Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

التسليم بوساطة الكهربية للبروتينات الريبونوكليوكرية Cas9 والحمض النووي الريبي المرسال إلى خلايا كبد الفئران الأولية المعزولة حديثا

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63828
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Bioengineering, Clemson University, 2Godley Snell Research Center, Clemson University
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا البروتوكول تقنيات عزل خلايا الكبد الأولية للفئران عن الكبد وتحويل CRISPR-Cas9 كهربائيا كبروتينات ريبية و mRNA لتعطيل جين مستهدف علاجي مرتبط بمرض استقلابي وراثي في الكبد. تؤدي الطرق الموصوفة إلى قابلية عالية للاستمرار ومستويات عالية من تعديل الجينات بعد العزل الكهربائي.

Abstract

يصف هذا البروتوكول طريقة سريعة وفعالة لعزل خلايا كبد الفئران الأولية متبوعة بتوصيل كريسبر-كاس9 بوساطة الكهربية كبروتينات ريبية نووية (RNPs) و mRNA. تم عزل خلايا الكبد الأولية للفئران باستخدام طريقة تروية رجعية من ثلاث خطوات مما أدى إلى غلات عالية تصل إلى 50 × 106 خلايا لكل كبد وبقاء الخلية بنسبة >85٪. يوفر هذا البروتوكول تعليمات مفصلة لطلاء خلايا الكبد وتلوينها وزراعتها. تشير النتائج إلى أن الكهربية توفر كفاءة نقل عالية تبلغ 89٪ ، كما تقاس بنسبة الخلايا الإيجابية للبروتين الفلوري الأخضر (GFP) وقابلية الخلايا المتواضعة >35٪ في خلايا كبد الفئران.

ولإثبات فائدة هذا النهج، تم تحويل كريسبر-كاس9 الذي يستهدف جين هيدروكسي فينيل بيروفات ثنائي الأكسجيناز إلى خلايا كبد أولية للفئران كدليل على المبدأ لتحرير الجينات لتعطيل جين علاجي مرتبط بمرض استقلابي وراثي (IMD) في الكبد. لوحظ تحرير أعلى على الهدف بنسبة 78٪ ل RNPs مقارنة بكفاءة تحرير 47٪ مع mRNA. تم تقييم وظائف خلايا الكبد في المختبر باستخدام فحص الألبومين الذي أشار إلى أن تقديم CRISPR-Cas9 كRNPs و mRNA يؤدي إلى بقاء خلية مماثلة في خلايا الكبد الأولية للماوس. تطبيق واعد لهذا البروتوكول هو توليد نماذج الفئران للأمراض الوراثية البشرية التي تؤثر على الكبد.

Introduction

IMDs من الكبد هي اضطرابات وراثية تتميز بنقص إنزيم كبدي حاسم يشارك في عملية التمثيل الغذائي التي تؤدي إلى تراكم الأيضات السامة. بدون علاج ، تؤدي IMDs للكبد إلى فشل الأعضاء أو الوفاة المبكرة 1,2. الخيار العلاجي الوحيد للمرضى الذين يعانون من IMDs من الكبد هو زرع الكبد التقويمي ، وهو محدود بسبب انخفاض توافر الأعضاء المانحة والمضاعفات الناجمة عن العلاج المثبط للمناعة بعد الإجراء 3,4. وفقا للبيانات الأخيرة التي جمعتها شبكة شراء الأعضاء وزرعها ، فإن 40٪ -46٪ فقط من المرضى البالغين على قائمة انتظار زراعة الكبد يتلقون عضوا ، بينما يموت 12.3٪ من هؤلاء المرضى أثناء وجودهم في قائمة الانتظار5. علاوة على ذلك ، فإن 5٪ فقط من جميع أمراض الكبد النادرة لديها علاج معتمد من إدارة الأغذية والعقاقير6. من الواضح أن هناك حاجة ماسة لعلاجات جديدة ل IMDs في الكبد. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى نماذج المرض المناسبة لتطوير خيارات علاجية جديدة.

لا تزال نمذجة الأمراض البشرية باستخدام أنظمة المختبر وفي الجسم الحي عقبة أمام تطوير علاجات فعالة ودراسة أمراض IMDs في الكبد. خلايا الكبد من المرضى الذين يعانون من أمراض الكبد النادرة هي تحديا للحصول على7. النماذج الحيوانية ضرورية لتطوير فهم لأمراض الأمراض واختبار الاستراتيجيات العلاجية. ومع ذلك ، فإن إحدى العقبات هي توليد نماذج من الأجنة التي تحمل طفرات قاتلة. على سبيل المثال، أدت محاولات إنشاء نماذج فأر من متلازمة ألاجيل (ALGS) مع أجنة تحتوي على حذف متماثل الزيجوت لتسلسل 5 كيلوبايت بالقرب من نهاية 5 لجين Jag1 إلى الموت المبكر للأجنة8. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون توليد نماذج الفئران عن طريق تحرير الجينات في الخلايا الجذعية الجنينية كثيف الوقت والموارد9. أخيرا ، ستظهر طفرات خارج الأنسجة المستهدفة ، مما يؤدي إلى متغيرات مربكة قد تعيق دراسة المرض9. سيسمح تحرير الجينات الجسدية بتحرير أسهل في أنسجة الكبد ويتجاوز التحديات المرتبطة بتوليد النماذج باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية.

تمكن الكهربية من توصيل كريسبر-كاس9 مباشرة إلى النواة من خلال تطبيق تيارات عالية الجهد لتخلل غشاء الخلية وهي متوافقة مع العديد من أنواع الخلايا ، بما في ذلك تلك التي تتعنت على تقنيات النقل ، مثل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، والخلايا الجذعية متعددة القدرات ، والخلايا العصبية 10،11،12 . ومع ذلك ، فإن انخفاض الجدوى هو عيب محتمل للكهربية ؛ يمكن أن يؤدي تحسين الإجراء إلى مستويات عالية من التسليم مع الحد من السمية13. أظهرت دراسة حديثة جدوى تحويل مكونات CRISPR-Cas9 بالكهرباء إلى خلايا كبد بشرية وماوس أولية كنهج عالي الكفاءة14. الكهربية خارج الجسم الحي في خلايا الكبد لديها القدرة على تطبيقها لتوليد نماذج جديدة للفئران ل IMDs البشرية من الكبد.

يوفر هذا البروتوكول إجراء مفصلا خطوة بخطوة لعزل خلايا كبد الفئران عن الكبد ومن ثم إلكتروبورات CRISPR-Cas9 كمجمعات RNP ، تتكون من بروتين Cas9 والحمض النووي الريبي الاصطناعي أحادي التوجيه (sgRNA) ، أو Cas9 mRNA جنبا إلى جنب مع sgRNA للحصول على مستويات عالية من تحرير الجينات على الهدف. بالإضافة إلى ذلك، يوفر البروتوكول طرقا لقياس كفاءة تحرير الجينات وقابليتها للتطبيق ووظائفها بعد إلكتروبورات كريسبر-كاس9 في خلايا كبد الفئران المعزولة حديثا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات والبروتوكولات المعتمدة في جامعة كليمسون. تم إجراء العمليات الجراحية في الفئران البرية المخدرة C57BL/6J التي يتراوح عمرها بين 8 و 10 أسابيع.

