restoration in a rat model of stress urinary incontinence. Neurourology and Urodynamics. 30 (3), 447-455 (2011).
- Smaldone, M. C., Chen, M. L., Chancellor, M. B. Stem cell therapy for urethral sphincter regeneration. Minerva Urologica e Nefrologica. 61 (1), 27-40 (2009).
- Perin, E. C., López, J. Methods of stem cell delivery in cardiac diseases. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 3, Suppl 1 110-113 (2006).
- Zhang, M., et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
- Amer, M. H., Rose, F. R. A. J., Shakesheff, K. M., Modo, M., White, L. J. Translational considerations in injectable cell-based therapeutics for neurological applications: concepts, progress and challenges. NPJ Regenerative Medicine. 2, 23-23 (2017).
- Linzenbold, W., Fech, A., Hofmann, M., Aicher, W. K., Enderle, M. D. Novel Techniques to Improve Precise Cell Injection. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6367 (2021).
- Adamo, A., Roushdy, O., Dokov, R., Sharei, A., Jensen, K. F. Microfluidic jet injection for delivering macromolecules into cells. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 23, 035026 (2013).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Weber, M., et al. Hydrojet-based delivery of footprint-free iPSC-derived cardiomyocytes into porcine myocardium. Scientific Reports. 10 (1), 16787 (2020).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Linzenbold, W., et al. Rapid and precise delivery of cells in the urethral sphincter complex by a novel needle-free waterjet technology. BJU International. 127 (4), 463-472 (2021).
- Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
- Gálvez-Martín, P., Hmadcha, A., Soria, B., Calpena-Campmany, A. C., Clares-Naveros, B. Study of the stability of packaging and storage conditions of human mesenchymal stem cell for intra-arterial clinical application in patient with critical limb ischemia. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (3), 459-468 (2014).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), (2021).
- Amend, B., et al. Precise injection of human mesenchymal stromal cells in the urethral sphincter complex of Göttingen minipigs without unspecific bulking effects. Neurourology and Urodynamics. 36 (7), 1723-1733 (2017).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 3958 (2021).
- Strasser, H., et al. 328: Transurethral Ultrasound Guided Stem Cell Therapy of Urinary Incontinence. Journal of Urology. 175 (4), 107 (2006).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
- Ding, Y., Xu, G. -K., Wang, G. -F. On the determination of elastic moduli of cells by AFM based indentation. Scientific Reports. 7 (1), 45575 (2017).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Carl, P., Schillers, H. Elasticity measurement of living cells with an atomic force microscope: data acquisition and processing. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 457 (2), 551-559 (2008).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
- Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic Force Microscopy in Characterizing Cell Mechanics for Biomedical Applications: A Review. IEEE Trans Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
- Morimoto, A., et al. A conserved KASH domain protein associates with telomeres, SUN1, and dynactin during mammalian meiosis. The Journal of Cell Biology. 198 (2), 165 (2012).
- Lombardi, M. L., et al. The interaction between nesprins and sun proteins at the nuclear envelope is critical for force transmission between the nucleus and cytoskeleton. Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26743-26753 (2011).
- Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear Mechanics and Mechanotransduction in Health and Disease. Current Biology. 23 (24), 1113-1121 (2013).
- Méjat, A. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1 (1), 40-52 (2010).
- Folker, E. S., Östlund, C., Luxton, G. G., Worman, H. J., Gundersen, G. G. Lamin A variants that cause striated muscle disease are defective in anchoring transmembrane actin-associated nuclear lines for nuclear movement. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 131-136 (2011).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature cell biology. 16 (4), 376-381 (2014).
- Fischer, T., Hayn, A., Mierke, C. T. Effect of Nuclear Stiffness on Cell Mechanics and Migration of Human Breast Cancer Cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 393 (2020).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), 5117 (2017).
- Costa, K. D., Yin, F. C. Analysis of indentation: implications for measuring mechanical properties with atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 462-471 (1999).
- Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), (2004).
- Park, S., Costa, K. D., Ateshian, G. A., Hong, K. S. Mechanical properties of bovine articular cartilage under microscale indentation loading from atomic force microscopy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 223 (3), 339-347 (2009).
- Usukura, E., Narita, A., Yagi, A., Ito, S., Usukura, J. An Unroofing Method to Observe the Cytoskeleton Directly at Molecular Resolution Using Atomic Force Microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 27472 (2016).
