Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

In vivo Billeddannelse af biologisk væv med kombineret to-fotonfluorescens og stimuleret Raman-spredningsmikroskopi

Published: December 20, 2021 doi: 10.3791/63411
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4, 5
1Department of Electronic and Computer Engineering, The Hong Kong University of Science and Technology, 2State Key Laboratory of Molecular Neuroscience, The Hong Kong University of Science and Technology, 3Center of Systems Biology and Human Health, The Hong Kong University of Science and Technology, 4Molecular Neuroscience Center, The Hong Kong University of Science and Technology, 5Department of Biology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology

Summary

Stimuleret Raman scattering (SRS) mikroskopi tillader etiketfri billeddannelse af biomolekyler baseret på deres iboende vibration af specifikke kemiske bindinger. I denne protokol beskrives den instrumentelle opsætning af et integreret SRS og to-fotonfluorescensmikroskop for at visualisere cellulære strukturer i rygmarven hos levende mus.

Abstract

Stimuleret Raman scattering (SRS) mikroskopi muliggør etiketfri billeddannelse af det biologiske væv i dets naturlige mikromiljø baseret på iboende molekylær vibration, hvilket giver et perfekt værktøj til in vivo-undersøgelse af biologiske processer ved subcellulær opløsning. Ved at integrere to-foton ophidset fluorescens (TPEF) billeddannelse i SRS-mikroskopet kan den dobbeltmodale in vivo-billeddannelse af væv erhverve kritisk biokemisk og biofysisk information fra flere perspektiver, som hjælper med at forstå de dynamiske processer, der er involveret i cellulær metabolisme, immunrespons og vævsombygning osv. I denne videoprotokol introduceres opsætningen af et TPEF-SRS-mikroskopsystem samt in vivo-billeddannelsesmetoden for dyrets rygmarv. Rygmarven, som en del af centralnervesystemet, spiller en kritisk rolle i kommunikationen mellem hjernen og det perifere nervesystem. Myelinskede, der er rigelig i phospholipider, omgiver og isolerer axonen for at tillade saltholdig ledning af aktionspotentialer. In vivo-billeddannelse af myelinskeder i rygmarven er vigtig for at studere progressionen af neurodegenerative sygdomme og rygmarvsskade. Protokollen beskriver også dyrepræparationer og in vivo TPEF-SRS-billeddannelsesmetoder til at erhverve biologiske billeder i høj opløsning.

Introduction

Ramanmikroskopi1,2 fremstår som en kraftfuld etiketfri metode til at afbilde biologisk væv baseret på de karakteristiske frekvenser af forskellige kemiske bindinger i biomolekyler. På grund af sin ikke-invasive og veladaptive billeddannelsesevne er Raman-mikroskopi i vid udstrækning blevet anvendt til billeddannelse af lipidberigede komponenter i biologiske væv som myelinskede3,4,5, adipocytter6,7 og lipiddråber8,9,10 . Stimuleret Raman scattering (SRS) signal erhvervet som stimuleret Raman gain (SRG) eller stimuleret Raman tab (SRL) er baggrundsfrit, hvilket viser perfekt spektral lighed med spontan Raman spredning11,12. Derudover er SRL og SRG lineært afhængige af analytkoncentrationen, hvilket muliggør kvantitativ analyse af biokemiske komponenter9,11,13. To-foton ophidset fluorescensmikroskopi (TPEF) er blevet anvendt i vid udstrækning til in vivo biologisk billeddannelse på grund af dets iboende optiske sektioneringsevne, dybe penetrationsdybde og lave fototoksicitet14,15,16. Udførelsen af TPEF-billeddannelse afhænger imidlertid af egenskaberne ved fluorescerende tags, og antallet af opløselige farver er begrænset på grund af bredbåndsfluorescensspektrene8,17,18,19. Etiketfri SRS-billeddannelse og fluorescensbaseret TPEF-billeddannelse er to komplementære billeddannelsesmetoder, og deres kombination kan give rigelig biofysisk og biokemisk information om væv. Disse to billeddannelsesmetoder er begge baseret på de ikke-lineære optiske (NLO) processer, som muliggør enkel integration i et mikroskopsystem. Kombinationen af SRS- og TPEF-billeddannelsen, den såkaldte dual-modal imaging, muliggør højdimensionel billeddannelse og profilering af celler og væv, hvilket letter en omfattende forståelse af komplekse biologiske systemer. Specifikt kan picosekund (ps) SRS-mikroskopi opnå kemisk bindingsbilleddannelse med høj spektral opløsning sammenlignet med femtosekund (fs) SRS-teknik11, hvilket gør det muligt at differentiere flere biokemiske komponenter i biologisk væv, især i det overfyldte fingeraftryksområde20,21. Sammenlignet med et andet almindeligt anvendt dobbeltmodalt NLO-mikroskopsystem med integration af sammenhængende anti-Stokes scattering (CARS) mikroskop viser SRS desuden overlegen ydeevne i forhold til CARS med hensyn til spektral- og billedfortolkning samt detektionsfølsomhed11. SRS-TPEF-mikroskopet er blevet brugt som et kraftfuldt værktøj til at studere forskellige biologiske systemer, såsom Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis tadpole brain5, musehjerne23,24, rygmarv25,26, perifer nerve27 og fedtvæv7 osv.

Rygmarven udgør sammen med hjernen centralnervesystemet (CNS). Visualisering af cellulære aktiviteter i CNS in vivo under fysiologiske og patologiske tilstande er afgørende for at forstå mekanismerne for CNS-lidelser28,29,30 og for at udvikle tilsvarende terapier31,32,33. Myelinskede, der ombryder og isolerer axoner til højhastighedsvirkende potentiel ledning, spiller en væsentlig rolle i udviklingen af CNS. Demyelination betragtes som et kendetegn ved hvide substansforstyrrelser, såsom multipel sklerose34. Efter rygmarvsskade35 kan myelinaffald desuden modulere makrofagaktivering, hvilket bidrager til kronisk inflammation og sekundær skade36. Derfor er in vivo-billeddannelse af myelinskede sammen med neuroner og gliaceller i levende musemodeller til stor hjælp til at forstå de dynamiske processer i CNS-lidelser.