1. جراحة الحيوان

  1. إعداد الحلول والأدوات
    ملاحظة: تظهر محاليل التروية ووصفات كوكتيل التخدير في جدول المواد.
    1. تحضير محلول التروية 1 (HEPES و EGTA و EBSS) ، وحل التروية 2 (HEPES ، EGTA ، EBSS ، CaCl 2 ، و MgSO4) ، ومحلول التروية 3 (الحل2 و Liberase). تأكد من أن الحلول مختلطة جيدا.
    2. اضبط الحمام المائي على 42 درجة مئوية وقم بتسخين حلول التروية 1 و 2 و 3 لمدة لا تقل عن 30 دقيقة قبل بدء الإجراء واحتفظ بها في الحمام المائي.
      ملاحظة: المحاليل التروية 1 و 2 سوف تخلب الكالسيوم وتطرد الدم في الكبد. يحتوي محلول التروية 3 على الإنزيم الهضمي ليبراز لفصل المصفوفة خارج الخلية.
    3. ضع 150 مل من DMEM + 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) في أنابيب مخروطية واحتفظ بها على الجليد.
      ملاحظة: سيتم استخدام هذا الوسط لإطلاق الخلايا من كبسولة الكبد وغسل خلايا الكبد المعزولة في الخطوتين 2.1 و 2.2 على التوالي.
    4. اضبط جهاز الطرد المركزي على 4 درجات مئوية.
    5. قم بتعقيم أنابيب المضخة عن طريق وضع طرفي الأنبوب في قارورة مملوءة بالإيثانول بنسبة 70٪ وتدوير الإيثانول ثلاث مرات.
    6. اغسل الأنابيب بالماء المقطر وأفرغها.
    7. املأ الأنابيب ب 30 مل من محلول التروية 1 المسخن مسبقا ، متبوعا ب 8 مل من محلول التروية 2. إذا كان الأنبوب لا يزال يحتوي على مساحة لمزيد من السوائل، فقم بملء بقية الأنابيب بمحلول التروية 3. أوقف المضخة عند التبديل إلى محلول تروية مختلف لتجنب إدخال فقاعات الهواء في الأنابيب.
    8. ضع الأنابيب الزائدة في حمام مائي 42 درجة مئوية للحفاظ على دفء محاليل التروية.
    9. ضع نهاية أنبوب المضخة في الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على محلول التروية 3 ، مع الاحتفاظ به في الحمام المائي.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية للسماح للمضخة بالتعبئة المستمرة بمحلول التروية 3 أثناء التروية.
  2. إعداد الحيوانات
    1. تخدير الفأر عن طريق حقن كوكتيل مخدر داخل الصفاق بجرعة 10-11.7 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم. يحتوي كوكتيل التخدير على تركيز نهائي من 7.5 ملغ / مل من الكيتامين ، و 0.25 ملغ / مل من الأسيبرومازين و 1.5 ملغ / مل من الزيلازين.
    2. راقب تنفس الماوس وتحقق من أن الماوس لا يتفاعل مع الألم. انتظر حتى يكون لدى الماوس معدل تنفس ~ 55-65 نفسا في الدقيقة ، ولا يستجيب لقرصة أصابع قدميه ، وله ذيل رخو. بالإضافة إلى ذلك ، تحقق من منعكس الجفن (الوميض) عن طريق لمس الجلد برفق على الجانب الإنسي من العين المغلقة. إذا كان الماوس يومض أو ترتعش عضلات العين ، فقم بزيادة جرعة كوكتيل التخدير بأكمله بمقدار 5-10 ميكرولتر.
    3. ضع الماوس على ظهره في وضع ضعيف وقم بتثبيت الأطراف على السطح باستخدام دبابيس أو شريط (الشكل التكميلي S1).
    4. رش البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول وجففه باستخدام كرة قطنية.
  3. تروية الكبد
    1. قم بعمل شق جانبي على شكل حرف U في جلد البطن باستخدام مقص وقم بتوسيع الثقب عبر الجانبين.
    2. استمر في فتح الجلد إلى القفص الصدري.
    3. باستخدام المقص ، قم بقطع الصفاق لفضح تجويف البطن حتى القفص الصدري ، مع الحرص على عدم ضرب أي أعضاء. حرك الأمعاء إلى الجانب الأيمن باستخدام الجزء الخلفي من الملقط أو السطح الحاد للمقص. تحديد الوريد الأجوف السفلي والوريد البابي (الشكل التكميلي S1).
    4. ابدأ تشغيل المضخة لطرد محلول التروية المسخن مسبقا من خلال القسطرة.
    5. أوقف المضخة وقم بإزالة القسطرة بمجرد تدفق كل الهواء عبر النظام. أدخل طرف الإبرة المتصلة بالقسطرة في الوريد الأجوف السفلي بزاوية 10 درجات -20 درجة إلى الوريد. قم بإزالة الإبرة من القسطرة وادفع القسطرة برفق إلى الوريد في حركة موازية للوريد.
      ملاحظة: يجب على المستخدم مراقبة الفلاش باك للدم في القسطرة للتحقق من القنية المناسبة في الوريد.
    6. قم بتوصيل الأنبوب بالقسطرة دون تحريك القسطرة أكثر في الوريد.
    7. ابدأ تشغيل المضخة بمعدل تدفق 2 مل / دقيقة. ابحث عن الكبد الذي يتحول على الفور إلى شاحب كعلامة على نجاح التروية.
    8. قطع الوريد البوابة باستخدام مقص.
    9. زيادة معدل التدفق تدريجيا إلى 5 مل / دقيقة.
    10. قم بالضغط بشكل دوري على الوريد البابي في موقع القطع التقريبي لمدة 3 ثوان باستخدام ملقط أو قطعة قطن لمنع الصرف وتسهيل التروية الجيدة.
    11. بمجرد تدفق محلول التروية 3 ، راقب بعناية مرونة الكبد. لتحديد ما إذا كان الكبد منعم أم لا، اضغط برفق على الكبد باستخدام قطعة قطن أو ملقط وتحقق مما إذا كانت المسافات البادئة تتشكل على الكبد. احرص على عدم الإفراط في الاختراق لتجنب فقدان صلاحية الخلايا.
    12. بمجرد أن يتم تليين الكبد (يحدث بعد تدفق 30-50 مل من محلول التروية 3) ، أوقف المضخة ، وأزل القسطرة ، وقم بتشريح الكبد بعناية. ضع الكبد في طبق بتري 100 مم يحتوي على DMEM بارد + 10٪ FBS متوسط. استئصال المرارة ، مع الحرص على عدم انسكاب محتوياتها. قم بتدوير طبق بتري لإزالة جلطات الدم المحتملة بلطف.
    13. انقل الكبد إلى طبق بتري جديد يحتوي على DMEM بارد مثلج + 10٪ FBS متوسط.

