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Bioengineering

विवो में संयुक्त दो फोटॉन प्रतिदीप्ति और उत्तेजित रमन प्रकीर्णन माइक्रोस्कोपी के साथ जैविक ऊतकों की इमेजिंग

Published: December 20, 2021 doi: 10.3791/63411
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4, 5
1Department of Electronic and Computer Engineering, The Hong Kong University of Science and Technology, 2State Key Laboratory of Molecular Neuroscience, The Hong Kong University of Science and Technology, 3Center of Systems Biology and Human Health, The Hong Kong University of Science and Technology, 4Molecular Neuroscience Center, The Hong Kong University of Science and Technology, 5Department of Biology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology

Summary

उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी विशिष्ट रासायनिक बांडों के अपने आंतरिक कंपन के आधार पर बायोमोलेक्यूल्स के लेबल-मुक्त इमेजिंग की अनुमति देती है। इस प्रोटोकॉल में, एक एकीकृत एसआरएस और दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के वाद्य सेटअप को जीवित चूहों की रीढ़ की हड्डी में सेलुलर संरचनाओं की कल्पना करने के लिए वर्णित किया गया है।

Abstract

उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी आंतरिक आणविक कंपन के आधार पर अपने प्राकृतिक माइक्रोएन्वायरमेंट में जैविक ऊतकों के लेबल-मुक्त इमेजिंग को सक्षम बनाता है, इस प्रकार उपकोशिकीय संकल्प पर जैविक प्रक्रियाओं के विवो अध्ययन के लिए एक आदर्श उपकरण प्रदान करता है। एसआरएस माइक्रोस्कोप में दो-फोटॉन उत्तेजित प्रतिदीप्ति (टीपीईएफ) इमेजिंग को एकीकृत करके, ऊतकों के विवो इमेजिंग में दोहरी-मोडल कई दृष्टिकोणों से महत्वपूर्ण जैव रासायनिक और बायोफिजिकल जानकारी प्राप्त कर सकती है जो सेलुलर चयापचय, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और ऊतक रीमॉडलिंग, आदि में शामिल गतिशील प्रक्रियाओं को समझने में मदद करती है। इस वीडियो प्रोटोकॉल में, एक TPEF-SRS माइक्रोस्कोप सिस्टम के सेटअप के साथ-साथ पशु रीढ़ की हड्डी की इन विवो इमेजिंग विधि पेश की जाती है। रीढ़ की हड्डी, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के हिस्से के रूप में, मस्तिष्क और परिधीय तंत्रिका तंत्र के बीच संचार में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। माइलिन म्यान, फॉस्फोलिपिड्स में प्रचुर मात्रा में, अक्षतंतु को चारों ओर से घेरता है और कार्रवाई क्षमता के नमकीन चालन की अनुमति देने के लिए इन्सुलेट करता है। रीढ़ की हड्डी में माइलिन म्यान के विवो इमेजिंग में न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों और रीढ़ की हड्डी की चोट की प्रगति का अध्ययन करना महत्वपूर्ण है। प्रोटोकॉल पशु तैयारी और विवो TPEF-SRS इमेजिंग विधियों में उच्च रिज़ॉल्यूशन जैविक छवियों को प्राप्त करने के लिए भी वर्णन करता है।

Introduction

रमन माइक्रोस्कोपी 1,2 बायोमोलेक्यूल्स में विभिन्न रासायनिक बांडों की विशेषता आवृत्तियों के आधार पर जैविक ऊतकों की छवि के लिए एक शक्तिशाली लेबल-मुक्त विधि के रूप में उभर रहा है। अपनी गैर-इनवेसिव और अच्छी तरह से अनुकूली इमेजिंग क्षमता के कारण, रमन माइक्रोस्कोपी का व्यापक रूप से जैविक ऊतकों में लिपिड-समृद्ध घटकों जैसे माइलिन म्यान 3,4,5, एडिपोसाइट्स 6,7, और लिपिड ड्रॉपलेट्स 8,9,10 में इमेजिंग लिपिड-समृद्ध घटकों के लिए उपयोग किया गया है। . उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) सिग्नल प्रेरित रमन लाभ (एसआरजी) या उत्तेजित रमन हानि (एसआरएल) के रूप में अधिग्रहित पृष्ठभूमि-मुक्त है, जो सहज रमन प्रकीर्णन 11,12 के लिए सही वर्णक्रमीय समानता दिखाता है। इसके अलावा, एसआरएल और एसआरजी रैखिक रूप से विश्लेषक एकाग्रता पर निर्भर हैं, जो जैव रासायनिक घटकों के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं9,11,13। दो फोटॉन उत्तेजित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TPEF) व्यापक रूप से अपनी अंतर्निहित ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमता, गहरी पैठ गहराई, और कम phototoxicity14,15,16 के कारण विवो जैविक इमेजिंग में के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, TPEF इमेजिंग का प्रदर्शन फ्लोरोसेंट टैग की विशेषताओं पर निर्भर करता है, और ब्रॉडबैंड प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा 8,17,18,19 के कारण समाधान योग्य रंगों की संख्या सीमित है। लेबल-मुक्त एसआरएस इमेजिंग और प्रतिदीप्ति-आधारित टीपीईएफ इमेजिंग दो पूरक इमेजिंग तरीके हैं, और उनका संयोजन ऊतकों की प्रचुर मात्रा में बायोफिजिकल और जैव रासायनिक जानकारी प्रदान कर सकता है। ये दो इमेजिंग तौर-तरीके दोनों नॉनलाइनर ऑप्टिकल (एनएलओ) प्रक्रियाओं पर आधारित हैं, जो एक माइक्रोस्कोप सिस्टम में सरल एकीकरण की अनुमति देता है। एसआरएस और टीपीईएफ इमेजिंग का संयोजन, तथाकथित दोहरी-मोडल इमेजिंग, उच्च आयामी इमेजिंग और कोशिकाओं और ऊतकों की प्रोफाइलिंग को सक्षम बनाता है, जिससे जटिल जैविक प्रणालियों की व्यापक समझ की सुविधा मिलती है। विशेष रूप से, पिकोसेकंड (पीएस) एसआरएस माइक्रोस्कोपी फेम्टोसेकंड (एफएस) एसआरएस तकनीक 11 की तुलना में उच्च वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन के साथ रासायनिक-बॉन्ड इमेजिंग प्राप्त कर सकती है, जिससे जैविक ऊतक में कई जैव रासायनिक घटकों को अलग करने की अनुमति मिलती है, विशेष रूप से भीड़ भरे फिंगरप्रिंट क्षेत्र में 20,21। इसके अलावा, सुसंगत विरोधी स्टोक्स प्रकीर्णन (CARS) माइक्रोस्कोप के एकीकरण के साथ एक और आमतौर पर इस्तेमाल किया दोहरी मोडल NLO माइक्रोस्कोप प्रणाली के साथ तुलना में, SRS वर्णक्रमीय और छवि व्याख्या के साथ-साथ पता लगाने संवेदनशीलता 11 के मामले में CARS के लिए बेहतर प्रदर्शन दिखाता है। एसआरएस-टीपीईएफ माइक्रोस्कोप का उपयोग विभिन्न जैविक प्रणालियों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में किया गया है, जैसे कि केनोरहाबडिटिस एलिगेंस 9,22, ज़ेनोफस लेविस टैडपोल ब्रेन 5, माउस ब्रेन 23,24, रीढ़ की हड्डी 25,26, परिधीय तंत्रिका 27, और वसा ऊतक 7, आदि।

मस्तिष्क के साथ रीढ़ की हड्डी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) बनाती है। शारीरिक और रोग संबंधी स्थितियों के तहत विवो में सीएनएस में सेलुलर गतिविधियों को विज़ुअलाइज़ करना सीएनएस विकार28,29,30 के तंत्र को समझने और संबंधित उपचारों को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है31,32,33। माइलिन म्यान, जो उच्च गति की कार्रवाई संभावित चालन के लिए अक्षतंतुओं को लपेटता है और इन्सुलेट करता है, सीएनएस के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। Demyelination को सफेद पदार्थ विकारों में एक हॉलमार्क के रूप में माना जाता है, जैसे कि मल्टीपल स्केलेरोसिस 34। इसके अलावा, रीढ़ की हड्डी की चोट 35 के बाद, माइलिन मलबे मैक्रोफेज सक्रियण को संशोधित कर सकते हैं, पुरानी सूजन और माध्यमिक चोट 36 में योगदान कर सकते हैं। इसलिए, जीवित माउस मॉडल में न्यूरॉन्स और ग्लियाल कोशिकाओं के साथ माइलिन म्यान के विवो इमेजिंग में सीएनएस विकारों में गतिशील प्रक्रियाओं को समझने में बहुत मदद मिलती है।

इस प्रोटोकॉल में, घर-निर्मित TPEF-SRS माइक्रोस्कोप की मौलिक सेटअप प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है और माउस रीढ़ की हड्डी के लिए विवो इमेजिंग विधियों में दोहरे-मोडल को पेश किया जाता है।

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Protocol

इस काम में की गई सभी पशु प्रक्रियाओं को हांगकांग यूनिवर्सिटी ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी (HKUST) की प्रयोगशाला पशु सुविधा के दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया जाता है और HKUST की पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है। TPEF-SRS माइक्रोस्कोप स्थापित करने और संचालित करने के लिए लेजर हैंडलिंग के लिए सुरक्षा प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। लेजर से निपटने के दौरान हमेशा उचित तरंग दैर्ध्य सीमा के साथ लेजर सुरक्षा चश्मे पहनें।

1. TPEF-SRS माइक्रोस्कोप का सेटअप (सेटअप योजनाबद्ध के लिए चित्रा 1 देखें)

  1. एसआरएस इमेजिंग के लिए पीएस लेजर स्रोत के रूप में एक मोड-लॉक Ytterbium फाइबर लेजर के साथ जुड़े एक एकीकृत ऑप्टिकल पैरामीट्रिक थरथरानवाला (OPO) का उपयोग करें।
    नोट: OPO आउटपुट एक स्टोक्स बीम (1031 एनएम) और एक पंप बीम (780 एनएम से 960 एनएम तक tunable) 2 ps पल्स अवधि और 80 मेगाहर्ट्ज पुनरावृत्ति दर के साथ। स्टोक्स बीम को मेगाहर्ट्ज स्तर पर उच्च-आवृत्ति चरण-संवेदनशील एसआरएस का पता लगाने के लिए एक अंतर्निहित इलेक्ट्रो-ऑप्टिकल मॉड्यूलेटर (ईओएम) द्वारा 20 मेगाहर्ट्ज पर संशोधित किया जाता है।
  2. एक एफएस टाइटेनियम (टीआई) का उपयोग करें: नीलम लेजर TPEF इमेजिंग के लिए लेजर स्रोत के रूप में।
  3. लेंस की एक जोड़ी का उपयोग करें (L1 और L2) collimate और 3 मिमी करने के लिए fs बीम के आकार को समायोजित करने के लिए।
  4. पीएस लेजर बीम को कॉलिमेट करने और इसके व्यास को 3 मिमी तक विस्तारित करने के लिए लेंस (एल 3 और एल 4) की एक जोड़ी का उपयोग करें।
  5. एक आधा लहर प्लेट का उपयोग कर ध्रुवीकरण करने के लिए पी ध्रुवीकरण से एफएस लेजर बीम के ध्रुवीकरण को बदलें।
  6. एक polarizing बीम विभाजक (PBS) के साथ दो लेजर बीम गठबंधन.
  7. बीम स्कैनिंग के लिए पीबीएस के पीछे 3 मिमी XY-स्कैन गैल्वेनोमीटर दर्पण की एक जोड़ी जोड़ें।
  8. स्कैनिंग दर्पण और 25x उद्देश्य लेंस के पीछे की पुतली को संयुग्मित करने के लिए एक टेलीसेंट्रिक स्कैन लेंस (L5) और एक अनंत-सही ट्यूब लेंस (L6) का उपयोग करें। उद्देश्य के पीछे एपर्चर को भरने के लिए स्कैन लेंस और ट्यूब लेंस द्वारा लेजर बीम का विस्तार करें।
  9. एसआरएस या प्रतिदीप्ति संकेत संग्रह के लिए ट्यूब लेंस और उद्देश्य लेंस के बीच एक पीबीएस या डाइक्रोइक दर्पण (डी 2) रखें। PBS और D2 के बीच स्विच करने के लिए एक motorized फ्लिपर का उपयोग करें।
    नोट: वापस बिखरे हुए SRS संकेत का हिस्सा खो जाता है जब PBS के माध्यम से अपने बेतरतीब ढंग से स्थानांतरित ध्रुवीकरण के परिणामस्वरूप गुजर रहा है।
  10. पता लगाने की बीम को संकीर्ण करने के लिए लेंस (L7 और L9) की एक जोड़ी का उपयोग करें और एक फोटोडायोड सेंसर के साथ 25x उद्देश्य लेंस के पीछे की पुतली को संयुग्मित करें।
  11. पता लगाने की बीम को संकीर्ण करने के लिए लेंस (L8 और L10) की एक जोड़ी का उपयोग करें और फोटोमल्टीप्लायर (PMT) की पहचान सतह के साथ 25x उद्देश्य के पीछे की पुतली को संयुग्मित करें।
  12. प्रतिदीप्ति और SRS संकेतों का पता लगाने के पथ को अलग करने के लिए एक dichroic दर्पण (D3) का उपयोग करें।
  13. स्टोक्स लेजर को अवरुद्ध करने और केवल पंप बीम को पास करने के लिए फोटोडायोड डिटेक्टर के सामने एक फ़िल्टर सेट (Fs1) रखें।
  14. केवल लक्ष्य प्रतिदीप्ति संकेत को पारित करने के लिए PMT डिटेक्टर के सामने एक फ़िल्टर सेट (Fs2) रखें।
  15. पीएमटी को सिग्नल प्रवर्धन के लिए एक वर्तमान एम्पलीफायर से कनेक्ट करें।
  16. फोटोडायोड को लॉक-इन एम्पलीफायर से कनेक्ट करें।
  17. SRS सिग्नल demodulation के लिए लॉक-इन एम्पलीफायर के संदर्भ इनपुट के लिए अंतर्निहित EOM आउटपुट से सिंक्रनाइज़ेशन सिग्नल कनेक्ट करें।
  18. PMT एम्पलीफायर और लॉक-इन एम्पलीफायर आउटपुट को डेटा अधिग्रहण मॉड्यूल से कनेक्ट करें।

2. TPEF-SRS माइक्रोस्कोप प्रणाली अंशांकन

  1. लेजर का स्टार्टअप
    1. टीआई को चालू करने के लिए स्टैंडबाय से ऑन स्थिति में कुंजी स्विच करें: नीलम लेजर और लेजर को गर्म करने के लिए 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    2. OPO नियंत्रण कक्ष पर प्रारंभ बटन पर क्लिक करके OPO पर स्विच करें और लेजर को गर्म करने के लिए 20 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    3. पीएस लेजर के गर्म होने के बाद, स्टोक्स बीम की मॉडुलन गहराई की जांच करने के लिए एक उच्च गति वाले फोटोडिटेक्टर का उपयोग करें। स्टोक्स बीम के लिए लेजर शटर खोलें। सेट OPO पावर बॉक्स पर क्लिक करें और 20 दर्ज करें। बीम का पता लगाने के लिए OPO आउटपुट पर उच्च गति photodetector रखें। लेजर पल्स की निगरानी करने के लिए Bayonet Neill-Concelman (BNC) कनेक्टर के साथ एक समाक्षीय केबल का उपयोग कर एक oscilloscope के इनपुट पोर्ट के लिए photodetector के आउटपुट पोर्ट कनेक्ट करें।
    4. OPO नियंत्रण सॉफ़्टवेयर में EOM नियंत्रण विंडो खोलें। 20 मेगाहर्ट्ज पर अधिकतम मॉडुलन गहराई प्राप्त करने के लिए oscilloscope पर दिखाए गए पल्स तीव्रता आरेख के अनुसार EOM शक्ति और चरण को समायोजित करें।
      नोट:: EOM प्रदर्शन आमतौर पर स्थिर है और केवल जब SRS संकेत काफी कम पाया जाता है, तो जाँच करने की आवश्यकता है।
  2. संयुक्त TPEF-SRS माइक्रोस्कोप का ऑप्टिकल संरेखण
    1. चरण 2.2.2 से 2.2.13 में वर्णित के रूप में ps और fs बीम के colocalization के लिए ऑप्टिकल संरेखण निष्पादित करें।
    2. OPO नियंत्रण सॉफ़्टवेयर में स्टोक्स आउटपुट को रोकते समय पंप लेजर शटर खोलें। सेट सिग्नल बॉक्स पर क्लिक करके और तरंग दैर्ध्य मान 796 दर्ज करके पंप बीम की तरंग दैर्ध्य को 796 एनएम पर सेट करने के लिए OPO नियंत्रण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। सेट OPO पावर बॉक्स पर क्लिक करें और ऑप्टिकल संरेखण के लिए न्यूनतम (~ 20 mW) के लिए अपनी शक्ति सेट करने के लिए 20 दर्ज करें।
    3. माइक्रोस्कोप कंप्यूटर और स्कैनर, उद्देश्य actuators, photodiodes, PMTs, वर्तमान एम्पलीफायरों, लॉक-इन एम्पलीफायरों, और motorized flippers सहित सभी संबद्ध इलेक्ट्रॉनिक घटकों पर स्विच करें। माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें।
      नोट: माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर एक घर का बना इंटरफ़ेस है।
    4. ऑप्टिकल पथ पर दो संरेखण प्लेटों ( चित्र 1 में P1 और P2) रखें। पीबीएस के पीछे P1 को लगभग 10 सेमी की दूरी पर रखें और P2 को P1 के पीछे लगभग 30 सेमी की दूरी पर रखें।
      नोट: ps और fs बीम एक PBS (चित्रा 1) का उपयोग कर संयुक्त हैं। दो संरेखण प्लेटों का उपयोग संरेखण के साथ-साथ दो लेजर बीम के सह-स्थानीयकरण की जांच करने के लिए किया जाता है।
    5. पीएस लेजर बीम के लिए माइक्रोस्कोप शटर खोलें।
    6. P1 के माध्यम से छेद पर पीएस लेजर बीम केंद्र का पता लगाने के लिए दर्पण M1 समायोजित करें। दर्पण M1 को समायोजित करते समय P1 पर बीम स्पॉट की स्थिति का निरीक्षण करने के लिए एक अवरक्त (IR) क्षेत्र का उपयोग करें।
    7. दर्पण M2 समायोजित करने के लिए पी 2 के माध्यम से छेद पर पीएस लेजर बीम केंद्र का पता लगाने के लिए। दर्पण M2 को समायोजित करते समय P2 पर बीम स्पॉट की स्थिति का निरीक्षण करने के लिए IR क्षेत्र का उपयोग करें।
    8. चरण 2.2.6 और 2.2.7 को दोहराएं जब तक कि पीएस बीम केंद्र दोनों संरेखण प्लेटों के थ्रू-होल पर स्थित न हो। माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर में पीएस बीम के शटर को बंद करें।
    9. एफएस टीआई की तरंग दैर्ध्य सेट करें: नीलम लेजर 740 एनएम पर और लेजर शटर खोलें। ऑप्टिकल संरेखण के लिए लेजर शक्ति को 5 mW (माइक्रोस्कोप सिस्टम के इनपुट पोर्ट पर मापा जाता है) पर सेट करें।
    10. एफएस लेजर बीम के लिए माइक्रोस्कोप शटर खोलें।
    11. दर्पण M3 समायोजित करने के लिए P1 के माध्यम से छेद पर fs लेजर बीम स्पॉट केंद्र का पता लगाने के लिए.
    12. दर्पण M4 को समायोजित करने के लिए P2 के माध्यम से छेद पर लेजर बीम स्पॉट केंद्र का पता लगाने के लिए।
    13. चरण 2.2.11 और 2.2.12 को दोहराएं जब तक कि एफएस लेजर बीम केंद्र दो संरेखण प्लेटों के माध्यम से छेद पर स्थित न हो। FS बीम के लिए माइक्रोस्कोप शटर बंद करें।
    14. 2.2.15 से 2.2.18 चरणमें वर्णित के रूप में पंप और स्टोक्स बीम के स्थानिक अतिव्यापी प्रदर्शन।
      नोट: हालांकि पंप और स्टोक्स बीम मोटे तौर पर पीएस लेजर के अंदर ओवरलैप किए जाते हैं, इष्टतम एसआरएस प्रदर्शन प्राप्त करने के लिए दो लेजर बीम की स्थिति की ठीक-ट्यूनिंग की आवश्यकता होती है। चूंकि पंप बीम को पहले से वर्णित के रूप में संरेखित किया जाता है, इसलिए अगले स्टोक्स बीम को पंप बीम के साथ सह-स्थानीयकरण के लिए समायोजित किया जाता है।
    15. दो बीम स्पॉट के स्थान की कल्पना करने के उद्देश्य की स्थिति में एक कैमरा रखें। एक संदर्भ के रूप में कैमरा स्क्रीन पर पंप बीम की स्थिति को चिह्नित करें।
    16. L3 (चित्र1) से पहले एक संरेखण प्लेट P0 रखें. ऑप्टिकल मिरर 1 (OM1) को समायोजित करने के लिए एक हेक्स कुंजी का उपयोग करें ताकि स्टोक्स बीम केंद्र संरेखण प्लेट के माध्यम से छेद से गुजरता है और लेजर आउटपुट पोर्ट पर पंप बीम के साथ सह-स्थानीयकरण करता है। समायोजन के दौरान P0 पर बीम स्पॉट की स्थिति की पुष्टि करने के लिए IR क्षेत्र का उपयोग करें।
      नोट: OM1 और OM2 1031 nm स्टोक्स बीम की स्थिति को समायोजित करने के लिए OPO सिर में दो दर्पण हैं।
    17. संरेखण प्लेट P0 निकालें और OM2 को समायोजित करने के लिए हेक्स कुंजी का उपयोग करें ताकि स्टोक्स बीम का केंद्र कैमरे पर पंप बीम के संदर्भ चिह्न के साथ सह-स्थानीयकरण कर सके।
    18. चरण 2.2.16 और 2.2.17 को दोहराएं जब तक कि स्टोक्स बीम सख्ती से पी 0 और कैमरा विमानों दोनों पर पंप बीम के साथ ओवरलैप नहीं हो जाता।
      नोट:: कैमरे पर बीम स्पॉट visualizing करते समय, सभी संरेखण प्लेटों ऑप्टिकल पथ से हटा दिया जाना चाहिए।
  3. इमेजिंग स्थितियों को ऑप्टिमाइज़ करें
    1. चरण 2.3.2 में वर्णित के रूप में लॉक-इन एम्पलीफायर का चरण समायोजन निष्पादित करें। 2.3.7 के लिए।
      नोट:: SRS का पता लगाना एक उच्च-आवृत्ति चरण-संवेदनशील योजना पर आधारित है। एसआरएल का पता लगाने के लिए, स्टोक्स बीम की तीव्रता को 20 मेगाहर्ट्ज पर संशोधित किया जाता है और सिग्नल को डिमोड्यूलेट करने के लिए लॉक-इन एम्पलीफायर का उपयोग किया जाता है। लॉक-इन एम्पलीफायर के चरण और ऑफसेट को इष्टतम छवि कंट्रास्ट प्राप्त करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता है।
    2. लॉक-इन एम्पलीफायर नियंत्रण सॉफ़्टवेयर खोलें।
    3. पंप लेजर की तरंग दैर्ध्य को 796 एनएम पर सेट करें और पंप और स्टोक्स बीम की शक्ति क्रमशः नमूने पर 15 mW और 25 mW हो।
      नोट: यहाँ एसआरएस इमेजिंग अनुकूलन और अंशांकन के लिए जैतून के तेल का उपयोग करें। कार्बन-हाइड्रोजन क्षेत्र में जैतून के तेल का रमन शिखर 2863.5 सेमी -1 पर है, जो 796 एनएम पर पंप बीम तरंग दैर्ध्य के अनुरूप है।
    4. एक स्लाइड में जैतून का तेल सील और epi-SRS का पता लगाने के लिए संकेत backscattering बढ़ाने के लिए स्लाइड के नीचे के लिए एक तह ऊतक कागज संलग्न. मंच पर जैतून के तेल के नमूने को रखें और नमूने पर 25x उद्देश्य का ध्यान समायोजित करें।
    5. इमेजिंग पैरामीटर को निम्नानुसार सेट करने के लिए माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें: 500 μm x 500 μm फ़ील्ड ऑफ व्यू (FOV), 6.4 μs पिक्सेल निवास समय के लिए 512 x 512 पिक्सेल। लॉक-इन एम्पलीफायर नियंत्रण सॉफ़्टवेयर का उपयोग समय स्थिर मान को 10 μs होने के लिए सेट करने के लिए करें, जो पिक्सेल रहने के समय के करीब है।
    6. नमूने पर लेजर बीम को स्कैन करें। लॉक-इन एम्पलीफायर नियंत्रण सॉफ़्टवेयर का उपयोग 22.5 ° के चरण आकार के साथ चरण (0-180 °) को ट्यून करने के लिए करें जब तक कि SRS सिग्नल तीव्रता अधिकतम तक नहीं पहुंच जाती।
      नोट:: इस सभी एनालॉग लॉक-इन एम्पलीफायर में, सिग्नल आउटपुट इन-फेज घटक है, जो संदर्भ संकेत के चरण पर निर्भर है। चरण को लॉक-इन एम्पलीफायर नियंत्रण सॉफ़्टवेयर द्वारा 11° रिज़ॉल्यूशन के साथ समायोजित किया जा सकता है, जिससे पता लगाए गए सिग्नल को ~ 2% 12 के भीतर अधिकतम करने की अनुमति मिलती है। सिंक सिग्नल बाधित होने के बाद लॉक-इन एम्पलीफायर चरण से बाहर हो जाता है। हर बार जब सिंक सिग्नल को पुनर्स्थापित किया जाता है तो चरण को समायोजित करने की आवश्यकता होती है।
    7. लेजर शटर बंद के साथ नमूना स्कैन करें। औसत SRS संकेत शून्य के करीब है जब तक 1 mV के एक चरण आकार के साथ ऑफसेट मान ट्यून करने के लिए लॉक-इन एम्पलीफायर नियंत्रण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।
      नोट:: औसत SRS संकेत SRS छवि है, जो स्वचालित रूप से माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ़्टवेयर द्वारा परिकलित किया जाता है में सभी पिक्सेल की औसत तीव्रता के रूप में अनुमानित है। ऑफसेट अवांछित चरण-सुसंगत संकेतों को रद्द करने के लिए उपयोगी हैं।
    8. 2.3.9 से 2.3.14 के लिए चरणमें वर्णित के रूप में अस्थायी सिंक्रनाइज़ेशन ऑप्टिमाइज़ेशन निष्पादित करें।
    9. OPO नियंत्रण सॉफ़्टवेयर में विलंब प्रबंधक संवाद (चित्रा 2) खोलें।
    10. जैतून का तेल स्कैन करें और देरी चरण को तब तक ट्यून करें जब तक कि जैतून का तेल एसआरएस सिग्नल अपनी अधिकतम सीमा तक न पहुंच जाए।
      नोट:: SRS इमेजिंग की पहली बार के लिए, जब लॉक-इन एम्पलीफायर के चरण को अनुकूलित नहीं किया गया है, अस्थायी सिंक्रनाइज़ेशन पहले मोटे तौर पर लॉक-इन एम्पलीफायर के चरण को अनुकूलित करने से पहले नमूने के SRS संकेत की कल्पना करने के लिए समायोजित किया जाता है।
    11. स्कैनिंग बंद करें और वर्तमान विलंब डेटा रिकॉर्ड करने के लिए विलंब प्रबंधक संवाद में डेटा जोड़ें बटन पर क्लिक करें।
    12. चरण 2.3 को दोहराएँ। 10 और 2.3.11 विभिन्न तरंग दैर्ध्य पर विभिन्न रासायनिक नमूनों के लिए।
      नोट: Polystyrene मोती, भारी पानी, 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine, ग्लिसरॉल विभिन्न कंपन बैंड पर देरी डेटा को मापने के लिए उपयोग किया जाता है।
    13. पांचवें-क्रम polynomic फ़ंक्शन के साथ वर्तमान डेटा बिंदुओं को फिट करने के लिए विलंब प्रबंधक संवाद पर डेटा फ़िट और ऑर्डर 5 का चयन करें। कस्टम के रूप में उपयोग करें बटन पर क्लिक करके और चेक बॉक्स की जाँच करके फिट किए गए डेटा को लागू करें. विलंब चरण को फिट किए गए विलंब वक्र के अनुसार विभिन्न तरंग दैर्ध्य पर स्वत: समायोजित किया जाएगा।
    14. सभी विलंब डेटा को एक पाठ फ़ाइल में सहेजें, जिसे भविष्य के उपयोग के लिए लोड किया जा सकता है।

3. विवो प्रतिदीप्ति और एसआरएस इमेजिंग में माउस के सर्जिकल तैयारी

  1. Scalpels, वसंत कैंची, संदंश, coverslips, और धुंध पैड सहित सभी आवश्यक उपकरणों, sterilize.
  2. सभी सतहों को कीटाणुरहित करें, जिन्हें 70% इथेनॉल के साथ सर्जरी के दौरान छुआ जाएगा। बाँझ drapes के साथ बेंचटॉप के कार्य क्षेत्र को कवर करें। ड्रेप के नीचे एक हीटिंग पैड रखो।
  3. Thy1-YFP-H (Tg(Thy1-YFP)HJrs/J)37 ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करें जो विवो स्पाइनल कॉर्ड इमेजिंग के लिए पृष्ठीय रूट गैंग्लियन अभिवाही न्यूरॉन्स में बढ़े हुए पीले प्रतिदीप्ति प्रोटीन (EYFP) को व्यक्त करते हैं। माउस का वजन करें और केटामाइन-xylazine मिश्रण (87.5 मिलीग्राम किग्रा -1 और 12.5 मिलीग्राम किग्रा -1) के इंट्रापेरिटोनियल (आई.पी.) इंजेक्शन द्वारा एनेस्थेटाइजेशन को प्रेरित करें।
  4. गहरी संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के लिए माउस के पैर की अंगुली को चुटकी लें। यदि आवश्यक हो तो एनेस्थेटिक्स की मूल खुराक के आधे के साथ पूरक। कॉर्नियल सूखापन को रोकने के लिए माउस आंखों पर मरहम लागू करें।
  5. वक्षीय रीढ़ की हड्डी के ऊपर पीठ पर बालों को शेव करें, और फिर डिपिलेटिंग क्रीम का उपयोग करके बालों को पूरी तरह से हटा दें। आयोडीन समाधान के साथ मुंडा क्षेत्र कीटाणुरहित.
  6. एक स्केलपेल के साथ T11-T13 कशेरुका पर त्वचा का एक छोटा सा मिडलाइन चीरा (~ 1.5 सेमी) बनाएं।
  7. मांसपेशियों और tendons दोनों ऊपर और T11-T13 कशेरुका के पक्षों पर वसंत कैंची और संदंश के साथ incise. तीन आसन्न कशेरुकाओं को उजागर करें। रक्तस्राव को नियंत्रित करने और सर्जिकल साइट को साफ करने के लिए बाँझ धुंध पैड और बाँझ खारा का उपयोग करें।
  8. एक कस्टम डिजाइन स्थिरीकरण चरण (चित्रा 2 बी) पर दो स्टेनलेस स्टील साइडबार की मदद से रीढ़ की हड्डी को स्थिर करें।
  9. T12 में एक लैमिनेक्टॉमी करने के लिए # 2 संदंश का उपयोग करें। ध्यान से टुकड़े से टुकड़े से लामिना टुकड़ा तोड़ने के लिए संदंश का उपयोग करें जब तक कि T12 कशेरुका के पूरे लामिना को हटा नहीं दिया जाता है।
  10. बाँझ खारा के साथ रीढ़ की हड्डी overlying रक्त को धोने और अत्यधिक तरल पदार्थ को अवशोषित करने के लिए धुंध पैड का उपयोग करें। रक्तस्राव को नियंत्रित करने के लिए धुंध पैड के एक टुकड़े के साथ रक्तस्राव साइट पर दबाव लागू करें।
  11. क्लैंपिंग बार पर एक कवरस्लिप (22 x 22 मिमी) रखें और कवरस्लिप और रीढ़ की हड्डी के बीच के इंटरस्पेस को खारा के साथ भरें।

4. माउस रीढ़ की हड्डी के विवो TPEF-SRS इमेजिंग में

  1. TPEF-SRS माइक्रोस्कोप के नीचे एक पांच-अक्ष चरण पर स्थिरीकरण चरण माउंट करें।
    नोट: पांच-अक्ष चरण तीन-अक्ष अनुवाद और ±5 ° पिच और रोल flexure गति की अनुमति देता है।
  2. दो सिर सलाखों के साथ माउस सिर को सुरक्षित करें और श्वास के दौरान छाती के आंदोलन के लिए पर्याप्त स्थान प्रदान करने के लिए होल्डिंग प्लेट को कम करें, गति कलाकृतियों को कम करें।
  3. इमेजिंग के दौरान माउस को गर्म रखने के लिए माउस के नीचे एक हीटिंग पैड डालें।
  4. फोकस ट्यून करने के लिए जेड ट्रांसलेशनल चरण को समायोजित करें जब तक कि रीढ़ की हड्डी वास्कुलचर की उज्ज्वल-क्षेत्र छवि को 10x उद्देश्य के तहत नहीं देखा जा सकता है।
  5. पांच-अक्ष चरण के दो-अक्ष ट्रांसलेशनल चरण को ट्यून करके एफओवी के केंद्र में रीढ़ की हड्डी की पृष्ठीय शिरा का पता लगाएं।
  6. उज्ज्वल-क्षेत्र छवि के आधार पर उद्देश्य अक्ष के लंबवत रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय सतह को समायोजित करने के लिए पांच-अक्ष चरण के रोल और पिच कोणों को ट्यून करें।
  7. TPEF-SRS इमेजिंग के लिए 25x जल विसर्जन उद्देश्य के साथ 10x को बदलें।
  8. एफएस बीम की तरंग दैर्ध्य को 920 एनएम पर सेट करें। नमूने पर 10 mW होने के लिए fs बीम शक्ति ट्यून.
  9. पंप बीम की तरंग दैर्ध्य को 796 एनएम पर सेट करें। पंप और स्टोक्स बीम की शक्ति को क्रमशः नमूने पर 60 mW और 75 mW होने के लिए ट्यून करें।
    नोट: स्पाइनल कॉर्ड एसआरएस इमेजिंग 2863.5 सेमी -1 की तरंग संख्या पर किया जाता है, जो मापा गया एसआरएस स्पेक्ट्रा 7, 9 के आधार पर कार्बन-हाइड्रोजन क्षेत्र में माइलिन म्यान के रमन शिखर से मेल खाता है। लेजर शक्ति रीढ़ की हड्डी के उच्च-रिज़ॉल्यूशन TPEF-SRS इमेजिंग को सुनिश्चित करने के लिए निर्धारित की जाती है। ऊतक क्षति वर्तमान इमेजिंग स्थितियों के तहत नहीं देखी जाती है।
  10. एसआरएस इमेजिंग के लिए, मोटरचालित फ्लिपर से जुड़े स्विच बटन को दबाकर मोटरचालित फ्लिपर का उपयोग करके उद्देश्य के ऊपर पीबीएस का चयन करें।
  11. इमेजिंग पैरामीटर को निम्नानुसार सेट करें: 150 μm x 150 μm FOV, 3.2 μs पिक्सेल निवास समय, 2 μs समय स्थिरांक के लिए 512 x 512 पिक्सेल।
  12. नमूने को स्कैन करना शुरू करें और रीढ़ की हड्डी की पृष्ठीय सतह पर फोकस सेट करें।
  13. OPO नियंत्रण सॉफ़्टवेयर द्वारा देरी चरण को तब तक बारीक ट्यून करें जब तक कि अधिकतम रीढ़ की हड्डी एसआरएस सिग्नल प्राप्त नहीं हो जाता है।
    नोट:: जैविक नमूने अतिरिक्त रंगीन फैलाव को प्रेरित कर सकते हैं, देरी चरण अस्थायी सिंक्रनाइज़ेशन को अनुकूलित करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। हालांकि, जब एसआरएस इमेजिंग ऊतक की शीर्ष सतह के पास किया जाता है, तो जैविक ऊतक और इमेजिंग विंडो द्वारा पेश किए गए दो लेजर दालों का अस्थायी अंतर आमतौर पर छोटा होता है (कई सौ एफएस से कम)।
  14. TPEF इमेजिंग के लिए, मोटरचालित फ्लिपर से जुड़े स्विच बटन को दबाकर एक मोटर चालित फ्लिपर का उपयोग करके उद्देश्य के ऊपर डाइक्रोइक दर्पण D2 का चयन करें।
  15. इमेजिंग पैरामीटर सेट करें और नमूना स्कैन करना शुरू करें। TPEF-SRS छवि स्टैक को कैप्चर करने के लिए, अगली गहराई पर जाने से पहले एक ही गहराई पर 1 s अंतराल के साथ TPEF और SRS छवियों को क्रमिक रूप से प्राप्त करें। TPEF इमेजिंग के लिए इमेजिंग पैरामीटर 512 x 512 पिक्सेल, 150 μm x 150 μm FOV, 3.2 μs पिक्सेल निवास समय हैं।
  16. सभी छवियों को एकत्र करने के बाद स्थिरीकरण चरण से जानवर को हटा दें।
  17. नमकीन फ्लशिंग द्वारा उजागर ऊतक को साफ करें और एक धुंध पैड का उपयोग करके अतिरिक्त तरल पदार्थ को अवशोषित करें। उजागर रीढ़ की हड्डी पर सिलिकॉन जेल लागू करें और ~ 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें जब तक कि यह ठीक न हो जाए।
  18. घाव को बंद करने के लिए # 6-0 सर्जिकल सीवन के साथ त्वचा को सीवन करें। संक्रमण को रोकने के लिए सर्जिकल साइट की त्वचा पर बर्न क्रीम लागू करें। एनाल्जेसिक उपचार चमड़े के नीचे (0.1 मिलीग्राम / किग्रा बुप्रेनोर्फिन) का प्रशासन करें।
  19. जानवर को एक साफ पिंजरे में रखें और पिंजरे को हीटिंग पैड पर रखें जब तक कि माउस पूरी तरह से संज्ञाहरण से ठीक न हो जाए।
  20. सर्जरी के बाद 3 दिनों के लिए हर 12 घंटे में एनाल्जेसिक प्रशासन को दोहराएं।
  21. ओपीओ और एफएस लेजर के शटर को बंद करें। पंप और स्टोक्स बीम की शक्ति को अधिकतम करने के लिए सेट करें।
    नोट: लेजर को बंद करने से पहले अधिकतम शक्ति सेट करना लेजर रखरखाव के लिए फायदेमंद है।
  22. पंप बीम और एफएस लेजर की तरंग दैर्ध्य को 800 एनएम पर सेट करें।
  23. स्टैंडबाय पर दो लेजर सेट करें, सभी इलेक्ट्रॉनिक्स नियंत्रण सॉफ़्टवेयर को बंद करें और सभी संबंधित उपकरणों को बंद कर दें।

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Representative Results

विवो में रीढ़ की हड्डी के अक्षतंतुओं के साथ-साथ माइलिन म्यान की दोहरी-मोडल इमेजिंग को Thy1-YFPH ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके आयोजित किया जाता है, जो पृष्ठीय रूट गैंग्लियन अभिवाही न्यूरॉन्स (चित्रा 3) में EYFP व्यक्त करते हैं। ये लेबल किए गए अभिवाही न्यूरॉन्स परिधीय तंत्रिका से रीढ़ की हड्डी तक संवेदी जानकारी को रिले करते हैं, जिसमें केंद्रीय शाखा रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय स्तंभ में स्थित होती है। TPEF-SRS माइक्रोस्कोप के साथ, घनी वितरित माइलिन म्यान को लेबल-मुक्त एसआरएस इमेजिंग का उपयोग करके स्पष्ट रूप से कल्पना की जा सकती है, और टीपीईएफ इमेजिंग का उपयोग करके विरल रूप से लेबल किए गए वाईएफपी अक्षतंतुओं को देखा जा सकता है। यह दोहरे मॉडल इमेजिंग द्वारा पता चला है कि अक्षतंतु माइलिन म्यान (चित्रा 3 सी) की एक मोटी परत द्वारा बारीकी से लपेटे जाते हैं। Ranvier (NR) के नोड्स, जहां एक्सोलेमा माइलिन म्यान के नंगे होते हैं, एक्शन पोटेंशियल के तेजी से नमकीन प्रचार में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं। जैसा कि TPEF-SRS रीढ़ की हड्डी की छवि (चित्रा 3 C) में देखा जा सकता है, NR कम क्षैतिज व्यास और अक्षीय रूप से सीधे बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स के संपर्क में आता है। एनआर के अस्तित्व और स्थान की पुष्टि करने के लिए आस-पास के माइलिन म्यान के साथ अक्षतंतुओं को एक साथ छवि बनाना आवश्यक है। इसलिए, TPEF-SRS माइक्रोस्कोपी हमें रीढ़ की हड्डी के विकारों के विकास में अक्षतंतु और माइलिन म्यान के गतिशील परिवर्तनों का निरीक्षण करने की अनुमति देती है, जो सेलुलर गतिशीलता के तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।

Figure 1
चित्रा 1: TPEF-SRS माइक्रोस्कोप सिस्टम का योजनाबद्ध आरेख। पंप और स्टोक्स बीम picosecond (ps) लेजर में एक dichroic दर्पण (D1) के साथ संयुक्त कर रहे हैं. पीएस बीम और फेम्टोसेकंड (एफएस) बीम को 3 मिमी एक्सवाई-स्कैन गैल्वेनोमीटर दर्पणों से मेल खाने के लिए लेंस (एल 3, एल 4, और एल 1, एल 2, क्रमशः) की एक जोड़ी द्वारा संयोजित और विस्तारित / संकुचित किया जाता है। एफएस बीम को एक अर्ध-तरंग प्लेट (एचडब्ल्यूपी) द्वारा क्षैतिज से ऊर्ध्वाधर ध्रुवीकरण में घुमाया जाता है, और फिर एक ध्रुवीकरण बीम स्प्लिटर (पीबीएस) द्वारा पीएस बीम के साथ जोड़ा जाता है। स्कैनिंग दर्पण और उद्देश्य लेंस के पीछे की पुतली को एक टेलीसेंट्रिक स्कैन लेंस L5 और एक अनंत-सही ट्यूब लेंस L6 द्वारा संयुग्मित किया जाता है। लेजर बीम को स्कैन और ट्यूब लेंस द्वारा 25x उद्देश्य के पीछे एपर्चर को भरने के लिए विस्तारित किया जाता है। उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) इमेजिंग के लिए, उद्देश्य द्वारा एकत्र बैकस्कैटर्ड पंप बीम को पीबीएस द्वारा परिलक्षित किया जाता है और एक बड़े क्षेत्र (10 मिमी x 10 मिमी) सिलिकॉन फोटोडायोड (पीडी) के लिए निर्देशित किया जाता है। दो-फोटॉन इमेजिंग के लिए, दो-फोटॉन उत्तेजित प्रतिदीप्ति (टीपीईएफ) सिग्नल फोटोडिटेक्शन यूनिट के लिए एक डाइक्रोइक बीम स्प्लिटर डी 2 द्वारा परिलक्षित होता है। TPEF सिग्नल का पता लगाने के लिए एक वर्तमान फोटोमल्टीप्लायर (PMT) मॉड्यूल का उपयोग किया जाता है। संक्षेप-L1-L10: लेंस; OL: उद्देश्य लेंस; D1-D3: dichroic दर्पण; Fs1, Fs2: फ़िल्टर सेट; एम: दर्पण; OM1, OM2: ऑप्टिकल दर्पण; P0-P2: संरेखण प्लेटों. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: OPO नियंत्रण सॉफ़्टवेयर पर विलंब प्रबंधक का इंटरफ़ेस. लाल तीर कैलिब्रेटेड विलंब डेटा लागू करने के लिए जाँच बॉक्स को इंगित करता है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: माउस रीढ़ की हड्डी के विवो TPEF-SRS इमेजिंग में . (ए) माउस रीढ़ की हड्डी की शल्य चिकित्सा तैयारी और रीढ़ की हड्डी की उज्ज्वल क्षेत्र छवि का योजनाबद्ध आरेख। (बी) रीढ़ की हड्डी के विवो इमेजिंग के लिए माउस बढ़ते योजना। (सी) माउस रीढ़ की हड्डी में अक्षतंतु और माइलिन म्यान की अधिकतम जेड प्रक्षेपण छवियां। सफेद एरोहेड्स रैनवियर के नोड के स्थान को इंगित करते हैं। माइलिन की एसआरएस छवियों को 2863.5 सेमी -1 के रमन शिफ्ट में लिया जाता है। चित्रा A BioRender (https://biorender.com/) का उपयोग करके बनाया गया था।  कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, TPEF-SRS माइक्रोस्कोप के मूल सेटअप का विस्तार से वर्णन किया गया है। एसआरएस इमेजिंग के लिए, पंप और स्टोक्स बीम अस्थायी रूप से और स्थानिक रूप से ओपीओ के अंदर ओवरलैप किए जाते हैं। हालांकि, माइक्रोस्कोप सिस्टम से गुजरने के बाद इस ओवरलैपिंग को बाधित किया जा सकता है। इसलिए, दोनों पंप और स्टोक्स बीम के colocalization के स्थानिक और अस्थायी अनुकूलन इष्टतम एसआरएस इमेजिंग प्राप्त करने के लिए आवश्यक और महत्वपूर्ण है। पंप और स्टोक्स बीम के बीच अस्थायी देरी दो बीम के ऑप्टिकल पथ अंतर से संबंधित है, जो माइक्रोस्कोप सिस्टम 38 में ऑप्टिकल तत्वों के फैलाव द्वारा निर्धारित किया जाता है। जब पंप बीम की तरंग दैर्ध्य को विभिन्न रमन शिफ्टों में एसआरएस इमेजिंग के लिए ट्यून किया जाता है, तो पंप बीम की ऑप्टिकल पथ की लंबाई तदनुसार बदल जाती है क्योंकि ऑप्टिकल लेंस का अपवर्तक सूचकांक तरंग दैर्ध्य 38 पर निर्भर करता है। इसलिए, पंप और स्टोक्स लेजर पल्स के बीच अस्थायी देरी पंप बीम की तरंग दैर्ध्य के साथ बदलती है और इस प्रकार कैलिब्रेट करने की आवश्यकता होती है। OPO पंप और स्टोक्स बीम के अस्थायी सिंक्रनाइज़ेशन के लिए एक सॉफ्टवेयर-नियंत्रित देरी लाइन से सुसज्जित है। एक ही ऑप्टिकल सेटअप के लिए, देरी डेटा स्थिर रहता है और केवल एक बार कैलिब्रेट करने की आवश्यकता होती है। नतीजतन, पंप बीम के विभिन्न तरंग दैर्ध्य पर देरी डेटा को भविष्य के उपयोग के लिए पहले माप पर बचाया जा सकता है। कैलिब्रेटेड देरी डेटा को स्वचालित रूप से ओपीओ नियंत्रण सॉफ़्टवेयर द्वारा लागू किया जा सकता है जब पंप बीम की तरंग दैर्ध्य बदल जाती है, जो विभिन्न रमन शिफ्ट या हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस इमेजिंग पर एसआरएस इमेजिंग के लिए सुविधाजनक होती है। TPEF-SRS इमेजिंग के लिए, संयोजन के बाद पीएस और एफएस बीम का सख्त स्थानिक ओवरलैपिंग दो इमेजिंग मॉडल के बीच किसी भी एफओवी शिफ्ट से बचने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। सबसे पहले, पीएस पंप बीम और एफएस बीम को यह सुनिश्चित करने के लिए संरेखित किया जाता है कि वे दोनों माइक्रोस्कोप सिस्टम के ऑप्टिकल अक्ष पर हैं, जो दो इमेजिंग मॉडल को स्विच करते समय किसी भी एफओवी शिफ्ट से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। फिर, एक संदर्भ के रूप में पंप बीम का उपयोग करते हुए, स्टोक्स बीम की स्थिति को सख्त स्थानिक सहस्थानीयकरण प्राप्त करने के लिए तदनुसार समायोजित किया जाता है। प्रत्येक संरेखण प्रक्रिया को इष्टतम तक पहुंचने के लिए कई परीक्षणों की आवश्यकता होती है।

यदि एसआरएस सिग्नल काफी कम हो जाता है, तो लॉक-इन एम्पलीफायर और समय-देरी डेटा के चरण मान को पहले जांचा जाना चाहिए। चूंकि लॉक-इन एम्पलीफायर सिंक सिग्नल बाधित होने के बाद चरण से बाहर हो जाता है, इसलिए इसकी बिजली की आपूर्ति या ईओएम सिंक सिग्नल बाधित होने के बाद चरण मूल्य को हर बार पुन: समायोजित करने की आवश्यकता होती है। पंप और स्टोक्स बीम के अस्थायी तुल्यकालन को ओपीओ के अंदर देरी लाइन को थोड़ा समायोजित करके जल्दी से जांचा जा सकता है। कैलिब्रेटेड समय-विलंब डेटा इष्टतम मान से बहुत दूर है, तो विलंब प्रबंधक संवाद पर शून्य स्कैन बटन पर क्लिक करके विलंब ऑफसेट recalibrate करने के लिए एक शून्य स्कैन किया जाना चाहिए। पूरी शून्य स्कैन प्रक्रिया में लगभग 10 मिनट लगते हैं। यदि SRS संकेत चरण और समय-विलंब मान के ऑप्टिमाइज़ेशन के बाद पुनर्प्राप्त करने में विफल रहता है, तो स्टोक्स बीम के EOM मॉडुलन को चरण 2.1.3-2.1.4 में वर्णित के रूप में जाँचा जाना चाहिए। यदि विलुप्त होने का अनुपात स्टोक्स पल्स ट्रेन की ऑफ पोजिशन पर छोटी पल्स चोटियों के अवलोकन के साथ 10 डीबी से बहुत कम है, तो ईओएम को फिर से शुरू किया जाना चाहिए, और अधिकतम मॉडुलन गहराई प्राप्त करने के लिए मॉडुलन शक्ति और चरण को समायोजित किया जाना चाहिए। आमतौर पर, मॉडुलन समस्या को EOM को रीसेट करके हल किया जा सकता है। यदि नहीं, तो निर्माता से तकनीकी सहायता की आवश्यकता होनी चाहिए।

विवो मोटी ऊतक इमेजिंग में के लिए, epi-SRS का पता लगाने मोड का उपयोग किया जाना है। इस प्रोटोकॉल में, एक पीबीएस का उपयोग उत्तेजना लेजर को पारित करने और डिटेक्टर को बैक-बिखरे हुए एसआरएस सिग्नल को प्रतिबिंबित करने के लिए किया जाता है। पता लगाया गया एसआरएल संकेत ऊतकों द्वारा आगे जाने वाले पंप बीम के बैकस्कैटरिंग पर निर्भर करता है। उत्तेजना लेजर में रैखिक ध्रुवीकरण होता है और पूरी तरह से पीबीएस के माध्यम से पारित हो सकता है, जबकि बैकस्कैटर्ड बीम ने ध्रुवीकरण को स्थानांतरित कर दिया है और इस प्रकार पीबीएस द्वारा केवल आंशिक रूप से परिलक्षित किया जा सकता है। इसलिए, वर्तमान सिग्नल संग्रह योजना रणनीति की तुलना में कम दक्षता दिखाती है जो सीधे उद्देश्य 12 के सामने एक कुंडलाकार फोटोडिटेक्टर रखती है। फिर भी, लिपिड-समृद्ध ऊतकों के मजबूत बिखरने के कारण, रीढ़ की हड्डी के उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात एसआरएस छवियों (512 x 512 पिक्सेल) को 1-2 एस एकीकरण समय के साथ प्राप्त किया जा सकता है, जिससे इस पीबीएस-आधारित संग्रह योजना रीढ़ की हड्डी इमेजिंग के लिए एक उपयुक्त दृष्टिकोण बन जाती है। दूसरी ओर, हालांकि, मजबूत ऊतक प्रकीर्णन प्रकाश प्रवेश गहराई को सीमित करता है। एसआरएस और टीपीईएफ इमेजिंग दोनों के लिए, रीढ़ की हड्डी के लिए इमेजिंग गहराई लगभग 50 μm तक सीमित है।

एसआरएस और टीपीईएफ इमेजिंग के लिए अनुक्रमिक इमेजिंग प्रक्रिया वर्तमान दोहरी-मोडल इमेजिंग विधि की प्रमुख सीमा है। प्रोटोकॉल में, TPEF और SRS इमेजिंग स्वचालित रूप से motorized flipper स्विचिंग द्वारा एक 1 s अंतराल के साथ एक ही स्थान पर क्रमिक रूप से प्रदर्शन कर रहे हैं। मोशन कलाकृतियां टीपीईएफ और एसआरएस छवियों के अपूर्ण विलय का कारण बन सकती हैं, जो अत्यधिक गतिशील प्रक्रियाओं या ऊतकों को इमेजिंग के लिए इस विधि की क्षमता को सीमित करती है जो जानवरों की सांस और दिल की धड़कन से काफी हद तक प्रभावित होती हैं। एक संभावित समाधान एसआरएस इमेजिंग 9 के दौरान पीएस लेजर-उत्साहित दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति को एक साथ इकट्ठा करना है। हालांकि, यह विधि केवल मजबूत प्रतिदीप्ति संकेतों के साथ जैविक संरचनाओं पर लागू होती है, क्योंकि पीएस पल्स में एफएस पल्स 14 की तुलना में बहुत कम प्रतिदीप्ति उत्तेजना दक्षता होती है। वैकल्पिक रूप से, समस्या को एक एफएस-एसआरएस सिस्टम 22,40 का उपयोग करके हल किया जा सकता है, जहां एफएस लेजर स्रोत एसआरएस इमेजिंग के कम वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन की कीमत पर एसआरएस और टीपीईएफ संकेतों के एक साथ उत्तेजना की अनुमति देता है। एक अन्य समाधान एफएस प्रतिदीप्ति छवियों को पंजीकृत करने के लिए एक संदर्भ के रूप में एसआरएस इमेजिंग के दौरान प्राप्त पीएस लेजर-उत्साहित प्रतिदीप्ति का उपयोग करना है। जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, यह पंजीकरण रणनीति अच्छी तरह से काम करती है यदि एसआरएस और प्रतिदीप्ति इमेजिंग के दौरान कोई महत्वपूर्ण गति नहीं होती है।

एसआरएस जैविक इमेजिंग में अद्वितीय लाभ प्रदर्शित करता है क्योंकि यह अपने विशिष्ट लेबल-मुक्त विपरीत तंत्र के आधार पर बायोमोलेक्यूल्स की रासायनिक जानकारी प्रदान करता है। CARS की तुलना में जिसे multimodal NLO इमेजिंग के लिए TPEF के साथ भी जोड़ा गया है, SRS ने बेहतर वर्णक्रमीय और छवि व्याख्या क्षमता 11 दिखाई। इसलिए, इसे व्यापक रूप से इमेजिंग लिपिड 9,11, प्रोटीन 42,43, डीएनए 44, और जैव-ओर्थोगोनल घटकों के लिए लागू किया गया है जिसमें एल्काइन (सी ≡ सी) 13,45, कार्बन-ड्यूटेरियम (सी-डी)9,46 और ऑक्सीजन-ड्यूटेरियम (ओ-डी) बांड 47,48 शामिल हैं। जैविक ऊतकों में। इस प्रोटोकॉल में, हमने एसआरएस इमेजिंग के लिए एक पीएस लेजर स्रोत और टीपीईएफ इमेजिंग के लिए एक एफएस लेजर स्रोत का उपयोग किया, जो कुशल प्रतिदीप्ति उत्तेजना और उच्च रमन वर्णक्रमीय संकल्प के फायदों को जोड़ता है, जिससे विविध बायोमोलेक्यूल्स 42,44 के प्रभावी भेदभाव की अनुमति मिलती है। रीढ़ की हड्डी में, ग्लियाल कोशिकाओं, न्यूरॉन्स और भर्ती प्रतिरक्षा कोशिकाओं को शामिल करने वाले जटिल सेल-माइक्रोएन्वायरमेंट इंटरैक्शन चोट 49 और बीमारियों की प्रगति में योगदान करते हैं50। विभिन्न प्रतिदीप्ति और एसआरएस इमेजिंग जांच के साथ संयुक्त, TPEF-SRS माइक्रोस्कोपी विभिन्न सेलुलर संरचनाओं के साथ-साथ उनके अलग-अलग बायोमोलेक्यूल घटकों की एक साथ इमेजिंग प्राप्त कर सकती है, जो रीढ़ की हड्डी के विकारों की शुरुआत और विकास की हमारी समझ को काफी सुविधाजनक बना सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है और उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को हांगकांग अनुसंधान अनुदान परिषद द्वारा अनुदान 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6002-19E, N_HKUST603/19E, नवाचार और प्रौद्योगिकी आयोग (ITCPD/17-9) के माध्यम से समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#2 Forceps Dumont 11223-20 For laminectomy
10X objective Nikon CFI Plan Apo Lambda 10X
25X objective Olympus XLPLN25XSVMP2
Burn cream Betadine
Camera Sony α6300
Current amplifier Stanford research SR570
Current photomultiplier modules Hamamatsu H11461-01
D2 665 nm long-pass dichroic mirror Semrock FF665-Di02-25x36 For directing epi-fluorescence signal to the detection module
D3 700 nm short-pass dichroic mirror Edmund 69-206 For separating SRS from TPEF detection path
Depilating cream Veet
FS1 975 nm short-pass filter Edmund 86-108 For blocking stokes beam
FS1 Bandpass filter Semrock FF01-850/310 For blocking stokes beam
Fs2 Bandpass filter Semrock FF01-525/50 For selecting YFP signal
Fs2 Shortpass filter Semrock FF01-715/SP-25 For blocking fs excitation laser beam
Half-wave plate Thorlabs SAHWP05M-1700
High-speed photodetector MenloSystems FPD 310-F For checking Stokes beam modulation
Iodine Betadine
IR Scope FJW FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X
Iris Thorlabs CPA1
L1 Thorlabs AC254-060-B-ML
L10 Thorlabs LA4052-A
L2 Thorlabs LA1422-B
L3 Thorlabs AC254-050-B
L4 Thorlabs AC254-060-B-ML
L7 f=100 mm, AB coating
L8 Thorlabs LA4874-A
L9 Thorlabs AC254-035-B-ML
Lock-in amplifier APE
Mirror Thorlabs PF10-03-P01
Motorized flipper Thorlabs MFF101/M
multifunctional acquisition card National Instrument PCIe-6363
Oscilloscope Tektronix TDS2012C
Photodiode APE For detecting SRS signal
Picosecond laser source APE picoEmerald
Polarizing beam splitter Thorlabs CCM1-PBS252/M
Power meter Newport 843-R
Saline Braun
Scan lens L5 Thorlabs SL50-CLS2
Scanning mirror Cambridge Technology 6215H
Silicone gel World Precision Inc. KWIK-SIL
Ti:sapphire fs laser Coherent Chameleon Ultra II
Tube lens L6 Thorlabs TTL200-S8

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References

  1. Raman, C. V., Krishnan, K. S. The optical analogue of the compton effect. Nature. 121 (3053), 711 (1928).
  2. Turrell, G., Corset, J. Raman Microscopy: Developments and Applications. , Academic Press. (1996).
  3. Tian, F., et al. Monitoring peripheral nerve degeneration in ALS by label-free stimulated Raman scattering imaging. Nature Communications. 7 (1), 13283 (2016).
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Bioengineering अंक 178
<em>विवो में</em> संयुक्त दो फोटॉन प्रतिदीप्ति और उत्तेजित रमन प्रकीर्णन माइक्रोस्कोपी के साथ जैविक ऊतकों की इमेजिंग
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Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S. In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (178), e63411, doi:10.3791/63411 (2021).

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