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Bioengineering

ताजा पृथक प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स में कैस 9 राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन और एमआरएनए की इलेक्ट्रोपोरेशन-मध्यस्थता डिलीवरी

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63828
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Bioengineering, Clemson University, 2Godley Snell Research Center, Clemson University
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल यकृत से प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स को अलग करने और यकृत के विरासत में मिली चयापचय बीमारी से जुड़े चिकित्सीय लक्ष्य जीन को बाधित करने के लिए राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन और एमआरएनए के रूप में सीआरआईएसपीआर-कैस 9 को इलेक्ट्रोपोरेट करने की तकनीकों का वर्णन करता है। वर्णित विधियों के परिणामस्वरूप इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद उच्च व्यवहार्यता और जीन संशोधन के उच्च स्तर होते हैं।

Abstract

यह प्रोटोकॉल राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) और एमआरएनए के रूप में सीआरआईएसपीआर-कैस 9 के इलेक्ट्रोपोरेशन-मध्यस्थता वितरण के बाद प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स को अलग करने के लिए एक तेज़ और प्रभावी विधि का वर्णन करता है। प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स को तीन-चरण प्रतिगामी छिड़काव विधि का उपयोग करके अलग किया गया था जिसके परिणामस्वरूप यकृत प्रति 50 × 106 कोशिकाओं और >85% की सेल व्यवहार्यता की उच्च पैदावार हुई थी। यह प्रोटोकॉल चढ़ाना, धुंधला, और हेपेटोसाइट्स संवर्धन के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करता है। परिणाम बताते हैं कि इलेक्ट्रोपोरेशन 89% की उच्च अभिकर्मक दक्षता प्रदान करता है, जैसा कि ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिशत और माउस हेपेटोसाइट्स में >35% की मामूली सेल व्यवहार्यता द्वारा मापा जाता है।

इस दृष्टिकोण की उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए, सीआरआईएसपीआर-कैस 9 को हाइड्रोक्सीफेनिलपाइरूवेट डाइऑक्सीजिनेज जीन को लक्षित करते हुए प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स में प्रूफ-ऑफ-प्रिंसिपल जीन संपादन के रूप में इलेक्ट्रोपोरेट किया गया था ताकि यकृत के विरासत में मिले चयापचय रोग (आईएमडी) से संबंधित चिकित्सीय जीन को बाधित किया जा सके। एमआरएनए के साथ 47% संपादन दक्षता की तुलना में आरएनपी के लिए 78% का उच्च ऑन-टारगेट संपादन देखा गया था। हेपेटोसाइट्स की कार्यक्षमता का मूल्यांकन इन विट्रो में एक एल्बुमिन परख का उपयोग करके किया गया था जिसने संकेत दिया था कि आरएनपी और एमआरएनए के रूप में सीआरआईएसपीआर-सीएएस 9 देने से प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स में तुलनीय सेल व्यवहार्यता होती है। इस प्रोटोकॉल के लिए एक आशाजनक आवेदन जिगर को प्रभावित मानव आनुवंशिक रोगों के लिए माउस मॉडल की पीढ़ी है।

Introduction

यकृत के आईएमडी आनुवंशिक विकार हैं जो चयापचय में शामिल एक महत्वपूर्ण यकृत एंजाइम की कमी की विशेषता है जो विषाक्त चयापचयों के संचय की ओर जाता है। उपचार के बिना, यकृत के आईएमडी के परिणामस्वरूप अंग विफलता या समय से पहले मृत्यु 1,2 होती है। यकृत के आईएमडी वाले रोगियों के लिए एकमात्र उपचारात्मक विकल्प ऑर्थोटोपिक यकृत प्रत्यारोपण है, जो दाता अंगों की कम उपलब्धता और प्रक्रिया 3,4 के बाद इम्यूनोसप्रेसिव थेरेपी से जटिलताओं के कारण सीमित है। ऑर्गन प्रोक्योरमेंट एंड ट्रांसप्लांटेशन नेटवर्क द्वारा एकत्र किए गए हालिया आंकड़ों के अनुसार, यकृत प्रत्यारोपण प्रतीक्षा सूची में केवल 40% -46% वयस्क रोगियों को एक अंग प्राप्त होता है, जबकि इनमें से 12.3% रोगियों की मृत्यु प्रतीक्षा सूची5 पर होती है। इसके अलावा, सभी दुर्लभ जिगर की बीमारियों में से केवल 5% में एफडीए-अनुमोदित उपचारहै 6. यह स्पष्ट है कि यकृत के आईएमडी के लिए उपन्यास उपचार की महत्वपूर्ण आवश्यकता है। हालांकि, नए चिकित्सीय विकल्प विकसित करने के लिए उपयुक्त रोग मॉडल की आवश्यकता होती है।

इन विट्रो और इन विवो सिस्टम का उपयोग करके मानव रोगों का मॉडलिंग प्रभावी उपचार विकसित करने और यकृत के आईएमडी की विकृति का अध्ययन करने के लिए एक बाधा बनी हुई है। दुर्लभ जिगर की बीमारियों वाले रोगियों से हेपेटोसाइट्स7 प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं। रोग विकृति विज्ञान की समझ विकसित करने और चिकित्सीय रणनीतियों के परीक्षण के लिए पशु मॉडल महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, एक बाधा घातक उत्परिवर्तन ले जाने वाले भ्रूण से मॉडल उत्पन्न कर रही है। उदाहरण के लिए, जग 1 जीन के 5'-अंत के पास 5 केबी अनुक्रम के समरूप विलोपन वाले भ्रूण के साथ अलागिल सिंड्रोम (एएलजीएस) के माउस मॉडल बनाने के प्रयासों के परिणामस्वरूप भ्रूण8 की प्रारंभिक मृत्यु हो गई। इसके अलावा, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में जीन संपादन द्वारा माउस मॉडल उत्पन्न करना समय- और संसाधन-गहन9 हो सकता है। अंत में, उत्परिवर्तन लक्षित ऊतक के बाहर दिखाई देंगे, जिससे भ्रमित चर हो सकते हैं जो रोग के अध्ययन में बाधा डाल सकतेहैं 9. दैहिक जीन संपादन यकृत ऊतक में आसान संपादन की अनुमति देगा और भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करके मॉडल उत्पन्न करने से जुड़ी चुनौतियों को दरकिनार कर देगा।

इलेक्ट्रोपोरेशन कोशिका झिल्ली को पारगम्य बनाने के लिए उच्च वोल्टेज धाराओं को लागू करके सीधे नाभिक में सीआरआईएसपीआर-कैस 9 की डिलीवरी को सक्षम बनाता है और कई सेल प्रकारों के साथ संगत है, जिसमें मानव भ्रूण स्टेम सेल, प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल और न्यूरॉन्स10,11,12 जैसे अभिकर्मक तकनीकों के लिए अपरिवर्तनीय हैं . हालांकि, कम व्यवहार्यता इलेक्ट्रोपोरेशन का एक संभावित दोष है; प्रक्रिया का अनुकूलन विषाक्तता को सीमित करते हुए वितरण के उच्च स्तर का उत्पादन कर सकता है13. हाल के एक अध्ययन में सीआरआईएसपीआर-कैस 9 घटकों को प्राथमिक माउस और मानव हेपेटोसाइट्स में अत्यधिक कुशल दृष्टिकोण 14 के रूप में इलेक्ट्रोपोरेट करने की व्यवहार्यता कोदर्शाया गया है। हेपेटोसाइट्स में पूर्व विवो इलेक्ट्रोपोरेशन में यकृत के मानव आईएमडी के लिए नए माउस मॉडल उत्पन्न करने के लिए लागू करने की क्षमता है।

यह प्रोटोकॉल यकृत से माउस हेपेटोसाइट्स को अलग करने और बाद में सीआरआईएसपीआर-कैस 9 को आरएनपी परिसरों के रूप में इलेक्ट्रोपोरेट करने के लिए एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रक्रिया प्रदान करता है, जिसमें कैस 9 प्रोटीन और सिंथेटिक सिंगल-गाइड आरएनए (एसजीआरएनए), या कैस 9 एमआरएनए शामिल हैं। इसके अलावा, प्रोटोकॉल ताजा पृथक माउस हेपेटोसाइट्स में सीआरआईएसपीआर-कैस 9 के इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद जीन संपादन दक्षता, व्यवहार्यता और कार्यक्षमता को मापने के तरीके प्रदान करता है।

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Protocol

पशु प्रयोगों सभी संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों और क्लेम्सन विश्वविद्यालय में अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुपालन में प्रदर्शन किया गया। सर्जिकल प्रक्रियाएं 8 से 10 सप्ताह के बीच संवेदनाहारी जंगली प्रकार के सी 57 बीएल / 6 जे चूहों में की गईं।