2. عزل خلايا الكبد

  1. إطلاق الخلايا من كبسولة الكبد.
    1. ضع طبق بتري على الثلج وباستخدام زوجين من الملقط المعقم ، قم بتمزيق كبسولة الكبد بلطف على جميع الفصوص. قم بتدوير الكبد بلطف في الوسط باستخدام رافع الخلايا أو ملقط لإطلاق خلايا الكبد. استمر في هذه الحركة حتى يصبح الكبد صغيرا جدا ويتحول التعليق إلى اللون البني وغير الشفاف.
    2. قم بإزالة بقايا أنسجة الكبد من الصفيحة وباستخدام ماصة مصلية سعة 25 مل تم ضبطها على سرعة منخفضة ، انقل تعليق الخلية بعناية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل (مبرد مسبقا على الجليد) مزود بمصفاة خلية 100 ميكرومتر.
    3. أضف DMEM طازجا وباردا + 10٪ FBS متوسطا إلى طبق بتري لغسل الخلايا المتبقية وجمعها من السطح ونقلها إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مل. كرر هذه الخطوة حتى يتم تجميع كافة الخلايا.
  2. غسل وتنقية خلايا الكبد من الخلايا غير المتني.
    1. الطرد المركزي للخلايا التي تم جمعها في الأنبوب المخروطي 50 مل عند 50 × غرام عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق عند تباطؤ منخفض أو بدون أي فرامل.
    2. تخلص من المادة الفائقة التي تحتوي على حطام وخلايا غير متنية وأعد تعليق الكريات في السوبرنات المتبقي عن طريق تدوير الأنبوب بلطف. بعد إنعاش الكرية، أضيفي 30 مل من DMEM الطازج والبارد + 10٪ FBS متوسط.
    3. كرر الطرد المركزي (الخطوة 2.2.1) والغسيل (الخطوة 2.2.3) ثلاث مرات.
    4. أعد تعليق حبيبة الخلية النهائية في 10 مل من DMEM المثلج + 10٪ FBS المتوسط.
      ملاحظة: يعتمد حجم الوسط المستخدم لإعادة تعليق الكريات على حجم الكرية. إذا كانت الكريات أصغر بكثير من 15 مم ، فاستخدم 1-5 مل من DMEM البارد المثلج + 10٪ FBS المتوسط.
  3. تحديد كمية صلاحية الخلية
    1. في أنبوب microfuge ، أضف 50 ميكرولتر من محلول Trypan Blue بنسبة 0.4٪ إلى 350 ميكرولتر من وسط طلاء خلايا الكبد (PM). ثم ، أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لإجراء تخفيف نهائي بنسبة 1: 5 وماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للخلط.
    2. عد كثافة الخلايا وقابليتها للحياة باستخدام مقياس الدم. أثناء العد ، ضع تعليق خلايا الكبد على الجليد ، ثم ضع دلو الثلج على شاكر مداري مضبوط على 30 دورة في الدقيقة لمنع خلايا الكبد من الاستقرار.
    3. اتبع خطوات المعالجة والطرد المركزي Percoll أدناه إذا كانت صلاحية الخلية <70٪.
      1. تمييع Percoll باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات 10x (PBS) بنسبة 9: 1.
      2. امزج تعليق خلايا الكبد مع Percoll المخفف بنسبة 1: 1.
      3. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
      4. تخلص من المادة الفائقة التي تحتوي على خلايا ميتة. أعد تعليق الكريات في DMEM البارد المثلج + 10٪ FBS المتوسط.
      5. عد الخلايا مرة أخرى.
  4. اختبار خلايا الكبد من أجل القابلية للصفيح
    1. قم بلوحة بعض الخلايا على ألواح الكولاجين I-مغلفة ب 6 آبار بكثافة 0.5 × 106 خلايا لكل مل باستخدام 1.5 مل من PM.
    2. احتفظ بالخلايا المتبقية على الجليد أثناء وجودها على الاهتزاز المداري حتى تصبح جاهزة لإجراء عملية الكهروبورات.
    3. ضع صفيحة الخلايا في حاضنة CO2 مغطاة بالماء على درجة حرارة 37 درجة مئوية، حرك الصفيحة أفقيا ورأسيا بلطف في حركة من الشمال إلى الجنوب ومن الشرق إلى الغرب لضمان الطلاء المتجانس. كرر الحركة مرتين أخريين كل 1.5 ساعة.
    4. تحقق من مرفق الخلية في 3 ساعات بعد الطلاء.
      ملاحظة: يجب أن تلتصق 60٪ على الأقل من الخلايا باللوحة كمؤشر على خلايا الكبد ذات النوعية الجيدة.
    5. قم بتغيير الوسط إلى وسيط صيانة خلايا الكبد (MM) عند 24 ساعة بعد الطلاء للحفاظ على الخلايا في الثقافة.
  5. تلطيخ الجليكوجين
    1. بعد أن تلتصق الخلايا بألواح الكولاجين I-colegen المغلفة ب 6 آبار ، قم بإزالة الوسط المستهلك من الخلايا المستزرعة.
    2. إصلاح الخلايا لمدة 10-15 دقيقة في الإيثانول الجليدي البارد.
    3. يغسل جيدا بالماء المعقم.
    4. احتضان في 1٪ حمض دوري مائي لمدة 5 دقائق ثم يغسل بالماء المعقم.
    5. احتضان كاشف شيف 100٪ لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يجب عدم تخفيف كاشف شيف قبل إضافته إلى الخلايا.
    6. يغسل بالماء ثلاث مرات على مدى 10 دقائق.
    7. يركب في وسط تركيب.
    8. صورة باستخدام المجهر على إعداد برايتفيلد.

3. تصميم sgRNAs لتحرير الجينات CRISPR-Cas9

ملاحظة: يصف هذا القسم تصميم الحمض النووي الريبوزي المرسال (sgRNA) الذي يستهدف جين هيدروكسي فينيل بيروفات ثنائي الأكسجين (Hpd) كدليل على المبدأ لتحرير الجينات لتعطيل جين مستهدف علاجي مرتبط ب IMD في الكبد.

  1. صمم تسلسل الدليل الذي يستهدف Hpd باستخدام البرنامج المشار إليه15.
  2. تحقق من تسلسل Hpd باستخدام متصفح Ensembl Genome.
  3. استخدم المعلمات التالية لتصميم gRNA: طول دليل واحد من 20 نيوكليوتيدات و NGG (N يمكن أن يكون أي نيوكليوتيد) تسلسل زخارف متجاورة (PAM).
  4. حدد منطقة مستهدفة من exon 3 في Hpd.
  5. قم بإنشاء قائمة بتسلسلات الدليل من المنطقة المستهدفة باستخدام نقاط التشغيل وخارج الهدف.
    ملاحظة: تشير النتيجة على الهدف إلى كفاءة التحرير المتوقعة على الهدف للتصميم المحدد: ترتبط النتيجة الأعلى بكفاءة تحرير أعلى. ترتبط النتيجة خارج الهدف بخصوصية تسلسل الدليل: تشير النتيجة الأعلى إلى انخفاض احتمال التحرير خارج الهدف. من الناحية المثالية ، يجب أن تكون كلتا الدرجتين مرتفعتين: النتيجة على الهدف >60 ، والنتيجة خارج الهدف >50.
  6. حدد تسلسل الدليل بأعلى الدرجات على الهدف وخارج الهدف. قم بتصنيع sgRNA الذي يحتوي على تسلسل الدليل كيميائيا.