I denne protokol beskrives de grundlæggende opsætningsprocedurer for et hjemmebygget TPEF-SRS-mikroskop, og de dobbeltmodale in vivo-billeddannelsesmetoder til musens rygmarv introduceres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg, der udføres i dette arbejde, udføres i overensstemmelse med retningslinjerne fra Laboratory Animal Facility ved Hong Kong University of Science and Technology (HKUST) og er godkendt af HKUST's dyreetiske komité. Sikkerhedstræning i laserhåndtering er nødvendig for at opsætte og betjene TPEF-SRS-mikroskopet. Brug altid lasersikkerhedsbriller med passende bølgelængdeområde, når du beskæftiger dig med laser.

1. Opsætning af TPEF-SRS-mikroskopet (for opsætning skematisk se figur 1)

  1. Brug en integreret optisk parametrisk oscillator (OPO) forbundet med en tilstandslåst Ytterbium-fiberlaser som ps-laserkilde til SRS-billeddannelse.
    BEMÆRK: OPO udsender en Stokes-stråle (1031 nm) og en pumpestråle (justerbar fra 780 nm til 960 nm) med 2 ps pulsvarighed og 80 MHz gentagelseshastighed. Stokes-strålen moduleres ved 20 MHz af en indbygget elektrooptisk modulator (EOM) til højfrekvent fasefølsom SRS-detektion på MHz-niveau.
  2. Brug en fs titanium (Ti): safirlaser som laserkilde til TPEF-billeddannelse.
  3. Brug et par linser (L1 og L2) til at kollimatere og justere størrelsen på fs-strålen til 3 mm.
  4. Brug et par linser (L3 og L4) til at kolliere ps-laserstrålen og udvide dens diameter til 3 mm.
  5. Skift polariseringen af fs-laserstrålen fra p-polarisering til s polarisering ved hjælp af en halvbølgeplade.
  6. Kombiner de to laserstråler med en polariserende strålesplitter (PBS).
  7. Tilføj et par 3 mm XY-scan galvanometerspejle bag PBS til strålescanning.
  8. Brug et telecentrisk scanningsobjektiv (L5) og et uendeligt korrigeret rørobjektiv (L6) til at konjugere scanningsspejlet og den bageste pupil på objektivobjektivet 25x. Udvid laserstrålen med scanningsobjektivet og rørlinsen for at fylde målets bageste blænde.
  9. Anbring et PBS- eller dikroisk spejl (D2) mellem rørlinsen og objektivlinsen til SRS- eller fluorescenssignalopsamling. Brug en motoriseret flipper til at skifte mellem PBS og D2.
    BEMÆRK: En del af det tilbagespredte SRS-signal går tabt, når det passerer gennem PBS som følge af dets tilfældigt forskudte polarisering.
  10. Brug et par objektiver (L7 og L9) til at indsnævre detektionsstrålen og konjugere den bageste pupil på objektivobjektivet 25x med en fotodiodesensor.
  11. Brug et par objektiver (L8 og L10) til at indsnævre detektionsstrålen og konjugere den bageste pupil af 25x-målet med detektionsoverfladen på fotomultiplikatoren (PMT).
  12. Brug et dikroisk spejl (D3) til at adskille detektionsvejen for fluorescens- og SRS-signaler.
  13. Placer et filtersæt (Fs1) foran fotodiodedetektoren for at blokere Stokes-laseren og kun passere pumpestrålen.
  14. Anbring et filtersæt (Fs2) foran PMT-detektoren for kun at passere målfluorescenssignalet.
  15. Tilslut PMT til en strømforstærker for signalforstærkning.
  16. Tilslut fotodioden til en låseforstærker.
  17. Tilslut synkroniseringssignalet fra den indbyggede EOM-udgang til referenceindgangen på lock-in-forstærkeren til SRS-signaldemodulation.
  18. Tilslut PMT-forstærkeren og fastlåsningsforstærkerens udgange til dataindsamlingsmodulet.