1. पशु शल्य चिकित्सा

  1. समाधान और उपकरणों की तैयारी
    नोट: छिड़काव समाधान और संज्ञाहरण कॉकटेल व्यंजनों सामग्री की तालिका में दिखाया गया है।
    1. छिड़काव समाधान 1 (एचईपीईएस, ईजीटीए, और ईबीएसएस), छिड़काव समाधान 2 (एचईपीईएस, ईजीटीए, ईबीएसएस, सीएसीएल2, और एमजीएसओ4), और छिड़काव समाधान 3 (समाधान 2 और लाइबेरेज़) तैयार करें। सुनिश्चित करें कि समाधान अच्छी तरह से मिश्रित हैं।
    2. प्रक्रिया शुरू करने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए पानी के स्नान को 42 डिग्री सेल्सियस और प्रीवार्म छिड़काव समाधान 1, 2 और 3 पर सेट करें और उन्हें पानी के स्नान में रखें।
      नोट: छिड़काव समाधान 1 और 2 कैल्शियम को चेलेट करेगा और यकृत में रक्त को बाहर निकाल देगा। छिड़काव समाधान 3 में बाह्य मैट्रिक्स को अलग करने के लिए पाचन एंजाइम लिबेरेस होता है।
    3. शंक्वाकार ट्यूबों में डीएमईएम + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 150 मिलीलीटर रखें और उन्हें बर्फ पर रखें।
      नोट: इस माध्यम का उपयोग यकृत कैप्सूल से कोशिकाओं को छोड़ने और क्रमशः चरण 2.1 और 2.2 में पृथक हेपेटोसाइट्स को धोने के लिए किया जाएगा।
    4. अपकेंद्रित्र को 4 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    5. 70% इथेनॉल से भरे फ्लास्क में ट्यूबिंग के दोनों सिरों को रखकर पंप ट्यूबिंग को निष्फल करें और इथेनॉल को तीन बार साइकिल चलाएं।
    6. आसुत जल के साथ ट्यूबिंग को धोलें और इसे खाली करें।
    7. छिड़काव समाधान 1 के प्रीवर्म्ड 30 एमएल के साथ ट्यूबिंग भरें, इसके बाद छिड़काव समाधान 2 के 8 मिलीलीटर। यदि टयूबिंग में अभी भी अधिक तरल पदार्थ के लिए जगह है, तो छिड़काव समाधान 3 के साथ बाकी ट्यूबिंग भरें। ट्यूबिंग में हवा के बुलबुले पेश करने से बचने के लिए एक अलग छिड़काव समाधान पर स्विच करते समय पंप को रोकें।
    8. छिड़काव समाधान गर्म रखने के लिए अतिरिक्त ट्यूबिंग को 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें।
    9. पंप ट्यूबिंग के अंत को छिड़काव समाधान 3 युक्त शंक्वाकार ट्यूब में रखें, जबकि पानी के स्नान में रखा जाए।
      नोट: छिड़काव के दौरान छिड़काव समाधान 3 के साथ लगातार भरने के लिए पंप की अनुमति देने के लिए यह कदम आवश्यक है।
  2. जानवरों की तैयारी
    1. जी शरीर के वजन की खुराक पर संवेदनाहारी कॉकटेल इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा माउस को संवेदनाहारी करें। संवेदनाहारी कॉकटेल में 7.5 मिलीग्राम / एमएल केटामाइन, 0.25 मिलीग्राम / एमएल एसीप्रोमाज़िन और 1.5 मिलीग्राम / एमएल ज़ाइलाज़िन की अंतिम एकाग्रता है।
    2. माउस श्वास की निगरानी करें और जांचें कि माउस दर्द पर प्रतिक्रिया नहीं कर रहा है। माउस प्रति मिनट ~ 55-65 सांस की सांस लेने की दर है जब तक प्रतीक्षा करें, अपने पैर की उंगलियों को चुटकी लेने के लिए अनुत्तरदायी है, और एक फ्लैसिड पूंछ है। इसके अतिरिक्त, बंद आंख के औसत दर्जे की तरफ त्वचा को हल्के ढंग से छूकर पाल्पेब्रल (ब्लिंकिंग) रिफ्लेक्स की जांच करें। यदि माउस झपकी या आंख की मांसपेशियों में मरोड़ होती है, तो पूरे संवेदनाहारी कॉकटेल की खुराक को 5-10 μL तक बढ़ाएं।
    3. एक लापरवाह स्थिति में अपनी पीठ पर माउस प्लेस और पिन या टेप (पूरक चित्रा एस 1) का उपयोग कर सतह पर अंगों को सुरक्षित।
    4. 70% इथेनॉल के साथ पेट स्प्रे करें और कपास की गेंद का उपयोग करके इसे सूखा दें।
  3. जिगर छिड़काव
    1. कैंची का उपयोग करके पेट की त्वचा में यू-आकार का पार्श्व चीरा बनाएं और पक्षों के माध्यम से छेद का विस्तार करें।
    2. रिब पिंजरे के लिए त्वचा को खोलना जारी रखें।
    3. कैंची का उपयोग करके, रिब पिंजरे तक पेट की गुहा को उजागर करने के लिए पेरिटोनियम के माध्यम से काटें, सावधान रहें कि किसी भी अंग को निक न करें। संदंश के पीछे या कैंची की कुंद सतह का उपयोग करके आंतों को दाईं ओर ले जाएं। अवर वेना कावा और पोर्टल नस (पूरक चित्रा एस 1) की पहचान करें।
    4. कैथेटर के माध्यम से प्रीवॉर्ड छिड़काव समाधान फ्लश करने के लिए पंप शुरू करें।
    5. पंप बंद करो और कैथेटर को हटा दें एक बार सभी हवा प्रणाली के माध्यम से फ्लश किया गया है। नस के लिए 10 ° -20 ° कोण पर अवर वेना कावा में कैथेटर से जुड़ी सुई की नोक डालें। कैथेटर से सुई निकालें और धीरे नस के समानांतर एक आंदोलन में नस में कैथेटर धक्का।
      नोट: उपयोगकर्ता को नस में उचित कैनुलेशन को सत्यापित करने के लिए कैथेटर में रक्त के फ्लैशबैक का निरीक्षण करना चाहिए।
    6. नस में कैथेटर को आगे बढ़ाए बिना ट्यूबिंग को कैथेटर से कनेक्ट करें।
    7. मिनट प्रवाह दर के साथ पंप शुरू करें। यकृत को तुरंत एक संकेत के रूप में पीला होने की तलाश करें कि छिड़काव सफल है।
    8. कैंची का उपयोग करके पोर्टल नस काटें।
    9. धीरे-धीरे प्रवाह दर को 5 एमएल /
    10. जल निकासी को अवरुद्ध करने और अच्छे छिड़काव की सुविधा के लिए संदंश या कपास झाड़ू का उपयोग करके 3 एस के लिए अनुमानित कट साइट पर पोर्टल नस पर समय-समय पर दबाव लागू करें।
    11. एक बार छिड़काव समाधान 3 के माध्यम से बह रहा है, ध्यान से जिगर की लोच की निगरानी। यह निर्धारित करने के लिए कि यकृत नरम है या नहीं, धीरे-धीरे यकृत को कपास झाड़ू या संदंश के साथ दबाएं और जांचें कि यकृत पर इंडेंटेशन बनते हैं या नहीं। सेल व्यवहार्यता के नुकसान से बचने के लिए ओवरपरफ्यूज न करने के लिए सावधान रहें।
    12. एक बार जिगर नरम हो जाने के बाद (छिड़काव समाधान 3 के 30-50 मिलीलीटर के बाद होने वाली), पंप को रोकें, कैथेटर को हटा दें, और यकृत को सावधानीपूर्वक विच्छेदन करें। जिगर को बर्फ-ठंडा डीएमईएम + 10% एफबीएस माध्यम युक्त 100 मिमी पेट्री डिश में रखें। पित्ताशय की थैली का उत्पाद शुल्क, सावधान रहें कि इसकी सामग्री न फैले। संभावित रक्त के थक्कों को धीरे-धीरे हटाने के लिए पेट्री डिश को घुमाएं।
    13. जिगर को बर्फ-ठंडा डीएमईएम + 10% एफबीएस माध्यम युक्त एक नए पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।

2. हेपेटोसाइट अलगाव

  1. यकृत कैप्सूल से कोशिकाओं को छोड़ दें।
    1. पेट्री डिश को बर्फ पर रखें और बाँझ संदंश के दो जोड़े का उपयोग करके, धीरे-धीरे सभी लोबों पर यकृत कैप्सूल को अलग करें। हेपेटोसाइट्स को छोड़ने के लिए सेल लिफ्टर या संदंश का उपयोग करके माध्यम में यकृत को धीरे-धीरे घुमाएं। इस गति को तब तक जारी रखें जब तक कि यकृत बहुत छोटा न हो जाए और निलंबन भूरा और अपारदर्शी न हो जाए।
    2. प्लेट से जिगर के ऊतकों के अवशेषों को निकालें और कम गति के लिए सेट 25 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, ध्यान से सेल निलंबन को 100 μm सेल छलनी के साथ लगे 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (बर्फ पर पूर्वचिल्ड) में स्थानांतरित करें।
    3. सतह से शेष कोशिकाओं को धोने और इकट्ठा करने और 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए पेट्री डिश में ताजा, बर्फ-ठंडा डीएमईएम + 10% एफबीएस माध्यम जोड़ें। इस चरण को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी कोशिकाएं एकत्र न हो जाएं।
  2. नॉनपेरेन्काइमल कोशिकाओं से हेपेटोसाइट्स को धोएं और शुद्ध करें।
    1. कम मंदी पर या किसी भी ब्रेक के बिना 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 × ग्राम पर 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में एकत्र कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
    2. मलबे और गैर-सतह पर तैरनेवाला युक्त सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ट्यूब को धीरे-धीरे घुमाकर बचे हुए सतह पर तैरनेवाला में गोली को फिर से निलंबित करें। गोली को फिर से निलंबित करने के बाद, 30 मिलीलीटर ताजा, बर्फ-ठंडा डीएमईएम + 10% एफबीएस माध्यम जोड़ें।
    3. सेंट्रीफ्यूजेशन (चरण 2.2.1) और धोने (चरण 2.2.3) को तीन बार दोहराएं।
    4. बर्फ-ठंडा डीएमईएम + 10% एफबीएस माध्यम के 10 मिलीलीटर में अंतिम सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
      नोट: गोली को फिर से निलंबित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले माध्यम की मात्रा गोली के आकार पर निर्भर करती है। यदि गोली 15 मिमी से काफी छोटी है, तो बर्फ-ठंडा डीएमईएम + 10% एफबीएस माध्यम के 1-5 मिलीलीटर का उपयोग करें।
  3. सेल व्यवहार्यता मात्रा का ठहराव
    1. एक माइक्रोफ्यूज ट्यूब में, हेपेटोसाइट चढ़ाना माध्यम (पीएम) के 350 μL करने के लिए 0.4% ट्रिपैन ब्लू समाधान के 50 μL जोड़ें। फिर, मिश्रण करने के लिए कई बार एक अंतिम 1: 5 कमजोर पड़ने और पिपेट ऊपर और नीचे बनाने के लिए सेल निलंबन के 100 μL जोड़ें।
    2. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल घनत्व और व्यवहार्यता की गणना करें। गिनती करते समय, हेपेटोसाइट निलंबन को बर्फ पर रखें, और फिर हेपेटोसाइट्स को बसने से रोकने के लिए 30 आरपीएम पर सेट कक्षीय शेकर पर बर्फ की बाल्टी रखें।
    3. यदि सेल व्यवहार्यता <70% है, तो नीचे दिए गए पर्कोल उपचार और सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों का पालन करें।
      1. 9: 1 अनुपात में 10 एक्स फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ पेरकोल को पतला करें।
      2. 1: 1 अनुपात में पतला पेरकोल के साथ हेपेटोसाइट निलंबन मिलाएं।
      3. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 200 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
      4. मृत कोशिकाओं वाले सतह पर तैरनेवाला त्यागें। बर्फ-ठंडे डीएमईएम + 10% एफबीएस माध्यम में गोली को फिर से निलंबित करें।
      5. कोशिकाओं को फिर से गिनें।
  4. प्लेटेबिलिटी के लिए हेपेटोसाइट्स का परीक्षण
    1. प्रीवॉर्स्टेड पीएम के 1.5 एमएल का उपयोग करके प्रति एमएल 0.5 × 106 कोशिकाओं के घनत्व पर कोलेजन आई-लेपित 6-अच्छी तरह से प्लेटों पर कुछ कोशिकाओं को प्लेट करें।
    2. इलेक्ट्रोपोरेशन करने के लिए तैयार होने तक कक्षीय शेकर पर रहते हुए शेष कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।
    3. 37 सी पर एक पानी जैकेट सीओ2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं की प्लेट रखें सजातीय चढ़ाना सुनिश्चित करने के लिए प्लेट क्षैतिज और लंबवत धीरे से एक उत्तर से दक्षिण और पूर्व से पश्चिम गति में स्थानांतरित करें। हर 1.5 घंटे में आंदोलन को दो बार दोहराएं।
    4. चढ़ाना के बाद 3 घंटे पर सेल लगाव सत्यापित करें।
      नोट: कोशिकाओं के कम से कम 60% अच्छी गुणवत्ता हेपेटोसाइट्स के एक संकेतक के रूप में थाली का पालन करना चाहिए।
    5. संस्कृति में कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए चढ़ाना के बाद 24 घंटे में हेपेटोसाइट रखरखाव माध्यम (एमएम) को प्रीवॉर्ड करने के लिए माध्यम बदलें।
  5. ग्लाइकोजन धुंधला हो जाना
    1. कोशिकाओं को 6-अच्छी तरह से कोलेजन आई-लेपित प्लेटों से जुड़ने के बाद, सुसंस्कृत कोशिकाओं से खर्च किए गए माध्यम को हटा दें।
    2. बर्फ ठंडा इथेनॉल में 10-15 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करें।
    3. बाँझ पानी से अच्छी तरह से धो लें।
    4. 5 मिनट के लिए 1% जलीय आवधिक एसिड में सेते हैं और फिर बाँझ पानी के साथ धो लें।
    5. 30 मिनट के लिए 100% शिफ अभिकर्मक में सेते हैं।
      नोट: कोशिकाओं को जोड़ने से पहले शिफ अभिकर्मक को पतला नहीं किया जाना चाहिए।
    6. 10 मिनट से अधिक पानी से तीन बार धो लें।
    7. बढ़ते माध्यम में माउंट करें।
    8. ब्राइटफील्ड सेटिंग पर माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवि।

3. सीआरआईएसपीआर-कैस 9 जीन संपादन के लिए डिजाइन एसजीआरएनए

नोट: यह खंड यकृत के आईएमडी से संबंधित चिकित्सीय लक्ष्य जीन को बाधित करने के लिए प्रूफ-ऑफ-प्रिंसिपल जीन संपादन के रूप में माउस हाइड्रॉक्सीफेनिलपाइरूवेट डाइऑक्सीजिनेज (एचपीडी) जीन को लक्षित करने वाले एसजीआरएनए के डिजाइन का वर्णन करता है।

  1. संदर्भित सॉफ़्टवेयर15 का उपयोग करके एचपीडी को लक्षित करने वाले गाइड अनुक्रम को डिज़ाइन करें।
  2. एनसेंबल जीनोम ब्राउज़र के साथ एचपीडी के लिए अनुक्रम की जाँच करें।
  3. जीआरएनए को डिजाइन करने के लिए निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: 20 न्यूक्लियोटाइड की एकल गाइड लंबाई और एक एनजीजी (एन कोई न्यूक्लियोटाइड हो सकता है) प्रोटोस्पेसर-आसन्न आकृति (पीएएम) अनुक्रम।
  4. एचपीडी में एक्सॉन 3 से एक लक्ष्य क्षेत्र का चयन करें।
  5. ऑन- और ऑफ-टारगेट स्कोर के साथ लक्ष्य क्षेत्र से गाइड अनुक्रमों की एक सूची उत्पन्न करें।
    नोट: ऑन-टारगेट स्कोर दिए गए डिज़ाइन के लिए अनुमानित ऑन-टारगेट संपादन दक्षता को इंगित करता है: एक उच्च स्कोर उच्च संपादन दक्षता के साथ सहसंबद्ध है। ऑफ-टारगेट स्कोर गाइड अनुक्रम की विशिष्टता से संबंधित है: एक उच्च स्कोर ऑफ-टारगेट संपादन की कम संभावना को इंगित करता है। आदर्श रूप से दोनों स्कोर उच्च होने चाहिए: ऑन-टारगेट स्कोर >60, और ऑफ-टारगेट स्कोर >50।
  6. उच्चतम ऑन-टारगेट और ऑफ-टारगेट स्कोर के साथ गाइड अनुक्रम का चयन करें। गाइड अनुक्रम युक्त एसजीआरएनए को रासायनिक रूप से संश्लेषित करें।

4. इलेक्ट्रोपोरेशन और सेल संस्कृति

  1. सीआरआईएसपीआर-कैस 9 सब्सट्रेट, मीडिया, कोशिकाओं और इलेक्ट्रोपोरेशन उपकरण की तैयारी
    1. पीएम के लिए पूरे पूरक जोड़ें और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म।
    2. पावर बटन दबाकर इलेक्ट्रोपोरेशन डिवाइस चालू करें और एक्स बटन दबाकर इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोग्राम सेट करें और फिर डाउन एरो बटन जब तक प्रोग्राम टी -028 स्क्रीन पर दिखाई न दे।
    3. छह अच्छी तरह से कोलेजन आई-लेपित प्लेटों में पीएम के 1.5 एमएल जोड़कर इलेक्ट्रोपोरेटेड हेपेटोसाइट्स के लिए गंतव्य कुओं को तैयार करें। उपयोग करने के लिए तैयार होने तक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेटों सेते हैं।
    4. इलेक्ट्रोपोरेशन बफर समाधान के लिए पूरे पूरक जोड़ें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
      नोट: शीशी पर इलेक्ट्रोपोरेशन बफर समाप्ति तिथि लेबल करें (पूरक जोड़ की तारीख के 3 महीने बाद)।
    5. पैकेजिंग से इलेक्ट्रोपोरेशन जहाजों को हटा दें और उन्हें प्रत्येक नमूने के लिए लेबल करें।
    6. पीसीआर स्प्लिट-स्ट्रिप ट्यूबों में, कैस 9 प्रोटीन के 300 पीएमओएल के साथ एसजीआरएनए के 30 μg के संयोजन से कैस 9 आरएनपी परिसरों को तैयार करें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर परिसरों सेते हैं। कैस 9 एमआरएनए (1 μg / μL) के 4 μL के साथ एसजीआरएनए के 30 μg के संयोजन से कैस 9 एमआरएनए तैयार करें। एमआरएनए-एसजीआरएनए मिश्रण को बर्फ पर इलेक्ट्रोपोरेशन तक स्टोर करें। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सफल इलेक्ट्रोपोरेशन को सत्यापित करने के लिए अलग से ईजीएफपी एमआरएनए के 1.0 μg युक्त एक ट्यूब तैयार करें।
    7. अपकेंद्रित्र 1.2 × 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर इलेक्ट्रोपोरेशन प्रतिक्रिया प्रति 106 कोशिकाओं।
    8. सेल गोली से सतह पर तैरनेवाला निकालें और ट्यूब की दीवार के किनारे प्रतिक्रिया प्रति इलेक्ट्रोपोरेशन समाधान के 100 μL जोड़ें। हाथ से धीरे से ट्यूब रॉकिंग द्वारा इलेक्ट्रोपोरेशन समाधान में हेपेटोसाइट्स को फिर से निलंबित करें।
  2. हेपेटोसाइट्स में सीआरआईएसपीआर-कैस 9 आरएनपी और एमआरएनए का इलेक्ट्रोपोरेशन
    1. एक बार जब हेपेटोसाइट्स इलेक्ट्रोपोरेशन समाधान में समान रूप से बिखरे हुए दिखाई देते हैं, तो हेपेटोसाइट निलंबन के 100 μL को कैस 9 परिसरों वाले स्ट्रिप ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
      नोट: सेल व्यवहार्यता को संरक्षित करने के लिए हेपेटोसाइट्स स्थानांतरित करते समय चौड़े बोर विंदुक युक्तियों का उपयोग करें।
    2. स्ट्रिप की सामग्री को एक इलेक्ट्रोपोरेशन पोत में अच्छी तरह से स्थानांतरित करें।
    3. इलेक्ट्रोपोरेशन डिवाइस पर स्लॉट में न्यूक्लियोवेट पोत रखें। एक्स बटन दबाकर हेपेटोसाइट्स को इलेक्ट्रोपोरेट करें। इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद, डिवाइस पर पॉप अप करने के लिए स्क्रीन की प्रतीक्षा करें जो ठीक कहता है। एक्स बटन को फिर से दबाएं और पोत को हटा दें।
    4. 15 मिनट के लिए बर्फ पर इलेक्ट्रोपोरेटेड पोत सेते हैं।
    5. इलेक्ट्रोपोरेशन पोत में प्रीवॉर्ड पीएम के 500 μL जोड़ें।
    6. प्रीवॉर्ड प्लेट पर प्रत्येक गंतव्य के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन प्रतिक्रिया के 300 μL स्थानांतरण।
      नोट: इलेक्ट्रोपोरेशन प्रतिक्रिया प्रति दो गंतव्य कुएं होने चाहिए। जीन संपादन दक्षता को मापने के लिए एक कुएं का उपयोग किया जाएगा; अन्य कुएं का उपयोग एमटीटी और एल्बुमिन परख के लिए किया जाएगा।
    7. हेपेटोसाइट्स को कुएं के केंद्र में जमा होने से रोकने के लिए, उत्तर-से-दक्षिण और पूर्व-से-पश्चिम गति में क्षैतिज और लंबवत रूप से प्लेटों को धीरे-धीरे स्थानांतरित करके कोशिकाओं को फैलाएं। सुनिश्चित करें कि प्लेट इनक्यूबेटर शेल्फ के साथ संपर्क बनाए रखती है जबकि इसे स्थानांतरित किया जा रहा है। इलेक्ट्रोपोरेटेड हेपेटोसाइट्स चढ़ाने के बाद 15, 30, 45, 60 और 90 मिनट में इस गति को दोहराएं।
    8. 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेटों सेते हैं।
    9. कोशिकाओं चढ़ाना के बाद 24 घंटे जीन संपादन विश्लेषण के लिए नामित कुओं से माध्यम निकालें, और 0.25 मिलीग्राम /
      नोट: यदि फ्रीजर में संग्रहीत किया जाता है, तो झिल्ली मैट्रिक्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें और इसे पिघलने दें। क्योंकि तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स 10 डिग्री सेल्सियस से ऊपर ठोस है, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के लिए बर्फ पर या उपयोग करने के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रहना महत्वपूर्ण है।

5. 0.25 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता देने के लिए एमएम के साथ मिश्रण करने के लिए झिल्ली मैट्रिक्स की मात्रा की गणना करें

नोट: 6-अच्छी तरह से प्लेट के लिए, 2 मिलीलीटर ओवरले प्रति अच्छी तरह से आवश्यक है।

6. बर्फ ठंड एमएम के लिए झिल्ली मैट्रिक्स की गणना की मात्रा जोड़ें और 10 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा मिश्रण

  1. विंदुक कोशिकाओं के शीर्ष पर धीरे-धीरे ओवरले मिश्रण, और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेट वापस जगह।
  2. हर 24 घंटे में ताजा रखरखाव माध्यम के साथ माध्यम को बदलें।
  3. चढ़ाना के बाद 24 घंटे में, एमटीटी और एल्बुमिन परख के लिए नामित अच्छी तरह से वातानुकूलित माध्यम को स्थानांतरित करें। एल्बुमिन परख करने के लिए तैयार होने तक एक माइक्रोफ्यूज ट्यूब में वातानुकूलित माध्यम स्टोर करें। एमटीटी परख के लिए चरण 7.1 के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: अल्पावधि भंडारण (एक दिन से कम) के लिए वातानुकूलित माध्यम को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। लंबे भंडारण के लिए, मध्यम को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. इलेक्ट्रोपोरेटेड माउस हेपेटोसाइट्स में वितरण दक्षता, व्यवहार्यता और ऑन-टारगेट संपादन का विश्लेषण

  1. एमटीटी परख का उपयोग करके व्यवहार्यता माप
    1. एमटीटी के एक 5 मिलीग्राम शीशी में 1 एमएल पीबीएस जोड़कर 12 एमएम एमटीटी स्टॉक समाधान तैयार करें।
    2. कुओं के लिए एमटीटी स्टॉक समाधान के 150 μL जोड़ें और 24 घंटे के लिए सेते हैं।
    3. इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक कुएं में 1.5 मिलीलीटर सोडियम डोडेसिल सल्फेट-हाइड्रोक्लोराइड (एसडीएस-एचसीएल) समाधान जोड़ें और फिर मिश्रण करने के लिए पिपेट।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए प्लेट सेते हैं और व्यवहार्य कोशिकाओं को इंगित करने के लिए स्पष्ट से बैंगनी तक माध्यम के रंग में बदलाव की तलाश करें।
    5. एक विंदुक का उपयोग कर फिर से प्रत्येक नमूना मिश्रण और एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग कर 570 एनएम पर अवशोषण पढ़ें।
    6. Eq (1) का उपयोग कर कैस 9 इलाज नमूनों के लिए सामान्यीकृत व्यवहार्यता की गणना करें:
      Equation 1 (1)
  2. हेपेटोसाइट कार्यक्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एल्बुमिन परख
    1. एल्बुमिन किट द्वारा प्रदान की गई प्लेट में कुओं के लिए वातानुकूलित माध्यम के 50 μL स्थानांतरण। कुओं को कवर करें और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सेते हैं।
    2. धोने बफर के 200 μL के साथ कुओं 5x धो लें।
    3. टिशू पेपर पर प्रत्येक कुएं को खाली करने के लिए प्लेट को पलटें और कुछ बार टैप करें।
    4. धोने के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से एल्बुमिन परख किट में प्रदान किए गए बायोटिनिलेटेड एंटीबॉडी के 50 μL जोड़ें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    5. कुओं को धोने के लिए चरण 5.2.2-5.2.3 दोहराएं।
    6. प्रत्येक अच्छी तरह से एल्बुमिन परख किट में प्रदान किए गए स्ट्रेप्टाविडिन-पेरोक्सीडेज के 50 μL जोड़ें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    7. चरण 5.2.2 दोहराएँ।
    8. अच्छी तरह से प्रति एल्बुमिन परख किट में प्रदान किए गए क्रोमोजन सब्सट्रेट के 50 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए प्लेट को धीरे-धीरे टैप करें। एक पिपेट टिप के साथ किसी भी हवा के बुलबुले निकालें।
    9. अंत में, प्रत्येक कुएं में स्टॉप समाधान के 50 μL जोड़ें और कार्यात्मक कोशिकाओं को इंगित करने के लिए पीले से नीले रंग में रंग परिवर्तन की तलाश करें।
    10. माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 450 एनएम पर अवशोषण पढ़ने के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
  3. ईजीएफपी एमआरएनए के साथ इलेक्ट्रोपोरेटेड कुओं में वितरण दक्षता का अनुमान लगाएं।
    1. इलेक्ट्रोपोरेशन के 24 घंटे बाद हेपेटोसाइट्स के चरण विपरीत और हरे प्रतिदीप्ति छवियों को कैप्चर करें। कुएं के भीतर अलग-अलग स्थानों पर तीन छवियां लें।
    2. इमेजजे पर कोशिकाओं की छवियां अपलोड करें। छवि टैब के तहत, छवि | ग्रेस्केल में कनवर्ट करने के लिए 16-बिट टाइप करें का चयन करें।
    3. छवि में कक्ष संरचनाओं को हाइलाइट करने के लिए, छवि टैब के तहत, समायोजित करें | थ्रेसहोल्ड। कोशिकाओं को हाइलाइट करने के लिए स्लाइडर समायोजित करें।
    4. प्रक्रिया टैब के तहत , पृष्ठभूमि शोर को निकालने के लिए पृष्ठभूमि घटाएँ का चयन करें।
    5. विश्लेषण टैब क्लिक करके कक्षों की गणना करें और फिर कणों का विश्लेषण करें का चयन करें। गिने गए कणों की सूची जनरेट करने के लिए ठीक क्लिक करें.
    6. इसी चरण विपरीत छवि में गिने गए कणों की संख्या से हरी प्रतिदीप्ति छवियों में गिने गए कणों की संख्या को विभाजित करके जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करें।
  4. ऑन-टारगेट कैस 9 गतिविधि का विश्लेषण
    1. इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए निकालें।
      1. इलेक्ट्रोपोरेशन के 3 दिन बाद प्लेट से मध्यम निकालें, और 0.25% ट्रिप्सिन के 500 μL जोड़ें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। इनक्यूबेशन के बाद कई बार पिपेट यह सुनिश्चित करने के लिए कि हेपेटोसाइट्स प्लेट से अलग हो गए हैं।
      2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 800 × ग्राम पर एक टेबलटॉप अपकेंद्रित्र में माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों और स्पिन में ट्रिप्सिनाइज्ड सेल निलंबन को स्थानांतरित करें। कताई के बाद, छर्रों के लिए ट्यूबों की जांच करें।
      3. पिपेटिंग द्वारा ट्रिप्सिन युक्त सतह पर तैरनेवाला निकालें। सुनिश्चित करें कि गोली को परेशान न करें। डीएनए निष्कर्षण समाधान के 80 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। गोली को देखने के लिए मुश्किल है, तो डीएनए निष्कर्षण समाधान के 50 μL में ट्यूब की सामग्री को फिर से निलंबित करें।
      4. गोली को फिर से निलंबित करने के लिए 30 एस के लिए भंवर। पीसीआर स्प्लिट-स्ट्रिप ट्यूबों के लिए निलंबन स्थानांतरित करें और उन्हें थर्मल साइक्लर में रखें। 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट और 68 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए चलाएं।
    2. पीसीआर-ऑन-टारगेट लोकस को बढ़ाता है।
    3. डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके एचपीडी ऑन-टारगेट क्षेत्र को बढ़ाने के लिए नीचे वर्णित प्रक्रिया का पालन करें।
      1. 10 एमएम डीएनटीपी के 0.5 μL, 10 μM फॉरवर्ड प्राइमर के 0.5 μL, 10 μM रिवर्स प्राइमर के 0.5 μL, टैक पोलीमरेज़ के 0.125 μL, हेपेटोसाइट्स से निकाले गए जीनोमिक डीएनए के 5 μL और न्यूक्लियस मुक्त पानी के 18.375 μL युक्त प्रतिक्रिया तैयार करें। प्राइमर अनुक्रमों के लिए पूरक तालिका एस 1 देखें।
      2. संक्षेप में भंवर और जल्दी से पीसीआर मिश्रण अपकेंद्रित्र सुनिश्चित करें कि समाधान ट्यूब के तल पर है।
      3. पीसीआर मिश्रण को थर्मल साइक्लर में रखें और इन शर्तों के तहत बढ़ाएं: विकृतीकरण के लिए 30 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 30 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्र, एनीलिंग के लिए 45 एस के लिए 57 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस, और 5 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस का अंतिम विस्तार।
        नोट: पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए एनीलिंग तापमान प्राइमरों की संरचना के आधार पर अलग-अलग होगा। पीसीआर करने से पहले पिघलने तापमान कैलकुलेटर का उपयोग करने पर विचार करें।
      4. सही उत्पाद आकार की पुष्टि करने के लिए, पानी के 2 μL और 6x डाई के 1 μL के साथ पीसीआर उत्पादों के 3 μL मिश्रण। 1.5% एगरोज़ जेल पर चलाएं और सही उत्पाद आकार की पुष्टि करें।
    4. चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके डीएनए को शुद्ध करें।
      नोट: पीसीआर सफाई के लिए स्पिन कॉलम का भी उपयोग किया जा सकता है। चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करने के लिए नीचे प्रक्रियाएं दी गई हैं।
      1. 4 डिग्री सेल्सियस से चुंबकीय मोती निकालें और उन्हें कमरे के तापमान तक पहुंचने की अनुमति दें।
      2. संक्षेप में भंवर और जल्दी से पीसीआर मिश्रण अपकेंद्रित्र।
      3. पीसीआर मिश्रण की मात्रा 1.8× के बराबर मोतियों की मात्रा जोड़ें। पिपेट पीसीआर मनका मिश्रण 10x सुनिश्चित करने के लिए समाधान समान रूप से मिश्रित है।
      4. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
      5. पीसीआर-मनका मिश्रण को पीसीआर प्लेट में स्थानांतरित करें और इसे चुंबकीय प्लेट पर रखें।
      6. 5 मिनट के लिए चुंबक पर प्लेट सेते हैं। 5 मिनट के बाद, जांचें कि समाधान स्पष्ट है, और मोती अगले चरण में जाने से पहले चुंबक से बंधे हैं।
      7. सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
      8. अच्छी तरह से करने के लिए 70% इथेनॉल के 200 μL जोड़ें और 30 एस के लिए सेते हैं।
        नोट: डीएनए हानि को रोकने के लिए सफाई करने से कुछ समय पहले 70% इथेनॉल तैयार किया जाना चाहिए।
      9. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और चरण 7.4.4.8 दोहराएं।
      10. सतह पर तैरनेवाला निकालें और इथेनॉल के निशान को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए सूखने की अनुमति दें।
      11. चुंबक से प्लेट निकालें और नमूने में 22 μL पानी जोड़ें। पिपेट ऊपर और नीचे 10x पानी और मोती मिश्रण करने के लिए।
      12. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए नमूने सेते हैं।
      13. प्लेट को चुंबक पर वापस स्थानांतरित करें और 3 मिनट के लिए या समाधान स्पष्ट होने तक सेते हैं।
      14. एक पीसीआर ट्यूब के लिए नमूना के 20 μL स्थानांतरण। ध्यान रखें कि कोई मोती न ले जाया जाए।
    5. सेंगर अनुक्रमण द्वारा अनुक्रम शुद्ध डीएनए एम्पलीकॉन।
    6. लक्ष्य स्थल पर इंडेल की मात्रा निर्धारित करने के लिए अपघटन (टीआईडीई) 16 द्वारा इंडेल की ट्रैकिंग के लिए इलाज और नियंत्रण (अनुपचारित) नमूनों के लिए .ab1 अनुक्रम फ़ाइलें अपलोड करें।

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Representative Results

यकृत से प्लेटेबल प्राथमिक हेपेटोसाइट्स का अलगाव
यकृत छिड़काव और हेपेटोसाइट अलगाव की समग्र प्रक्रिया चित्रा 1 में सचित्र है। इस प्रयोग में, जंगली प्रकार, 8-10 सप्ताह पुराने सी 57 बीएल 6 / 6 जे चूहों का उपयोग किया गया था। प्रक्रिया 85% और 95% के बीच एक व्यवहार्यता के साथ माउस प्रति 20-50 × 106 कोशिकाओं उपज की उम्मीद है। यदि व्यवहार्यता <70% है, तो मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए पेरकोल उपचार का पालन किया जाना चाहिए। ताजा पृथक हेपेटोसाइट्स को कोलेजन आई-लेपित या नाइट्रोजन युक्त टिशू कल्चर प्लेटों पर चढ़ाया जाना चाहिए। चढ़ाना के 3-12 घंटे के भीतर, हेपेटोसाइट्स को प्लेट का पालन करने की उम्मीद है, और सेल आकृति विज्ञान 24 घंटे (चित्रा 2) के भीतर एक विशिष्ट बहुभुज या हेक्सागोनल उपस्थिति मानता है। हेपेटोसाइट्स यकृत में एकमात्र कोशिकाएं हैं जो ग्लूकोज को ग्लाइकोजन के रूप में संग्रहीत करती हैं। पृथक कोशिकाओं की शुद्धता को सत्यापित करने के लिए, चढ़ाना के बाद 24 घंटे में आवधिक एसिड-शिफ अभिकर्मक का उपयोग करके ग्लाइकोजन धुंधला किया जाता है। दाग हेपेटोसाइट्स का साइटोप्लाज्म मैजेंटा (चित्रा 3) दिखाई देता है।

पृथक माउस हेपेटोसाइट्स में सीआरआईएसपीआर-कैस 9 आरएनपी और एमआरएनए का इलेक्ट्रोपोरेशन
हौसले से पृथक माउस हेपेटोसाइट्स को ईजीएफपी एमआरएनए, कैस 9 एमआरएनए के साथ एचपीडी-टारगेटिंग एसजीआरएनए के साथ इलेक्ट्रोपोरेट किया गया था, या एचपीडी-एसजीआरएनए (आरएनपी) के साथ जटिल कैस 9 प्रोटीन। एचपीडी-एसजीआरएनए को रासायनिक रूप से 2'-ओ-मिथाइल फॉस्फोरोथियोएट लिंकेज के साथ 5 'और 3' सिरों पर पहले और अंतिम तीन लगातार न्यूक्लियोटाइड के साथ संशोधितकिया गया था। स्ट्रेप्टोकोकस पायोजेन्स कैस 9 का उपयोग प्रयोगों के लिए किया गया था। हेपेटोसाइट्स को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोरेशन के 24 घंटे बाद इमेज किया गया था, और जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत छवियों (चित्रा 4 ए) में गिना गया था। औसतन, हेपेटोसाइट्स के 89.8% [रेंज 87.1% -92.4%] जीएफपी पॉजिटिव थे। इलेक्ट्रोपोरेशन के 3 दिनों बाद, एचपीडी लोकस में कैस 9-प्रेरित सम्मिलन और विलोपन (इंडेल) का विश्लेषण टाइड16 का उपयोग करके किया गया था। परिणाम सीआरआईएसपीआर-कैस 9 एमआरएनए के साथ इलेक्ट्रोपोरेटेड हेपेटोसाइट्स में 47.4% के ऑन-टारगेट इंडेल और कैस 9 आरएनपी (चित्रा 4 बी) के लिए 78.4% इंडेल दिखाते हैं। सीआरआईएसपीआर-कैस 9 को इलेक्ट्रोपोरेट करने के बाद हेपेटोसाइट व्यवहार्यता और कार्यक्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एमटीटी और एल्बुमिन परख का प्रदर्शन किया गया था। एमटीटी परिणाम क्रमशः सीआरआईएसपीआर-कैस 9 एमआरएनए और आरएनपी के साथ इलाज किए गए हेपेटोसाइट्स में 35.4% और 45.9% की व्यवहार्यता दिखाते हैं (चित्रा 4 सी)। एमटीटी परिणामों के अनुरूप, कैस 9 एमआरएनए के साथ इलाज किए गए हेपेटोसाइट्स में सामान्यीकृत एल्बुमिन का स्तर 31.8% और कैस 9 आरएनपी (चित्रा 4 डी) के लिए 34.5% था।

Figure 1
चित्रा 1: हेपेटोसाइट छिड़काव और अलगाव प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध। अवर वेना कावा के कैनुलेशन के बाद, पोर्टल नस काट दी जाती है, और छिड़काव समाधान 1, 2 और 3 यकृत के माध्यम से पंप किए जाते हैं। यकृत कैप्सूल टूट जाता है, और कोशिकाओं को सेल लिफ्टर का उपयोग करके जारी किया जाता है। जारी कोशिकाएं तनावपूर्ण और सेंट्रीफ्यूज होती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ताजा पृथक प्राथमिक हेपेटोसाइट्स। 6 जे चूहों से पृथक हेपेटोसाइट्स हेपेटोसाइट चढ़ाना मीडिया के साथ कोलेजन आई-लेपित 6-अच्छी तरह से प्लेटों पर चढ़ाया गया था। चढ़ाना के बाद 24 घंटे में ली गई छवियां। स्केल बार = 400 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ग्लाइकोजन धुंधला हो जाना। शुद्धता की पुष्टि करने के लिए ग्लाइकोजन के लिए ताजा पृथक प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स दाग थे। चढ़ाना के बाद 24 घंटे में शिफ अभिकर्मक का उपयोग करके धुंधला किया गया था। दाग वाले हेपेटोसाइट्स के साइटोप्लाज्म मैजेंटा दिखाई देते हैं। स्केल बार = 100 μm कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: हौसले से पृथक प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स में एचपीडी-लक्ष्यीकरण सीआरआईएसपीआर-कैस 9 का इलेक्ट्रोपोरेशन। (ए) चरण विपरीत और इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद 24 घंटे में ताजा पृथक माउस हेपेटोसाइट्स की हरी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियां। ऊपरी पंक्ति में छवियां ईजीएफपी एमआरएनए से संक्रमित हेपेटोसाइट्स हैं और निचली पंक्ति में छवियां असंक्रमित नियंत्रण हेपेटोसाइट्स हैं। स्केल बार = 400 μm. (बी) एसजीआरएनए या आरएनपी के साथ संयुक्त कैस 9 एमआरएनए के साथ इलेक्ट्रोपोरेटेड माउस हेपेटोसाइट्स के लिए ऑन-टारगेट इंडेल। (सी) इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद 24 घंटे में एमटीटी परख में अपरिवर्तित नियंत्रण हेपेटोसाइट्स के लिए व्यवहार्यता सामान्यीकृत। (डी) वातानुकूलित माध्यम में एल्बुमिन का स्तर दो तकनीकी प्रतिकृतियों के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन (एन = 3) के बाद 24 घंटे में मापा गया अपरिवर्तित नियंत्रण हेपेटोसाइट्स के लिए सामान्यीकृत होता है। सांख्यिकीय विश्लेषण अप्रकाशित टी-परीक्षणों द्वारा किया गया था। इस आंकड़े को 14 से संशोधित किया गया था। संक्षिप्त नाम: एचपीडी = 4-हाइड्रॉक्सीफेनिलपाइरुवेट डाइऑक्सीजिनेज; सीआरआईएसपीआर = क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक दोहराव; कैस 9 = सीआरआईएसपीआर से जुड़े प्रोटीन 9; एसजीआरएनए = एकल गाइड आरएनए; आरएनपी = राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन; इंडेल = सम्मिलन-विलोपन; एमटीटी = 3-[4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-वाईएल]-2,5 डिफेनिल टेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: यकृत छिड़काव और हेपेटोसाइट अलगाव प्रोटोकॉल के लिए समस्या निवारण। यह तालिका प्रोटोकॉल के दौरान आने वाली सामान्य समस्याओं पर प्रकाश डालती है और संभावित समाधान सुझाती है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा एस 1: सर्जरी के दौरान माउस पेट गुहा। कैथेटर को गुर्दे की शाखाओं (नहीं देखा गया) से पहले अवर वेना कावा (नीला डॉट) में डाला जाता है। संक्षिप्त नाम: एल = यकृत; के = किडनी; मैं = छोटी आंतें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 1: कैस 9 गाइड और पीसीआर प्राइमर अनुक्रम। एचपीडी को लक्षित करने वाले एसजीआरएनए के लिए गाइड अनुक्रम और पीएएम, और एचपीडी के प्रवर्धन के लिए पीसीआर प्राइमर अनुक्रम। संक्षिप्त नाम: एचपीडी = 4-हाइड्रॉक्सीफेनिलपाइरुवेट डाइऑक्सीजिनेज; सीआरआईएसपीआर = क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक दोहराव; कैस 9 = सीआरआईएसपीआर से जुड़े प्रोटीन 9; एसजीआरएनए = एकल गाइड आरएनए; पीएएम = प्रोटोस्पेसर-आसन्न आकृति। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हेपेटोसाइट अलगाव के लिए प्रोटोकॉल में उल्लिखित कदम चुनौतीपूर्ण हैं और प्रवीणता के लिए अभ्यास की आवश्यकता है। यकृत से सफल हेपेटोसाइट अलगाव के लिए कई महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, पूर्ण यकृत छिड़काव के लिए अवर वेना कावा का उचित कैनुलेशन आवश्यक है। छिड़काव के बाद यकृत में ब्लांचिंग की अनुपस्थिति कैथेटर के विस्थापन को इंगित करती है (तालिका 1)। अवर वेना कावा (प्रतिगामी छिड़काव) को प्रक्रिया में कैन्युलेट किया गया था क्योंकि यह पोर्टल शिरा (एंटीग्रेड छिड़काव) 17,18 की तुलना में सरल और अधिक सुलभ है। कुछ प्रोटोकॉल कैथेटर19 को सुरक्षित करने के लिए टांके का उपयोग करते हैं; हालाँकि, टांके प्रक्रिया को जटिल बनाते हैं। कैथेटर को टांके लगाने से अवांछित परिणाम हो सकते हैं, जैसे कि कैथेटर का गलत स्थान और इसकी स्थिति को समायोजित करना असंभव हो जाता है। इसके अलावा, सुई को हटाए बिना यकृत में कैनुलेशन करना संभव है, जो यकृत छिड़काव को और सरल बना सकता है। पंप को कैथेटर से जोड़ना नस में सुई के साथ अनावश्यक है। इसके अलावा, गलती से कैथेटर को बाहर निकालने और रक्त के थक्के बनने की संभावना कम होती है। नस के सापेक्ष एक सपाट कोण के साथ कैथेटर की केवल नोक डालने से कैनुलेशन बढ़ गया। अवर वेना कावा की कई शाखाएं होती हैं, इसलिए गलत साइट में कैथेटर डालने से शरीर के दूसरे हिस्से में छिड़काव होगा न कि यकृत (तालिका 1)। इस प्रकार, कैथेटर को एक ऐसी साइट पर रखना महत्वपूर्ण है जो शाखाओं से बचता है। संवहनी संरचना विभिन्न चूहों के बीच थोड़ा भिन्न होगी; इस प्रकार, कैथेटर इंजेक्शन लगाने के लिए सबसे अच्छी साइट निर्धारित करने के लिए कैनुलेटिंग से पहले नसों की जांच करना महत्वपूर्ण है। सुई को हटाने के बाद कैथेटर के अंदर रक्त का बैकफ्लश उचित कैनुलेशन का एक उत्कृष्ट संकेत है। पोर्टल नस (चरण 1.3.13) पर दबाव क्षणिक रूप से लागू होने पर यकृत सूजन की तलाश करके उचित कैनुलेशन की भी जांच की जा सकती है।

हेपेटोसाइट्स को अलग करते समय, दूसरा महत्वपूर्ण कदम यह पहचान रहा है कि पूर्ण यकृत पाचन कब हुआ है। एंजाइम की गुणवत्ता और एकाग्रता उचित पाचन के लिए आवश्यक हैं। 20,21 में पाए गए प्रोटोकॉल के विपरीत, यह प्रोटोकॉल लाइबेरेज़ का उपयोग करने का सुझाव देता है, जिसमें दो कोलेजनेज आइसोफॉर्म शामिल हैं, क्योंकि यह एंजाइम गतिविधि में बेहतर स्थिरता प्रदान करता है और नियमित कोलेजनेज22 की तुलना में बैच-टू-बैच भिन्नता को कम करता है। पाचन एंजाइम की गुणवत्ता और गतिविधि में भिन्नता अलगाव में विसंगतियों का कारण बन सकती है। पाचन के दौरान यकृत की निगरानी करना और यकृत के नरम होने के तुरंत बाद पाचन को रोकना आवश्यक है। एक पचा हुआ जिगर लचीला होगा और संदंश या कपास झाड़ू का उपयोग करके यकृत को निराश करके सत्यापित लोच में नुकसान दिखाएगा ताकि यह पुष्टि की जा सके कि ऊतक को वापस उछालने के बिना इंडेंटेशन बनते हैं। इस प्रोटोकॉल में, यकृत प्रति अनुशंसित लाइबेरेज़ समाधान की अधिकतम मात्रा 50 एमएल है; एक उच्च मात्रा के परिणामस्वरूप अतिअपच होगा। यदि कैनुलेशन पूरी तरह से किया जाता है, तो उचित पाचन प्राप्त करने के लिए 30 एमएल लाइबेरेज़ समाधान पर्याप्त है। प्रक्रिया के अंतिम महत्वपूर्ण चरण अलगाव और धोने के चरण हैं। यकृत को विच्छेदन करने और एफबीएस के साथ बर्फ-ठंडा डीएमईएम युक्त बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित करने के बाद, यकृत को टुकड़ों में काटने से बचना महत्वपूर्ण है। इस स्तर पर, कोशिकाओं को धीरे-धीरे जारी करने और सेल व्यवहार्यता को अधिकतम करने के लिए एक सेल लिफ्टर का उपयोग करें। डीएमईएम में जिगर को डुबोने के लिए पकवान को झुकाने से कैप्सूल से कोशिकाओं को निलंबन में छोड़ने की सुविधा मिलती है और धीरे-धीरे और बर्फ पर किया जाना चाहिए। रिहाई चरण के दौरान ग्लिसन के कैप्सूल को बाधित करना आसान होना चाहिए, और माध्यम बादल और भूरा होना चाहिए। कैप्सूल को बाधित करते समय कठिनाई खराब पाचन का संकेतक है (तालिका 1)।

यह प्रोटोकॉल ताजा पृथक माउस हेपेटोसाइट्स में सीआरआईएसपीआर-कैस 9 संपादन के उच्च स्तर उत्पन्न करने के लिए उपयुक्त है। अध्ययन में कैस 9 आरएनपी और एमआरएनए द्वारा उत्पन्न इंडेल की तुलना की गई थी। एमआरएनए की तुलना में कैस 9 आरएनपी के साथ इलेक्ट्रोपोरेटेड हेपेटोसाइट्स में जीन संपादन के उच्च स्तर देखे गए, जो अन्य अध्ययनों 14,23,24 के निष्कर्षों के अनुरूप है। एमआरएनए पर कैस 9 आरएनपी का लाभ यह है कि यह कम ऑफ-टारगेट संपादन प्रदान करता है क्योंकि सीएएस 9 प्रोटीन एमआरएनए23,24 की तुलना में कम अवधि के लिए सेल में मौजूद है। चूंकि एसजीआरएनए की दक्षता डिजाइन और लक्ष्य साइट के आधार पर भिन्न होती है, इसलिए ब्याज के जीन पर संपादन दक्षता के लिए कई एसजीआरएनए को डिजाइन और परीक्षण किया जाना चाहिए। उच्च जीन क्षमता वाले एसजीआरएनए के बीच चयन करते समय उच्च विशिष्टता स्कोरिंग डिज़ाइन का चयन करें। यदि जीन संपादन लगातार कम है, तो डिलीवरी की पुष्टि करने के लिए ईजीएफपी एमआरएनए जैसे रिपोर्टर को सह-वितरित करने पर विचार करें। इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद ईजीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं के निम्न स्तर प्रतिक्रिया में समाप्त इलेक्ट्रोपोरेशन बफर, इलेक्ट्रोपोरेशन डिवाइस मुद्दों या हवा के बुलबुले का संकेत दे सकते हैं। यदि ईजीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं की उच्च संख्या है लेकिन कम संपादन दक्षता है, तो संपादन गतिविधि की पुष्टि करने के लिए सेल लाइन में एसजीआरएनए डिजाइन का परीक्षण करें और कोशिकाओं में कैस 9 और एसजीआरएनए इलेक्ट्रोपोरेटेड की मात्रा को समायोजित करें। अंत में, संपादन गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधि पर विचार करें। जेल-आधारित परख, जैसे कि टी 7 एंडोन्यूक्लाइज आई, कट साइट पर 1 बीपी बेमेल के लिए कम संवेदनशीलता के कारण जीन संपादन को कम कर सकता है। गहरी अनुक्रमण कैस 9 जीन संपादन की मात्रा निर्धारित करने के लिए सबसे सटीक तरीका है, विशेष रूप से ऑफ-टारगेट साइटों पर कम-संपादन घटनाओं के लिए।

प्रोटोकॉल का एक और चुनौतीपूर्ण पहलू इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद ताजा पृथक हेपेटोसाइट्स संवर्धन है। उपयोगकर्ताओं को इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद व्यवहार्य, प्लेटेबल हेपेटोसाइट्स प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण के दौरान कोशिकाओं को धीरे-धीरे संभालना चाहिए। भंवर द्वारा हेपेटोसाइट्स को फैलाने से बचें; इसके बजाय, कोशिकाओं को धीरे-धीरे कोशिकाओं से युक्त शीशी को रॉक करें जब तक कि कोशिकाएं फिर से निलंबित न हो जाएं। हेपेटोसाइट्स को स्थानांतरित करते समय, व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए चौड़े बोर पिपेट युक्तियों का उपयोग करें। इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद 15 मिनट के लिए बर्फ पर क्यूवेट्स को इनक्यूबेट करने से कोशिका झिल्ली को फिर से सील करने और व्यवहार्यता बढ़ाने की अनुमति मिलती है। चढ़ाना के बाद, प्लेट को इनक्यूबेटर में रखें और धीरे-धीरे प्लेट को क्षैतिज और लंबवत रूप से उत्तर-से-दक्षिण और पूर्व-से-पश्चिम गति में स्थानांतरित करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि हेपेटोसाइट्स समान रूप से फैलते हैं और सेल व्यवहार्यता बनाए रखते हैं। यदि हेपेटोसाइट्स प्लेट से जुड़ने में विफल रहते हैं, तो इलेक्ट्रोपोरेशन प्रतिक्रिया में कोशिकाओं की संख्या 1.3 × 106 तक बढ़ाने पर विचार करें।

प्रोटोकॉल के लिए एक आशाजनक अनुप्रयोग यकृत के मानव आईएमडी के माउस मॉडल की पीढ़ी है। माउस हेपेटोसाइट्स जो फुमरीलासेटोसेटेटेट हाइड्रोलेज (एफएएच) के लिए जीन एन्कोडिंग के लिए सकारात्मक हैं, को फाह-कमी (फाह-/-) चूहों 25 में प्रत्यारोपण के बाद यकृत कोकुशलतापूर्वक एनग्राफ्ट और रीपुपुलेट करने के लिए दिखाया गया है। यकृत के आईएमडी के माउस मॉडल विकसित करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण सीआरआईएसपीआर-कैस 9 को जंगली प्रकार के माउस हेपेटोसाइट्स में इलेक्ट्रोपोरेट करके एक बीमारी से जुड़े संपादनों को पेश करने के लिए है, इसके बाद फाह-/- चूहों में जीन-संपादित हेपेटोसाइट्स का प्रत्यारोपण किया जाता है। कैस 9-संपादित हेपेटोसाइट्स को यकृत को फिर से शुरू करने के लिए देशी फाह-कमी वाली कोशिकाओं की तुलना में प्रत्यारोपण के बाद एक प्राकृतिक चयनात्मक लाभ होगा।

अंत में, यह प्रोटोकॉल उपयोगकर्ताओं को माउस यकृत से प्राथमिक हेपेटोसाइट्स को अलग करने की क्षमता से लैस करता है, इसके बाद सीआरआईएसपीआर-कैस 9 एमआरएनए और आरएनपी का उपयोग करके जीन-संपादन होता है। प्रोटोकॉल इन विट्रो और विवो में जिगर को प्रभावित आनुवंशिक रोगों के विभिन्न प्रकार का अध्ययन करने और चिकित्सीय दृष्टिकोण का परीक्षण करने के लिए चूहों के विभिन्न उपभेदों में उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास प्रकट करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है।

Acknowledgments

आरएनसी को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज (एनआईजीएमएस), अमेरिकन एसोसिएशन फॉर द स्टडी ऑफ लिवर डिजीज फाउंडेशन और अमेरिकन सोसाइटी ऑफ जीन एंड सेल थेरेपी द्वारा समर्थित साउथ कैरोलिना बायोइंजीनियरिंग सेंटर ऑफ रिजनरेशन एंड फॉर्मेशन ऑफ टिश्यूज पायलट अनुदान से अनुदान संख्या पी 30 जीएम 131959, 2021000920, और 2022000099, क्रमशः। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि अमेरिकन सोसाइटी ऑफ जीन एंड सेल थेरेपी या अमेरिकन एसोसिएशन फॉर द स्टडी ऑफ लिवर डिजीज फाउंडेशन के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है। चित्रा 1 के लिए योजनाबद्ध BioRender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural USA Scientific 1402-4700
6-well Collagen Plates Advanced Biomatrix 5073
accuSpin Micro 17R Fisher Scientific 13-100-675
All-in-one Fluorescent Microscope Keyence BZ-X810
Analog Vortex Mixer VWR 97043-562
ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL ThermoFisher Scientific 2079GPK
Automated Cell Counter Bio-Rad Laboratories TC20
Blue Wax Dissection Tray Braintree Scientific Inc. DTW1 9" x 6.5" x 1/2"+F21
Cell scraper/lifter Argos Technologies UX-04396-53 Non-pyrogenic, sterile
Conical tubes (15 mL) Fisher Scientific 339650
Conical tubes (50 mL) Fisher Scientific 14-432-22
Cotton applicators Fisher Scientific 22-363-170
Curved scissors Cooper Surgical 62131
Disposable Petri Dishes Falcon 351029 100mm,sterile
Disposable Petri Dishes VWR 25373-100 35mm, sterile
Epoch Microplate Spectrophotometer BioTek Instruments 250082
Falcon Cell strainer (70 µm) Fisher Scientific 08-771-2
Forceps Cooper Surgical 61864 Euro-Med Adson Tissue Forceps
IV catheters  BD 382612 24 G x 0.75 in
IV infusion set Baxter 2C6401
MyFuge 12 Mini Centrifuge Benchmark Scientific 1220P38
Needles Fisher Scientific 05-561-20 25 G
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001 Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes
Peristaltic Pump Masterflex  HV-77120-42 10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC
Precision pump tubing Masterflex HV-96410-14 25 ft, silicone
Primaria Culture Plates Corning Life Sciences 353846 Nitrogen-containing tissue culture plates
Serological Pipets (25 mL) Fisher Scientific 12-567-604
Syringes BD 329464 1 mL, sterile
T100 Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories 1861096
Water bath ALT 27577 Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 IDT 1081058
Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL Fisher Scientific NC9959336
CleanCap Cas9 mRNA Trilink Biotechnologies L-7606-100
CleanCap EGFP mRNA Trilink Biotechnologies L-7201-100
Corning Matrigel Matrix Corning Life Sciences 356234
DMEM ThermoFisher Scientific 11885076 Low glucose, pyruvate
Ethanol 70% VWR 71001-652
Fetal bovine serum Thermoscientific 26140-079
Hepatocyte Maintenance Medium (MM) Lonza MM250
Hepatocyte Plating Medium (PM) Lonza MP100
Mouse Albumin ELISA Kit Fisher Scientific NC0010653
Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit Lonza VPL-1004
OneTaq HotStart DNA Polymerase New England Biolabs M0481L
PBS 10x pH 7.4  Thermoscientific 70011-044 No calcium or magnesium chloride
Percoll (PVP solution) Santa Cruz Biotechnology sc-500790A
Periodic acid Sigma-Aldrich P7875-25G
Permount Mounting Medium VWR 100496-550
QuickExtract DNA Extraction Solution Lucigen Corporation QE05090
Schiff’s fuchsin-sulfite reagent Sigma-Aldrich S5133
Trypsin-EDTA (0.25%) ThermoFisher Scientific 25200056 Phenol red
Vybrant MTT Cell Viability Assay ThermoFisher Scientific V13154
Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized)  Stable at 4 °C for 2 months
EBSS Fisher Scientific 14155063 Complete to 200 mL
EGTA (0.5 M) Bioworld 40520008-1 200 µL
HEPES (pH 7.3, 1 M) ThermoFisher Scientific AAJ16924AE 2 mL 
Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized)  Stable at 4 °C for 2 months
CaCl2·2H20 (1.8 mM) Sigma C7902-500G 360 µL of 1 M stock 
EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) Fisher Scientific 14-155-063 Complete to 200 mL
HEPES (1 M) ThermoFisher Scientific AAJ16924AE 2 mL 
MgSO4·7H20 (0.8 mM) Sigma 30391-25G 160 µL of 1 M stock
Perfusion Solution 3  Prepared fresh prior to use
Solution 2 50 mL
Liberase Roche 5401127001 0.094 Wunsch units/mL
Mouse Anesthetic Cocktail 
Acepromzine 0.25 mg/mL final concentration
Ketamine 7.5 mg/mL final concentration
Xylazine 1.5 mg/mL final concentration
Software URL
Benchling https://www.benchling.com/
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/
TIDE: Tracking of Indels by Decomposition https://tide.nki.nl/

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 184
ताजा पृथक प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स में कैस 9 राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन और एमआरएनए की इलेक्ट्रोपोरेशन-मध्यस्थता डिलीवरी
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Rathbone, T., Ates, I., Stuart, C.,… More

Rathbone, T., Ates, I., Stuart, C., Parker, T., Cottle, R. N. Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes. J. Vis. Exp. (184), e63828, doi:10.3791/63828 (2022).

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