4. الكهربية وزراعة الخلايا

  1. تحضير ركائز CRISPR-Cas9 والوسائط والخلايا وأداة المعالجة الكهربائية
    1. أضف الملحق المصاحب بالكامل إلى PM وقم بتسخينه في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. قم بتشغيل جهاز الكهربية عن طريق الضغط على زر الطاقة وضبط برنامج الكهربية عن طريق الضغط على الزر x ثم زر السهم لأسفل حتى يظهر البرنامج T-028 على الشاشة.
    3. قم بإعداد الآبار المقصودة لخلايا الكبد الكهربية عن طريق إضافة 1.5 مل من PM إلى ألواح مغلفة بالكولاجين I. احتضن الألواح في حاضنة 37 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
    4. أضف الملحق المصاحب بالكامل إلى محلول المخزن المؤقت الكهربائي واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: قم بتسمية تاريخ انتهاء صلاحية المخزن المؤقت الكهربائي على القارورة (بعد 3 أشهر من تاريخ إضافة الملحق).
    5. قم بإزالة الأوعية الكهربائية من العبوة وقم بلصقها لكل عينة.
    6. في أنابيب PCR المنقسمة الشريط، قم بإعداد مجمعات Cas9 RNP من خلال الجمع بين 30 ميكروغرام من sgRNA مع 300 pmol من بروتين Cas9 واحتضان المجمعات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. قم بإعداد Cas9 mRNA عن طريق الجمع بين 30 ميكروغرام من sgRNA مع 4 ميكرولتر من Cas9 mRNA (1 ميكروغرام / ميكرولتر). قم بتخزين مزيج mRNA-sgRNA على الجليد حتى التفريغ الكهربائي. قم بإعداد أنبوب يحتوي على 1.0 ميكروغرام من eGFP mRNA بشكل منفصل للتحقق من نجاح المعالجة الكهربائية باستخدام المجهر الفلوري.
    7. جهاز الطرد المركزي 1.2 × 106 خلايا لكل تفاعل كهربائي عند 100 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.
    8. قم بإزالة المادة الفائقة من حبيبة الخلية وأضف 100 ميكرولتر من محلول الكهربية لكل تفاعل على طول جانب جدار الأنبوب. أعد تعليق خلايا الكبد في محلول الكهربية عن طريق هز الأنبوب بلطف باليد.
  2. تحويل CRISPR-Cas9 RNPs والحمض النووي الريبي المرسال كهربائيا إلى خلايا كبدية
    1. بمجرد أن تظهر خلايا الكبد مشتتة بالتساوي في محلول الكهربية ، قم بنقل 100 ميكرولتر من تعليق خلايا الكبد إلى أنابيب الشريط التي تحتوي على مجمعات Cas9.
      ملاحظة: استخدم أطراف ماصة واسعة التجويف عند نقل خلايا الكبد للحفاظ على صلاحية الخلية.
    2. انقل محتويات الشريط جيدا إلى وعاء كهربائي.
    3. ضع وعاء النيوكليوفيت في الفتحة الموجودة على جهاز التفريغ الكهربائي. قم بإلكتروبو خلايا الكبد عن طريق الضغط على الزر x . بعد الفحص الكهربائي ، انتظر حتى تظهر شاشة منبثقة على الجهاز تقول موافق. اضغط على الزر x مرة أخرى وقم بإزالة السفينة.
    4. احتضان الوعاء الكهربائي على الجليد لمدة 15 دقيقة.
    5. أضف 500 ميكرولتر من PM المسخن مسبقا إلى وعاء التفريغ الكهربائي.
    6. انقل 300 ميكرولتر من تفاعل الكهربية إلى كل وجهة بشكل جيد على اللوحة المسخنة مسبقا.
      ملاحظة: يجب أن يكون هناك بئران مقصودان لكل تفاعل كهربائي. سيتم استخدام بئر واحد لقياس كفاءة تحرير الجينات. سيتم استخدام البئر الآخر لفحوصات MTT والألبومين.
    7. لمنع خلايا الكبد من التراكم في وسط البئر ، قم بتفريق الخلايا عن طريق تحريك الألواح بلطف أفقيا ورأسيا في حركة من الشمال إلى الجنوب ومن الشرق إلى الغرب. تأكد من أن اللوحة تحافظ على ملامستها لرف الحاضنة أثناء تحريكها. كرر هذه الحركة في 15 و 30 و 45 و 60 و 90 دقيقة بعد طلاء خلايا الكبد الكهربائية.
    8. احتضان الألواح بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
    9. قم بإزالة الوسط من الآبار المخصصة لتحليل تحرير الجينات بعد 24 ساعة من طلاء الخلايا ، واستبدله بتراكب مصفوفة الغشاء السفلي 0.25 مجم / مل.
      ملاحظة: إذا تم تخزينها في الفريزر ، فانقل مصفوفة الغشاء إلى 4 درجات مئوية واتركها تذوب. نظرا لأن مصفوفة الغشاء السفلي صلبة فوق 10 درجات مئوية ، فمن الأهمية بمكان أن تظل مصفوفة الغشاء السفلي على الجليد أو عند 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.

5. احسب حجم مصفوفة الغشاء لمزجها مع MM لإعطاء تركيز نهائي قدره 0.25 مجم / مل

ملاحظة: بالنسبة للوحة المكونة من 6 آبار ، هناك حاجة إلى 2 مل من التراكب لكل بئر.

6. أضف الحجم المحسوب لمصفوفة الغشاء إلى MM البارد المثلج واخلطه عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 10 مرات

  1. ماصة خليط التراكب ببطء فوق الخلايا ، ووضع اللوحة مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية.
  2. استبدل الوسط بوسيط صيانة جديد كل 24 ساعة.
  3. في 24 ساعة بعد الطلاء ، انقل الوسط المشروط من البئر المخصص لفحوصات MTT والألبومين. قم بتخزين الوسط المشروط في أنبوب microfuge حتى يصبح جاهزا لإجراء فحص الألبومين. انتقل إلى الخطوة 7.1 لفحص MTT.
    ملاحظة: قم بتخزين الوسط المشروط عند 4 درجات مئوية للتخزين على المدى القصير (أقل من يوم). للتخزين لفترة أطول، قم بتخزين الوسط عند -80 درجة مئوية.

7. تحليل كفاءة التسليم ، والجدوى ، والتحرير على الهدف في خلايا كبد الماوس الكهربائي

  1. قياس الجدوى باستخدام مقايسة MTT
    1. قم بإعداد محلول مخزون MTT 12 mM عن طريق إضافة 1 مل من PBS إلى قارورة واحدة 5 ملغ من MTT.
    2. أضف 150 ميكرولتر من محلول مخزون MTT إلى الآبار واحتضنها لمدة 24 ساعة.
    3. بعد الحضانة ، أضف 1.5 مل من محلول كبريتات الصوديوم دوديسيل هيدروكلوريد (SDS-HCl) إلى كل بئر ثم ماصة للخلط.
    4. احتضن اللوحة لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية وابحث عن تغيير في لون الوسط من الشفاف إلى الأرجواني للإشارة إلى الخلايا القابلة للحياة.
    5. امزج كل عينة مرة أخرى باستخدام ماصة واقرأ الامتصاص عند 570 نانومتر باستخدام قارئ microplate.
    6. حساب الجدوى الطبيعية للعينات المعالجة بمعيار Cas9 باستخدام Eq (1):
      Equation 1 (1)
  2. فحص الألبومين لتقييم وظائف خلايا الكبد
    1. انقل 50 ميكرولتر من الوسط المشروط إلى الآبار الموجودة في اللوحة التي توفرها مجموعة الألبومين. تغطية الآبار وحضانة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    2. اغسل الآبار 5x ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل.
    3. اقلب اللوحة لتفريغ كل بئر على المناديل الورقية واضغط عدة مرات.
    4. بعد الغسيل ، أضف 50 ميكرولتر من الجسم المضاد البيوتينيل المقدم في مجموعة فحص الألبومين إلى كل بئر واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    5. كرر الخطوات 5.2.2-5.2.3 لغسل الآبار.
    6. أضف 50 ميكرولتر من الستربتافيدين بيروكسيديز المقدم في مجموعة فحص الألبومين إلى كل بئر واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    7. كرر الخطوة 5.2.2.
    8. أضف 50 ميكرولتر من ركيزة الكروموجين المتوفرة في مجموعة فحص الألبومين لكل بئر واحتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اضغط برفق على اللوحة لضمان الخلط المتساوي. قم بإزالة أي فقاعات هواء بطرف ماصة.
    9. أخيرا ، أضف 50 ميكرولتر من محلول التوقف إلى كل بئر وابحث عن تغيير اللون من الأصفر إلى الأزرق للإشارة إلى الخلايا الوظيفية.
    10. تابع على الفور قراءة الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ microplate.
  3. تقدير كفاءة التسليم في الآبار المكهربة باستخدام eGFP mRNA.
    1. التقط صور تباين الطور والتألق الأخضر لخلايا الكبد بعد 24 ساعة من التفريغ الكهربائي. التقط ثلاث صور في مواقع مختلفة داخل البئر.
    2. قم بتحميل صور الخلايا إلى ImageJ. ضمن علامة التبويب صورة ، حدد النوع | 16 بت لتحويل الصورة إلى تدرج رمادي.
    3. لتمييز هياكل الخلايا في الصورة، ضمن علامة التبويب صورة ، حدد ضبط | العتبة. اضبط شريط التمرير لتمييز الخلايا.
    4. ضمن علامة التبويب عملية ، حدد طرح الخلفية لإزالة ضوضاء الخلفية .
    5. قم بحساب الخلايا بالنقر فوق علامة التبويب تحليل ثم حدد تحليل الجسيمات. انقر فوق موافق لإنشاء قائمة بالجسيمات المعدودة.
    6. احسب النسبة المئوية للخلايا الموجبة GFP بقسمة عدد الجسيمات المعدودة في صور التألق الأخضر على عدد الجسيمات المعدودة في صورة تباين الطور المقابلة.
  4. تحليل نشاط Cas9 المستهدف
    1. استخراج الحمض النووي الجينومي من الخلايا الكهربائية.
      1. إزالة الوسط من اللوحة بعد 3 أيام من الكهربية ، وإضافة 500 ميكرولتر من 0.25 ٪ التربسين. تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ماصة عدة مرات بعد الحضانة لضمان انفصال خلايا الكبد عن اللوحة.
      2. انقل تعليق الخلايا التربسيني إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة وقم بالدوران في جهاز طرد مركزي على الطاولة عند 800 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الغزل ، افحص الأنابيب بحثا عن الكريات.
      3. قم بإزالة السوبر ناتانت الذي يحتوي على التربسين عن طريق السحب. تأكد من عدم إزعاج الكريات. أعد تعليق الكريات في 80 ميكرولتر من محلول استخراج الحمض النووي. إذا كان من الصعب رؤية الكريات ، فأعد تعليق محتوى الأنبوب في 50 ميكرولتر من محلول استخراج الحمض النووي.
      4. دوامة لمدة 30 ثانية لضمان إنعاش الكريات. انقل التعليق إلى أنابيب PCR المقسمة إلى شريط ووضعها في جهاز التدوير الحراري. اركض لمدة 15 دقيقة عند 95 درجة مئوية و 8 دقائق عند 68 درجة مئوية.
    2. PCR-تضخيم الموقع على الهدف.
    3. اتبع الإجراء الموضح أدناه لتضخيم Hpd على المنطقة المستهدفة باستخدام بوليميراز الحمض النووي.
      1. تحضير تفاعل يحتوي على 0.5 ميكرولتر من 10 mM dNTPs ، 0.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي الأمامي ، 0.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي العكسي ، 0.125 ميكرولتر من بوليميراز طق ، 5 ميكرولتر من الحمض النووي الجينومي المستخرج من خلايا الكبد ، و 18.375 ميكرولتر من الماء الحر من النوكليز. انظر الجدول التكميلي S1 للاطلاع على تسلسلات التمهيدي.
      2. دوامة لفترة وجيزة وبسرعة الطرد المركزي مزيج PCR للتأكد من أن الحل في الجزء السفلي من الأنبوب.
      3. ضع مزيج PCR في جهاز تدوير حراري وتضخيمه في ظل هذه الظروف: 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية لتمسخ ، و 30 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 57 درجة مئوية لمدة 45 ثانية للتلدين ، و 68 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، وتمديد نهائي قدره 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
        ملاحظة: تختلف درجة حرارة التلدين لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل اعتمادا على تكوين الاشعال . فكر في استخدام حاسبة درجة حرارة الانصهار قبل إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل.
      4. للتأكد من حجم المنتج الصحيح ، امزج 3 ميكرولتر من منتجات PCR مع 2 ميكرولتر من الماء و 1 ميكرولتر من صبغة 6x. تشغيل على هلام الأغاروز 1.5 ٪ وتأكيد حجم المنتج الصحيح.
    4. تنقية الحمض النووي باستخدام الخرز المغناطيسي.
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام أعمدة الدوران لتنظيف PCR. فيما يلي إجراءات لتنقية منتجات PCR باستخدام الخرز المغناطيسي.
      1. قم بإزالة الخرز المغناطيسي من 4 درجات مئوية واسمح لها بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة.
      2. دوامة لفترة وجيزة وبسرعة الطرد المركزي مزيج PCR.
      3. أضف كمية من الخرز تساوي 1.8× حجم مزيج PCR. ماصة مزيج حبة PCR 10x لضمان خلط الحل بالتساوي.
      4. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
      5. انقل مزيج حبة PCR إلى لوحة PCR وضعه على لوحة مغناطيسية.
      6. احتضن اللوحة على المغناطيس لمدة 5 دقائق. بعد 5 دقائق ، تحقق من أن المحلول واضح ، وأن الخرز مرتبط بالمغناطيس قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
      7. تخلص من السوبرناتانت.
      8. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪ إلى البئر واحتضنها لمدة 30 ثانية.
        ملاحظة: يجب تحضير الإيثانول بنسبة 70٪ قبل وقت قصير من إجراء التنظيف لمنع فقدان الحمض النووي.
      9. تخلص من supernatant وكرر الخطوة 7.4.4.8.
      10. قم بإزالة المادة الفائقة واتركها لتجف لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة آثار الإيثانول.
      11. قم بإزالة اللوحة من المغناطيس وأضف 22 ميكرولتر من الماء إلى العينة. ماصة لأعلى ولأسفل 10x لخلط الماء والخرز.
      12. احتضان العينات لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      13. انقل اللوحة مرة أخرى إلى المغناطيس واحتضنها لمدة 3 دقائق أو حتى يصبح المحلول واضحا.
      14. انقل 20 ميكرولتر من العينة إلى أنبوب PCR. احرص على عدم نقل الخرز.
    5. تسلسل منقي أمبليكون الحمض النووي عن طريق تسلسل سانجر.
    6. قم بتحميل ملفات تسلسل .ab1 للعينات المعالجة والتحكم (غير المعالجة) إلى تتبع indels بواسطة التحلل (TIDE)16 لتحديد كمية indels في الموقع المستهدف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عزل خلايا الكبد الأولية القابلة للصفاء عن الكبد
يوضح الشكل 1 العملية الشاملة لتروية الكبد وعزل خلايا الكبد. في هذه التجربة ، تم استخدام الفئران C57BL6/6J من النوع البري ، التي يبلغ عمرها 8-10 أسابيع. من المتوقع أن ينتج عن الإجراء 20-50 × 106 خلايا لكل فأر مع قابلية البقاء بين 85٪ و 95٪. إذا كانت الجدوى <70٪ ، فيجب اتباع علاج percoll لإزالة الخلايا الميتة. يجب طلاء خلايا الكبد المعزولة حديثا على ألواح زراعة الأنسجة المغلفة بالكولاجين I أو المحتوية على النيتروجين. في غضون 3-12 ساعة من الطلاء ، من المتوقع أن تلتصق خلايا الكبد باللوحة ، ويفترض مورفولوجيا الخلية مظهرا مضلعا أو سداسيا نموذجيا في غضون 24 ساعة (الشكل 2). خلايا الكبد هي الخلايا الوحيدة في الكبد التي تخزن الجلوكوز في شكل الجليكوجين. للتحقق من نقاء الخلايا المعزولة ، يتم إجراء تلطيخ الجليكوجين باستخدام كاشف حمض شيف الدوري في 24 ساعة بعد الطلاء. يظهر سيتوبلازم خلايا الكبد الملطخة أرجوانيا (الشكل 3).

تحويل كهربية CRISPR-Cas9 RNPs والحمض النووي الريبي المرسال إلى خلايا كبد الفئران المعزولة
تم تحويل خلايا كبد الفئران المعزولة حديثا بالكهرباء باستخدام eGFP mRNA أو Cas9 mRNA جنبا إلى جنب مع sgRNA المستهدف Hpd أو بروتين Cas9 المركب مع Hpd-sgRNA (RNP). تم تعديل Hpd-sgRNA كيميائيا مع روابط فوسفوروثيوات 2′-O-methyl مع أول وآخر ثلاثة نيوكليوتيدات متتالية على النهايتين 5′ و 3′14. العقدية المقيحة تم استخدام Cas9 للتجارب. تم تصوير خلايا الكبد بعد 24 ساعة من الفحص الكهربائي باستخدام المجهر الفلوري ، وتم حساب النسبة المئوية للخلايا الموجبة GFP في الصور (الشكل 4A). في المتوسط ، كان 89.8٪ [النطاق 87.1٪ -92.4٪] من خلايا الكبد إيجابية GFP. في 3 أيام بعد الكهربية ، تم تحليل عمليات الإدراج والحذف التي يسببها Cas9 (indels) في موضع Hpd باستخدام TIDE16. تظهر النتائج أن الإنديل على الهدف يبلغ 47.4٪ في خلايا الكبد الكهربائية مع CRISPR-Cas9 mRNA و 78.4٪ indels ل Cas9 RNP (الشكل 4B). تم إجراء فحوصات MTT والألبومين لتقييم جدوى خلايا الكبد ووظائفها بعد فحص CRISPR-Cas9 بالكهرباء. تظهر نتائج MTT قابلية للاستمرار بنسبة 35.4٪ و 45.9٪ في خلايا الكبد المعالجة ب CRISPR-Cas9 mRNA و RNP ، على التوالي (الشكل 4C). تمشيا مع نتائج MTT ، كانت مستويات الألبومين الطبيعية 31.8٪ في خلايا الكبد المعالجة ب Cas9 mRNA و 34.5٪ ل Cas9 RNP (الشكل 4D).

Figure 1
الشكل 1: مخطط لبروتوكول تروية خلايا الكبد وعزلها. بعد تقليب الوريد الأجوف السفلي ، يتم قطع الوريد البابي ، ويتم ضخ حلول التروية 1 و 2 و 3 عبر الكبد. تمزق كبسولة الكبد ، ويتم إطلاق الخلايا باستخدام رافع الخلايا. الخلايا التي تم إطلاقها متوترة ومرفوضة مركزيا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: خلايا الكبد الأولية المعزولة حديثا. تم طلاء خلايا الكبد المعزولة من الفئران C57BL/6J على ألواح 6 آبار مغلفة بالكولاجين I-coated مع وسائط طلاء خلايا الكبد. الصور التي تم التقاطها في 24 ساعة بعد الطلاء. شريط المقياس = 400 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تلطيخ الجليكوجين. تم تلطيخ خلايا الكبد الأولية للفئران المعزولة حديثا من أجل الجليكوجين لتأكيد النقاء. تم التلطيخ باستخدام كاشف شيف في 24 ساعة بعد الطلاء. السيتوبلازم من خلايا الكبد الملطخة تظهر أرجوانية. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: القابلية الكهربائية ل CRISPR-Cas9 التي تستهدف Hpd في خلايا كبد الفئران الأولية المعزولة حديثا. (أ) تباين الطور وصور الفحص المجهري الفلوري الأخضر لخلايا كبد الفئران المعزولة حديثا في الساعة 24 بعد التفريغ الكهربائي. الصور في الصف العلوي هي خلايا كبدية منقولة باستخدام eGFP mRNA والصور الموجودة في الصف السفلي هي خلايا كبدية غير منقولة. أشرطة المقياس = 400 ميكرومتر (B) indels على الهدف لخلايا كبد الماوس المكهربة مع Cas9 mRNA جنبا إلى جنب مع sgRNA أو RNP. (ج) إمكانية الصلاحية الطبيعية لخلايا الكبد الضابطة غير المنقولة في مقايسة MTT عند 24 ساعة بعد المعالجة الكهربائية. (د) مستويات الألبومين في الوسط المشروط الطبيعي إلى خلايا الكبد الضابطة غير المنقولة التي تقاس عند 24 ساعة بعد المعالجة الكهربائية (n = 3) مع نسختين متماثلتين تقنيتين. تم إجراء التحليل الإحصائي بواسطة اختبارات t غير المقترنة. تم تعديل هذا الرقم من 14. الاختصارات: Hpd = 4-هيدروكسي فينيل بيروفات ثنائي الأكسجيناز; CRISPR = التكرارات الباليندرومية القصيرة المجمعة بانتظام ؛ Cas9 = البروتين المرتبط بكريسبر 9; sgRNA = الحمض النووي الريبي دليل واحد; RNP = البروتين النووي الريبي; INDEL = الإدراج والحذف; MTT = 3-[4,5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-يل]-2,5 بروميد رباعي الفينيل ثنائي الفينيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: استكشاف الأخطاء وإصلاحها لتروية الكبد وبروتوكول عزل خلايا الكبد. يسلط هذا الجدول الضوء على المشاكل الشائعة التي تمت مواجهتها أثناء البروتوكول ويقترح الحلول الممكنة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الشكل التكميلي S1: تجويف بطن الفأر أثناء الجراحة. يتم إدخال القسطرة في الوريد الأجوف السفلي (النقطة الزرقاء) قبل الفروع الكلوية (غير مرئية). الاختصارات: L = الكبد; K = الكلى; I = الأمعاء الدقيقة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي S1: دليل Cas9 وتسلسل التمهيدي PCR. تسلسل الدليل و PAM ل sgRNA التي تستهدف Hpd ، وتسلسلات PCR التمهيدية لتضخيم Hpd. الاختصارات: Hpd = 4-هيدروكسي فينيل بيروفات ثنائي الأكسجيناز; CRISPR = التكرارات الباليندرومية القصيرة المجمعة بانتظام ؛ Cas9 = البروتين المرتبط بكريسبر 9; sgRNA = الحمض النووي الريبي دليل واحد; PAM = زخارف مجاورة للفاصل الأولي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوات الموضحة في بروتوكول عزل خلايا الكبد صعبة وتتطلب ممارسة للكفاءة. هناك العديد من الخطوات الرئيسية لعزل خلايا الكبد بنجاح عن الكبد. أولا ، يعد التعليب السليم للوريد الأجوف السفلي ضروريا لتروية الكبد الكاملة. يشير عدم وجود ابيضاض في الكبد بعد التروية إلى إزاحة القسطرة (الجدول 1). تم تعليب الوريد الأجوف السفلي (التروية الرجعية) في الإجراء لأنه أبسط وأكثر سهولة من الوريد البابي (التروية قبل الصف)17,18. تستخدم بعض البروتوكولات الغرز لتأمين القسطرة19; ومع ذلك ، فإن الغرز تعقد العملية. يمكن أن يؤدي خياطة القسطرة إلى نتائج غير مرغوب فيها، مثل وضع القسطرة في غير موضعها وجعل من المستحيل ضبط موضعها. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن إجراء القنية في الكبد دون إزالة الإبرة ، مما قد يزيد من تبسيط تروية الكبد. توصيل المضخة بالقسطرة غير ضروري باستخدام الإبرة في الوريد. بالإضافة إلى ذلك ، هناك احتمال أقل لسحب القسطرة عن طريق الخطأ وتشكيل جلطات دموية. إدخال طرف القسطرة فقط بزاوية مسطحة بالنسبة للوريد عزز القنطرة. يحتوي الوريد الأجوف السفلي على عدة فروع ، لذا فإن إدخال القسطرة في الموقع الخطأ سيؤدي إلى تروية في جزء آخر من الجسم وليس الكبد (الجدول 1). وبالتالي ، من الضروري وضع القسطرة في موقع يتجنب الفروع. سوف تختلف بنية الأوعية الدموية قليلا بين الفئران المختلفة. وبالتالي ، من المهم فحص الأوردة قبل التعليب لتحديد أفضل موقع لحقن القسطرة. يعد التدفق العكسي للدم داخل القسطرة بعد إزالة الإبرة مؤشرا ممتازا على القنية المناسبة. يمكن أيضا التحقق من القنية المناسبة من خلال البحث عن تورم الكبد عند تطبيق الضغط مؤقتا على الوريد البابي (الخطوة 1.3.13).

عند عزل خلايا الكبد ، فإن الخطوة الحرجة الثانية هي التعرف على وقت حدوث هضم كامل للكبد. جودة الإنزيم وتركيزه ضروريان للهضم السليم. على النقيض من البروتوكولات الموجودة في 20,21 ، يقترح هذا البروتوكول استخدام Liberase ، الذي يتكون من شكلين متساويين من الكولاجيناز ، لأنه يوفر اتساقا أفضل في نشاط الإنزيم ويقلل من التباين من دفعة إلى دفعة من الكولاجينازالعادي 22. الاختلافات في جودة الإنزيم الهضمي ونشاطه يمكن أن تسبب تناقضات في العزلة. من الضروري مراقبة الكبد أثناء الهضم وإيقاف الهضم مباشرة بعد تليين الكبد. سيكون الكبد المهضوم مرنا ويظهر فقدانا في المرونة يتم التحقق منه عن طريق تثبيط الكبد باستخدام ملقط أو مسحات قطنية للتأكد من أن المسافات البادئة تتشكل دون ارتداد الأنسجة مرة أخرى. في هذا البروتوكول ، الحد الأقصى لكمية محلول Liberase الموصى به لكل كبد هو 50 مل ؛ حجم أكبر من شأنه أن يؤدي إلى فرط الهضم. إذا تم تنفيذ القنية بشكل مثالي ، فإن 30 مل من محلول Liberase يكفي لتحقيق الهضم السليم. الخطوات الحاسمة الأخيرة للإجراء هي خطوات العزل والغسيل. بعد تشريح الكبد ونقله إلى طبق بتري معقم يحتوي على DMEM بارد مع FBS ، من الضروري تجنب تقطيع الكبد إلى أجزاء. في هذه المرحلة ، استخدم رافع الخلايا لتحرير الخلايا بلطف وزيادة صلاحية الخلية. إمالة الطبق لغمر الكبد في DMEM يسهل إطلاق الخلايا من الكبسولة إلى التعليق ويجب أن يتم ببطء وعلى الجليد. يجب أن يكون من السهل تعطيل كبسولة غليسون أثناء خطوة الإطلاق ، ويجب أن يصبح الوسط غائما وبنيا. الصعوبة عند تعطيل الكبسولة هي مؤشر على سوء الهضم (الجدول 1).

هذا البروتوكول مناسب لتوليد مستويات عالية من تعديلات CRISPR-Cas9 في خلايا كبد الماوس المعزولة حديثا. تمت مقارنة Indels الناتجة عن Cas9 RNP و mRNA في الدراسة. لوحظت مستويات أعلى من تحرير الجينات في خلايا الكبد الكهربية باستخدام Cas9 RNP من mRNA ، وهو ما يتفق مع نتائج الدراسات الأخرى14،23،24. ميزة Cas9 RNP على mRNA هي أنه يوفر تحريرا أقل خارج الهدف لأن بروتين Cas9 موجود في الخلية لفترات أقصر من mRNA23,24. نظرا لأن كفاءة sgRNAs تختلف بناء على التصميم والموقع المستهدف ، يجب تصميم واختبار sgRNAs متعددة لكفاءة التحرير في الجين محل الاهتمام. حدد تصميم تسجيل النقاط الأعلى خصوصية عند الاختيار بين sgRNA الذي يتمتع بكفاءة جينية عالية. إذا كان تحرير الجينات منخفضا باستمرار، ففكر في المشاركة في تقديم مراسل، مثل eGFP mRNA، لتأكيد التسليم. يمكن أن تشير المستويات المنخفضة من الخلايا الإيجابية eGFP بعد التفريغ الكهربائي إلى انتهاء صلاحية المخزن المؤقت الكهربائي أو مشكلات جهاز الكهربية أو فقاعات الهواء في التفاعل. إذا كانت هناك أعداد كبيرة من الخلايا الإيجابية eGFP ولكن كفاءة تحرير منخفضة ، فاختبر تصميم sgRNA في خط خلية لتأكيد نشاط التحرير وضبط كميات Cas9 و sgRNA المكهربة في الخلايا. أخيرا ، ضع في اعتبارك الطريقة المستخدمة لتقييم نشاط التحرير. يمكن للمقايسات القائمة على الجل ، مثل T7 Endonuclease I ، أن تقلل من تحرير الجينات بسبب الحساسية المنخفضة لعدم تطابق 1 نقطة أساس في موقع القطع. التسلسل العميق هو الطريقة الأكثر دقة لقياس تحرير الجينات Cas9 ، خاصة بالنسبة للأحداث منخفضة التحرير في المواقع غير المستهدفة.

جانب آخر صعب من البروتوكول هو زراعة خلايا الكبد المعزولة حديثا بعد الكهربية. يجب على المستخدمين التعامل مع الخلايا بلطف خلال كل خطوة من خطوات البروتوكول للحصول على خلايا كبدية قابلة للحياة وقابلة للصفير بعد التفريغ الكهربائي. تجنب تشتيت خلايا الكبد عن طريق الدوامة. بدلا من ذلك ، قم بهز الخلايا التي تحتوي على القارورة بلطف حتى يتم إنعاش الخلايا. عند نقل خلايا الكبد، استخدم أطراف ماصة واسعة التجويف للحفاظ على قابلية البقاء. إن احتضان الكوفيت على الجليد لمدة 15 دقيقة بعد التفريغ الكهربائي يسمح لغشاء الخلية بإعادة الإغلاق وتعزيز قابلية البقاء. بعد الطلاء ، ضع الصفيحة في الحاضنة وحرك الصفيحة بلطف أفقيا ورأسيا في حركة من الشمال إلى الجنوب ومن الشرق إلى الغرب لضمان تشتت خلايا الكبد بالتساوي والحفاظ على صلاحية الخلية. إذا فشلت خلايا الكبد في الالتصاق بالصفيحة ، ففكر في زيادة عدد الخلايا إلى 1.3 × 106 في تفاعل الكهربية.

أحد التطبيقات الواعدة للبروتوكول هو توليد نماذج الفئران من IMDs البشرية للكبد. وقد ثبت أن خلايا كبد الفئران الإيجابية للترميز الجيني لهيدرولاز فاماريلاسيتواتات (Fah) تندمج الكبد بكفاءة وتعيد تعبئته بعد الزرع في الفئران التي تعاني من نقص في فاه (Fah-/-)25. هناك نهج جديد لتطوير نماذج الفئران من IMDs للكبد عن طريق إلكتروبورات كريسبر-كاس9 في خلايا كبد الفئران البرية لإدخال التعديلات المرتبطة بالمرض ، تليها زرع خلايا الكبد المعدلة جينيا في الفئران Fah-/- . سيكون لخلايا الكبد التي تم تحريرها بواسطة Cas9 ميزة انتقائية طبيعية بعد الزرع مقارنة بالخلايا الأصلية التي تعاني من نقص Fah لإعادة ملء الكبد.

في الختام ، يزود هذا البروتوكول المستخدمين بالقدرة على عزل خلايا الكبد الأولية من كبد الفأر ، تليها تحرير الجينات باستخدام CRISPR-Cas9 mRNA و RNPs. يمكن تعديل البروتوكول للاستخدام في سلالات مختلفة من الفئران لدراسة أنواع مختلفة من الأمراض الوراثية التي تؤثر على الكبد في المختبر وفي الجسم الحي واختبار الأساليب العلاجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة للإفصاح عنها.

Acknowledgments

تلقت RNC تمويلا من مركز الهندسة الحيوية في ساوث كارولينا لتجديد وتشكيل الأنسجة منحة تجريبية مدعومة من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIGMS) التابع للمعاهد الوطنية للصحة ، والجمعية الأمريكية لدراسة مؤسسة أمراض الكبد ، والجمعية الأمريكية للعلاج الجيني والخلوي تحت أرقام المنح P30 GM131959 ، 2021000920 ، 2022000099 ، على التوالي. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للجمعية الأمريكية للعلاج الجيني والخلوي أو الجمعية الأمريكية لدراسة أمراض الكبد المؤسسة. تم إنشاء مخطط الشكل 1 مع BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural USA Scientific 1402-4700
6-well Collagen Plates Advanced Biomatrix 5073
accuSpin Micro 17R Fisher Scientific 13-100-675
All-in-one Fluorescent Microscope Keyence BZ-X810
Analog Vortex Mixer VWR 97043-562
ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL ThermoFisher Scientific 2079GPK
Automated Cell Counter Bio-Rad Laboratories TC20
Blue Wax Dissection Tray Braintree Scientific Inc. DTW1 9" x 6.5" x 1/2"+F21
Cell scraper/lifter Argos Technologies UX-04396-53 Non-pyrogenic, sterile
Conical tubes (15 mL) Fisher Scientific 339650
Conical tubes (50 mL) Fisher Scientific 14-432-22
Cotton applicators Fisher Scientific 22-363-170
Curved scissors Cooper Surgical 62131
Disposable Petri Dishes Falcon 351029 100mm,sterile
Disposable Petri Dishes VWR 25373-100 35mm, sterile
Epoch Microplate Spectrophotometer BioTek Instruments 250082
Falcon Cell strainer (70 µm) Fisher Scientific 08-771-2
Forceps Cooper Surgical 61864 Euro-Med Adson Tissue Forceps
IV catheters  BD 382612 24 G x 0.75 in
IV infusion set Baxter 2C6401
MyFuge 12 Mini Centrifuge Benchmark Scientific 1220P38
Needles Fisher Scientific 05-561-20 25 G
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001 Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes
Peristaltic Pump Masterflex  HV-77120-42 10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC
Precision pump tubing Masterflex HV-96410-14 25 ft, silicone
Primaria Culture Plates Corning Life Sciences 353846 Nitrogen-containing tissue culture plates
Serological Pipets (25 mL) Fisher Scientific 12-567-604
Syringes BD 329464 1 mL, sterile
T100 Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories 1861096
Water bath ALT 27577 Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 IDT 1081058
Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL Fisher Scientific NC9959336
CleanCap Cas9 mRNA Trilink Biotechnologies L-7606-100
CleanCap EGFP mRNA Trilink Biotechnologies L-7201-100
Corning Matrigel Matrix Corning Life Sciences 356234
DMEM ThermoFisher Scientific 11885076 Low glucose, pyruvate
Ethanol 70% VWR 71001-652
Fetal bovine serum Thermoscientific 26140-079
Hepatocyte Maintenance Medium (MM) Lonza MM250
Hepatocyte Plating Medium (PM) Lonza MP100
Mouse Albumin ELISA Kit Fisher Scientific NC0010653
Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit Lonza VPL-1004
OneTaq HotStart DNA Polymerase New England Biolabs M0481L
PBS 10x pH 7.4  Thermoscientific 70011-044 No calcium or magnesium chloride
Percoll (PVP solution) Santa Cruz Biotechnology sc-500790A
Periodic acid Sigma-Aldrich P7875-25G
Permount Mounting Medium VWR 100496-550
QuickExtract DNA Extraction Solution Lucigen Corporation QE05090
Schiff’s fuchsin-sulfite reagent Sigma-Aldrich S5133
Trypsin-EDTA (0.25%) ThermoFisher Scientific 25200056 Phenol red
Vybrant MTT Cell Viability Assay ThermoFisher Scientific V13154
Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized)  Stable at 4 °C for 2 months
EBSS Fisher Scientific 14155063 Complete to 200 mL
EGTA (0.5 M) Bioworld 40520008-1 200 µL
HEPES (pH 7.3, 1 M) ThermoFisher Scientific AAJ16924AE 2 mL 
Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized)  Stable at 4 °C for 2 months
CaCl2·2H20 (1.8 mM) Sigma C7902-500G 360 µL of 1 M stock 
EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) Fisher Scientific 14-155-063 Complete to 200 mL
HEPES (1 M) ThermoFisher Scientific AAJ16924AE 2 mL 
MgSO4·7H20 (0.8 mM) Sigma 30391-25G 160 µL of 1 M stock
Perfusion Solution 3  Prepared fresh prior to use
Solution 2 50 mL
Liberase Roche 5401127001 0.094 Wunsch units/mL
Mouse Anesthetic Cocktail 
Acepromzine 0.25 mg/mL final concentration
Ketamine 7.5 mg/mL final concentration
Xylazine 1.5 mg/mL final concentration
Software URL
Benchling https://www.benchling.com/
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/
TIDE: Tracking of Indels by Decomposition https://tide.nki.nl/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pampols, T. Inherited metabolic rare disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).
  2. Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction. Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).
  3. Arnon, R., et al. Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience. Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).
  4. Maiorana, A., et al. Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia. Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).
  5. OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver. , Available from: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx (2019).
  6. Fabris, L., Strazzabosco, M. Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities. Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).
  7. Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).
  8. Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
  9. Lima, A., Maddalo, D. SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research. Frontiers in Oncology. 11, 1117 (2021).
  10. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  11. Ye, L., et al. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).
  12. Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
  13. Hoban, M. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells. Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).
  14. Rathbone, T., et al. Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes. The CRISPR Journal. , (2022).
  15. Benchling [Biology Software]. , Available from: https://benchling.com (2022).
  16. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
  17. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
  18. Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).
  19. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  20. Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
  21. Kim, Y., et al. Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure. Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).
  22. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  23. Lattanzi, A., et al. Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements. Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).
  24. Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
  25. Grompe, M. Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management. Tanguay, R. M. , Springer International Publishing. 215-230 (2017).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 184 ،
التسليم بوساطة الكهربية للبروتينات الريبونوكليوكرية Cas9 والحمض النووي الريبي المرسال إلى خلايا كبد الفئران الأولية المعزولة حديثا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rathbone, T., Ates, I., Stuart, C.,… More

Rathbone, T., Ates, I., Stuart, C., Parker, T., Cottle, R. N. Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes. J. Vis. Exp. (184), e63828, doi:10.3791/63828 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter