Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Een robuust ontdekkingsplatform voor de identificatie van nieuwe mediatoren van melanoommetastase

Published: March 8, 2022 doi: 10.3791/63186
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 2,5, 3,4, 1,2
1Department of Pathology, NYU Grossman School of Medicine, 2Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group, Perlmutter Cancer Center, 3Department of Radiology, NYU Grossman School of Medicine, 4Preclinical Imaging Core, NYU Grossman School of Medicine, 5Ronald Perelman Department of Dermatology, NYU Grossman School of Medicine

Summary

Dit artikel beschrijft een workflow van technieken die worden gebruikt voor het testen van nieuwe kandidaat-mediatoren van melanoommetastase en hun werkingsmechanisme (s).

Abstract

Metastase is een complex proces waarbij cellen barrières moeten overwinnen die slechts onvolledig worden gemodelleerd door in vitro assays. Een systematische workflow werd opgezet met behulp van robuuste, reproduceerbare in vivo modellen en gestandaardiseerde methoden om nieuwe spelers in melanoommetastase te identificeren. Deze benadering maakt het mogelijk om gegevens in specifieke experimentele stadia te laten afleiden om de rol van een gen in metastase nauwkeurig te karakteriseren. Modellen worden vastgesteld door genetisch gemodificeerde melanoomcellen via intracardiale, intradermale of subcutane injecties in muizen te introduceren, gevolgd door monitoring met seriële in vivo beeldvorming. Zodra vooraf vastgestelde eindpunten zijn bereikt, worden primaire tumoren en/of metastasen-dragende organen geoogst en verwerkt voor verschillende analyses. Tumorcellen kunnen worden gesorteerd en onderworpen aan een van de verschillende 'omics'-platforms, waaronder eencellige RNA-sequencing. Organen ondergaan beeldvorming en immunohistopathologische analyses om de totale last van metastasen te kwantificeren en hun specifieke anatomische locatie in kaart te brengen. Deze geoptimaliseerde pijplijn, inclusief gestandaardiseerde protocollen voor engraftment, monitoring, weefseloogst, verwerking en analyse, kan worden gebruikt voor patiënt-afgeleide, kortetermijnculturen en gevestigde menselijke en muizencellijnen van verschillende vaste kankertypen.

Introduction

De hoge mortaliteit geassocieerd met gemetastaseerd melanoom in combinatie met een toenemende incidentie van melanoom wereldwijd1 (een geschatte toename van 7,86% tegen 2025) vraagt om nieuwe behandelingsbenaderingen. Vooruitgang in doelontdekking hangt af van reproduceerbare modellen van metastase, een zeer complex proces. Gedurende de stappen van de gemetastaseerde cascade moeten melanoomcellen talloze barrières overwinnen om ontwijking van het immuunsysteem en kolonisatie van verre weefsels te bereiken2. De veerkracht en het aanpassingsvermogen van melanoomcellen komen voort uit een veelheid aan factoren, waaronder hun hoge genetische mutatielast3 en hun neurale crest-oorsprong, die cruciale fenotypische plasticiteitverlenen 3,4,5. Bij elke stap laten transcriptionele programma's metastaserende melanoomcellen van de ene toestand naar de andere overschakelen op basis van signalen van de kruisverwijzing met de micro-omgeving, bestaande uit het immuunsysteem6, het extracellulaire milieu 7,8 en de cellulaire architectuur van fysieke barrières9 waarmee ze in contact komen. Melanoomcellen ontsnappen bijvoorbeeld aan immuunsurveillance door de expressie van belangrijke immuun-priming tumor-uitgescheiden factoren te downreguleren6.

Studies beschrijven een "premetastatische niche", waarbij melanoomcellen chemokines en cytokines afscheiden om het verre "doel" -orgaan voor te bereiden op metastase10. Deze bevindingen roepen belangrijke vragen op over het orgaantropisme van gemetastaseerde melanoomcellen en de anatomische route die ze nemen om toegang te krijgen tot verre weefsels. Na intravasatie is bekend dat melanoomcellen uitzaaien via lymfevaten (lymfestelsel) en bloedvaten (hematogene verspreiding)2,11. Terwijl de meeste patiënten zich presenteren met gelokaliseerde ziekte, presenteert een kleine subset van gevallen zich met gemetastaseerde ziekte op afstand en geen lymfatische verspreiding (negatieve betrokkenheid van lymfeklieren)11, wat wijst op het bestaan van alternatieve gemetastaseerde routes voor melanoom.

Wanneer ze een gemetastaseerde site koloniseren, ondergaan melanoomcellen epigenetische en metabole aanpassingen12,13. Om toegang te krijgen tot nieuwe compartimenten en deze binnen te dringen, gebruiken melanoomcellen proteasen14 en cytoskeletale modificaties 11,15, waardoor ze naar hun nieuwe locatie kunnen reizen en groeien. De moeilijkheid bij het richten op melanoomcellen ligt in de complexiteit en het aantal van dergelijke aanpassingen; daarom moet het veld zich inspannen om experimenteel zoveel mogelijk stappen en aanpassingen na te bootsen. Ondanks talrijke vooruitgang in in vitro assays zoals organoïden en 3D-culturen16,17, vatten deze modellen de in vivo metastatische cascade slechts onvolledig samen.

Murine-modellen hebben waarde aangetoond door een balans te vinden tussen reproduceerbaarheid, technische haalbaarheid en simulatie van menselijke ziekten. Intravasculair, orthotopisch en heterotopisch geïmplanteerde melanoomcellen uit patiënt-afgeleide xenografts of kortetermijnculturen in immuungecompromitteerde of gehumaniseerde muizen vormen de ruggengraat van doelontdekking bij gemetastaseerd melanoom. Deze systemen missen echter vaak een cruciale biologische beperking op metastase: het immuunsysteem. Syngeneïsche melanoommetastasemodellen die deze beperking bezitten, zijn relatief schaars in het veld. Deze systemen, ontwikkeld in immunocompetente muizen, waaronder B16-F1018, de YUMM-familie van cellijnen19, SM120, D4M321, RIM322 of meer recent, de RMS23 en M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905) 24 melanoomcellijnen, vergemakkelijken het onderzoek naar de complexe rol van de immuunrespons van de gastheer bij de progressie van melanoom.

Hier wordt een pijplijn voor melanoommetastase doelidentificatie gepresenteerd. Met toenemende en grotere 'omics'-datasets die worden gegenereerd uit melanoompatiëntencohorten, stellen we dat studies met de meeste klinische beloftes die zijn die voortkomen uit big data-integratie, wat leidt tot nauwgezette functionele en mechanistische ondervraging 25,26,27,28. Door muismodellen te gebruiken om potentiële doelen in het metastatische proces te bestuderen, kan men rekening houden met in vivo-specifieke gebeurtenissen en weefselinteracties, waardoor de kans op klinische vertaling toeneemt. Meerdere methoden om gemetastaseerde belasting te kwantificeren worden geschetst, die aanvullende gegevens over de resultaten van een bepaald experiment opleveren. Een protocol voor eencellige isolatie van tumoren in verschillende organen wordt beschreven om de onbevooroordeelde karakterisering van genexpressie in gemetastaseerde cellen te ondersteunen, die vooraf kunnen gaan aan single-cell of bulk RNA-sequencing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: De dierprocedures die betrokken zijn bij het volgende protocol zijn goedgekeurd door de New York University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alle procedures worden uitgevoerd in faciliteiten die zijn goedgekeurd door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Figuur 1 toont de algemene experimentele benadering.

1. Patiënt-afgeleide melanoom korte termijn culturen (STC's)

  1. Plaats het weefsel in een petrischaaltje van 60 mm met 1 ml volledige RPMI (RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 1x MEM niet-essentiële aminozurenoplossing en penicilline (100 IE /ml) / streptomycine (100 μg / ml)).
    OPMERKING: Om de verhouding van tumorcellen te verhogen, ontleed en verwijder indien nodig het weefsel rond de tumor in de petrischaal, onder een microscoop, met behulp van steriele chirurgische instrumenten.
  2. Snijd het verse weefsel fijn met gesteriliseerde scheermesjes in blokjes van 1-2 mm. Voeg 4 ml volledige RPMI toe en pipetteer de inhoud van de plaat 5-10 keer op en neer met een serologische pipet van 10 ml.
  3. Breng de celsuspensie over in een polypropyleen conische buis van 15 ml en draai de cellen naar beneden (180 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C). Zuig het supernatant op, resuspend de celkorrel in 1 ml vers medium en breng de suspensie over in een 25 cm2 weefselkweekkolf.
  4. Om de weefselfragmenten aan de bodem te helpen hechten, plaatst u de kolf gekanteld in een hoek van 20°-30° in een weefselkweekincubator bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 20 minuten.
  5. Leg de kolf plat neer zodat het medium het weefsel kan bedekken en controleer dagelijks de status van de kweek. Splits de cellen wanneer ze 90-100% confluentie bereiken. Houd kortetermijnculturen op een "laag" passagenummer.
    OPMERKING: STC's zullen ongeveer 2 maanden na celisolatie en kweek worden vastgesteld, hoewel de werkelijke tijdlijn varieert tussen monsters en tumortypen. Na 10 tot 14 passages bereiken cellijnen 100% zuiverheid en bevatten ze alleen melanoomcellen29. De passagegetaldrempel wordt empirisch bepaald door veranderingen in celmorfologie, verdubbelingstijd en gedrag in vivo waar te nemen. Om heterogeniteit en andere kenmerken van de oudertumor te behouden, splits de cellen niet meer dan 1: 5.
  6. Bij het vaststellen van een STC en met elk cellijnmodel dat in dieren moet worden geïnjecteerd zoals beschreven in de volgende stappen, transduceren cellen met een verslaggever.
    OPMERKING: Een fluorescerende tag (bijv. rood fluorescerend eiwit (RFP), groen fluorescerend eiwit (GFP)) maakt bijvoorbeeld ex-vivo immunofluorescentiebeeldvorming en sortering van tumorcellen mogelijk door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Luciferase maakt in vivo bioluminescentie beeldvorming mogelijk, een nuttig hulpmiddel voor het monitoren van experimentele progressie (rubriek 4).

Figure 1
Figuur 1: Schema dat de beschreven workflow illustreert, van integratie van patiëntgegevens tot het genereren en analyseren van in vivo gegevens van muizen. Afkortingen: LOF = functieverlies; GOF = versterking van functie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Xenograft implantatie

OPMERKING: De hier beschreven experimentele procedures worden uitgevoerd bij muizen met een verminderd adaptief en aangeboren immuunsysteem, NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) muizen; of bij muizen die alleen adaptieve immuniteit missen, zoals de T-cel-deficiënte athymische / naakte (NU / J) muizen. Dieren zijn van mannelijk geslacht, 8 tot 10 weken oud. Vrouwen vertonen vaak een hoge incidentie van gonadale metastasen bij intracardiale injectie van tumorcellen, wat hun overleving vermindert.

  1. Bereid voor subcutane en intradermale injecties een 1:1 celsuspensie door een deel van de cellen gesuspendeerd in 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) te mengen met een deel ontdooide extracellulaire matrixsubstraat (EMS) en houd op ijs bij 4 °C. Voor intravasculaire (intracardiale, intracarotis-, retro-orbitale, staartader- of milt) injecties suspensie de cellen alleen in DPBS.
    OPMERKING: Het juiste volume voor intradermale injecties moet zo laag mogelijk worden gehouden (30 μL). Voor subcutane injecties kan het geïnjecteerde volume oplopen tot 150 μL en voor intravasculaire injecties tot 250 μL (op basis van het gewicht van het dier). Voeg aan de eindcelsuspensie 10-30% extra volume injectaat toe, op basis van de geïnjecteerde hoeveelheid en de spuit die wordt gebruikt om rekening te houden met het dode volume in de sliptip en dat van de naald (bijv. Een tuberculinespuit van 1 ml met een naald van 30 G, 25 mm heeft een dood volume van 100 μL).
  2. Voer een pilot uit om het gedrag van de gebruikte cellijnen en de tijdlijn van tumorprogressie in vivo te karakteriseren. Voor intradermale injecties, begin met het injecteren van 1.000 tot 50.000 cellen / 30 μL. Voor subcutane injecties, begin met het injecteren van 10.000 tot 2 × 106 cellen / 150 μL. Voor intravasculaire (intracardiale, intracarotis, retro-orbitale en milt) injecties, begin met het injecteren van 50.000 cellen / 150 μL.
    OPMERKING: Intravasculaire injecties maken de dieren vatbaar voor embolische gebeurtenissen, hetzij door lucht in de bloedsomloop te brengen of door een overmatig aantal cellen te gebruiken die de kleine bloedvaten afsluiten. Meng de celsuspensie goed om klonteren te voorkomen. Bereid de spuit voor voordat u de celsuspensie laadt. Verwijder eventuele luchtbellen in de spuit. Houd de celsuspensie/spuiten op ijs tot het laden en de injectietijd.
  3. Anesthesie toedienen door inhalatie. Stel de zuurstofniveauregelaar in tussen 1-2 L/min. Plaats het dier in de inductiekamer met de isofluraanverdamper ingesteld op 2,5-5% voor inductie en 1,5-3% voor onderhoud.
    OPMERKING: Controleer de ademhaling en hartslag van het dier tijdens de inductiefase van de anesthesie. Laat het dier niet onbeheerd achter. Controleer niet meer dan één dier tegelijk. Titer de hoeveelheid anesthesie tot het gewicht van het dier.
  4. Verplaats het dier van de inductiekamer naar de neuskegel. Breng steriele vaseline oftalmische zalf aan op de ogen van het dier om drogen van het hoornvlies tijdens de procedure te voorkomen.
  5. Scheer de procedureplaats met een recht scheermesje gekanteld in een hoek van 30°. Reinig de huid van het ingreepgebied met 70% isopropylalcoholdoekjes. Voordat u verdere stappen uitvoert, beoordeelt u op een voldoende niveau van anesthesie door pedaalreflex.
  6. Voor intradermale injecties voert u de hele procedure uit in een bioveiligheidskast om aseptische omstandigheden te behouden.
    1. Verdoof en scheer het dier zoals beschreven in stappen 2.3-2.5.
    2. Pak de huid vast en trek deze naar achteren tegen het traject van de naaldsteek. Gebruik een naald van 31 G insulinespuit, 6 mm lang, in een scherpe hoek gehouden, de huid voorzichtig doorboren met de schuine kant naar boven gericht.
    3. Voel de drukafgifte aan de punt van de naald. Ga voorzichtig verder om in het intradermale compartiment te blijven en niet door de hele huiddiepte in de subcutis te gaan. Cruciaal: Als er een in de onderhuidse ruimte glijdt, verwijder dan de naald, verander het injectiegebied en plaats de naald opnieuw. Injecteer het volledige volume (30 μL) celsuspensie langzaam totdat een koepelvormige wheal wordt waargenomen.
      OPMERKING: Lage injectievolumes veroorzaken minder dissectie van de huidlagen en minder architecturale vervorming.
    4. Houd de naald erin en tel tot 5.
      OPMERKING: EMS wordt stroperig bij lichaamstemperatuur, waardoor terugstroming door de naaldpunctiewond wordt voorkomen.
    5. Verwijder de naald en breng het dier in een kooi op een warm kussen om te herstellen. Breng het dier terug naar de vivariumkooi na het herwinnen van het bewustzijn, wanneer het sternaal en ambulant is.
      OPMERKING: Controleer het dier continu tijdens alle procedures die in dit protocol worden beschreven. Laat het dier niet onbeheerd achter en controleer niet meer dan één dier tegelijk.
    6. Controleer de progressie van tumorgroei, gewichtsverlies en algehele gezondheidsstatus in samenwerking met veterinair personeel dagelijks in de eerste groeifase en intenser, indien nodig, nadat dieren beginnen af te vallen. Tijdens deze monitoringsessies: weeg de dieren en zet een grafiek uit om gewichtsverlies te controleren en controleer op tekenen van tumorzweren, neurologische, locomotorische en / of gedragssymptomen (lethargie, gebrek aan verzorging, lage voedsel- of waterinname).
      OPMERKING: Euthanaseer de dieren onmiddellijk na het waarnemen van tekenen van gevorderde ziekte (meer dan 20% gewichtsverlies, een lichaamsconditiescore van <2, extreem verminderde activiteitsniveaus, verlamming of epileptische aanvallen). Gebruik de euthanasiemethode die is goedgekeurd door de IACUC van de instelling (een geautomatiseerde CO2-kamer op tafel wordt bijvoorbeeld gebruikt om de dieren gedurende 15 minuten bloot te stellen aan CO2 , gevolgd door een secundaire methode van euthanasie, ofwel cervicale dislocatie, onthoofding of pneumothorax bilateraal geïnduceerd door de ribbenkast in te snijden).
    7. Neem metingen met remklauwen en gebruik de lengte (L) en de breedte (W) dimensies van de tumor om het volume (V) te berekenen met de formule:
      Equation 1
  7. Voor subcutane injecties:
    1. Voer de volledige procedure uit in een bioveiligheidskast om aseptische omstandigheden te handhaven26,27.
    2. Verdoof en scheer het dier zoals beschreven in stappen 2.3-2.5.
    3. Gebruik een naald van 28 G tot 31 G insulinespuit, 6 mm lang, in een acute hoek gehouden, om de huid voorzichtig door te prikken met de schuine kant naar boven gericht. Voel de druk die twee keer aan het punt van de naald vrijkomt tijdens het passeren van de opperhuid, dermis en hypodermis.
      OPMERKING: De tweede keer dat een drukontlading aan de punt van de naald wordt gevoeld, geeft aan dat het onderhuidse compartiment is bereikt.
    4. Injecteer het volledige volume (30-150 μL) celsuspensie langzaam totdat een langwerpige ellipsvormige wheal wordt waargenomen. Houd de naald erin en tel tot 5. Tel tot 10 voor grotere volumes (meer dan 50 μL).
      OPMERKING: EMS wordt stroperig bij lichaamstemperatuur, waardoor terugstroming door de naaldpunctiewond wordt voorkomen.
    5. Verwijder de naald en breng het dier in een kooi op een warm kussen om te herstellen. Breng het dier terug naar zijn vivariumkooi na het herwinnen van het bewustzijn, wanneer het sternaal en ambulant is.
      OPMERKING: Let tijdens de postprocedurale controle op tekenen van complicaties (lage ademhalingsfrequentie, bloeding, langzaam herstel) en pak ze op de juiste manier aan. Als er geen verbetering wordt waargenomen, ga dan over tot humane euthanasieprocedures die worden beschreven in de OPMERKING van stap 2.6.6.
    6. Controleer het dier op tumorgroei, gewichtsverlies en algehele gezondheidsstatus zoals beschreven in stappen 2.6.6-2.6.7.
  8. Voor intracardiale injecties:
    1. Voer de hele procedure uit in een bioveiligheidskast om aseptische omstandigheden te handhaven26,30.
    2. Verdoof het dier zoals beschreven in stappen 2.3-2.4.
    3. Breng het dier over op het verwarmde platform van het echoapparaat en bevestig het met hypoallergene tape aan de neuskegel.
    4. Scheer de thorax met een recht scheermesje gekanteld in een hoek van 30°. Reinig de huid van het proceduregebied met 3 toepassingen van 10% povidon-jodium afgewisseld met 3 toepassingen van isopropylalcohol.
    5. Voordat u verdere stappen uitvoert, beoordeelt u op een voldoende niveau van anesthesie door pedaalreflex. Breng ultrasone gel aan op de procedureplaats.
    6. Vang het hartvenster op met de ultrasone sonde. Plaats de ultrasone sonde in het midden van de thorax aan de linkerkant van het dier om een horizontaal venster vast te leggen dat is georiënteerd om een dwarsdoorsnede (korte as) van de linker ventrikel te verkrijgen. Zorg ervoor dat de lange as van de sonde naar boven is gericht, bevestig de sonde in een hoek van 50° en het verwarmde platform in een hoek van 20°. Vergrendel de sonde en het steunframe op hun plaats.
    7. Trek de celsuspensie op terwijl u in de bioveiligheidskast werkt in een tuberculinespuit van 1 ml met een naald van 30 G, 25 mm. Verwijder eventuele luchtbellen in de spuit.
      OPMERKING: Het is belangrijk om een eencellige suspensie te creëren en te behouden terwijl cellen worden verwerkt en geïnjecteerd. Het verwijderen van luchtbellen is een belangrijke stap om luchtembolie te voorkomen. Een goed geprepareerd spuit-naaldsysteem voorkomt vermijdbare sterfgevallen in de experimentele groep. Trek altijd meer volume in de spuit dan er wordt geïnjecteerd. Het extra volume helpt de lucht te verwijderen door een deel van de celsuspensie terug te injecteren in een buis van 1,5 ml.
    8. Vergrendel de spuit in de stereotactische injector. Onder echografische begeleiding, verplaats de naald door de thoracale wand in de linker ventrikel van het hart. Injecteer het volledige volume (100-250 μL) celsuspensie langzaam.
    9. Verwijder de naald en breng het dier in een kooi op een warm kussen om te herstellen. Breng het dier terug naar zijn vivariumkooi na het herwinnen van het bewustzijn, wanneer het sternaal en ambulant is. Controleer het dier op tumorgroei, gewichtsverlies en algehele gezondheidsstatus zoals beschreven in stap 2.6.6.
  9. Voor intracarotide injecties:
    1. Voer de hele procedure uit op een goed gedesinfecteerd oppervlak om aseptische omstandigheden te helpen handhaven30.
    2. Verdoof het dier met een cocktail van ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) door intraperitoneale injectie met een insulinespuit, 28 G naald. Breng steriele vaseline oftalmische zalf aan op de ogen van het dier om drogen van het hoornvlies tijdens de procedure te voorkomen.
    3. Scheer het ingreepgebied met een recht scheermesje gekanteld in een hoek van 30°. Voordat u verdere stappen uitvoert, beoordeelt u op een voldoende niveau van anesthesie door pedaalreflex.
    4. Plaats het dier onder een stereomicroscoop op een warmhoudkussen. Reinig de huid van het proceduregebied met 3 toepassingen van 10% povidon-jodium afgewisseld met 3 toepassingen van isopropylalcohol.
    5. Trek steriele persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) en steriele handschoenen aan. Bereid het steriele veld voor door een steriel gordijn over het lichaam van het dier te leggen.
      OPMERKING: Als het steriele gordijn geen gat heeft dat geschikt is voor de grootte en locatie van de incisie, vouwt u het gordijn in tweeën en gebruikt u een Metzenbaum-schaar om het juiste gat in het midden van het steriele gordijn te knippen.
    6. Gebruik een scalpel of Iris schaar om de huid van de helft van de nek tot aan het borstbeen te snijden. Ontleed met twee microchirurgische tangen botweg de 2 submandibulaire speekselklieren in het middellijnvlak. Gebruik indien nodig een elektrische cautery voor hemostase.
    7. Ontleed de fascia rond de gemeenschappelijke halsslagader (CCA) van het manubrium naar de bifurcatie en ga mediaal door om de achterste wand van de externe halsslagader vrij te maken. Klem de uitwendige halsslagader (ECA) tijdelijk vast voordat u injecteert.
      OPMERKING: Bij het ontleden rond de omtrek van het CCA moet ervoor worden gezorgd dat de nervus vagus (ligt lateraal aan de slagader) niet wordt beschadigd.
    8. Laad de celsuspensie in een spuit van 1 ml met een naald van 33 G, 15 mm.
    9. Passeer twee 7-0 ligaturen onder de CCA en voer een losse instrumentknoop uit voor elk van de twee ligaturen. Gebruik een drukvatclip van 5 mm en 10 G en knip de ECA tijdelijk vast. Bind de proximale ligatuur; bind vervolgens de distale ligatuur losjes (naast de bifurcatie van de CCA). Gebruik de distale lus later om de bloeding na de injectie onder controle te houden.
    10. Gebruik de spuit met een naald van 33 G, 15 mm, prik voorzichtig de CCA met de schuine kant van de naald naar boven en onder een scherpe hoek. Injecteer het volledige volume (50-150 μL) celsuspensie langzaam.
    11. Pak de distale lus vast met de tang en til deze op terwijl u de naald verwijdert om het lumen van de CCA af te sluiten en het bloeden te stoppen. Vervang de spuit met een #7 Juwelierstang en bind de distale lus vast.
    12. Gooi nog een instrumentknoop op de distale ligatuur en verwijder de vaatklem van de ECA. Controleer het operatieveld op bloedingen en cauteriseer eventuele bloedende vaten vóór sluiting. Gebruik een nietapparaat van 9 mm om de huid van het dier te sluiten en plaats het dier op een warm kussen om te herstellen.
      OPMERKING: Verwijder de nietjes 7-10 dagen na de operatie.
    13. Dien pijnstillende medicatie subcutaan-Buprenorfine (0,3 mg / ml) elke 12 uur toe gedurende 72 uur na de operatie in een concentratie van 0,1 mg / kg.
      OPMERKING: Overweeg ook het gebruik van een pijnstillende medicatie met verlengde afgifte, waarvoor elke 72 uur 1 dosis nodig is.
    14. Breng het dier terug naar zijn vivariumkooi na het herwinnen van het bewustzijn, wanneer het sternaal en ambulant is. Controleer de dieren postoperatief dagelijks op tekenen van infectie of pijn op de operatieplaats, algemene gezondheidstoestand en complicaties.
      OPMERKING: Dieren die niet goed herstellen van een overlevingsoperatie kunnen extra doses pijnmedicatie krijgen en zullen humaan worden geëuthanaseerd als ze niet 72 uur na de operatie volledig zijn hersteld.
    15. Controleer het dier op tumorgroei, gewichtsverlies en algehele gezondheidsstatus zoals beschreven in stap 2.6.6.
  10. Voor retro-orbitale injecties:
    OPMERKING: Gebruik deze techniek als alternatief voor staartaderinjecties wanneer de operator getraind en bekwaam is in deze techniek en wanneer er een sterke wetenschappelijke rechtvaardiging is. Celsuspensies die via deze route worden toegediend, kunnen tumorgroei in de retro-orbitale ruimte veroorzaken; daarom moet zorgvuldig rekening worden gehouden met de risico's en voordelen bij het kiezen van deze techniek. Om bijvoorbeeld te profiteren van de directe circulatieverbinding van de retro-orbitale veneuze sinus met de intracerebrale aderen via anastomosen, selecteert u deze methode wanneer de vorming van hersentumoren is mislukt met behulp van andere injectieroutes.
    1. Voer de hele procedure uit in een bioveiligheidskast om aseptische omstandigheden te behouden. Trek steriele PBM's en handschoenen aan.
    2. Verdoof het dier zoals beschreven in stappen 2.3-2.4.
      OPMERKING: Breng voor deze procedure geen steriele vaseline oftalmische zalf aan op de ogen van het dier, omdat dit de injectie zal belemmeren; breng alleen lokale verdovingsdruppels aan.
    3. Laad de celsuspensie in een insulinespuit met een naald van 28-31 G, 6 mm.
    4. Met het dier in buikligging trekt u de oogleden in totdat het oog uitsteekt. Breng 1 druppel lokale verdoving aan in het oog aan de kant die de procedure ondergaat.
    5. Steek de naald in een hoek van 30-45° tussen het oog en de mediale epicanthus met de schuine kant naar beneden gericht. Injecteer de celsuspensie (10-150 μL) langzaam.
      OPMERKING: Langzamere bewegingen voorkomen schade aan het oog en de terugstroom van het injectaat.
    6. Voer de stappen uit die worden beschreven in 2.7.5-2.7.6.
  11. Voor miltinjecties:
    1. Voer de hele procedure uit in een bioveiligheidskast om aseptische omstandigheden te handhaven31. Trek steriele PBM's en steriele handschoenen aan.
    2. Verdoof en scheer het dier zoals beschreven in stappen 2.3-2.5.
    3. Plaats het dier in een rechterzij lighouding. Reinig de huid van het proceduregebied met 3 toepassingen van 10% povidon-jodium afgewisseld met 3 toepassingen van isopropylalcohol en bereid het chirurgische veld voor zoals beschreven in stap 2.9.5.
    4. Maak met een Metzenbaum-schaar of een scalpel een incisie van 1 cm in de linkerflank van de buikwand, gevolgd door een incisie in het peritoneum.
      OPMERKING: De milt wordt gezien door de doorschijnende buikwand na het maken van de huidincisie. Voer de peritoneale incisie precies op deze site uit.
    5. Leg de milt en de milt hilum bloot via de incisie. Gebruik een naald van 28-31 G insulinespuit, 6 mm lang, prik voorzichtig in de milt met de schuine kant van de naald naar boven en onder een scherpe hoek.
      OPMERKING: Als de prikwond bloedt, cauteriseer de plaats om bloedingen en terugstroom te beperken.
    6. Injecteer het volledige volume (50-100 μL) celsuspensie langzaam. Verwijder de naald. Plaats een klein gaasje op de milt en oefen druk uit met een tang. Klem de milt lichtjes tussen het gaas met behulp van een fijne muggentang en wacht 15 minuten.
    7. Voer een splenectomie uit door het milt hilum te binden met een 3-0 of 4-0 zijden hechtdraad, waarbij de bloedvaten indien nodig worden dichtgeschroeid. Sluit het peritoneum met een 5-0 polydioxanon (PDS) of polyglycolzuur absorbeerbare hechting.
    8. Voer de stappen uit die worden beschreven in stappen 2.7.5-2.7.6.
      OPMERKING: Dieren die bloedingscomplicaties vertonen of die 72 uur na de operatie niet volledig zijn hersteld, moeten op humane wijze worden geëuthanaseerd. Vergeet niet dat het welzijn van de muizen te allen tijde de prioriteit is.

3. Gefaseerde overlevingsoperatie (SSS)

  1. Bepaal op basis van de experimentele conclusies uit stap 2.2 de juiste tijd om de operatie te overleven. Selecteer, afhankelijk van de cellijn en experimentele hypothese, een eerder tijdstip voor tumorresectie (bij een tumorvolume = 150 mm3) of een later tijdstip (bij een tumorvolume = 500 mm3)26.
    OPMERKING: De limiet voor het tumorvolume is 1.500 mm3 wanneer de tumorbelasting hoog genoeg is om schadelijk te zijn voor het welzijn van het dier en vatbaar is voor complicaties.
  2. Verdoof en scheer het dier zoals beschreven in stappen 2.3-2.5.
    OPMERKING: De hele procedure wordt uitgevoerd in een bioveiligheidskast.
  3. Reinig de huid van het proceduregebied met 3 toepassingen van 10% povidon-jodium afgewisseld met 3 toepassingen van isopropylalcohol en bereid het chirurgische veld voor zoals beschreven in stap 2.9.5.
  4. Gebruik een irisschaar of een scalpel om de huid in te snijden, met behoud van een resectiemarge van 5-7 mm vanaf de rand van de tumor.
    OPMERKING: De marge voor resectie hangt af van het vermogen van de tumor om zich lokaal te verspreiden. Voor agressieve tumoren, verhoog de resectiemarge terwijl u ervoor zorgt dat er voldoende huid overblijft om de wondsluiting uit te voeren.
  5. In het geval van intradermale tumoren, reseceer de tumor samen met de omtrekkende huid.
  6. Voor subcutane tumoren, ontleed en verwijder de tumor onder de huid.
    OPMERKING: Als de tumor het peritoneum en/of de huid binnendringt, reseceer deze dan en bloc met de tumor en sluit het peritoneum met 5-0/4-0 PDS of polyglycolzuur absorbeerbare hechtingen.
  7. Sluit de wond met het nietapparaat van 9 mm.
    OPMERKING: Verwijder de nietjes 7-10 dagen na de operatie. Dien pijnstillende medicatie toe en plaats het dier op een warm kussen om te herstellen. Blijf pijnstillende medicatie toedienen gedurende 72 uur na de operatie, eenmaal per 12 uur volgens stap 2.9.13. Dieren met bloedingscomplicaties of die na de operatie niet volledig bij bewustzijn zijn gekomen, moeten op humane wijze worden geëuthanaseerd.
  8. Single-house het dier in een kooi, op een warm pad om te herstellen. Breng het dier terug naar de vivariumkooi na het herwinnen van het bewustzijn, wanneer het sternaal en ambulant is.
  9. Blijf het dier na de operatie controleren op lokale recidieven, gewichtsverlies, neurologische, locomotorische en / of gedragssymptomen (lethargie, gebrek aan verzorging, lage voedsel- of waterinname) en de algehele gezondheidsstatus.

4. In vivo beeldvorming (figuur 2A)

  1. Dien D-luciferinesubstraat (150 mg/kg) toe aan dieren door intraperitoneale injectie met een insulinespuit van 1 ml, naald van 28 g.
    OPMERKING: Tumorcellen moeten stabiel worden getransduceerd met het luciferase cDNA.
  2. Induceer anesthesie zoals beschreven in stappen 2.3-2.4, 6 minuten na de injectie met het D-luciferinesubstraat.
  3. Voer beeldvorming uit met behulp van een bioluminescentiebeeldvormingsscanner (in vivo beeldvormingssysteem)26.
  4. Verplaats het dier in de beeldvormingskamer en in de neuskegel. Stel tot 5 dieren tegelijk in beeld, afhankelijk van de capaciteit van het beeldvormingssysteem.
  5. Start het instrument door op initialiseren te drukken. Stel de belichtingstijd in op automatisch (1-120 s).
  6. Leg een lege afbeelding vast om indien nodig een achtergrond af te trekken. Klik op verwerven en sla de afbeelding op nadat de acquisitiereeks is voltooid.
  7. Plaats het dier terug in een kooi, die met 50% van het basisoppervlak boven een opwarmkussen zit om te herstellen van anesthesie. Breng het dier terug naar de vivariumkooi na het herwinnen van het bewustzijn, wanneer het sternaal en ambulant is.
  8. Voor gegevensanalyse in dezelfde in vivo beeldvormingssoftware waarmee de beelden zijn vastgelegd, navigeert u naar de map waar de afbeeldingen zijn opgeslagen en opent u de afbeeldingen van alle muizen die betrekking hebben op het experiment in één keer.
    OPMERKING: Analyse van één afbeelding tegelijk maakt normalisatie tussen groepen niet mogelijk.
  9. Stel de eenheden in op uitstraling (niet tellen). Zorg ervoor dat het selectievakje dat aangeeft dat het individu aangeeft, niet is aangevinkt, omdat dit normalisatie van het signaal tussen groepen voorkomt.
  10. Teken met behulp van de region of interest (ROI) tekentool cirkelvormige ROI's voor het hersengebied en rechthoekige ROI's voor het lichaam. Wees voorzichtig om de oren en neus uit te sluiten van de ROI van de hersenen, omdat ze de neiging hebben om niet-specifieke luminescentie uit te zenden. Om vertekening in dit proces te minimaliseren, tekent u alleen ROI's op de foto's van de muizen, zonder dat het lichtgevende signaal eroverheen wordt gelegd.
  11. Selecteer MRI's meten om het signaal te kwantificeren en de gegevens naar een spreadsheet te exporteren. Analyseer verschillen tussen groepen door de totale luminescerende flux (p/sec/cm2/sr) in de betreffende lichaamsgebieden uit te zetten.
    OPMERKING: Om de verschillen tussen groepen in hersentropisme specifiek te beoordelen, berekent u de verhouding tussen het hersensignaal en het lichaamssignaal voor elke muis. Dit controleert op intermouse variatie in totale tumorbelasting en verschillen in niveaus van luciferase-expressie tussen experimentele groepen.

5. Ex vivo magnetische resonantie beeldvorming

  1. Voer ex vivo MRI uit onmiddellijk na euthanasie. U kunt ook de interessante organen oogsten, ze tot 72 uur in formaline fixeren en de beeldvorming op een later tijdstip uitvoeren.
  2. Verkrijg de beelden met een 7-Tesla (7-T) (300-MHz) micro-MRI-systeem uitgerust met een NMR-console en een zero-boil-off, horizontale boringsmagneet of soortgelijke apparatuur.
    OPMERKING: De noodzaak van een actief afgeschermde gradiënt spoelinzet met de juiste afweging van prestaties is cruciaal. Het moet een gradiënt lineariteit van ten minste 50 mm dynamisch bolvormig volume (DSV) bieden om de reeks monsters die gelijktijdig worden onderzocht zonder geometrische vervorming te bedekken. De combinatie van gradiëntsterkte (variërend van 440 tot 750 mT/m) en de duty cycle die maximale gelijktijdige GELIJKSTROOM van 3 x 30 A tot 3 x 87 A mogelijk maakt, maakt adequate beeldvormingsprestaties mogelijk. De gebruikte gradiëntspoelinzet (zie de tabel met materialen) maakt de volgende prestaties mogelijk: 660 mT/m, 130 μs stijgtijd, 3 x 87 A en een DSV = 80 mm.
  3. Voer de scans uit met een commerciële zend-ontvangst circulair gepolariseerde radiofrequentiespoel van het hele muislichaam (OD = 59 mm, ID = 38 mm, L = 40 mm) afgestemd op 300,16 MHz, de 1H proton Larmor-frequentie.
    OPMERKING: Deze rf-sonde maakt het mogelijk om 3D-datasets te verzamelen met submillimetrische isotrope resolutie (<150 μm) tijdens nachtelijke scans van 8-12 uur.
  4. Detecteer de tumorbelasting met behulp van meerdere sequenties30.
    OPMERKING: Hyperintense signaal gedetecteerd door een T2-gewogen, Rapid Imaging with Refocused Echoes (RARE) sequentie herkent oedeem rond tumoren.
  5. Voer de 3D RARE-sequentie uit met de volgende acquisitieparameters: [120 μm]3 isotrope resolutie; acquisitietijd 5 uur, 27 min; herhalingstijd (TR) = 500 ms; echoafstand (ES) = 12,7 min; Turbofactor TFx = 12; effectieve echotijd (TEeff) = 76,2 ms; bandbreedte (BW) = 75 KHz; Matrixgrootte = 2843; gezichtsveld (FOV) = [4,0 mm]3; aantal gemiddelden (Nav) = 6.
  6. Detecteer metastasen met behulp van de volgende parameters.
    1. Gebruik voor gepigmenteerde metastasen met signaalverheldering een T1-gewogen 3D-gradiëntechosequentie met de volgende parameters: [120 μm]3 isotrope resolutie; acquisitietijd 2 uur, 41 min; TR = 20 ms; echotijd (TE) = 4,0 ms; flip hoek (FA) = 18°; BW = 75 KHz; Matrixgrootte = 2843; FOV = [34,0 mm]3; Nav = 6.
    2. Gebruik voor ongepigmenteerde en/of hemorragische metastasen een hypointense-signaal bij het verkrijgen van een T2*-gewogen, multigradient echo (MGE) sequentie (3D MGE, [120 μm]3 isotrope resolutie; acquisitietijd 3 h, 35 min; TR = 40 ms; TE = 3,6 ms; ES = 3,2 ms; 4 echo's; FA = 20°; BW = 100 kHz; Matrixgrootte = 2843; FOV = (34,0 mm)3; Nav = 4.
  7. Gebruik alle 3 de sequenties om de tumorlast te kwantificeren.
  8. Kruisverwijzing van de tumorgebieden die tijdens de analyse zijn geïdentificeerd met histologische secties om nauwkeurigheid te garanderen. Zie rubrieken 7 en 8.

6. Weefselverwerking voor single-cell of bulk RNA sequencing

  1. Euthanaseer het dier met behulp van een methode die is goedgekeurd door de IACUC van de instelling. Zie een van de procedures die worden beschreven in de NOTA van stap 2.6.6.
  2. Ontleed de interessante organen en plaats ze in afzonderlijke putten van een plaat met Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) op ijs. Werk snel en houd het weefsel te allen tijde op ijs om de levensvatbaarheid van de cel te maximaliseren.
    OPMERKING: De volgende stappen zijn specifiek voor hersenverwerking. Pas het collagenasetype aan het specifieke weefsel aan, op basis van uw behoeften.
  3. Bereid een bord met 6 putten met 3 ml HBSS in elke put.
  4. Om de dissectie te visualiseren en verder te begeleiden, gebruikt u een fluorescentiemicroscoop en identificeert u de gelabelde gebieden.
  5. Ontleed de fluorescerende gebieden en plaats de weefselfragmenten in de 6-putplaat (1 fragment per put als individuele gemetastaseerde foci moeten worden geanalyseerd of meerdere fragmenten van één orgaan als meerdere metastasen in hetzelfde orgaan moeten worden geanalyseerd). Gebruik steriele scheermesjes om het weefsel zo klein mogelijk in fragmenten te hakken (zonder meer dan 1-2 minuten aan deze stap voor elk monster te besteden).
    OPMERKING: Het beperken van de verwerkingstijd van de tumoren helpt de levensvatbaarheid van de cel te behouden.
  6. Aspirateer en breng de inhoud van elke put over naar een conische buis van 15 ml.
    OPMERKING: Snijd de punt van een pipetpunt van 1.000 μL om de overdracht van grotere fragmenten te vergemakkelijken.
  7. Voeg 1 ml HBSS toe aan de put en zorg ervoor dat de resterende weefselfragmenten / cellen worden overgebracht naar de buis van 15 ml, die een eindvolume van 4 ml zal bevatten. Voeg 50 μL collagenase type I (40 mg/ml) en 12,5 μL DNase I (2.000 eenheden/ml) toe aan elke buis.
  8. Plaats de conische buizen gedurende 45 minuten in een waterbad dat verwarmd is op 37 °C. Draai de conische buizen kort om de 5 minuten.
  9. Prewet een 70 μm zeef met HBSS. Gebruik het afgedekte uiteinde van een gesteriliseerde microcentrifugebuis of het plastic deel van een spuitzuiger en maal de weefselhomogenaten door een zeef van 70 μm in een nieuwe conische buis van 50 ml.
    OPMERKING: Het voorbevochtigen van de zeven met HBSS of FACS-buffer vergemakkelijkt het persen.
  10. Was de zeef met 1 ml HBSS. Prewet een 40 μm zeef met HBSS. Filtreer elk monster opnieuw door een zeef van 40 μm in een nieuwe conische buis van 50 ml. Voeg 1 ml FBS toe aan de zeef van 40 μm om het te wassen. Houd de conische buizen de hele tijd op ijs.
  11. Vul de conische buis tot 50 ml met ijskoude DPBS. Draai de cellen (180 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C). Gooi het supernatant weg en pas op dat u de celkorrel niet verliest.
    OPMERKING: Voor hersenmonsters, resuspend de cellen in 2,5 ml 38% dichtheidsscheidingsoplossing (verdun in HBSS en opslaan bij kamertemperatuur (RT)). Breng over op 5 ml FACS-buizen. Draai gedurende 20 minuten op 800 × g. Snijd de punt van een pipetpunt van 1.000 μL en verwijder de bovenste vetlaag. Laat geen vet achter op de wanden van de buizen. Als er vet overblijft, draai dan opnieuw naar beneden en herhaal het proces. Dit is een cruciale stap. Verwijder de rest van de vloeibare fase (de pellet zal doorschijnend en moeilijk te visualiseren zijn).
  12. Resuspend de cellen in 1 ml rode bloedcel (RBC) lysisbuffer en incubeer gedurende 60 s bij RT. Blus de lysisoplossing door 20 ml DPBS toe te voegen.
  13. Draai de cellen gedurende 10 minuten bij 4 °C op 180 × g . Verwijder het supernatant en resuspend de cellen in 2 ml FACS-buffer (5% FBS in DPBS).
  14. Ga verder met het sorteren van gelabelde cellen en / of bibliotheekvoorbereiding voor bulk- of eencellige RNA-sequencing.
    OPMERKING: Cellen kunnen worden gesponnen, vastgevroren en opgeslagen bij -80 °C voorafgaand aan RNA-isolatie voor bulk RNA-seq.

7. Dierlijke weefselperfusie en voorbereiding voor immunohistologische analyses

  1. Verdoof het dier met een overdosis ketamine (300 mg/kg) en xylazine (30 mg/kg) cocktail door intraperitoneale injectie met een insulinespuit en een naald van 28 G.
  2. Stel het hart bloot door grove dissectie en maak een incisie in het rechteratrium. Houd het hart zachtjes op zijn plaats met een lange, gebogen tang naar voren gericht.
    OPMERKING: Formaline en paraformaldehyde (PFA) zijn kankerverwekkend. Lees het veiligheidsinformatieblad (SDS), vermijd blootstelling aan dampen en draag de juiste PBM's.
  3. Injecteer met een spuit van 10 ml met een naald van 22 G, 22 mm, 10 ml DPBS gevolgd door 10 ml 4% PFA in de linker ventrikel.
  4. Ga verder met het oogsten van de organen en laad ze in vooraf gelabelde histologische cassettes. Plaats de cassettes in een container van de juiste grootte die voldoende fixatief (formaline) bevat om de weefsels te bedekken.
    OPMERKING: Idealiter moet het fixatieve volume 5-10 keer het volume van de weefsels zijn.
  5. Bevestig de organen in de histologische cassettes in 10% formaline gedurende 48-72 uur. Gooi de 10% formaline weg en was de cassettes twee keer met 1x DPBS.
  6. Begin het uitdrogingsproces door de cassettes gedurende 2 uur onder te dompelen in 70% ethanol. Blijf de cassettes achtereenvolgens onderdompelen in toenemende ethanolconcentraties: 80%, 95%, 100% gedurende 1 uur elk. Vervang de 100% oplossing tweemaal na 1,5 uur. Dompel de cassettes gedurende 1,5 uur onder in xyleen en voer drie veranderingen van de oplossing uit.
  7. Sluit de cassettes in paraffine bij 58-60 °C. Sectie de paraffine blokken. Ga verder met hematoxyline en eosine (H & E) orimmunohistochemische kleuring.
  8. Om melanoomcellen te identificeren, gebruikt u een van deze markers of een paneel: S100, Melan-A, HMB-45, Tyrosinase, MITF. Gebruik indien mogelijk Nuclear Mitotic Apparatus Protein (NuMA) kleuring omdat het een zeer specifieke menselijke celmarker is.
    OPMERKING: NuMA-kleuring biedt een scherpe afbakening tussen gastheer (muis) en geënt cellen (menselijk) die helpt bij beeldverwerking en daaropvolgende tumorkwantificeringsfasen.

Figure 2
Figuur 2: Voorbeelden van BLI-, brightfield-, ex vivo fluorescentie- en H&E-kleuringsbeelden die de multipronged benadering illustreren voor de analyse van de effecten van kandidaatgenen bij melanoommetastase. (A) BLI,(B) BF, (C) ex vivo fluorescentie en (D) H&E-kleuringsbeelden. De afbeeldingen die ter illustratie worden gebruikt, komen overeen met een experiment waarbij 131/6-4L melanoomcellen getransduceerd met een niet-targeting control shRNA (shNTC) of een shRNA gericht op FUT8 werden geïnjecteerd in immunodeficiënte (NSG) muizen. FUT8-uitschakeling verminderde de gemetastaseerde verspreiding van melanoomcellen. Schaalbalken en kleurenbalken = p/sec/cm2/sr × 106 (A), 100 mm (B, C), 100 μm (D). Afkortingen: BLI = bioluminescentie beeldvorming; H&E = hematoxyline en eosine; shRNA = kort haarspeld RNA; shNTC = non-targeting controle shRNA; NSG = niet-obese diabetische ernstige gecombineerde immunodeficiëntie gamma; FUT8 = fucosyltransferase 8; BF = helder veld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

8. Nuclear Mitotic Apparatus Protein (NuMA) kleuring (Figuur 3)

  1. Gebruik een anti-NuMA-antilichaam als een zeer mensspecifieke mitotische spindelmarker voor de identificatie en kwantificering van gemetastaseerde belasting in weefselsecties. 8.1. Zeer specifieke en gevoelige identificatie van melanoomcellen wordt bereikt.
  2. Als chromogene immunohistochemie voor NuMA wordt uitgevoerd op een automatisch immunostaining-instrument, volg dan deze stappen zoals beschreven32:
  3. Deparaffiniseer de secties in xyleen en rehydrateer ze in opeenvolgend dalende ethanolconcentraties. Houd de glaasjes gedurende 15 minuten ondergedompeld in xyleen en breng ze nog eens 15 minuten over in 100% ethanol.
    OPMERKING: De rest van de ethanolrehydratatiestappen (95%, 80%, 75%) duren elk 3 tot 5 minuten.
  4. Spoel de glaasjes af in gedeïoniseerd water.
  5. Voer epitoop ophalen uit door de dia's in een container (bijv. Coplin-kleurpot) onder te dompelen in een natriumcitraatbuffer van 10 mM, pH 6,0, in een magnetron van 1200 Watt op 100% vermogen gedurende 10 minuten.
  6. Gebruik ongeconjugeerd, polyklonaal konijn anti-humaan NuMA-antilichaam voor etikettering, verdund 1:7.000 in Tris-Bovine serumalbumine (BSA) (25 mM Tris, 15 mM NaCl, 1% BSA, pH 7,2). Voer de juiste positieve en negatieve controles parallel aan de studiesecties uit.
  7. Incubeer de dia's met het primaire antilichaam gedurende 12 uur. Detecteer het primaire antilichaam met geiten-anti-konijn HRP geconjugeerd multimeer en visualiseer het complex met 3,3-diaminobenzidine en een kopersulfaatversterker.
  8. Was de glaasjes in gedestilleerd water, counterstain met hematoxyline, droog uit en monteer met permanent medium.
    OPMERKING: De uitdrogingsstappen zijn het omgekeerde van de rehydratatiestappen beschreven in stap 8.3. Scan de dia's met de beschikbare scanner met een vergroting van 20x of 40x en upload ze naar een database.
  9. Teken met behulp van software ROI's om alle NuMA-gekleurde cellen in het orgaanweefsel op te nemen, met uitzondering van ander orgaanparenchym en lege ruimtes.
  10. Pas de instellingen aan om de NuMA-positieve en NuMA-negatieve cellen te categoriseren met behulp van de juiste positieve en negatieve controles voor elk orgaan. Gebruik een gevestigd softwarealgoritme om het totale aantal/percentage NuMA-positieve cellen voor elk monster te kwantificeren.

9. Weefselschijf immunofluorescentie

Om het gemetastaseerde stadium te identificeren waarin een bepaald kandidaat-gen nodig is (bijv. Extravasatie versus overleving na zaaien), kan men weefselschijfimmunofluorescentie op verschillende tijdstippen bepalen om tumorcelprogressie te volgen van injectie tot verre orgaaninvasie, zaaien en groei. Deze aanpak maakt het mogelijk om markers voor naburige cellen toe te voegen om de extravasatiegebeurtenis en de omringende micro-omgevingsveranderingen van de tumor vast te leggen33.

  1. Verdoof het dier zoals beschreven in stap 7.1.
  2. Injecteer 100 μg fluorofoor geconjugeerd Lycopersicon Esculentum (Tomaat) Lectine in de linker ventrikel van elk dier, 3 minuten voorafgaand aan de perfusie, om het vasculaire endotheel af te bakenen.
    OPMERKING: Geef de Tomato Lectin de tijd om in het hele systeem te recirculeren.
  3. Perfuseer het dier zoals beschreven in stappen 7.2-7.3. Oogst de organen van belang en breng ze over in vooraf gelabelde containers gevuld met 4% PFA. Fixeer het weefsel gedurende 24 tot 48 uur. Snijd het weefsel met behulp van een vibratome in plakken van 30-50 μm dik.
    OPMERKING: Dikte moet worden geoptimaliseerd. Plakjes tussen 30 μm en 50 μm dikte worden aanbevolen, vooral bij het uitvoeren van z-stack beeldvorming.
  4. Incubeer de plakjes in de blokkerende buffer (10% Normal Goat Serum, 2% BSA, 0,25% Triton X-100 in DPBS) gedurende 2 uur bij RT.
  5. Voer een kleuringsoptimalisatie-experiment uit.
    OPMERKING: Als antigeen ophaaltijd, buffers die worden gebruikt voor het ophalen van antigeen, temperatuur, verschillende antilichamen / verschillende partijen en het type weefsel dat de kleuring beïnvloedt, zijn optimalisatie-experimenten noodzakelijk.
  6. Voeg primaire antilichamen toe bij een geoptimaliseerde verdunning en incubeer gedurende een geoptimaliseerde tijd bij een geoptimaliseerde temperatuur (zie voorbeelden in tabel 1).
    OPMERKING: Gebruik geschikte controles voor primaire/secundaire antilichamen en niet-gekleurde weefselmonsters.
  7. Was de plakjes van het weefsel 3 keer gedurende 5 minuten met 0,25% Triton X-100 in DPBS.
  8. Incubeer de weefselplakken in secundair antilichaam verdund in blokkerende oplossing gedurende de gewenste tijd (tabel 1).
  9. Was de plakjes van het weefsel 3 keer gedurende 5 minuten met 0,25% Triton X-100 in DPBS.
  10. Kleur de kernen met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) verdund 1:1.000 in DPBS of blokkerende buffer gedurende 5 min.
  11. Voeg 2 druppels antifade fluorescentie montagemedium toe aan een coverslip en monteer het weefsel op glazen dia's, zorg ervoor dat de plakjes volledig bedekt zijn door het montagemedium.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen direct op de plakjes zitten, omdat dit de microscopie vervormt.
  12. Leg confocale beelden vast met de beschikbare microscoop met behulp van een 60x olie-onderdompelingsobjectief.
    OPMERKING: Pas bij het verkrijgen van confocale afbeeldingen dezelfde instellingsparameters (spanning, luchtige eenheden en versterking) toe op alle afbeeldingen in het experiment.
  13. Leg niet-confocale beelden vast met de microscoop op 10x, 20x of 40x.
  14. Upload de foto's in een beeldanalysesoftware en analyseer ze door de parameters van keuze te vergelijken (d.w.z. gebied, aantal, intensiteit van markeringen of contact met aangrenzende cellen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De volgende figuren illustreren hoe de beschreven workflow is toegepast voor de identificatie van nieuwe oorzaken van melanoommetastase. Figuur 2 vat de resultaten samen van een gepubliceerde studie waarin de effecten van het uitschakelen van het fucosyltransferase FUT8 bij in vivo melanoommetastase werden bestudeerd26. Kortom, analyse van glycomische gegevens van menselijke patiënten (verkregen door lectine-arrays) en transcriptomische profilering onthulde verhoogde niveaus van alfa-1,6-fucose geassocieerd met progressie van primair naar gemetastaseerd melanoom, consistent met een toename van het overeenkomstige fucosyltransferase (FUT8).

113/6-4L melanoomcellen getransduceerd met lentivirussen met een FUT8-shRNA of de overeenkomstige niet-gerichte controle (shNTC) werden geïntroduceerd door echogeleide intracardiale injectie in immunodeficiënte muizen (NSG), zoals hierboven beschreven (rubriek 2.9). De muizen werden gecontroleerd op gemetastaseerde verspreiding door in vivo BLI. De muizen werden aan het einde van het experiment geëuthanaseerd, de organen werden onderzocht op ex vivo fluorescentie en verwerkt voor histologische analyses. Naast H&E werd NuMA-kleuring uitgevoerd om specifiek menselijke cellen in muizenweefsels te identificeren. Zoals geïllustreerd in figuur 3, werden NuMA-gekleurde secties verwerkt door digitale beeldvorming om de metastatische belasting over meerdere secties en experimentele groepen te kwantificeren. Een vergelijkbare workflow kan worden toegepast om de bijdrage van andere kandidaatgenen aan melanoommetastase te beoordelen.

Figure 3
Figuur 3: NuMA-gekleurde longsecties. (A) Links, representatieve afbeeldingen van NuMA-gekleurde longsecties uit Groep I (melanoomcellen geïnfecteerd met controle lentivirus) en Groep II (melanoomcellen geïnfecteerd met een metastase suppressor-expresserend lentivirus). Schaalbalken = 1.000 μm. Inzetstukken vertonen gemetastaseerde foci (midden) die met behulp van software kunnen worden gekwantificeerd. Rechts, gemetastaseerde melanoomcellen worden groen gelabeld en het orgaangebied wordt afgebakend door een groene gearceerde lijn. NuMA-negatieve cellen hebben het label blauw. Schaalstaven = 100 μm. (B) Voorbeeld van een micrometastase in NuMA-gekleurde longsecties illustreert de gevoeligheid van de software bij het detecteren van een klein aantal cellen. Schaalstaven = 100 μm. Afkorting: NuMA = Nuclear Mitotic Apparatus Protein. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Antistof Fabrikant Catalogus nr. Gastheer soorten Reactiviteit Fluorofoor Verdunning Incubatietijd Incubatietemperatuur
anti-GFP Abcam Ab6556 Konijn Muis ontsmetting 1:1000 24 uur 4°C
anti-GFAP Aves Labs GFAP Kip Muis ontsmetting 1:2000 24 uur 4°C
secundair Invitrogen A11041 Geit Kip A568 1:500 2 uur Kamertemperatuur
secundair Invitrogen A32731 Geit Konijn A488 1:500 2 uur Kamertemperatuur

Tabel 1: Voorbeelden van antilichaam- en incubatieomstandigheden voor immunofluorescentie in de hersenen.

Cellijn Type Tijd tot euthanasie Geslacht van muizen Genetische achtergrond van muizen Wijze van injectie # Geïnjecteerde cellen Plaatsen van metastase
12-273 BM+ Humaan melanoom STC 4-5 weken M NSG Intracardiaal 100K Hersenparenchym, leptomeninges, lever, nieren, bijnieren
131/4-5B1* Menselijk melanoom 4-6 weken M Athymisch naakt of NSG Intracardiaal 50-200K Hersenparenchym, lever, longen
113/6-4l* Menselijk melanoom 5-7 weken M Athymisch naakt of NSG Intracardiaal 50-100K Hersenparenchym (weinig), lever, longen
WM 4265-2** Humaan melanoom STC 11 weken M Athymisch naakt of NSG Intracardiaal 200K Hersenparenchym
WM 4257-1** Humaan melanoom STC 10-13 weken M Athymisch naakt Intracardiaal 100K Hersenparenchym (weinig)
WM 4257-2 ** Humaan melanoom STC 10-13 weken M Athymisch naakt Intracardiaal 100K Hersenparenchym
10-230 BM+ Humaan melanoom STC 8-9 weken M Athymisch naakt Intracardiaal 100K Hersenparenchym, leptomeninges, lever (weinig)

Tabel 2: Uitsplitsing van de resultaten van representatieve in vivo experimenten van verschillende menselijke melanoomcellijnen en kortetermijnculturen volgens het beschreven protocol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het doel van dit technisch rapport is om een gestandaardiseerde, top-to-bottom workflow te bieden voor het onderzoek naar potentiële actoren in melanoommetastase. Omdat in vivo experimenten kostbaar en tijdrovend kunnen zijn, zijn strategieën om de efficiëntie te maximaliseren en de waarde van de verkregen informatie te verhogen van het grootste belang.

Het is absoluut noodzakelijk om overal complementaire benaderingen te gebruiken om bevindingen binnen hetzelfde experiment te crossvalidateren. Bijvoorbeeld, zowel NuMA immunohistochemische kleuring als BLI zijn complementaire methoden voor het kwantificeren van gemetastaseerde belasting omdat geen van beide alomvattend is. Hoewel BLI een onschatbare, niet-invasieve methode is om tumorprogressie in vivo te volgen, zijn deze gegevens inherent van lage resolutie. NuMA-kleuring maakt een nauwgezette analyse van gemetastaseerde belasting in vaste organen mogelijk; uitgebreide sectie door de gehele weefseldikte is echter onpraktisch. Als zodanig kan alleen een monster van elk orgaan worden gekleurd. Inderdaad, in de ervaring van de auteurs zijn BLI-resultaten niet altijd recht evenredig met de tumorbelasting die duidelijk is in histopathologische analyse. Dit is deels te wijten aan de beperkte gevoeligheid van deze methode, met name in de hersenen, vanwege transcraniële verzwakking34. Bovendien kunnen deze gegevens worden beïnvloed door onvolledige opname van luciferine en/of variabele luciferase-expressie. Daarom moet BLI worden geïnterpreteerd in combinatie met ex vivo beeldvorming en histopathologische studies.

Histologische evaluatie van weefselmonsters behandeld met generieke vlekken, zoals H & E, vereist gespecialiseerde anatomopathologietraining, is vaak low-throughput en is gevoelig voor interobservervariaties. De auteurs werken momenteel samen met collega's van de bio-informatica om experimentele data-analyse te standaardiseren en te versnellen door een machine learning-algoritme te ontwikkelen voor geautomatiseerde en betrouwbare kwantificering van gemetastaseerde belasting als een percentage van orgaanweefselsectie in histopathologische afbeeldingen. Deze en andere hulpmiddelen zullen van cruciaal belang zijn voor het veld, vooral omdat de rol van de gemetastaseerde micro-omgeving in beeld komt met een fijnere resolutie (bijvoorbeeld ruimtelijke transcriptomics). Niettemin is deskundige histopathologische evaluatie van het weefsel essentieel, met name bij subtypen van hersenmetastase zoals leptomeningeal, een biologisch verschillend subtype, dat gemakkelijk verkeerd kan worden geïnterpreteerd als parenchymale hersenmetastase via BLI alleen. NuMA-kleuring (sectie 8) versnelt de histopathologische beoordeling van gemetastaseerde belasting, waardoor onbevooroordeelde identificatie en kwantificering van menselijke cellen in muizenorganen mogelijk is. Onderscheid tussen anatomische compartimenten op NuMA-gekleurde secties, zoals het hersenparenchym versus de leptomeninges, is echter van cruciaal belang om verdere biologische inzichten te verkrijgen.

De hierin beschreven technieken kunnen worden gebruikt om de functionele relevantie van genen die van belang zijn voor de melanoom gemetastaseerde cascade te onderzoeken. Het is van cruciaal belang om een model te selecteren met een reproduceerbaar fenotype dat geschikt is voor de studie in kwestie. Een gen dat is geupreguleerd in menselijke patiëntmonsters van metastase kan bijvoorbeeld worden "neergehaald" om te beoordelen of dit de metastatische belasting vermindert in vergelijking met een controlegroep. Deze benadering kan het beste worden uitgevoerd in een modelcellijn of kortetermijncultuur die zowel a) een hoge expressie van het gen van belang heeft als b) een aanzienlijke metastatische belasting genereert met betrouwbare kinetiek wanneer deze in muizen wordt geïnjecteerd, zodat een afname van de metastatische capaciteit merkbaar en toewijsbaar zal zijn aan de genetische verstoring die wordt getest.

Ook cruciaal in experimenteel ontwerp is de geselecteerde injectiemethode die het meest geschikt is voor het stadium van metastase dat wordt onderzocht. Elke fase van de gemetastaseerde cascade presenteert verschillende biologische en fysieke barrières voor melanoomcellen. Onderzoekers die vragen willen beantwoorden over de beginstadia van metastase, namelijk invasie en intravasatie, moeten de in rubriek 2 beschreven technieken gebruiken voor respectievelijk intradermale en subcutane injecties, gevolgd door overlevingschirurgie (rubriek 3). Belangrijk is dat deze procedures het proces nabootsen waarmee primaire melanomen bij mensen worden gereseceerd, waarna een patiënt al dan niet metastase kan vertonen. Hoewel technisch delicater dan subcutane injectie, plant de intradermale route tumorcellen in het anatomische compartiment waar melanomen zich ontwikkelen bij menselijke patiënten. Dit is vooral belangrijk in studies naar immuunsurveillance van melanoom, omdat de huid een uniek ecosysteem heeft van patrouillerende immuunpopulaties35.

Als de hypothese die wordt getest zich echter concentreert op latere stadia van metastase, zoals extravasatie uit de arteriële circulatie, zijn methoden zoals intracardiale, intracarotis en retro-orbitale injectie voordelig. Deze technieken leveren metastase op grotere schaal op in een veel kortere tijdspanne dan die met een "primaire" tumor. Met name voor studies van hersenmetastasen kunnen modellen die betrouwbaar tumoren in het hersenparenchym produceren, moeilijk vast te stellen zijn. In deze gevallen vertegenwoordigen intracarotide en retro-orbitale injectie methoden voor het omzeilen van organen met lagere "toetredingsdrempels", zoals de lever en de nieren, die vroegtijdige sterfte kunnen veroorzaken bij muizen die via de intracardiale route worden geïnjecteerd.

De genetische achtergrond van de muis bij uitstek voor xeno- of allografttransplantatie hangt af van de bron van cellen (mens, muis) en, af en toe, van genetische modificaties van de geïmplanteerde cellen die immuunafstoting kunnen veroorzaken. Experimenten met menselijke xenograftmodellen worden meestal uitgevoerd bij muizen met een verminderd adaptief en aangeboren immuunsysteem, NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) muizen; of muizen zonder adaptieve immuniteit, zoals T-cel-deficiënte athymische / naakte (NU / J) muizen. Een ander immunodeficiënt model dat vaak wordt gebruikt, is het RAG2 knockout (KO) -model, dat B- en T-cellen mist en een functionele natural killer-celpopulatie behoudt. Deze immunodeficiënte muismodellen moeten strategisch worden ingezet, omdat elk voordelen heeft ten koste van enkele nadelen die verband houden met hun intrinsieke immuundeficiënties. In de ervaring van de auteurs vertoont dezelfde cellijn- of patiënt-afgeleide STC verschillend orgaantropisme op basis van de injectieroute (bijv. subcutaan versus intracardiaal) en / of de ontvangende muizenstam (bijv. NSG versus athymisch / naakt) (zie tabel 2).

Om de experimentele variabiliteit met betrekking tot de gastheer waarin melanoomcellen worden geïmplanteerd (bijv. Immuunrespons, microbiota) te verminderen en 'op doel' en reproduceerbare bevindingen te maximaliseren, wordt het volgende aanbevolen: i) het verhogen van het aantal proefdieren per groep (met behulp van vermogensberekeningen om een optimaal aantal te bereiken op basis van de effectgrootte), ii) orthogonale methoden gebruiken om genkandidaten te manipuleren (d.w.z. CRISPR/Cas9, CRISPRi, shRNA) en 'add-back' experimenten (d.w.z. gelijktijdige ectopische expressie van een Cas9- of shRNA-resistent cDNA van het gen van belang). Deze complementaire technieken verminderen de mogelijkheid van off-target effecten en/of biologische en experimentele variatie.

Hoewel dit protocol zeker kan worden toegepast voor hypothesegestuurde validatie van kandidaat-drivers of onderdrukkers van metastase, kunnen deze methoden ook nuttig zijn voor onbevooroordeelde, verkennende studies. Gepoolde CRISPR/cas9, CRISPR-KRAB-dCas9 (CRISPRi) en op shRNA gebaseerde schermen maken het bijvoorbeeld mogelijk om een proces van Darwiniaanse selectie in vivo uit te spelen 36. De conceptuele basis voor dergelijke studies is als volgt: een cel met een uitgeschakeld gen dat essentieel is voor het fenotype van belang (bijv. Tumorgroei) zal sterven of niet prolifereren, zodat de representatie ervan in de gesequencede bibliotheek aan het einde van het experiment ten opzichte van de uitgangswaarde afneemt. De hier beschreven procedures kunnen worden toegepast voor een dergelijke aanpak, met passende optimalisatie 37,38.

Met betrekking tot kandidaat-genselectie kunnen meerdere bronnen worden gedolven. Melanoom patiënt transcriptomics en proteomics datasets zijn openbaar beschikbaar via de NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)39, het European Genome-Phenome Archive40, cBioPortal41 (dat The Cancer Genome Atlas, of TCGA42 host), en andere hosting sites. Heranalyse van ruwe gegevens wordt aanbevolen omdat kwaliteitscontrolemaatregelen sterk kunnen variëren tussen openbare databases, wat van invloed is op de resultaten. Bij het ondervragen van ruwe datasets zijn vragen die geschikt zijn voor kandidaat-genselectie die geschikt zijn voor toepassing op de hier beschreven workflow: welke genen zijn ontregeld in metastatische monsters in vergelijking met primaire melanoommonsters of met melanocytische naevi?; welke genen zijn ontregeld op specifieke plaatsen van metastase?; is de ontregelde expressie van het kandidaat-gen geassocieerd met een verbeterde overleving van de patiënt?; maakt dit gen deel uit van een groter genexpressieprogramma dat over het algemeen ontregeld is?; zijn de interactoren van het genproduct goed gekarakteriseerd of onbekend?; is het genproduct druggable, en zo ja, zijn er doelgerichte hulpmiddelen beschikbaar?; en heel belangrijk, is het gen essentieel voor alle menselijke cellen, of voor veel weefsels, zodanig dat interferentie met zijn activiteit in een klinische omgeving giftig zou kunnen blijken te zijn?

De juiste strategie voor de manipulatie van de genen van belang hangt af van de hypothesen die moeten worden getest. Een gen dat is geupreguleerd in metastase kan bijvoorbeeld worden neergehaald om te beoordelen of de overeenkomstige muizen een verminderde metastatische belasting zouden vertonen in vergelijking met een controlegroep. Deze benadering kan het beste worden uitgevoerd in een modelcellijn of kortetermijncultuur, die zowel: a) hoge expressie van het gen van belang als b) aanzienlijke metastatische belasting genereert wanneer geïnjecteerd in muizen met reproduceerbare kinetiek. Knockdown-benaderingen omvatten shRNA- en CRISPR / Cas9-gebaseerde methoden, die beide kunnen worden ontworpen via lentivirale infectie van melanoomcellen en op een induceerbare of constitutieve manier kunnen worden ingezet. Een van de voordelen van induceerbare expressie (zie pLKO Tet-On in de Tabel van Materialen) is de temporele regulatie van knockdown, die kan worden gebruikt in een in vivo experiment. Zo kunnen induceerbare shRNA's /sgRNA's worden gebruikt om een "therapeutische setting" te modelleren waarin gevestigde tumorcellen worden onderworpen aan een kandidaat-gen knockdown. Blootstelling aan het inducerende agens, bijvoorbeeld doxycycline, kan echter gevolgen hebben voor het gedrag van bepaalde melanoomcellen; als zodanig is de opname van controlecellen getransduceerd met een gecodeerd shRNA die ook deze behandeling ervaren van cruciaal belang.

Terwijl shRNA's vaak een gedeeltelijke knockdown van genexpressie opleveren, bewerken CRISPR / Cas9-gebaseerde systemen een gen op DNA-niveau, waardoor theoretisch een volledige "knock-out" (KO) wordt uitgelokt. Het gebruik ervan heeft zowel voor- als nadelen. Als een gen essentieel is voor de levensvatbaarheid van melanoomcellen, zullen cellen met een volledige KO negatief worden geselecteerd in vitro en later in vivo. Hoewel dit probleem gedeeltelijk kan worden verzacht door eencellige klonen te selecteren, hebben melanoomcellen moeite om uit enkele cellen te groeien, wat resulteert in onvoorspelbare en vaak ongelijksoortige aanpassingen. Er moeten dus meerdere KO-klonen worden getest om te controleren op interklonale fenotypische variaties. Bovendien, in het geval van patiënt-afgeleide STC's, kan het aantal lentivirale infecties waaraan melanoomcellen worden blootgesteld, een grote invloed hebben op in vitro proliferatie en in vivo gemetastaseerd gedrag. Daarom wordt een single-vector, single-infection benadering met Cas9 en een sgRNA (zie lentiCRISPRv2 in de Tabel van Materialen) aanbevolen. Andere systemen maken gebruik van een "recombinase dead" Cas9 om transcriptionele repressie uit te lokken (dCas9-KRAB in de Table of Materials).

Een gain-of-function-benadering kan geschikt zijn als een interessant gen wordt verondersteld een metastasebevorderend gen te zijn. In dit geval is de selectie van een melanoomlijn die weinig metastasen oplevert bij injectie bij muizen en met een lage basale expressie van het gen van belang de sleutel. Overexpressieconstructies (met name die aangedreven door CMV-promotors) leiden vaak tot suprafysiologische expressieniveaus, die proteotoxische stress veroorzaken. Daarom wordt het kiezen van lentivirale vectoren aanbevolen die de fysiologische expressie van het gen van belang mogelijk maken.

Zodra een aanpak is geselecteerd, is het belangrijk om de volgende experimenten uit te voeren voorafgaand aan het engraftment van cellen. Lentivirale infectieprocedures variëren tussen laboratoria en vereisen optimalisatie voor elke cellijn en knockdown-systeem. Universele overwegingen omvatten echter een volledige positieve of negatieve selectie van cellen met gen-knockdown (bijv. FACS / celsortering voor fluorescerende reporters of antibioticaresistentieselectie, indien van toepassing), gevolgd door RT-qPCR en western blot met geschikte controles om reproduceerbare en robuuste knockdown of overexpressie van het gen van belang aan te tonen. Een in vitro proliferatietest moet worden uitgevoerd om te bepalen of interferentie met het interessante gen de levensvatbaarheid van de cel beïnvloedt. Deze stap is belangrijk voor betrouwbare celkarakterisering en voor de juiste interpretatie van in vivo resultaten. Hier is een voorbeeld van een valkuil als de beschreven experimenten niet worden uitgevoerd: als een gen knockdown resulteert in een drastisch proliferatiedefect in vitro, zal dit de interpretatie van verminderde metastatische belasting verstoren, omdat de specifieke bijdrage van dit gen aan de metastatische cascade niet nauwkeurig kan worden beoordeeld. Verschillende modaliteiten van proliferatie-assays omvatten commercieel verkrijgbare kits, live celbeeldvormingssystemen of traditionele op celcultuur gebaseerde assays, bijvoorbeeld kristalviolet, trypan blauwe uitsluiting.

Een van de belangrijkste beperkingen voor dit platform bij het ontdekken van mediatoren in melanoom is dat de voorgestelde workflow alleen tumorcel-intrinsieke genkandidaten onderzoekt, geen genen die tot expressie worden gebracht door de cellen van de omliggende micro-omgeving in verschillende metastatische stadia, die belangrijke modulatoren zijn van tumorcelaanpassing en zaaien van distale organen. Een andere belangrijke factor om te overwegen is differentieel gemetastaseerd gedrag op basis van de engraftmentroute. De interlaboratorium- en interoperatorvariabiliteit die inherent is aan sommige van de gepresenteerde technieken kan worden aangepakt door standaardisatie in het onderzoeksveld van metastase. Momenteel is het meest geschikte protocol voor standaardisatie de intracardiale injectie vanwege de ultrasone geleiding en statische injectieapparaten, die de interoperatorvariabiliteit verminderen. Dit protocol vertegenwoordigt een van de vele stappen in de richting van uniformiteit, reproduceerbaarheid en grondige documentatie van methoden die worden gebruikt in laboratoria die werken aan de identificatie van nieuwe mediatoren van melanoommetastase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Acknowledgments

We bedanken de afdeling Advanced Research Technologies (DART) van NYU Langone Health, en in het bijzonder het Experimental Pathology Research Laboratory, Genome Technology Center, Cytometry and Cell Sorting Laboratory, Pre-Clinical Imaging Core, die gedeeltelijk worden ondersteund door de Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH / NCI 5P30CA016087. We bedanken de NYU Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group (PI: Dr. Iman Osman) voor het bieden van toegang tot patiënt-afgeleide melanoom korte termijn culturen + (10-230BM en 12-273BM), die werden verkregen via IRB-goedgekeurde protocollen (Universal Consent studie #s16-00122 en Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group studie # 10362). We danken Dr. Robert Kerbel (Universiteit van Toronto) voor het leveren van 113/6-4L en 131/4-5B1 melanoomcellijnen* en Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) voor het leveren van WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2 melanoom op korte termijn**. E.H. wordt ondersteund door NIH / NCI R01CA243446, P01CA206980, een American Cancer Society-Melanoma Research Alliance Team Science Award en een NIH Melanoma SPORE (NCI P50 CA225450; PI: I.O.). Figuur 1 is gemaakt met Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#15 Scapel Blade  WPI 500242 For surgical procedures
#3 Scapel Handle WPI 500236 For surgical procedures
1 mL Tuberculin syringe, slip tip  BD 309626 Injections
10 mL syringe, slip tip  BD 301029 Perfusion
10% Formalin Sodium Buffered EK Industries 4499-20L For perfusion/tissue fixative
15 mL Conical Corning  430052 Cell culture
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Falcon 352196 Cell culture
200 Proof Ethanol Deacon Labs 04-355-223 Histology
22G – 22mm needle BD 305156 Perfusion
4-0 Vicryl Suture Ethicon J464G Suture
4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde  EMS 15733-10 For perfusion/tissue fixative
40µm Corning 431750 Tissue processing
5-0 Absorbable Suture  Ethicon 6542000 Closure
50 mL Conical  Corning  430828 Cell culture
50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Falcon 352070 Cell culture
7-0 Silk suture  FST 18020-70 Ligature
70µm Corning 431751 Tissue processing
Anti-fade mounting media   Vector Labs H-1000-10 Immunofluorescence
Approximator applying Forceps, 10cm  WPI 14189 For microsurgical procedures
Avance Bruker 3 HD NMR Console 
Biospec 7030  Bruker 7030 Micro MRI
BSA Bioreg A941 NuMA Staining
Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm  WPI WP5025501 For microsurgical procedures
Coplin Staining Jar Bel-Art  F44208-1000 Histology
DAPI Sigma-Aldrich D9542-1MG Immunofluorescence
dCas9-KRAB Addgene 110820 Genetic manipulation
DNase I NEB M0303L Tissue processing
DPBS Corning 21-030-CM Tissue processing
Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade GEM 62-0167 Tissue processing
Extracellular Matrix Substrate  Corning 354234 Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative 
FBS Cytiva SH30910.03 Cell culture
Fiji Image J Fiji Image J Software Immunofluorescence
Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer  Thermo Fisher A16104 NuMA Staining
Goat Serum Gibco PCN5000 Immunofluorescence
HBSS Corning 21-020-CV Tissue processing
Hematoxylin  Richard-Allan Scientific  7231 Histology
Illumina III  PerkinElmer CLS136334 BLI Instrument
Insulin syringe 28G - 8mm needle BD 329424 Injections
Insulin syringe 31G - 6mm needle  BD 326730 Injections
Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated WPI 504478 For perfusion and surgical procedures
Isoflurane USP Covetrus 11695067772 Anesthesia
Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip WPI WP6570 For microsurgical procedures
Ketamine HCl 100mg/mL Mylan Ind. 1049007 Anesthesia
lentiCRISPRv2 Addgene 98290 Genetic manipulation
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649 Invitrogen L32472 Vascular endothelial cells marker
MEM non-essential amino acids X 100 Corning 25-025-CI Cell culture
Metzenbaum Scissors WPI 503269 For surgical procedures
Microinjection Unit KOPF 5000 Intracardiac injections
NaCl Fisher S25877  NuMA Staining
Needle 30G x 25mm BD 305128 Intracardiac Injection
Needle 33G x 15mm Hamilton 7747-01 Intracarotid Injection
Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws WPI 14137-G For microsurgical procedures
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice The Jackson Laboratory 005557 Murine model
NU/J mice The Jackson Laboratory 002019 Murine model
Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human  Abcam 97585 NuMA Staining
Penicillin-Streptomycin 10000U/mL Gibco 15140122 Cell culture
Percoll GE 0891-01 density separation solution 
PI Classic Surgical Gloves Cardinal Health 2D72PT75X Surgery
pLKO Tet-On Addgene 21915 Genetic manipulation
Povidone-Iodine 10% Solution Medline MDS093943 Surgery
Proparacaine Drops 0.5% Akorn Pharma AX0501 Opthalmic local anesthetic
Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment Dechra 83592 Anesthesia
Razor Blade Double Edge Blades  EMS 72000 Shaving and Vibrotome Brain Slicing 
Reflex 9mm EZ Clip  Braintree EZC- KIT Wound closure
RPMI 1640  Corning 10-040-CM Cell culture
Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades WPI 501235 For microsurgical procedures
Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome Leica VT1200 Brain Slice Immunofluorescence
Single Channel Anesthesia Vaporizer System Kent Scientific VetFlo-1210S  Anesthesia
Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower EZ Systems TT4000 CO2 Euthanasia
Sterile Fenestrated Disposable Drape Medline NON21002 Surgery
Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves Medline DYNJP2715 Surgery
T25 Flask Corning  430639 Cell culture
Tris Corning 46-031-CM NuMA Staining
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML Immunofluorescence
Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform WPI WP505210 For microsurgical procedures
Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg WPI 15911 For microsurgical procedures
Visiopharm Visiopharm Visiopharm NuMA Staining Quantification Software
Xylasine 100mg/mL Akorn Pharma 59399-111-50 Anesthesia
Xylene Fisher X3P-1GAL Histology

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J. Metastatic pathways in patients with cutaneous melanoma. Pigment Cell Melanoma Research. 30 (1), 13-27 (2017).
  3. Platz, A., Egyhazi, S., Ringborg, U., Hansson, J. Human cutaneous melanoma; a review of NRAS and BRAF mutation frequencies in relation to histogenetic subclass and body site. Molecular Oncology. 1 (4), 395-405 (2008).
  4. Alonso, S. R., et al. A high-throughput study in melanoma identifies epithelial-mesenchymal transition as a major determinant of metastasis. Cancer Research. 67 (7), 3450-3460 (2007).
  5. Rowe, C. J., Khosrotehrani, K. Clinical and biological determinants of melanoma progression: Should all be considered for clinical management. Australasian Journal of Dermatology. 57 (3), 175-181 (2016).
  6. Plebanek, M. P., et al. Pre-metastatic cancer exosomes induce immune surveillance by patrolling monocytes at the metastatic niche. Nature Communications. 8 (1), 1319 (2017).
  7. Orgaz, J. L., et al. Loss of pigment epithelium-derived factor enables migration, invasion and metastatic spread of human melanoma. Oncogene. 28 (47), 4147-4161 (2009).
  8. Ladhani, O., Sanchez-Martinez, C., Orgaz, J. L., Jimenez, B., Volpert, O. V. Pigment epithelium-derived factor blocks tumor extravasation by suppressing amoeboid morphology and mesenchymal proteolysis. Neoplasia. 13 (7), 633-642 (2011).
  9. Ju, R. J., Stehbens, S. J., Haass, N. K. The role of melanoma cell-stroma interaction in cell motility, invasion, and metastasis. Frontiers in Medicine - Dermatology. 5, 307 (2018).
  10. Wiley, H. E., Gonzalez, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
  11. Meier, F., et al. Metastatic pathways and time courses in the orderly progression of cutaneous melanoma. British Journal of Dermatology. 147 (1), 62-70 (2002).
  12. Turner, N., Ware, O., Bosenberg, M. Genetics of metastasis: melanoma and other cancers. Clinical & Experimental Metastasis. 35 (5-6), 379-391 (2018).
  13. Ubellacker, J. M., et al. Lymph protects metastasizing melanoma cells from ferroptosis. Nature. 585 (7823), 113-118 (2020).
  14. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  15. Cunningham, C. C., et al. Actin-binding protein requirement for cortical stability and efficient locomotion. Science. 255 (5042), 325-327 (1992).
  16. Unger, C., et al. Modeling human carcinomas: physiologically relevant 3D models to improve anti-cancer drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 50-67 (2014).
  17. Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
  18. Nakamura, K., et al. Characterization of mouse melanoma cell lines by their mortal malignancy using an experimental metastatic model. Life Science. 70 (7), 791-798 (2002).
  19. Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
  20. Koya, R. C., et al. BRAF inhibitor vemurafenib improves the antitumor activity of adoptive cell immunotherapy. Cancer Research. 72 (16), 3928-3937 (2012).
  21. Jenkins, M. H. Multiple murine BRaf(V600E) melanoma cell lines with sensitivity to PLX4032. Pigment Cell Melanoma Research. 27 (3), 495-501 (2014).
  22. Tuncer, E., et al. SMAD signaling promotes melanoma metastasis independently of phenotype switching. The Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2702-2716 (2019).
  23. Schwartz, H., et al. Incipient Melanoma Brain Metastases Instigate Astrogliosis and Neuroinflammation. Cancer Research. 76 (15), 4359-4371 (2016).
  24. Perez-Guijarro, E., et al. Multimodel preclinical platform predicts clinical response of melanoma to immunotherapy. Nature Medicine. 26 (5), 781-791 (2020).
  25. Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
  26. Agrawal, P., et al. A systems biology approach identifies FUT8 as a driver of melanoma metastasis. Cell. 31 (6), 804-819 (2017).
  27. Hanniford, D., et al. Epigenetic silencing of CDR1as drives IGF2BP3-mediated melanoma invasion and metastasis. Cancer Cell. 37 (1), 55-70 (2020).
  28. Kim, H., et al. PRMT5 control of cGAS/STING and NLRC5 pathways defines melanoma response to antitumor immunity. Science Translational Medicine. 12 (551), (2020).
  29. de Miera, E. V., Friedman, E. B., Greenwald, H. S., Perle, M. A., Osman, I. Development of five new melanoma low passage cell lines representing the clinical and genetic profile of their tumors of origin. Pigment Cell Melanoma Research. 25 (3), 395-397 (2012).
  30. Morsi, A., et al. Development and characterization of a clinically relevant mouse model of melanoma brain metastasis. Pigment Cell Melanoma Research. 26 (5), 743-745 (2013).
  31. Huynh, C., et al. Efficient in vivo microRNA targeting of liver metastasis. Oncogene. 30 (12), 1481-1488 (2011).
  32. Zou, C., et al. Experimental variables that affect human hepatocyte AAV transduction in liver chimeric mice. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 18, 189-198 (2020).
  33. Kleffman, K., et al. Melanoma-secreted Amyloid Beta Suppresses Neuroinflammation and Promotes Brain Metastasis. bioRxiv. , 854885 (2019).
  34. Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging and Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
  35. Sil, P., Wong, S. W., Martinez, J. More than skin deep: autophagy is vital for skin barrier function. Frontiers in Immunology. 9, 1376 (2018).
  36. Chen, S., et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis. Cell. 160 (6), 1246-1260 (2015).
  37. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  38. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  39. Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Research. 30 (1), 207-210 (2002).
  40. Lappalainen, I., et al. The European Genome-phenome Archive of human data consented for biomedical research. Nature Genetics. 47 (7), 692-695 (2015).
  41. Cerami, E., et al. The cBio cancer genomics portal: an open platform for exploring multidimensional cancer genomics data. Cancer Discovery. 2 (5), 401-404 (2012).
  42. Grossman, R. L., et al. Toward a shared vision for cancer genomic data. New England Journal of Medicine. 375 (12), 1109-1112 (2016).

Tags

Kankeronderzoek Nummer 181
Een robuust ontdekkingsplatform voor de identificatie van nieuwe mediatoren van melanoommetastase
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shadaloey, A. A. S., Karz, A.,… More

Shadaloey, A. A. S., Karz, A., Moubarak, R. S., Agrawal, P., Levinson, G., Kleffman, K., Aristizabal, O., Osman, I., Wadghiri, Y. Z., Hernando, E. A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis. J. Vis. Exp. (181), e63186, doi:10.3791/63186 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter