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Bioengineering

वाटरजेट प्रौद्योगिकी के माध्यम से पोर्सिनी वसा ऊतक-व्युत्पन्न स्ट्रोमा कोशिकाओं का इंजेक्शन

Published: November 23, 2021 doi: 10.3791/63132
Automatic Translation
*1, *2, 3, 3, 1, 1, 1
1Department of Urology, University Hospital Tübingen, 2Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen, 3ERBE Elektromedizin GmbH Tübingen
* These authors contributed equally

Summary

हम सेलुलर व्यवहार्यता, प्रसार, और लोच माप के संदर्भ में पोस्ट-डिलीवरी जांच की अगली कड़ी के साथ मिलकर सुई मुक्त वाटरजेट तकनीक के माध्यम से सेल इंजेक्शन की एक विधि प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

मूत्र असंयम (यूआई) एक अत्यधिक प्रचलित स्थिति है जो मूत्रमार्ग स्फिंक्टर मांसपेशी की कमी की विशेषता है। पुनर्योजी चिकित्सा शाखाएं, विशेष रूप से सेल थेरेपी, मूत्रमार्ग स्फिंक्टर फ़ंक्शन को बेहतर बनाने और पुनर्स्थापित करने के लिए उपन्यास दृष्टिकोण हैं। भले ही सक्रिय कार्यात्मक कोशिकाओं का इंजेक्शन नियमित रूप से सुई और सिरिंज द्वारा नैदानिक सेटिंग्स में किया जाता है, इन दृष्टिकोणों में महत्वपूर्ण नुकसान और सीमाएं हैं। इस संदर्भ में, सुई-मुक्त वाटरजेट (डब्ल्यूजे) तकनीक एक व्यवहार्य और अभिनव विधि है जो मूत्रमार्ग स्फिंक्टर में दृश्य निर्देशित सिस्टोस्कोपी द्वारा व्यवहार्य कोशिकाओं को इंजेक्ट कर सकती है। वर्तमान अध्ययन में, हमने पोर्सिनी वसा ऊतक-व्युत्पन्न स्ट्रोमल कोशिकाओं (पीएडीएससी) को कैडेवरिक यूरेथ्रल ऊतक में वितरित करने के लिए डब्ल्यूजे का उपयोग किया और बाद में सेल उपज और व्यवहार्यता पर डब्ल्यूजे वितरण के प्रभाव की जांच की। हमने परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) माप द्वारा बायोमैकेनिकल विशेषताओं (यानी, लोच) का भी आकलन किया। हमने दिखाया कि डब्ल्यूजे वितरित pADSCs उनके सेलुलर लोच में काफी कम हो गए थे। नियंत्रण की तुलना में व्यवहार्यता काफी कम थी, लेकिन अभी भी 80% से ऊपर है।

Introduction

मूत्र असंयम (यूआई)यूरोपीय आबादी 1 में 1.8 - 30.5% की व्यापकता के साथ एक व्यापक विकार है और मुख्य रूप से मूत्रमार्ग स्फिंक्टर की खराबी की विशेषता है। नैदानिक परिप्रेक्ष्य से, सर्जिकल उपचार अक्सर रोगियों को पेश किया जाता है जब रूढ़िवादी उपचार या भौतिक चिकित्सा उभरते लक्षणों को संबोधित करने और कम करने में विफल रहती है।

स्फिंक्टर जटिल खराबी की संभावित पुनर्योजी मरम्मत के लिए सेल थेरेपी यूआई पैथोलॉजी 2,3 के उपचार के लिए एक अवंत-गार्डे दृष्टिकोण के रूप में उभर रही है। इसका मुख्य लक्ष्य क्षतिग्रस्त ऊतक की जैविक कार्यक्षमता को प्रतिस्थापित करना, मरम्मत करना और पुनर्स्थापित करना है। यूआई के लिए पशु मॉडल में, स्टेम सेल प्रत्यारोपण ने यूरोडायनामिक परिणामों में आशाजनक परिणाम दिखाएहैं 2,4,5। स्टेम कोशिकाएं इष्टतम सेलुलर उम्मीदवारों के रूप में उत्पन्न होती हैं क्योंकि उनके पास आत्म-नवीकरण और बहु-शक्तिशाली भेदभाव से गुजरने की क्षमता होती है, इस प्रकार, प्रभावित ऊतक पुनर्जनन 6 की सहायता करताहै। आगामी पुनर्योजी क्षमता के बावजूद, सेल थेरेपी का व्यावहारिक उपयोग बाधित रहता है क्योंकि कोशिकाओं के न्यूनतम इनवेसिव वितरण को अभी भी इंजेक्शन परिशुद्धता और लक्ष्य के कवरेज से संबंधित कई चुनौतियों का सामना करना पड़ता है। भले ही सेल डिलीवरी के लिए उपयोग किया जाने वाला वर्तमान दृष्टिकोण सुई-सिरिंज सिस्टम7 के माध्यम से इंजेक्शन है, लेकिन इसके परिणामस्वरूप आमतौर पर व्यवहार्य कोशिकाओं की समग्र कमी होती है, जिसमें 1% - 31% पोस्ट-ट्रांसप्लांटेशन8 के रूप में कम होने की रिपोर्ट की गई है। इसके अलावा, सुई इंजेक्शन के माध्यम से सेल वितरण को प्लेसमेंट, प्रतिधारण दर, साथ ही लक्षित ऊतक 9,10,11 में प्रत्यारोपित कोशिकाओं के वितरण को प्रभावित करने के लिए भी दिखाया गया है। एक व्यवहार्य, उपन्यास दृष्टिकोण जो उपर्युक्त सीमा को दूर करता है, वह पानी-जेट तकनीक के माध्यम से सुई-मुक्त सेल वितरण है।

वाटरजेट (डब्ल्यूजे) तकनीक एक नए दृष्टिकोण के रूप में उभर रही है जो मूत्रमार्ग स्फिंक्टर12,13 में दृश्य नियंत्रण के तहत सिस्टोस्कोप द्वारा कोशिकाओं के उच्च थ्रूपुट वितरण को सक्षम बनाती है। WJ E5 से E8013 तक के विभिन्न दबावों (E = बार में प्रभाव) पर सेल वितरण को सक्षम बनाता है। पहले चरण में, (ऊतक प्रवेश चरण) आइसोटोनिक समाधान को उच्च दबाव (यानी, E60 या E80) के साथ लागू किया जाता है ताकि लक्षित ऊतक के आसपास के बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स को ढीला किया जा सके और छोटे इंटरकनेक्टिंग माइक्रो-लैकुने को खोला जा सके। दूसरे चरण (इंजेक्शन चरण) में, दबाव को मिलीसेकंड (यानी, ई 10 तक) के भीतर कम किया जाता है ताकि कोशिकाओं को धीरे से लक्षित ऊतक में वितरित किया जा सके। इस दो चरण-चरण अनुप्रयोग के बाद, कोशिकाओं को बाहर निकाले जाने पर ऊतक के खिलाफ अतिरिक्त दबाव के अधीन नहीं किया जाता है, लेकिन एक तरल-भरे गुफाक्षेत्र13 में कम दबाव वाली धारा में तैर रहे हैं। एक पूर्व विवो मॉडल सेटिंग में जहां स्टेम कोशिकाओं को डब्ल्यूजे के माध्यम से कैडेवरिक मूत्रमार्ग ऊतक में इंजेक्ट किया गया था, व्यवहार्य कोशिकाओं को बाद में एस्पिरेटेड किया जा सकता है और ऊतक से पुनर्प्राप्त किया जा सकता है और विट्रो13 में आगे बढ़ाया जा सकता है। हालांकि वेबर एट अल द्वारा 2020 के एक अध्ययन ने मायोकार्डियम14 में पदचिह्न-मुक्त कार्डियोमायोसाइट्स वितरित करने के लिए डब्ल्यूजे की व्यवहार्यता और प्रयोज्यता का प्रदर्शन किया, लेकिन यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि डब्ल्यूजे तकनीक अभी भी एक प्रोटोटाइप चरण में है।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि पोर्सिनी वसा ऊतक-व्युत्पन्न स्ट्रोमल कोशिकाओं (पीएडीएससी) को कैसे तैयार और लेबल किया जाए और उन्हें डब्ल्यूजे प्रौद्योगिकी और विलियम्स सिस्टोस्कोपी सुइयों (डब्ल्यूएन) के माध्यम से तरल पदार्थ और कैडेवरिक ऊतक पर कब्जा करने में कैसे वितरित किया जाए। पोस्ट सेलुलर इंजेक्शन, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) के माध्यम से सेलुलर जीवन शक्ति और लोच का मूल्यांकन किया जाता है। चरण-दर-चरण निर्देशों के माध्यम से, प्रोटोकॉल विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने के लिए एक स्पष्ट और संक्षिप्त दृष्टिकोण देता है। चर्चा अनुभाग प्रस्तुत करता है और तकनीक के प्रमुख लाभों, सीमाओं और भविष्य के दृष्टिकोण का वर्णन करता है। कोशिकाओं के WJ वितरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से sequela पोस्ट अनुवाद विश्लेषण यहाँ रिपोर्ट मानक सुई इंजेक्शन की जगह ले रहे हैं और लक्ष्य ऊतक के पुनर्योजी उपचार के लिए एक ठोस सेल वितरण रूपरेखा प्रदान करते हैं. हमारे हाल के अध्ययनों में हमने सबूत प्रदान किए कि डब्ल्यूजे ने सुई इंजेक्शन15,16 की तुलना में कोशिकाओं को अधिक सटीक रूप से और कम से कम तुलनीय व्यवहार्यता पर वितरित किया।

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Protocol

पोर्सिनी वसा ऊतक के नमूने Tuebingen विश्वविद्यालय में प्रयोगात्मक सर्जरी के लिए संस्थान से प्राप्त किए गए थे। सभी प्रक्रियाओं को पशु प्रयोग संख्या CU1/16 के तहत स्थानीय पशु कल्याण अधिकारियों द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. पोर्सिनी वसा ऊतक व्युत्पन्न स्ट्रोमल कोशिकाओं का अलगाव

  1. प्रयोगशाला के लिए एक 50 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्रयोगात्मक सर्जरी के लिए संस्थान से वितरित पोर्सिनी वसा ऊतक का उपयोग करें।
  2. बाँझ बेंच के नीचे एक बाँझ पेट्री डिश में ऊतक को स्थानांतरित करें और इसे छोटे टुकड़ों और मश के लिए दो स्केलपेल्स (नंबर 10) के साथ कीमा बना दें।
    नोट: कैंची का उपयोग छोटे टुकड़े प्राप्त करने के लिए भी किया जा सकता है। टुकड़े जितने छोटे होते हैं, निम्नलिखित पाचन के लिए उतना ही बेहतर होता है।
    1. छोटे टुकड़ों / मश को 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे एक शेकर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 30 मिनट के लिए होमोजेनाइज़र समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ इनक्यूबेट करें। Homogenizer समाधान 1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (BSA) (स्टॉक समाधान: 1% (w / v) पीबीएस में बीएसए) और 0.1% कोलेजेनेस प्रकार I के साथ PBS है।
      नोट: हमेशा homogenizer समाधान ताजा तैयार करें। शेकर में धीमी गति से 25-500 आरपीएम पर एक परिपत्र मिलाते हुए गति होती है।
  3. इनक्यूबेशन को रोकने के लिए, विकास मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें [Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम - कम ग्लूकोज (DMEM-LG), 2.5% HEPES सोडियम नमक समाधान (1 M), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% L-Glutamin (200 mM), 1% पेनिसिलिन-Streptomycin (10000 U / mL पेनिसिलिन; 10,000 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन) और 1% एम्फोटेरिसिन बी (10,000 μg / mL)
    नोट: विकास मीडिया पहले से तैयार किया जा सकता है। कोशिकाओं को संदूषण से बचाने के लिए कोशिका संस्कृति के लिए विकास मीडिया की तैयारी में एंटीबायोटिक्स और एंटिफंगल दवाएं आवश्यक हैं।
  4. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
  5. एडिपोसाइट्स के साथ अंश को एस्पिरेट करें, जो हल्का है और इसलिए तरल के शीर्ष पर तैरता है, 10 एमएल पिपेट के साथ और इसे छोड़ दें।
  6. वसा ऊतक के टुकड़ों को रोकने और केवल सेल निलंबन को पुनः प्राप्त करने के लिए भारी धातुओं से मुक्त पॉलीथीन टेरेफ्थालेट (पीईटी) झिल्ली के साथ एक 100 μm सेल छलनी के माध्यम से शेष स्ट्रोमल अंश को फ़िल्टर करें।
  7. कमरे के तापमान पर 630 x g पर 7 मिनट के लिए फ़िल्टर किए गए सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
  8. कोशिकाओं को एक बार धोने के लिए पीबीएस के 2 एमएल में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें।
  9. कमरे के तापमान पर 630 x g पर 7 मिनट के लिए सेल निलंबन को फिर से सेंट्रीफ्यूज करें।
  10. सेंट्रीफ्यूजेशन और प्रति फ्लास्क विकास मीडिया के 10 मिलीलीटर में सेल पैलेट के बार-बार पुन: निलंबन के बाद, 75 सेमी2 सेल संस्कृति फ्लास्क में बीज कोशिकाएं।
    नोट: पीबीएस के साथ धोने के चरण के बाद सेल गोली के आकार के आधार पर, एक से चार फ्लास्क में बीज कोशिकाएं।

2. पोर्सिनी वसा ऊतक व्युत्पन्न स्ट्रोमल कोशिकाओं की कोशिका खेती

  1. फसल और मार्ग कोशिकाएं जब वे 70% संगम तक पहुंचती हैं।
  2. पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं और पूरी तरह से एस्पिरेट पीबीएस।
    नोट:: यह चरण शेष विकास मीडिया, जो 10% FBS द्वारा पूरक है को निकालने के लिए आवश्यक है। एफबीएस में कई प्रोटीज इनहिबिटर होते हैं जो निम्नलिखित ट्रिप्सिनाइजेशन के कार्य में बाधा डाल सकते हैं।
  3. कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रति फ्लास्क 0.05% -ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 3 एमएल जोड़ें।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए फ्लास्क इनक्यूबेट करें।
  5. माइक्रोस्कोप के नीचे जांचें कि क्या कोशिकाएं अलग हो गई हैं।
    नोट:: कभी-कभी यह कक्षों को अलग करने के लिए कुछ और समय लेता है। इस मामले में, 37 डिग्री सेल्सियस पर अधिकतम 5 मिनट के लिए फ्लास्क इनक्यूबेट करें।
  6. इनक्यूबेशन और अलग करने की प्रक्रिया को रोकने के लिए, विकास मीडिया के 3 एमएल जोड़ें।
    नोट: जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, विकास मीडिया 10% FBS द्वारा पूरक है जिसमें प्रोटीज अवरोधक होते हैं।
  7. एक centrifugation ट्यूब और कमरे के तापमान पर 630 x g पर 7 मिनट के लिए centrifuge करने के लिए अलग कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
  8. विकास मीडिया के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और उन्हें हेमोसाइटोमीटर के साथ गिनें।
  9. 3 x 10 5 कोशिकाओं प्रति75 सेमी2 फ्लास्क के एक इनोक्यूलेशन घनत्व के साथ बीज कोशिकाओं.

3. calcein-AM के साथ कोशिकाओं के लेबलिंग

नोट: कैडेवरिक ऊतकों में इंजेक्ट की जाने वाली कोशिकाओं को हरे-फ्लोरोसेंट झिल्ली-पारगम्य लाइव-सेल दाग और एक लाल-फ्लोरोसेंट झिल्ली-अभेद्य व्यवहार्यता संकेतक के साथ दाग दिया जाता है ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि निकाली गई कोशिकाएं इंजेक्ट की गई कोशिकाओं के समान हैं और मूत्रमार्ग के ऊतक टुकड़े नहीं हैं।

  1. पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं।
  2. प्रति 75 सेमी2 फ्लास्क डाई समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें। डाई समाधान हरे-फ्लोरोसेंट झिल्ली-पारगम्य लाइव-सेल डाई और 4 μM लाल-फ्लोरोसेंट झिल्ली-अभेद्य व्यवहार्यता संकेतक के 2 μM के साथ विकास मीडिया के होते हैं।
  3. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. एस्पिरेट करें और डाई समाधान को छोड़ दें।
  5. पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को फिर से दो बार धोएं।
  6. विकास मीडिया जोड़ें और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा हरे और लाल प्रतिदीप्ति संकेत दस्तावेज।
    1. माइक्रोस्कोप टेबल पर 75 सेमी2 फ्लास्क रखें, 10x उद्देश्य का उपयोग करें, कोई प्रतिदीप्ति फ़िल्टर का चयन न करें और सुनिश्चित करें कि संचारित प्रकाश पथ सक्रिय है।
      नोट:: ये सभी चरण ों को माइक्रोस्कोप पर मैन्युअल रूप से निष्पादित कर रहे हैं।
    2. चरण 3.6.1 के समानांतर में, सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम खोलें।
    3. मेज पर फ्लास्क में कोशिकाओं की लाइव छवि प्राप्त करने के लिए स्थिति जानें टैब के तहत लाइव बटन दबाएँ और मोटे और ठीक समायोजन ड्राइव के साथ उन पर ध्यान केंद्रित करें।
      नोट: सही दृष्टि पर लाइव बटन सक्रिय होने के बाद लाइव छवि दिखाई देगी।
    4. उप-टैब माइक्रोस्कोप घटकों में, सही उद्देश्य (10x) का चयन करें।
    5. उप-टैब कैमरा में, ऑटो एक्सपोज़र के लिए एक चेकमार्क लागू करें।
    6. संचारित प्रकाश के साथ पहली तस्वीर लेने के लिए स्नैप बटन दबाएं।
    7. मेनू पट्टी में ग्राफ़िक्स टैब का उपयोग करके और स्केल पट्टी का चयन करके स्केल पट्टी सम्मिलित करें.
    8. मेनू पट्टी में फ़ाइलें टैब का उपयोग करके और czi के रूप में सहेजें का चयन करके छवि सहेजें।
    9. प्रतिदीप्ति चित्रों के लिए फ़िल्टर को हरे या लाल प्रतिदीप्ति के लिए विशिष्ट में बदलें और परावर्तित प्रकाश पथ का चयन करें।
      नोट:: इन परिवर्तनों को माइक्रोस्कोप पर मैन्युअल रूप से किया जाना है।
    10. कक्षों की लाइव छवि प्राप्त करने के लिए स्थिति जानें टैब के अंतर्गत लाइव बटन को फिर से दबाएँ.
    11. बटन स्नैप दबाएँ या तो हरे या लाल प्रतिदीप्ति के साथ दूसरी तस्वीर लेने के लिए.
    12. मेनू पट्टी में ग्राफ़िक्स टैब का उपयोग करके और स्केल पट्टी का चयन करके स्केल पट्टी सम्मिलित करें.
    13. मेनू पट्टी में फ़ाइलें टैब का उपयोग करके और czi के रूप में सहेजें का चयन करके छवि सहेजें।
    14. अन्य प्रतिदीप्ति चैनल के साथ चरण 3.6.9 से 3.6.13 को दोहराएँ।

4. इंजेक्शन के लिए मूत्रमार्ग ऊतक के नमूने तैयार करें

  1. मूत्रमार्ग और जोड़ने वाले मूत्राशय को सुअर से बाहर विच्छेदित करें।
    नोट: वयस्क मादा लैंडरेस सूअरों के ताजा कैडेवरिक नमूनों से मूत्रमार्ग ऊतक के नमूनों का उपयोग प्रयोगों के लिए किया गया था।
  2. इसे गीली बर्फ पर बैग में प्रयोगशाला में ले जाएं।
    नोट: नमूनों को आगे के प्रसंस्करण तक बर्फ पर छोड़ दिया जाना चाहिए। नमूनों में कोई additives नहीं जोड़े गए थे।
  3. मूत्राशय के साथ मूत्रमार्ग को स्पंज पर रखें, जो निचले श्रोणि मंजिल की लोच की नकल करता है।
    1. मूत्रमार्ग के अभिविन्यास (समीपस्थ, दूरस्थ, पृष्ठीय और वेंट्रल) को निर्धारित करने के लिए मूत्राशय का उपयोग करें। यह मूत्रवाहिनी के स्थानीयकरण और तीन स्नायुबंधन के कारण संभव है जो पेट और श्रोणि गुहा में मूत्राशय को ठीक करते हैं। तीन स्नायुबंधन मूत्राशय और वेसिके माध्यिका के किनारों पर दो वेसिके लेटरालिया स्नायुबंधन हैं, जो मूत्राशय की वेंट्रल सतह से उत्पन्न होते हैं (चित्रा 1)।
  4. एक कैथेटर की सहायता से पृष्ठीय पक्ष पर मूत्रमार्ग को अनुदैर्ध्य रूप से खोलें।
  5. निम्नलिखित अध्यायों में वर्णित के रूप में खुले मूत्रमार्ग में कोशिकाओं को इंजेक्ट करें।

5. तरल पदार्थ और ऊतक के नमूनों में एक विलियम्स सुई के माध्यम से कोशिकाओं के इंजेक्शन

  1. चरण 2 में वर्णित के रूप में हार्वेस्ट कोशिकाओं।
  2. चरण 2.9 के विपरीत, इंजेक्शन के लिए सेल घनत्व को 2.4 x 106 कोशिकाओं प्रति एमएल में समायोजित करें।
    नोट: ऊतक के नमूनों में इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं को हरे-फ्लोरोसेंट झिल्ली-पारगम्य लाइव-सेल के साथ लेबल करें।
  3. एक सिरिंज के साथ सेल निलंबन aspirate और यह करने के लिए विलियम्स cystoscopic इंजेक्शन सुई (WN) लागू होते हैं।
  4. या तो एक 15 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब में विकास मीडिया के 2 मिलीलीटर के कुछ ही समय ऊपर सुई को पकड़ें या खुले मूत्रमार्ग ऊतक में सुई डालें। दोनों मामलों में मैन्युअल रूप से कोशिकाओं के 250 μL इंजेक्ट करें।
    नोट: कैडेवरिक मूत्रमार्ग में इंजेक्ट की गई कोशिकाएं एक इंजेक्शन गुंबद बनाती हैं।
  5. कमरे के तापमान पर 630 x g पर 7 मिनट के लिए centrifugation द्वारा सीधे मीडिया में इंजेक्ट की गई कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
  6. कैडेवरिक मूत्रमार्ग में इंजेक्ट की गई कोशिकाओं के लिए, उन्हें सिरिंज पर लागू 18 जी सुई के साथ इंजेक्शन गुंबद से बाहर निकालें।
  7. इंजेक्टेड और एस्पिरेटेड कोशिकाओं को एक सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 7 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज पर 630 x g पर मीडिया में इंजेक्ट की गई कोशिकाओं के लिए तुलनात्मक रूप से।
  8. centrifugation के बाद, दोनों मामलों में विकास मीडिया के 4 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया।
  9. एक हेमोसाइटोमीटर के साथ ट्रिपैन ब्लू डाई बहिष्करण की सहायता से सेल उपज और व्यवहार्यता का निर्धारण करें।
    1. ट्रिपैन नीले रंग के 20 μL के साथ सेल निलंबन के 20 μL को अच्छी तरह से मिलाएं।
    2. हेमोसाइटोमीटर के प्रत्येक कक्ष में इस मिश्रण के 10 μL भरें।
      नोट: दोनों कक्षों को भरा जाता है और नमूनाकरण को दोगुना करके सांख्यिकीय अनुकूलन प्राप्त करने के लिए गिना जाता है।
    3. एक माइक्रोस्कोप के तहत, सभी चार कोने वर्गों में कोशिकाओं की गणना करें।
      नोट: व्यवहार्य कोशिकाओं के रूप में सफेद (बिना दाग) में चमकने वाली कोशिकाओं की गणना करें जबकि नीले रंग (दाग) को चमकने वाली कोशिकाओं को मृत कोशिकाओं के रूप में गिना जाता है।
    4. प्रति एमएल सेल संख्या की गणना करने के लिए, दो कक्षों के माध्य की गणना करें, इस संख्या को दो से विभाजित करें और इसे 104 से गुणा करें।

6. तरल पदार्थ और ऊतक के नमूनों में Waterjet के माध्यम से कोशिकाओं के इंजेक्शन

  1. चरण 2 में वर्णित के रूप में हार्वेस्ट कोशिकाओं।
  2. चरण 2.9 और 5.2 के विपरीत, इंजेक्शन के लिए सेल घनत्व को 6 x 106 कोशिकाओं प्रति एमएल में समायोजित करें।
    नोट: ऊतक के नमूनों में इंजेक्शन के लिए एक हरे-फ्लोरोसेंट झिल्ली-पारगम्य लाइव-सेल के साथ लेबल की गई कोशिकाओं का उपयोग करें।
  3. कक्ष निलंबन को WJ डिवाइस की खुराक इकाई में भरें.
  4. या तो इंजेक्शन नोजल को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब में विकास मीडिया के 2 मिलीलीटर के कुछ ही समय ऊपर या खुले मूत्रमार्ग ऊतक के ऊपर रखें।
  5. दोनों मामलों में ऊतक प्रवेश के लिए एक उच्च दबाव का उपयोग करके डिवाइस द्वारा कोशिकाओं के 100 μL इंजेक्ट करें, जिसके बाद सेल इंजेक्शन के लिए कम दबाव चरण होता है। दबाव सेटिंग्स E60-10 का उपयोग करें।
    नोट: कैडेवरिक मूत्रमार्ग में इंजेक्ट की गई कोशिकाएं एक इंजेक्शन गुंबद बनाती हैं।
  6. कमरे के तापमान पर 630 x g पर 7 मिनट के लिए centrifugation द्वारा सीधे मीडिया में इंजेक्ट की गई कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
  7. कैडेवरिक मूत्रमार्ग में इंजेक्ट की गई कोशिकाओं के लिए, उन्हें सिरिंज पर लागू 18 जी सुई के साथ इंजेक्शन गुंबद से बाहर निकालें।
  8. इंजेक्टेड और एस्पिरेटेड कोशिकाओं को एक सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 7 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज पर 630 x g पर मीडिया में इंजेक्ट की गई कोशिकाओं के लिए तुलनात्मक रूप से।
  9. centrifugation के बाद, दोनों मामलों में विकास मीडिया के 4 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend.
  10. 5.10 में विस्तार से वर्णित के रूप में एक hemocytometer के साथ Trypan नीले डाई बहिष्करण की सहायता से सेल उपज और व्यवहार्यता निर्धारित करें।

7. परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) द्वारा सेलुलर लोच के बायोमैकेनिकल मूल्यांकन

  1. नमूनों की तैयारी
    नोट:: इंजेक्शन के बाद पुनर्प्राप्त कोशिकाओं अब AFM द्वारा आगे के विश्लेषण के लिए विषय हैं। साथ ही, जिन कक्षों को इंजेक्ट नहीं किया गया था, उनका उपयोग नियंत्रण के रूप में किया जाता है।
    1. ऊतक संस्कृति व्यंजनों में बीज कोशिकाएं प्रति डिश 5 x 105 कोशिकाओं के घनत्व के साथ।
      नोट: बीज एक ऊतक संस्कृति पकवान प्रति शर्त. शर्तों को नियंत्रण कर रहे हैं, ADSCs मीडिया में WJ या WN द्वारा इंजेक्ट किया और ADSCs कैडेवरिक ऊतक में WJ या WN द्वारा इंजेक्ट किया.
    2. ऊतक संस्कृति व्यंजनों में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: G1 चरण में कोशिकाओं के कारण और माइटोसिस के दौरान विचरण से बचने के लिए, हमने सेल सीडिंग चरण के बाद 3 घंटे AFM माप किया।
    3. एएफएम के साथ माप से ठीक पहले विकास मीडिया को एल-ग्लूटामाइन के बिना लीबोविट्ज़ के एल -15 मीडिया के 3 एमएल के साथ बदल दें।
    4. AFM डिवाइस के नमूना धारक में ऊतक संस्कृति पकवान जगह और 37 डिग्री सेल्सियस पर पेट्री डिश हीटर सेट चालू करें।
  2. AFM और कैंटिलीवर अंशांकन की तैयारी
    1. तरल पदार्थों में माप के लिए निर्दिष्ट एक ग्लास ब्लॉक का उपयोग करें और इसे AFM धारक पर समायोजित करें।
      नोट: ग्लास ब्लॉक की ऊपरी सतह सीधे और AFM धारक के समानांतर होनी चाहिए।
    2. कांच के ब्लॉक की सतह पर कैंटिलीवर को ध्यान से रखें। टिप ए पॉलिश ऑप्टिकल विमान पर रखना चाहिए।
      नोट: कांच ब्लॉक की पॉलिश ऑप्टिकल सतह खरोंच मत करो क्योंकि खरोंच माप में हस्तक्षेप करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। टिप ए को पॉलिश ऑप्टिकल प्लेन पर फैलाना चाहिए क्योंकि अन्यथा फोटोडिटेक्टर के लिए एएफएम के लेजर का प्रतिबिंब संभव नहीं है।
    3. ग्लास ब्लॉक पर कैंटिलीवर को स्थिर करने के लिए, चिमटी की सहायता से एक धातु वसंत जोड़ें।
    4. जब कैंटिलीवर ग्लास ब्लॉक पर तय किया जाता है, तो ब्लॉक को एएफएम हेड पर रखें और एकीकृत लॉकिंग तंत्र को लॉक करें।
    5. AFM डिवाइस पर AFM सिर माउंट करें।
      नोट:: वसंत सही ढंग से रखा जा करने के लिए बाईं ओर का सामना करना चाहिए। यदि यह मामला नहीं है, तो ग्लास ब्लॉक की स्थिति को सही करें और एएफएम सिर को फिर से समायोजित करें।
    6. सॉफ़्टवेयर सेटअप प्रारंभ करें और लेजर संरेखण विंडो और दृष्टिकोण पैरामीटर सेटिंग्स के साथ सॉफ़्टवेयर खोलें। इसके अतिरिक्त, stepper मोटर, लेजर प्रकाश और सीसीडी कैमरा चालू करें।
    7. सीसीडी-कैमरा का उपयोग करके कैंटिलीवर टिप ए की पहचान करें।
    8. कैंटिलीवर को तब तक कम करें जब तक कि यह माध्यम में पूरी तरह से डूब न जाए। इस उद्देश्य तक पहुँचने के लिए स्टेपर मोटर फ़ंक्शन का उपयोग करें।
    9. एक बार जब कैंटिलीवर पूरी तरह से माध्यम से कवर हो जाता है, तो लेजर को समायोजन शिकंजा का उपयोग करके कैंटिलीवर के शीर्ष पर संरेखित किया जाता है। परावर्तित बीम को फोटोडिटेक्टर के केंद्र पर गिरना चाहिए और संकेतों का योग 1 वी या उससे अधिक होना चाहिए। पार्श्व और ऊर्ध्वाधर विक्षेपण 0 के करीब होना चाहिए।
      नोट:: यदि केंद्र तक पहुँच गया है लेजर संरेखण फ़ंक्शन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संकेत मान में निगरानी की जा सकती है। यदि सिग्नल मान सही नहीं हैं, तो आगे समायोजन आवश्यक हैं।
    10. अब दृष्टिकोण पैरामीटर (तालिका 1) के साथ स्कैनर दृष्टिकोण चलाएँ।
    11. 100 μm द्वारा कैंटिलीवर को वापस लें एक बार जब यह रिट्रेक्ट बटन दबाकर नीचे तक पहुंच जाता है।
      नोट:: सुनिश्चित करें कि कोई भी कक्ष उस फ़ील्ड पर अनुलग्न है दृष्टिकोण किया गया है क्योंकि यह अंशांकन को गलत साबित करेगा।
    12. निम्न विनिर्देशों के अनुसार रन पैरामीटर सेट करें: Setpoint 1 V, खींच लंबाई 90 μm, वेग: 5 μm / s, नमूना दर: 2000 हर्ट्ज और एक देरी मोड के रूप में: निरंतर बल।
    13. चलाएँ बटन दबाकर अंशांकन बल-दूरी वक्र मापने प्रारंभ करें।
      नोट:: सॉफ़्टवेयर में चलाएँ बटन पर क्लिक करके एक बल-दूरी वक्र प्राप्त होता है।
    14. प्राप्त अंशांकन बल दूरी वक्र पर सॉफ़्टवेयर में वापस लिए गए वक्र के रैखिक फिट के क्षेत्र का चयन करें। सॉफ़्टवेयर द्वारा वसंत निरंतर माप की गणना करें।
    15. Danalache et al.17 द्वारा वर्णित के रूप में सटीक मापदंडों और चरणों के बाद कैंटिलीवर कैलिब्रेट करें।
  3. अलग-अलग कोशिकाओं की लोच को मापना
    1. नेत्रहीन रूप से एक सेल की पहचान करें और उस पर ध्यान केंद्रित करें। कंप्यूटर माउस को सेल के बीच में रखें। माप परिशुद्धता में सुधार करने के लिए, एएफएम टिप को सीधे सेल नाभिक के ऊपर रखें।
      नोट:: कंप्यूटर माउस इंडेंटेशन के लक्ष्य साइट की पहचान करने के लिए दृश्य मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है।
    2. अब कैंटिलीवर पर ध्यान केंद्रित करें और इसे कंप्यूटर माउस पर ले जाएं।
    3. तालिका 2 में दिए गए पैरामीटर्स के साथ चलाएँ के साथ माप प्रारंभ करें।
      नोट:: सेट बिंदु पैरामीटर कैंटिलीवर के अंशांकन द्वारा प्राप्त किया जाता है उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, एक सेल को तीन बार मापा जाता है। कम से कम 50 कोशिकाओं को मापें।
  4. डेटा संसाधन
    1. Danalache17 द्वारा पहले वर्णित के रूप में सटीक चरणों और पैरामीटर के बाद डेटा को संसाधित करें।
    2. सहेजें और फ़ाइल निर्यात करें।

8. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर खोलें.
  2. नए डेटासेट का चयन चुनें.
    नोट:: दो फ़ाइलें खोली जाती हैं। एक "DataSet" है और दूसरा एक "आउटपुट" फ़ाइल है।
  3. DataSet फ़ाइल का चयन करें और चर दृश्य टैब खोलें।
  4. साइट इंजेक्शन (तरल पदार्थ या कैडेवरिक ऊतक पर कब्जा), श्रेणी (नियंत्रण, डब्ल्यूजे इंजेक्शन, डब्ल्यूएन इंजेक्शन) और लोच के लिए संख्यात्मक चर डालें।
  5. डेटा दृश्य टैब में उनके संगत साइट इंजेक्शन और श्रेणी संख्या के साथ मापा लोच डेटा सम्मिलित करें.
  6. मेनू पट्टी टैब का चयन करके डेटा का विश्लेषण करें विश्लेषण | Descriptive Statistics और Exploratory Data Analysis चुनें।
  7. निर्भर चर के रूप में, लोच और कारक सूची का चयन करें श्रेणी का चयन करें।
    नोट:: परिणाम परिणाम अनुभाग के लिए उपयोग किया जाता है जो एक बॉक्स प्लॉट सहित "आउटपुट" फ़ाइल में परिणाम प्रदर्शित होते हैं।
  8. एक सांख्यिकीय परीक्षण करने के लिए, मेनू पट्टी टैब विश्लेषण के अंतर्गत Nonparametric परीक्षण में स्वतंत्र नमूने का चयन करें।
  9. नई खोली गई फ़ाइल में सेटिंग्स को टैब ऑब्जेक्टिव और सेटिंग्स में रखें।
  10. टैब फ़ील्ड्स खोलें और परीक्षण फ़ील्ड ्स के रूप में लोच और समूह के रूप में श्रेणी चुनें.
  11. चलाएँ दबाएँ.
    नोट:: परिणाम "आउटपुट" फ़ाइल में प्रदर्शित होते हैं। इन विश्लेषणों के लिए एक मान-यू-व्हिटनी परीक्षण किया जाता है।
  12. अन्वेषक डेटा विश्लेषण के बॉक्स प्लॉट में nonparametric परीक्षण के परिणाम को शामिल करें।
  13. मेनू पट्टी में फ़ाइल का चयन करके और सहेजें का चयन करके फ़ाइलों को सहेजें.

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Representative Results

दो दृष्टिकोणों के माध्यम से सेल वितरण के बाद, WN (97.2 ± 2%, n = 10, p<0.002) के माध्यम से वितरित कोशिकाओं की व्यवहार्यता अधिक थी जब WJ द्वारा E60-10 सेटिंग्स (85.9 ± 0.16%, n = 12) (चित्रा 2) का उपयोग करके इंजेक्शन की तुलना में। बायोमैकेनिकल मूल्यांकन परिणामों से पता चला है कि: कैप्चर तरल पदार्थ में कोशिकाओं के डब्ल्यूएन इंजेक्शन ने नियंत्रण (1.176 केपीए) की तुलना में लोचदार मोडुली (ईएम; 0.992 केपीए) के संबंध में कोई महत्वपूर्ण अंतर प्रदर्शित नहीं किया; चित्रा 3ए), जबकि डब्ल्यूजे इंजेक्शन ने सेलुलर ईएम (0.440 केपीए, पी<0.001, चित्रा 3 बी) की एक महत्वपूर्ण कमी को ट्रिगर किया। WJ इंजेक्शन के बाद EM के 40 - 50% की कमी नोट की गई थी। भले ही, कैडेवरिक मूत्रमार्ग ऊतक में डब्ल्यूएन इंजेक्शन ने सेलुलर ईएम (चित्रा 4 ए) में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिया, ऊतक के नमूनों में डब्ल्यूजे इंजेक्शन के बाद ईएम में एक महत्वपूर्ण कमी नोट की गई थी (0.890 केपीए से 0.429 केपीए; पी<0.00, चित्रा 4 बी)। इस प्रकार, डब्ल्यूजे इंजेक्शन के बाद पूर्ण ईएम मान इस प्रकार 51% तक कम हो गए थे। सामूहिक रूप से, परिणाम बताते हैं कि जबकि डब्ल्यूजे सेल डिलीवरी नैदानिक कार्यान्वयन के लिए एक पूर्ण आवश्यकता को पूरा करती है जहां डिलीवरी18 के बाद 80% से अधिक व्यवहार्य कोशिकाएं, डब्ल्यूजे डिलीवरी के बाद सेल लोचदार मोडुली प्रभावित होती हैं। एक कम सेलुलर ईएम WJ वितरण के बाद कोशिकाओं की सुविधाओं के प्रवास की सुविधा प्रदान कर सकता है। इस तरह के एक व्यापक वितरण और वांछित क्षेत्र में पुनर्योजी क्षमताओं की सीमामें 19.

Figure 1
चित्र 1. पोर्सिनी मूत्राशय और मूत्रमार्ग और इंजेक्शन साइटों की शारीरिक रचना। ए) पोर्सिनी मूत्राशय और मूत्रमार्ग के वेंट्रल पक्ष को तीन स्नायुबंधन के साथ पेट और श्रोणि गुहा में मूत्राशय को ठीक करने के साथ दिखाया गया है। इसके अतिरिक्त, मूत्राशय के पृष्ठीय पक्ष पर समाप्त होने वाले मूत्रवाहिनी को दिखाया गया है। बी) WJ और WN इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया cadaveric मूत्रमार्ग की प्रतिनिधि छवि. अनुदैर्ध्य रूप से, काले रंग में घेरे हुए इंजेक्शन गुंबदों के साथ पृष्ठीय खुले मूत्रमार्ग को दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. WN और WJ के माध्यम से सेलुलर व्यवहार्यता निर्धारण इंजेक्शन। WN या WJ के माध्यम से इंजेक्ट किए गए pADSCs को इंजेक्शन के बाद एकत्र किया गया था और व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए ट्रिपैन बहिष्करण के माध्यम से गिना गया था। डब्ल्यूएन के माध्यम से वितरित कोशिकाओं की तुलना में डब्ल्यूजे इंजेक्शन के बाद सेलुलर व्यवहार्यता काफी कम हो गई थी। p<0.001. डेटा को मानक विचलन के साथ माध्य के रूप में रेखांकित किया जाता है। संक्षिप्त रूप: WJ - waterjet, WN - विलियम्स सुई. Danalache et al. 202119 से अनुकूलित आंकड़ा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. क्रमशः डब्ल्यूएन के परिमाणित यंग के मोडुली की तुलना ने कोशिकाओं को कैप्चर मीडिया और उनके संबंधित नियंत्रणों में वितरित किया। नियंत्रण (अनुपचारित) सेल मोनोलेयर्स और डब्ल्यूएन वितरित कोशिकाओं (ए) के लिए बॉक्सप्लॉट में ईएम में कोई उल्लेखनीय अंतर नहीं देखा गया था। विपरीत रूप से, लोच में एक महत्वपूर्ण कमी नियंत्रण कोशिकाओं और WJ समूह (बी) के boxplots के बीच नोट किया जा सकता है। एनएस - महत्वपूर्ण नहीं है, पी > 0.05, ***पी<0.001. संक्षिप्त रूप: WJ - waterjet, WN - विलियम्स सुई. Danalache et al. 202119 से अनुकूलित आंकड़ा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. WN के परिमाणित यंग के मोडुली की तुलना क्रमशः WJ ने कैडेवरिक मूत्रमार्ग और उनके संबंधित नियंत्रणों में कोशिकाओं को वितरित किया। डब्ल्यूएन कोशिकाओं के माध्यम से वितरित कोशिकाओं और उनके संबंधित नियंत्रण (ए) के बीच कोई उल्लेखनीय अंतर नहीं देखा गया था। लोच में एक महत्वपूर्ण कमी WJ वितरित कोशिकाओं और नियंत्रण सेल monolayer (बी) के बीच नोट किया गया था। एनएस - महत्वपूर्ण नहीं है, पी > 0.05, ***पी<0.001. संक्षिप्त रूप: WJ - waterjet, WN - विलियम्स सुई. Danalache et al. 202119 से अनुकूलित आंकड़ा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

दृष्टिकोण पैरामीटर मूल्य
दृष्टिकोण IGain 3.0 हर्ट्ज
दृष्टिकोण PGain 0.0002
दृष्टिकोण लक्ष्य ऊँचाई 10.0 μm
दृष्टिकोण सेटपॉइंट 3.00 वोल्ट
दृष्टिकोण आधार रेखा 0.00 वोल्ट

तालिका 1. दृष्टिकोण पैरामीटर.

पैरामीटर चलाएँ मूल्य
बिंदु सेट करें 10 nN
Z आंदोलन / गति का विस्तार करें निरंतर गति/
5.0 μm/s
संपर्क समय 0.0 सेकंड
खींचने की लंबाई 90 μm
विलंब मोड स्थिर बल
नमूना दर 2000 हर्ट्ज

तालिका 2. पैरामीटर चलाएँ.

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Discussion

वर्तमान अध्ययन में, हमने डब्ल्यूजे सेल डिलीवरी प्रक्रिया के लिए एक चरण-दर-चरण दृष्टिकोण का प्रदर्शन किया और प्रस्तुत किया और सेलुलर विशेषताओं पर डब्ल्यूजे वितरण के प्रभाव का आकलन करने के लिए मात्रात्मक जांच की एक अगली कड़ी को नियोजित किया: सेलुलर व्यवहार्यता और बायोमैकेनिकल विशेषताएं (यानी, ईएम)। डब्ल्यूजे इंजेक्शन के बाद, काटी गई कोशिकाओं का 85.9% व्यवहार्य था। डब्ल्यूएन इंजेक्शन के संदर्भ में, 97.2% कोशिकाओं ने इंजेक्शन के बाद अपनी व्यवहार्यता को बनाए रखा। इस प्रकार, डब्ल्यूजे दृष्टिकोण नैदानिक कार्यान्वयन के लिए एक पूर्ण आवश्यकता को पूरा करता है: 80% से अधिक व्यवहार्य कोशिकाएं प्रसवके बाद 18। जबकि एक मानकीकृत और पुन: प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल डब्ल्यूजे दृष्टिकोण के साथ प्राप्त किया जाता है, सुई इंजेक्शन वितरण का परिणाम सिरिंज और सुई के आकार और नोजल, दबाव, प्रवाह दर और इंजेक्शन स्वयं19 करने वाले चिकित्सक पर अत्यधिक निर्भर करता है।

जीवित पशु मॉडल में डब्ल्यूजे सेल वितरण को नियोजित करने वाले अध्ययनों से पता चला है कि अलग-अलग इजेक्शन दबाव से, प्रवेश की गहराई को लक्षित ऊतक के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और इस तरह, वांछित नैदानिक अनुप्रयोग13,16 के लिए। दृश्य नियंत्रण के तहत जीवित जानवरों में ट्रांसयूरेथ्रल सेल इंजेक्शन ने20 का इलाज करने वाले लगभग 50% जानवरों में कोशिकाओं के गलत स्थान या नुकसान की सूचना दी, जबकि डब्ल्यूजे इंजेक्शन ने 90% से ऊपर की सटीक सेल इंजेक्शन दरों की सूचना दी (Linzenbold et al.16 और अप्रकाशित अवलोकन)। सेल डिलीवरी (सुई इंजेक्शन) के लिए वर्तमान सुनहरा मानक को लक्षित ऊतक में कैनुला के प्रवेश की आवश्यकता होती है। इसलिए, सुई सेल अनुवाद सभी मामलों में चोट और आघात का कारण बनता है। मूत्रमार्ग में, यह वास्तव में स्वस्थ मूत्र में भी पाए जाने वाले रोगाणु और विषाक्त पदार्थों के कारण सूजन विज्ञापन टॉक्सिफिकेशन का कारण बन सकता है। इसके अतिरिक्त, सुई इंजेक्शन की तुलना में डब्ल्यूजे इंजेक्शन में उपयोगकर्ता-संचालन का समय काफी कम होता है: कोशिकाओं को दबाव के स्तर को पूर्वसेट करके इच्छित ऊतक परत में मिलीसेकंड के भीतर रखा जाता है। इसके विपरीत, एंडोस्कोपी द्वारा दूरदराज के क्षेत्रों में सुई इंजेक्शन पर प्रवेश गहराई सर्जन के कौशल और अनुभव पर निर्भर करती है। डब्ल्यूजे इंजेक्शन की पुनरुत्पादकता भी बेहतर होने की उम्मीद है, लेकिन वर्तमान में केवल पूर्व-नैदानिक डेटामौजूद है 15,16,20 और 200 से कम जानवरों की जांच की गई थी। हमारे हाल के अध्ययन में हमने नोट किया कि सुई इंजेक्शन21 की तुलना में डब्ल्यूजे एप्लिकेशन द्वारा सेलुलर लोच कम हो जाती है। यह WJ वितरण के दौरान उच्च वेग में कोशिकाओं के कतरनी तनाव के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। इसके अलावा, अंतिम सेल हानि को ब्याज के क्षेत्र के भीतर सेल प्लेसमेंट और इजेक्शन की उच्च परिशुद्धता द्वारा मुआवजा दिया जा सकता है जैसा कि दृश्य निर्देशित सिस्टोस्कोपी22 द्वारा डब्ल्यूजे निर्देशित वितरण के साथ प्राप्त किया गया है।

यह अच्छी तरह से ज्ञात है कि यांत्रिक बल स्टेम सेल व्यवहार, पुनर्जनन क्षमता के साथ-साथ उनकी बाद की व्यवहार्यता और कार्यक्षमता पोस्ट-ट्रांसप्लांटेशन 10,23 को निर्देशित करते हैं। परमाणु AFM के आगमन ने जलीय परिस्थितियों में नैनो स्केल रिज़ॉल्यूशन में एकल जीवित कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों को परिमाणित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान किया 24,25,26,27। एएफएम एक विश्वसनीय और अत्यधिक संवेदनशील विधि है जो 100 पीए से 106 पीए तक की कठोरता का पता लगा सकती है और रिकॉर्ड कर सकती है, इस प्रकार बहुमत ऊतकों और कोशिकाओं के लिए एक विस्तृत श्रृंखला को कवर कर सकतीहै। वास्तव में, सेल यांत्रिकी सेल राज्य का मूल्यांकन करने के लिए लेबल-मुक्त बायोमार्कर के रूप में उभर रहा है और दोनों शारीरिक और पैथोलॉजिकल राज्य29 और सेल लोच में नाभिक की synergetic और संचयी प्रतिक्रिया है - साइटोस्केलेटन crosstalk। यह अच्छी तरह से स्थापित है कि जब एक कोशिका को बाहरी बलों के अधीन किया जाता है, तो इन बलों को प्लाज्मा झिल्ली से साइटोस्केलेटन के माध्यम से नाभिक में प्रेषित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप इंट्रा-परमाणु विरूपण और पुनर्गठन 30,31,32 होता है। इसलिए नाभिक, लंबे समय तक जीनोमिक सामग्री और प्रतिलेखन उपकरण के रूप में देखा जाता है, सेलुलर मेचानोट्रांसडक्शन में एक प्रमुख खिलाड़ी है और साथ ही32। वास्तव में, परमाणु यांत्रिकी और न्यूक्लियो-साइटोस्केलेटल कनेक्शन का महत्व, सभी सेलुलर कार्यों और उत्परिवर्तनों में, न्यूक्लियो-कंकाल के लैमिन और लिंकर्स में साइटोस्केलेटन (एलईएनसी) कॉम्प्लेक्स में - कई विकृतियों 33,34 की शुरुआत की नींव पर हैं। ये बल सेलुलर कलाकृतियों को भी इंगित कर सकते हैं। विशेष रूप से, बाहरी उत्पन्न बल वास्तव में साइटोस्केलेटल फिलामेंट्स के साथ प्रचारित होते हैं और आगे LINC परिसर में परमाणु लामिना में प्रेषित होते हैं; इन बलों के जवाब में, नाभिक, वास्तव में,35,36 कठोर हो जाता है, इस प्रकार दो बारीकी से जुड़े और जुड़े हुए प्रक्रियाओं को विलय कर देता है। यह हमारे दृष्टिकोण और हमारे परमाणु यांत्रिकी माप का भी तर्क है। इसके अलावा, परमाणु सतह के शीर्ष पर कैंटिलीवर का एक सटीक प्लेसमेंट भी पुनरुत्पादन की एक उच्च डिग्री सुनिश्चित करता है और सेल विषमता और उप-स्तर के प्रति लगाव के कारण भिन्नताओं को कम करता है।

भले ही सेल लोच सेल राज्य का मूल्यांकन करने के लिए लेबल-मुक्त बायोमार्कर के रूप में उभर रही है और दोनों शारीरिक और पैथोलॉजिकल राज्योंमें 29, मापा लोचदार मोडुली को एक ही सेल प्रकार37 में भी बड़े बदलावों द्वारा चिह्नित किया जाता है। शिलर्स एट अल द्वारा सुझाए गए इस तरह के बदलावों का मुकाबला करने की एक विधि मानकीकृत नैनोमैकेनिकल एएफएम प्रक्रियाओं (एसएनएपी) का कार्यान्वयन है जो विभिन्न राज्यों में कोशिकाओं के लिए एक विश्वसनीय मात्रात्मक मार्कर के रूप में लोच माप की उच्च पुनरुत्पादन और प्रयोज्यता सुनिश्चित करतीहै। इसके अलावा, भले ही एएफएम विश्लेषण में नियोजित प्रयोगात्मक पैरामीटर, जैसे इंडेंटेशन वेग, इंडेंटर आकार और आकार के साथ-साथ मॉडल फिटिंग 39 में टिप ज्यामिति का सटीक प्रतिनिधित्व, पूर्ण मापा मूल्यों40,41 को प्रभावित करते हैं, इन मापदंडों को एक अध्ययन या एक मापा प्रवृत्ति के भीतर परिणामों को प्रभावित नहीं करना चाहिए।

हालांकि, ध्यान रखें कि एएफएम इंडेंटेशन कोशिकाओं की बाहरी सतह के विश्लेषण तक सीमित हैं और इस प्रकार, एक सेल झिल्ली या विशेष इंट्रासेल्युलर संरचनाओं के अंदर स्कैन करने में असमर्थ हैं। Usukura et al. ने एक "unroofing" विधि का प्रस्ताव दिया जो सेलुलर झिल्ली को तोड़ता है और साइटोप्लाज्मिक-घुलनशील घटकों को हटा देता है42, इस प्रकार AFM- इंट्रासेल्युलर जांच की अनुमति देता है। हमारे अध्ययन में, हालांकि, अलग-अलग और चयनात्मक इंट्रासेल्युलर घटकों की जांच करने के बजाय औसत लोचदार मोडुली के मूल्यांकन पर ध्यान केंद्रित किया गया था।

सामूहिक रूप से, उपज वाले एएफएम डेटा की स्थिरता और विश्वसनीयता दृढ़ता से संबंधित ऑपरेटर के तकनीकी अनुभव पर निर्भर करती है और जैविक परिवर्तनशीलता38 द्वारा पक्षपाती हो सकती है। सभी संवेदनशील चर के लिए लेखांकन जो वास्तविक एएफएम परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं, इस अध्ययन में रिपोर्ट किए गए पूर्ण लोचदार मूल्यों को सामान्यीकृत नहीं किया जा सकता है और हमारे प्रयोगात्मक सेटअप के लिए विशिष्ट हैं।

कुल मिलाकर, हमारा अध्ययन पुनर्योजी सेल थेरेपी आहार के लिए सुई इंजेक्शन पर डब्ल्यूजे इंजेक्शन की श्रेष्ठता के लिए सबूत21 के साथ-साथ एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकजे.के., एमडी, टी.ए., ए.एस., डब्ल्यू.के. ए. का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है। लेखकों W.L. और M.D.E. ERBE Medizintechnik लेफ्टिनेंट Tübingen, ERBEJet2 के निर्माता और इस अध्ययन में नियोजित WJ प्रोटोटाइप के कर्मचारी हैं।

Acknowledgments

हम मूल प्रकाशनों से हमारे सह-लेखकों को उनकी मदद और समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL centrifuge tube Greiner BioOne 227261
1 mL BD Luer-LokTM Syringe BD Plastik Inc n.a.
100 µm cell sieve Greiner BioOne 542000
15 mL centrifuge tube Greiner BioOne 188271
75 cm2 tissue culture flask Corning Incorporated 353136
AFM head (CellHesion 200) JPK JPK00518
AFM processing software Bruker JPK00518
AFM software Bruker JPK00518
AFM system Cell Hesion 200 Bruker JPK00518
All-In-One-Al cantilever Budget Sensors AIO-10 tip A, Conatct Mode, Shape: Beam
Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m)
Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz)
Length: 500 µm (490 - 510 µm)
Width: 30 µm (35 - 45 µm)
Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm)
Amphotericin B solution Sigma A2942 250 µg/ml
Atomic Force Microscope (AFM) CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany JPK00518
BD Microlance 3 18G BD 304622
bovine serum albumin Gibco A10008-01
Cantilever  All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria AIO-TL-10 tip A, k ¼ 0.2 N/m
C-chip disposable hemocytometer NanoEnTek 631-1098
centrifuge: Rotina 420R Hettich Zentrifugen
Collagenase, Type I, powder Gibco 17100-017
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose Sigma D5546
Feather disposable scalpel (No. 10) Feather 02.001.30.010
fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524
HEPES sodium salt solution (1 M) Sigma H3662
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany L201306_03
laboratory bags Brand 759705
Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine Merck F1315
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) F1315
L-glutamine Lonza BE 17-605C1 200 mM
LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit Invitrogen by Thermo Fisher Scientific L3224 Calcein AM and EthD-1 are used from this kit.
Microscope software: Zen 2.6 Zeiss
Microscope: AxioVertA.1 Zeiss
Nelaton-Catheter female Bicakcilar 19512051
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 10000 U/ml Penicillin
10000 µg/ml Streptomycin
Petri dish heater associated with AFM Bruker T-05-0117
Petri dish heater associated with AFM JPK Instruments AG, Berlin, Germany T-05-0117
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010-015
Statistical Software: SPSS Statistics 22 IBM
Sterile Petri dish - CellStar Greiner BioOne 664160
Tissue culture dishes TPP AG TPP93040
Tissue culture dishes TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland TPP93040
Trypan Blue 0.4%
0.85% NaCl		 Lonza 17-942E
Trypsin-EDTA solution Sigma T3924
Waterjet: ERBEJET2 device Erbe Elektromedizin GmbH
Williams Cystoscopic Injection Needle Cook Medical G14220 23G, 5.0 Fr, 35 cm

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Knoll, J., Danalache, M., Linzenbold, W., Enderle, M., Abruzzese, T., Stenzl, A., Aicher, W. K. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stroma Cells via Waterjet Technology. J. Vis. Exp. (177), e63132, doi:10.3791/63132 (2021).

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