2. KALIBRERING AF TPEF-SRS-MIKROSKOPSYSTEM

  1. Opstart af laserne
    1. Skift nøglekontakten fra standby til tændt position for at tænde Ti: safirlaseren, og vent i 30 minutter på, at laseren varmer op.
    2. Tænd for OPO'en ved at klikke på Start-knappen på OPO-kontrolpanelet, og vent i 20 minutter på, at laseren varmer op.
    3. Når ps-laseren er varmet op, skal du bruge en højhastighedsfotodetektor til at kontrollere modulationsdybden af Stokes-strålen. Åbn laserlukkeren til Stokes-strålen. Klik på feltet Indstil OPO-strøm, og indtast 20. Placer højhastighedsfotodetektoren ved OPO-udgangen for at detektere strålen. Tilslut fotodetektorens udgangsport til indgangsporten på et oscilloskop ved hjælp af et koaksialkabel med Bayonet Neill-Concelman (BNC) -stik for at overvåge laserpulsen.
    4. Åbn EOM Control-vinduet i OPO-kontrolsoftwaren. Juster EOM-effekten og -fasen i henhold til pulsintensitetsdiagrammet vist på oscilloskopet for at opnå maksimal moduleringsdybde ved 20 MHz.
      BEMÆRK: EOM-ydeevnen er normalt stabil og skal kun kontrolleres, når SRS-signalet findes signifikant reduceret.
  2. Optisk justering af det kombinerede TPEF-SRS-mikroskop
    1. Udfør optisk justering for colokalisering af ps- og fs-strålerne som beskrevet i trin 2.2.2 til 2.2.13.
    2. Åbn pumpens laserlukker, mens du stopper Stokes-udgangen i OPO-styringssoftwaren. Brug OPO-styringssoftware til at indstille pumpestrålens bølgelængde til 796 nm ved at klikke på feltet Indstil signal og indtaste bølgelængdeværdien 796. Klik på feltet Indstil OPO-effekt, og indtast 20 for at indstille dens effekt til minimum (~ 20 mW) til optisk justering.
    3. Tænd mikroskopcomputeren og alle tilknyttede elektroniske komponenter, herunder scannere, objektive aktuatorer, fotodioder, PMT'er, strømforstærkere, låseforstærkere og motoriserede flippers. Start mikroskopstyringssoftwaren.
      BEMÆRK: Mikroskopstyringssoftwaren er en hjemmelavet grænseflade.
    4. Anbring to justeringsplader (P1 og P2 i figur 1) på den optiske vej. Placer P1 bag PBS i en afstand af ca. 10 cm og placer P2 bag P1 i en afstand af ca. 30 cm.
      BEMÆRK: Ps- og fs-bjælkerne kombineres ved hjælp af en PBS (figur 1). De to justeringsplader bruges til at kontrollere justeringen samt colokaliseringen af de to laserstråler.
    5. Åbn mikroskoplukkeren til ps-laserstrålen.
    6. Juster spejlet M1 for at lokalisere ps-laserstrålecentret ved det gennemgående hul i P1. Brug et infrarødt (IR) omfang til at observere strålepunktets position ved P1, når du justerer spejlet M1.
    7. Juster spejlet M2 for at lokalisere ps-laserstrålecentret ved det gennemgående hul i P2. Brug IR-omfanget til at observere strålepunktets position ved P2, når du justerer spejlet M2.
    8. Gentag trin 2.2.6 og 2.2.7, indtil ps-strålecentret lokaliserer sig ved det gennemgående hul på begge justeringsplader. Luk lukkeren på ps-strålen i mikroskopstyringssoftwaren.
    9. Indstil bølgelængden af fs Ti: safirlaser til 740 nm, og åbn laserlukkeren. Indstil lasereffekten til 5 mW (målt ved mikroskopsystemets indgangsport) for optisk justering.
    10. Åbn mikroskoplukkeren til fs-laserstrålen.
    11. Juster spejlet M3 for at lokalisere fs-laserstrålens spotcenter ved det gennemgående hul på P1.
    12. Juster spejlet M4 for at lokalisere laserstrålens spotcenter ved det gennemgående hul på P2.
    13. Gentag trin 2.2.11 og 2.2.12, indtil fs-laserstrålecentret lokaliserer ved gennemgående huller i to justeringsplader. Luk mikroskoplukkeren for fs-strålen.
    14. Udfør rumlig overlapning af pumpen og Stokes-bjælkerne som beskrevet i trin 2.2.15 til 2.2.18.
      BEMÆRK: Selvom pumpen og Stokes-strålerne er nogenlunde overlappende inde i ps-laseren, er det nødvendigt at finjustere positionerne for de to laserstråler for at opnå optimal SRS-ydeevne. Da pumpestrålen først er justeret som tidligere beskrevet, justeres Stokes-strålen derefter for at colokalisere med pumpestrålen.
    15. Placer et kamera på målets position for at visualisere placeringen af to strålepunkter. Marker pumpestrålens position på kameraskærmen som reference.
    16. Anbring en justeringsplade P0 før L3 (figur 1). Brug en hex-tast til at justere det optiske spejl 1 (OM1), så Stokes-strålecentret passerer justeringspladens gennemgående hul og colokaliseres med pumpestrålen ved laserudgangsporten. Brug IR-omfanget til at bekræfte strålepunktets position ved P0 under justering.
      BEMÆRK: OM1 og OM2 er to spejle i OPO-hovedet for at justere positionen af 1031 nm Stokes-strålen.
    17. Fjern justeringspladen P0, og brug hex-tasten til at justere OM2, så midten af Stokes-strålen colokaliseres med referencemærket for pumpestrålen på kameraet.
    18. Gentag trin 2.2.16 og 2.2.17, indtil Stokes-strålen nøje overlapper med pumpestrålen på både P0- og kameraplaner.
      BEMÆRK: Når du visualiserer strålepletterne på kameraet, skal alle justeringspladerne fjernes fra den optiske sti.
  3. Optimer billedbehandlingsforhold
    1. Udfør fasejustering af indlåsningsforstærkeren som beskrevet i trin 2.3.2. til 2.3.7.
      BEMÆRK: SRS-detektion er baseret på et højfrekvent fasefølsomt skema. Til SRL-detektion moduleres intensiteten af Stokes-strålen ved 20 MHz, og en lock-in-forstærker bruges til at demodulere signalet. Fasen og forskydningen af indlåsningsforstærkeren skal justeres for at opnå den optimale billedkontrast.
    2. Åbn låseforstærkerens styringssoftware.
    3. Indstil pumpelaserens bølgelængde til 796 nm, og pumpens og Stokes-strålens effekt til at være henholdsvis 15 mW og 25 mW på prøven.
      BEMÆRK: Brug her olivenolie til SRS-billeddannelsesoptimering og kalibrering. Raman-toppen af olivenolie i kulstof-hydrogenområdet er på 2863,5 cm-1, svarende til pumpestrålens bølgelængde ved 796 nm.
    4. Forsegl olivenolien i et dias, og fastgør et foldet silkepapir til bunden af diaset for at forbedre signalets backscattering til epi-SRS-detektion. Anbring olivenolieprøven på scenen, og juster fokus for 25x-målet på prøven.
    5. Brug mikroskopstyringssoftwaren til at indstille billedbehandlingsparametrene som følger: 512 x 512 pixels for 500 μm x 500 μm synsfelt (FOV), 6,4 μs pixel opholdstid. Brug låseforstærkerstyringssoftwaren til at indstille den konstante tidsværdi til at være 10 μs, hvilket er tæt på pixelopvaringstiden.
    6. Scan laserstrålen over prøven. Brug den fastlåste forstærkerstyringssoftware til at indstille fasen (0-180°) med en trinstørrelse på 22,5°, indtil SRS-signalintensiteten når det maksimale.
      BEMÆRK: I denne helt analoge lock-in-forstærker er signaludgangen in-phase-komponenten, som er afhængig af referencesignalets fase. Fasen kan justeres af lock-in forstærkerstyringssoftwaren med 11 ° opløsning, hvilket gør det muligt at maksimere det detekterede signal til inden for ~ 2% 12. Låseforstærkeren kommer ud af fase, når synkroniseringssignalet er afbrudt. Fasen skal justeres igen, hver gang synkroniseringssignalet genoprettes.
    7. Scan prøven med laserlukkeren lukket. Brug fastlåsningsforstærkerstyringssoftwaren til at indstille forskydningsværdien med en trinstørrelse på 1 mV, indtil det gennemsnitlige SRS-signal er tæt på nul.
      BEMÆRK: Det gennemsnitlige SRS-signal estimeres som den gennemsnitlige intensitet af alle pixels i SRS-billedet, som beregnes automatisk af mikroskopstyringssoftwaren. Forskydninger er nyttige til annullering af uønskede fasesammenslytnende signaler.
    8. Udfør optimering af tidsmæssig synkronisering som beskrevet i trin 2.3.9 til 2.3.14.
    9. Åbn dialogboksen Delay Manager (figur 2) i OPO-styringssoftwaren.
    10. Scan olivenolien, og indstil forsinkelsestrinnet, indtil olivenolie SRS-signalet når sit maksimum.
      BEMÆRK: For første gang af SRS-billeddannelse, når fasen af lock-in-forstærkeren ikke er optimeret, justeres den tidsmæssige synkronisering først groft for at visualisere SRS-signalet fra prøven, inden fasen af lock-in-forstærkeren optimeres.
    11. Stop scanningen, og klik på knappen Tilføj data i dialogboksen forsinkelseshåndtering for at registrere de aktuelle forsinkelsesdata.
    12. Gentag trin 2.3. 10 og 2.3.11 for forskellige kemiske prøver ved forskellige bølgelængder.
      BEMÆRK: Polystyrenperler, tungt vand, 5-Ethynyl-2′-deoxyuridin, glycerol bruges til at måle forsinkelsesdataene ved forskellige vibrationsbånd.
    13. Vælg Data Fit og Order 5 i dialogen delay manager, så de passer til de aktuelle datapunkter med den femte ordens polynomiske funktion. Anvend de monterede data ved at klikke på knappen Brug som brugerdefineret og markere afkrydsningsfeltet. Forsinkelsestrinnet justeres automatisk ved forskellige bølgelængder i henhold til den monterede forsinkelseskurve.
    14. Gem alle forsinkelsesdata i en tekstfil, som kan indlæses til fremtidig brug.

3. Kirurgisk forberedelse af mus til in vivo fluorescens og SRS-billeddannelse

  1. Steriliser alle nødvendige værktøjer, herunder skalpeller, fjedersaks, tang, dæksler og gasbind.
  2. Desinficer alle overflader, som ville blive rørt under operationen med 70% ethanol. Dæk bordpladens arbejdsområde med sterile gardiner. Sæt en varmepude under draperingen.
  3. Brug Thy1-YFP-H (Tg(Thy1-YFP)HJrs/J)37 transgene mus, der udtrykker forbedret gult fluorescensprotein (EYFP) i dorsale rodganglion afferente neuroner til in vivo rygmarvsbilleddannelse. Musen vejes og induceres anæstesi ved intraperitoneal (i.p.) injektion af ketamin-xylazinblandingen (87,5 mg kg-1 og 12,5 mg kg-1).
  4. Klem musens tå for at sikre dyb anæstesi. Suppler med halvdelen af den oprindelige dosis af bedøvelsesmidlerne, hvis det er nødvendigt. Påfør salve på musens øjne for at forhindre hornhindetørhed.
  5. Barber håret på ryggen over brystryggen, og fjern derefter håret helt ved hjælp af depilerende creme. Desinficere det barberede område med jodopløsning.
  6. Lav et lille midterlinjesnit (~ 1,5 cm) af huden over T11-T13 hvirvlen med en skalpel.
  7. Snit muskler og sener både ovenpå og på siderne af T11-T13 hvirvlen med fjedersaks og tang. Udsæt de tre tilstødende hvirvler. Brug sterile gasbind og sterilt saltvand til at kontrollere blødning og rense det kirurgiske sted.
  8. Stabiliser rygsøjlen ved hjælp af de to sidestænger i rustfrit stål på et specialdesignet stabiliseringstrin (figur 2B).
  9. Brug en # 2 tang til at udføre en laminektomi ved T12. Brug forsigtigt tangen til at bryde lamina stykke for stykke, indtil hele laminaen i T12-hvirvlen er fjernet.
  10. Vask blodet væk over rygmarven med sterilt saltvand og brug gasbindet til at absorbere overdreven væske. Påfør tryk på blødningsstedet med et stykke gasbind for at kontrollere blødningen.
  11. Placer et dækslip (22 x 22 mm) på spændestangen, og fyld mellemrummet mellem dækslippet og rygmarven med saltvand.

4. In vivo TPEF-SRS-billeddannelse af musens rygmarv

  1. Monter stabiliseringstrinnet på et femakset trin under TPEF-SRS-mikroskopet.
    BEMÆRK: Det femaksede trin tillader treakset oversættelse og ±5 ° tonehøjde og rullebøjningsbevægelse.
  2. Fastgør musehovedet med to hovedstænger, og sænk holdepladen for at give plads nok til brystbevægelse under vejrtrækning, hvilket lindrer bevægelsesartefakter.
  3. Indsæt en varmepude under musen for at holde musen varm under billeddannelsen.
  4. Juster z translationel fase for at indstille fokus, indtil lysfeltbilledet af rygmarvsvaskulatur kan observeres under et 10x mål.
  5. Find rygmarven dorsal vene i midten af FOV ved at indstille det toaksede translationelle stadium af det femaksede stadium.
  6. Indstil rulle- og stigningsvinklerne på det femaksede trin for at justere rygmarvens dorsale overflade vinkelret på målaksen baseret på lysfeltbilledet.
  7. Udskift 10x med et 25x vandnedsænkningsmål til TPEF-SRS-billeddannelse.
  8. Indstil bølgelængden af fs-strålen til 920 nm. Indstil fs-strålens effekt til at være 10 mW på prøven.
  9. Indstil pumpestrålens bølgelængde til 796 nm. Indstil effekten af pumpen og Stokes-strålen til at være henholdsvis 60 mW og 75 mW på prøven.
    BEMÆRK: Rygmarvs-SRS-billeddannelse udføres ved bølgetallet 2863,5 cm-1, hvilket svarer til Raman-toppen af myelinskeder i carbon-hydrogenområdet baseret på de målte SRS-spektre7,9. Lasereffekten er bestemt til at sikre TPEF-SRS-billeddannelse af rygmarven i høj opløsning. Vævsskade observeres ikke under de nuværende billeddannelsesforhold.
  10. For SRS-billeddannelse skal du vælge PBS over målet ved hjælp af en motoriseret flipper ved at trykke på Switch-knappen , der er tilsluttet den motoriserede flipper.
  11. Indstil billedbehandlingsparametrene som følger: 512 x 512 pixels for 150 μm x 150 μm FOV, 3,2 μs pixel dvæletid, 2 μs tidskonstant.
  12. Begynd at scanne prøven og indstil fokus på rygmarvens dorsale overflade.
  13. Finjuster forsinkelsestrinnet af OPO-kontrolsoftwaren, indtil der opnås maksimalt rygmarvs-SRS-signal.
    BEMÆRK: Biologiske prøver kan fremkalde ekstra kromatisk dispersion, forsinkelsestrinnet kan kræve at blive justeret for at optimere den tidsmæssige synkronisering. Men når SRS-billeddannelse udføres nær vævets øverste overflade, er den tidsmæssige forskel mellem de to laserpulser, der indføres af det biologiske væv og billeddannelsesvinduet, normalt lille (mindre end flere hundrede fs).
  14. Til TPEF-billeddannelse skal du vælge dikroisk spejl D2 over målet ved hjælp af en motoriseret flipper ved at trykke på Switch-knappen , der er tilsluttet den motoriserede flipper.
  15. Indstil billedbehandlingsparametrene, og begynd at scanne prøven. For at fange TPEF-SRS-billedstakken skal du hente TPEF- og SRS-billederne sekventielt med et interval på 1 s i samme dybde, før du går til den næste dybde. Billeddannelsesparametrene til TPEF-billeddannelse er 512 x 512 pixels, 150 μm x 150 μm FOV, 3,2 μs pixel dvæletid.
  16. Fjern dyret fra stabiliseringstrinnet, når alle billeder er indsamlet.
  17. Rengør det udsatte væv ved at skylle saltvand og absorbere overskydende væske ved hjælp af en gasbind. Påfør silikonegel på den udsatte rygmarv og vent i ~ 5 minutter, indtil den bliver helbredt.
  18. Sutur huden med # 6-0 kirurgisk sutur for at lukke såret. Påfør forbrændingscreme på huden på det kirurgiske sted for at forhindre infektion. Administrere smertestillende behandling subkutant (0,1 mg/kg buprenorphin).
  19. Placer dyret i et rent bur og læg buret på en varmepude, indtil musen fuldt ud kommer sig efter anæstesi.
  20. Gentag smertestillende administration hver 12. time i 3 dage efter operationen.
  21. Luk lukkeren på OPO og fs laser. Indstil pumpens og Stokes-strålens effekt til det maksimale.
    BEMÆRK: Indstilling af maksimal effekt, før laseren slukkes, er gavnlig for laservedligeholdelse.
  22. Indstil bølgelængden af pumpestrålen og fs-laseren til 800 nm.
  23. Sæt de to lasere på standby, luk al elektronikstyringssoftwaren, og sluk for alt det tilknyttede udstyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In vivo dual-modal billeddannelse af spinal axoner såvel som myelinskeder udføres ved hjælp af Thy1-YFPH transgene mus, som udtrykker EYFP i dorsale rodganglion afferente neuroner (figur 3). Disse mærkede afferente neuroner videresender den sensoriske information fra den perifere nerve til rygmarven, med den centrale gren placeret i rygmarven dorsal søjle. Med TPEF-SRS-mikroskopet kan tæt distribueret myelinskede tydeligt visualiseres ved hjælp af etiketfri SRS-billeddannelse, og sparsomt mærkede YFP-axoner kan observeres ved hjælp af TPEF-billeddannelse. Det afsløres af den dobbelte modelbilleddannelse, at axoner er tæt indpakket af et tykt lag myelinskeder (figur 3C). Noder af Ranvier (NR), hvor axolemmaet er blottet for myelinskeden, spiller en væsentlig rolle i den hurtige saltatoriske udbredelse af aktionspotentialer. Som det kan ses på TPEF-SRS rygmarvsbilledet (figur 3C), viser NR nedsat aksonal diameter og axolemma direkte udsat for den ekstracellulære matrix. Det er vigtigt at afbilde axonerne sammen med de omgivende myelinskeder for at bekræfte eksistensen og placeringen af NR. Derfor giver TPEF-SRS-mikroskopi os mulighed for at observere de dynamiske ændringer af axoner og myelinskeder i udviklingen af rygmarvsforstyrrelser, hvilket er vigtigt for at forstå mekanismerne for cellulær dynamik.

Figure 1
Figur 1: Det skematiske diagram over TPEF-SRS-mikroskopsystemet. Pumpen og Stokes-strålerne kombineres med et dikroisk spejl (D1) i picosekundlaseren (ps). Ps-strålen og femtosekundstrålen (fs) kollimeres og udvides/indsnævres af et par linser (henholdsvis L3, L4 og L1, L2) for at matche 3 mm XY-scan galvanometerspejlene. Fs-strålen drejes fra vandret til lodret polarisering af en halvbølgeplade (HWP) og kombineres derefter med ps-strålen af en polariserende strålesplitter (PBS). Scanningsspejlene og den bageste pupil på objektivlinsen konjugeres af et telecentrisk scanningsobjektiv L5 og et uendeligt korrigeret rørobjektiv L6. Laserstrålen udvides af scannings- og rørlinsen for at fylde bagblænden på 25x målet. For stimuleret Raman scattering (SRS) billeddannelse reflekteres den backscattered pumpestråle, der opsamles af målet, af en PBS og ledes til et stort område (10 mm x 10 mm) siliciumfotodiode (PD). Til to-foton-billeddannelse reflekteres tpef-signalet (two-photon excited fluorescence) af en dikroisk strålesplitter D2 til fotosektionsenheden. Et aktuelt fotomultiplikatormodul (PMT) bruges til at detektere TPEF-signalet. Forkortelser-L1-L10: linser; OL: objektiv linse; D1-D3: dikroiske spejle; Fs1, Fs2: filtersæt; M: spejle; OM1, OM2: optiske spejle; P0-P2: justeringsplader. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Grænsefladen til forsinkelsesadministratoren på OPO-kontrolsoftwaren. Den røde pil angiver afkrydsningsfeltet for anvendelse af de kalibrerede forsinkelsesdata. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: In vivo TPEF-SRS-billeddannelse af musens rygmarv. (A) Skematisk diagram over den kirurgiske forberedelse af musens rygmarv og det lyse feltbillede af rygmarven. (B) Musemonteringsskema til in vivo-billeddannelse af rygmarven. (C) Maksimale z-projektionsbilleder af axoner og myelinskeder i musens rygmarv. Hvide pilespidser angiver placeringen af en knude af Ranvier. SRS-billeder af myelin er taget ved Raman-skiftet på 2863,5 cm-1. Figur A blev oprettet ved hjælp af BioRender (https://biorender.com/).  Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol beskrives den grundlæggende opsætning af TPEF-SRS-mikroskopet detaljeret. Til SRS-billeddannelse overlappes pumpen og Stokes-strålerne tidsmæssigt og rumligt inde i OPO'en. Denne overlapning kan dog forstyrres efter at have passeret mikroskopsystemet. Derfor er både rumlig og tidsmæssig optimering af colokaliseringen af pumpen og Stokes-bjælkerne nødvendig og kritisk for at opnå optimal SRS-billeddannelse. Den tidsmæssige forsinkelse mellem pumpen og Stokes-strålen er relateret til den optiske stiforskel mellem de to stråler, som bestemmes af spredningen af optiske elementer i mikroskopsystemet38. Når pumpestrålens bølgelængde indstilles til SRS-billeddannelse ved forskellige Raman-skift, ændres pumpestrålens optiske banelængde tilsvarende, fordi brydningsindekset for de optiske linser er afhængigt af bølgelængden38. Derfor ændres den tidsmæssige forsinkelse mellem pumpen og Stokes laserpuls med bølgelængden af pumpestrålen og skal derfor kalibreres. OPO er udstyret med en softwarestyret forsinkelseslinje til tidsmæssig synkronisering af pumpen og Stokes-strålen. For den samme optiske opsætning forbliver forsinkelsesdataene stabile og skal kun kalibreres én gang. Som følge heraf kan forsinkelsesdataene ved forskellige bølgelængder af pumpestrålen gemmes ved den første måling til fremtidig brug. De kalibrerede forsinkelsesdata kan anvendes automatisk af OPO-styringssoftwaren, når pumpestrålens bølgelængde ændres, hvilket er praktisk til SRS-billeddannelse ved forskellige Raman-skift eller hyperspektral SRS-billeddannelse. For TPEF-SRS-billeddannelse er streng rumlig overlapning af ps- og fs-bjælkerne efter kombinationen et kritisk skridt for at undgå FOV-skift mellem de to billedmodeller. For det første er ps-pumpestrålen og fs-strålen justeret for at sikre, at de begge er på mikroskopsystemets optiske akse, hvilket er afgørende for at undgå fOV-skift, når de to billedmodeller skiftes. Derefter justeres Stokes-strålepositionen ved hjælp af pumpestrålen som reference i overensstemmelse hermed for at opnå streng rumlig colokalisering. Hver justeringsprocedure kræver flere forsøg for at nå det optimale.

Hvis SRS-signalet falder betydeligt, skal faseværdien af fastlåsningsforstærkeren og tidsforsinkelsesdataene kontrolleres først. Da lock-in-forstærkeren kommer ud af fase, når synkroniseringssignalet er afbrudt, kræver faseværdien justering hver gang, efter at strømforsyningen eller EOM-synkroniseringssignalet er afbrudt. Den tidsmæssige synkronisering af pumpen og Stokes-strålen kan hurtigt kontrolleres ved let at justere forsinkelseslinjen inde i OPO'en. Hvis de kalibrerede tidsforsinkelsesdata er langt væk fra den optimale værdi, skal der udføres en nulscanning for at kalibrere forsinkelsesforskydningen igen ved at klikke på knappen Nul scanning i dialogen om forsinkelsesstyring. Hele nulscanningsproceduren tager cirka 10 minutter. Hvis SRS-signalet ikke genoprettes efter optimering af fase- og tidsforsinkelsesværdien, skal EOM-moduleringen af Stokes-strålen kontrolleres som beskrevet i trin 2.1.3-2.1.4. Hvis udryddelsesforholdet er langt mindre end 10 dB med observation af små pulstoppe i Stokes-pulstogets slukket position, skal EOM genstartes, og moduleringskraften og fasen skal justeres for at opnå maksimal moduleringsdybde. Normalt kan moduleringsproblemet løses ved at nulstille EOM. Hvis ikke, bør der kræves teknisk support fra fabrikanten.

Til in vivo-billeddannelse af tykt væv skal epi-SRS-detektionstilstand anvendes. I denne protokol bruges en PBS til at passere excitationslaseren og reflektere det tilbagespredte SRS-signal til detektoren. Det detekterede SRL-signal er afhængigt af tilbagespredning af den fremadgående pumpestråle af væv. Excitationslaserne har lineær polarisation og kan fuldt ud passere gennem PBS, mens den tilbagespredte stråle har forskudt polarisering og dermed kun delvist kan reflekteres af PBS. Derfor viser det nuværende signalindsamlingsskema lavere effektivitet sammenlignet med den strategi, der direkte placerer en ringformet fotodetektor foran målet12. På grund af den stærke spredning af det lipidrige væv39 kan SRS-billeder med højt signal-støj-forhold (512 x 512 pixels) af rygmarven ikke desto mindre erhverves med 1-2 s integrationstid, hvilket gør dette PBS-baserede indsamlingsskema til en passende tilgang til rygmarvsbilleddannelse. På den anden side begrænser den stærke vævsspredning imidlertid lysindtrængningsdybden. For både SRS- og TPEF-billeddannelse er billeddannelsesdybden for rygmarven begrænset til ca. 50 μm.

Den sekventielle billeddannelsesprocedure for SRS- og TPEF-billeddannelse er den største begrænsning af den nuværende dobbeltmodale billeddannelsesmetode. I protokollen udføres TPEF- og SRS-billeddannelse på samme sted sekventielt med et interval på 1 s ved automatisk at skifte den motoriserede flipper. Bevægelsesartefakter kan forårsage en ufuldkommen sammensmeltning af TPEF- og SRS-billederne, hvilket begrænser denne metodes evne til at afbilde meget dynamiske processer eller væv, der i vid udstrækning påvirkes af dyrs åndedræt og hjerteslag. En mulig løsning er at indsamle den ps-laser-ophidsede to-fotonfluorescens samtidigt under SRS-billeddannelse9. Denne metode gælder dog kun for de biologiske strukturer med stærke fluorescenssignaler, da ps-pulsen har en meget lavere fluorescensexcitationseffektivitet sammenlignet med fs-pulsen14. Alternativt kan problemet løses ved hjælp af et fs-SRS-system22,40, hvor fs-laserkilden tillader samtidig excitation af SRS- og TPEF-signalerne effektivt på bekostning af lav spektral opløsning af SRS-billeddannelsen. En anden løsning er at bruge den ps-laser-ophidsede fluorescens opnået under SRS-billeddannelse som reference til registrering af fs-fluorescensbillederne. Som vist i figur 3 fungerer denne registreringsstrategi godt, hvis der ikke forekommer nogen signifikant bevægelse under SRS- og fluorescensbilleddannelsen.

SRS udviser unikke fordele inden for biologisk billeddannelse, da det giver kemisk information om biomolekyler baseret på dets specifikke etiketfri kontrastmekanisme41. Sammenlignet med CARS, som også er blevet kombineret med TPEF til multimodal NLO-billeddannelse, viste SRS bedre spektral- og billedfortolkningsevne11. Derfor er det blevet anvendt i vid udstrækning til billeddannelse af lipid9,11, protein42,43, DNA44 og bioortogonale komponenter indeholdende alkyn (C ≡ C)13,45, carbon-deuterium (C-D)9,46 og oxygen-deuterium (O-D) bindinger47,48 i biologiske væv. I denne protokol brugte vi en ps-laserkilde til SRS-billeddannelse og en fs-laserkilde til TPEF-billeddannelse, som kombinerer fordelene ved effektiv fluorescensexcitation og høj Raman-spektralopløsning, hvilket muliggør effektiv differentiering af forskellige biomolekyler42,44. I rygmarven bidrager komplekse cellemikromiljøinteraktioner, der involverer gliaceller, neuroner og rekrutterede immunceller, til udviklingen af skade49 og sygdomme50. Kombineret med forskellige fluorescens- og SRS-billeddannelsessonder kan TPEF-SRS-mikroskopi opnå samtidig billeddannelse af forskellige cellulære strukturer såvel som deres forskellige biomolekylekomponenter, hvilket kan lette vores forståelse af begyndelsen og udviklingen af rygmarvssygdomme betydeligt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre og har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Hong Kong Research Grants Council gennem tilskud 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, Innovation and Technology Commission (ITCPD/17-9), Area of Excellence Scheme fra University Grants Committee (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) og Hong Kong University of Science & Technology (HKUST) gennem tilskud RPC10EG33.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#2 Forceps Dumont 11223-20 For laminectomy
10X objective Nikon CFI Plan Apo Lambda 10X
25X objective Olympus XLPLN25XSVMP2
Burn cream Betadine
Camera Sony α6300
Current amplifier Stanford research SR570
Current photomultiplier modules Hamamatsu H11461-01
D2 665 nm long-pass dichroic mirror Semrock FF665-Di02-25x36 For directing epi-fluorescence signal to the detection module
D3 700 nm short-pass dichroic mirror Edmund 69-206 For separating SRS from TPEF detection path
Depilating cream Veet
FS1 975 nm short-pass filter Edmund 86-108 For blocking stokes beam
FS1 Bandpass filter Semrock FF01-850/310 For blocking stokes beam
Fs2 Bandpass filter Semrock FF01-525/50 For selecting YFP signal
Fs2 Shortpass filter Semrock FF01-715/SP-25 For blocking fs excitation laser beam
Half-wave plate Thorlabs SAHWP05M-1700
High-speed photodetector MenloSystems FPD 310-F For checking Stokes beam modulation
Iodine Betadine
IR Scope FJW FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X
Iris Thorlabs CPA1
L1 Thorlabs AC254-060-B-ML
L10 Thorlabs LA4052-A
L2 Thorlabs LA1422-B
L3 Thorlabs AC254-050-B
L4 Thorlabs AC254-060-B-ML
L7 f=100 mm, AB coating
L8 Thorlabs LA4874-A
L9 Thorlabs AC254-035-B-ML
Lock-in amplifier APE
Mirror Thorlabs PF10-03-P01
Motorized flipper Thorlabs MFF101/M
multifunctional acquisition card National Instrument PCIe-6363
Oscilloscope Tektronix TDS2012C
Photodiode APE For detecting SRS signal
Picosecond laser source APE picoEmerald
Polarizing beam splitter Thorlabs CCM1-PBS252/M
Power meter Newport 843-R
Saline Braun
Scan lens L5 Thorlabs SL50-CLS2
Scanning mirror Cambridge Technology 6215H
Silicone gel World Precision Inc. KWIK-SIL
Ti:sapphire fs laser Coherent Chameleon Ultra II
Tube lens L6 Thorlabs TTL200-S8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raman, C. V., Krishnan, K. S. The optical analogue of the compton effect. Nature. 121 (3053), 711 (1928).
  2. Turrell, G., Corset, J. Raman Microscopy: Developments and Applications. , Academic Press. (1996).
  3. Tian, F., et al. Monitoring peripheral nerve degeneration in ALS by label-free stimulated Raman scattering imaging. Nature Communications. 7 (1), 13283 (2016).
  4. Shi, Y., et al. Longitudinal in vivo coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of demyelination and remyelination in injured spinal cord. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106012 (2011).
  5. Hu, C. R., Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -X., Hu, B. Label-free real-time imaging of myelination in the Xenopus laevis tadpole by in vivo Stimulated Raman Scattering Microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (8), 086005 (2014).
  6. Den Broeder, M. J., et al. Altered adipogenesis in Zebrafish larvae following high fat diet and chemical exposure is visualised by Stimulated Raman Scattering Microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 894 (2017).
  7. He, S., et al. In vivo metabolic imaging and monitoring of brown and beige fat. Journal of Biophotonics. 11 (8), (2018).
  8. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
  9. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  10. Zhang, C., Li, J., Lan, L., Cheng, J. -X. Quantification of lipid metabolism in living cells through the dynamics of lipid droplets measured by Stimulated Raman Scattering Imaging. Analytical Chemistry. 89 (8), 4502-4507 (2017).
  11. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  12. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  13. Li, X., Jiang, M., Lam, J. W. Y., Tang, B. Z., Qu, J. Y. Mitochondrial imaging with combined fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy using a probe of the aggregation-induced emission characteristic. Journal of the American Chemical Society. 139 (47), 17022-17030 (2017).
  14. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  15. Pawlicki, M., Collins, H. A., Denning, R. G., Anderson, H. L. Two-photon absorption and the design of two-photon dyes. Angewandte Chemie International Edition. 48 (18), 3244-3266 (2009).
  16. König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200 (2), 83-104 (2000).
  17. Dean, K. M., Palmer, A. E. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging. Nature Chemical Biology. 10 (7), 512-523 (2014).
  18. Tsurui, H., et al. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  19. Niehörster, T., et al. Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy. Nature Methods. 13 (3), 257-262 (2016).
  20. Zhang, X., et al. Label-free live cell imaging of nucleic acids using Stimulated Raman Scattering (SRS) Microscopy. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (4), 1054-1059 (2012).
  21. Ji, M., et al. Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer's disease with stimulated Raman scattering microscopy. Science Advances. 4 (11), 7715 (2018).
  22. Li, X., et al. Integrated femtosecond stimulated Raman scattering and two-photon fluorescence imaging of subcellular lipid and vesicular structures. Journal of Biomedical Optics. 20 (11), 110501 (2015).
  23. Imitola, J., et al. Multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy reveals microglia-associated myelin and axonal dysfunction in multiple sclerosis-like lesions in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 021109 (2011).
  24. Uckermann, O., et al. Label-free multiphoton microscopy reveals altered tissue architecture in hippocampal sclerosis. Epilepsia. 58 (1), 1-5 (2017).
  25. Tamosaityte, S., et al. Inflammation-related alterations of lipids after spinal cord injury revealed by Raman spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), 061008 (2016).
  26. Uckermann, O., et al. Endogenous two-photon excited fluorescence provides label-free visualization of the inflammatory response in the rodent spinal cord. BioMed Research International. 2015, 859084 (2015).
  27. van Hameren, G., et al. In vivo real-time dynamics of ATP and ROS production in axonal mitochondria show decoupling in mouse models of peripheral neuropathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 1-16 (2019).
  28. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3 (1), 1-15 (2012).
  29. Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
  30. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
  31. Lau, S. -F., et al. IL-33-PU.1 transcriptome reprogramming drives functional state transition and clearance activity of microglia in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 31 (3), 107530 (2020).
  32. Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Scientific Reports. 5, 9691 (2015).
  33. Yang, Z., Xie, W., Ju, F., Khan, A., Zhang, S. In vivo two-photon imaging reveals a role of progesterone in reducing axonal dieback after spinal cord injury in mice. Neuropharmacology. 116, 30-37 (2017).
  34. Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
  35. Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. Journal of Comparative Neurology. 486 (4), 373-383 (2005).
  36. Kopper, T. J., Gensel, J. C. Myelin as an inflammatory mediator: Myelin interactions with complement, macrophages, and microglia in spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 96 (6), 969-977 (2018).
  37. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  38. Pedrotti, F. L., Pedrotti, L. M., Pedrotti, L. S. Introduction to Optics. , Higher Education from Cambridge University Press. (2017).
  39. Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), 37-61 (2013).
  40. Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -X. Highly sensitive vibrational imaging by Femtosecond Pulse Stimulated Raman Loss. The Journal of Physical Chemistry Letters. 2 (11), 1248-1253 (2011).
  41. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  42. Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  43. Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging. Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
  44. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  45. Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an Alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
  46. van Manen, H. -J., Lenferink, A., Otto, C. Noninvasive imaging of protein metabolic labeling in single human cells using stable isotopes and Raman Microscopy. Analytical Chemistry. 80 (24), 9576-9582 (2008).
  47. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  48. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  49. Ahuja, C. S., et al. Traumatic spinal cord injury. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), 1-21 (2017).
  50. Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936 (2018).

Tags

Bioengineering udgave 178
<em>In vivo</em> Billeddannelse af biologisk væv med kombineret to-fotonfluorescens og stimuleret Raman-spredningsmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S.… More

Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S. In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (178), e63411, doi:10.3791/63411 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter