Summary
该协议描述了从肝脏中分离原代小鼠肝细胞并将CRISPR-Cas9电冲为核糖核蛋白和mRNA的技术，以破坏与肝脏遗传性代谢疾病相关的治疗靶基因。所描述的方法导致电穿孔后的高生存能力和高水平的基因修饰。
Abstract
该协议描述了一种快速有效的方法，用于分离原代小鼠肝细胞，然后电穿孔介导的CRISPR-Cas9作为核糖核蛋白（RNP）和mRNA递送。使用三步逆行灌注方法分离原代小鼠肝细胞，结果高产率高达50×每肝106 个细胞，细胞活力>85%。该方案提供了肝细胞电镀、染色和培养的详细说明。结果表明，电穿孔提供了89%的高转染效率，这是通过小鼠肝细胞中绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞的百分比和>35%的适度细胞活力来测量的。
为了证明这种方法的实用性，将靶向羟基苯基丙酮酸二加氧酶基因的CRISPR-Cas9电穿孔到初级小鼠肝细胞中作为原理验证基因编辑，以破坏与肝脏遗传代谢疾病（IMD）相关的治疗基因。RNP的靶向编辑率更高，为78%，而mRNA的编辑效率为47%。使用白蛋白测定 法在体外 评估肝细胞的功能，该测定表明将CRISPR-Cas9作为RNP和mRNA递送导致原代小鼠肝细胞中具有相当的细胞活力。该协议的一个有希望的应用是为影响肝脏的人类遗传疾病生成小鼠模型。
Introduction
肝脏IMD是遗传性疾病，其特征在于缺乏参与代谢的关键肝酶，导致有毒代谢物的积累。如果不进行治疗，肝脏IMD会导致器官衰竭或过早死亡1，2。肝脏IMD患者的唯一治疗选择是原位肝移植，由于供体器官的可用性低以及手术后免疫抑制治疗的并发症，这是有限的3，4。根据器官采购和移植网络最近收集的数据，肝移植等待名单上只有40%-46%的成年患者接受器官，而这些患者中有12.3%在等待名单上死亡5。此外，只有5%的罕见肝病有FDA批准的治疗方法6。很明显，迫切需要对肝脏IMDs进行新的治疗。然而，需要适当的疾病模型来开发新的治疗方案。
使用 体外 和 体内 系统对人类疾病进行建模仍然是开发有效疗法和研究肝脏IMD病理学的障碍。来自罕见肝病患者的肝细胞很难获得7。动物模型对于发展对疾病病理学的理解和测试治疗策略至关重要。然而，一个障碍是从携带致命突变的胚胎中生成模型。例如，试图创建Alagille综合征（ALGS）的小鼠模型，其中胚胎含有 Jag1 基因5′端附近5 kb序列的纯合子缺失，导致胚胎8的早期死亡。此外，通过在胚胎干细胞中进行基因编辑来生成小鼠模型可能是时间和资源密集型的9。最后，突变将出现在目标组织之外，导致混淆变量，可能阻碍对疾病的研究9。体细胞基因编辑将允许在肝脏组织中更容易地进行编辑，并绕过与使用胚胎干细胞生成模型相关的挑战。
电穿孔使CRISPR-Cas9能够通过施加高压电流使细胞膜透化而直接输送到细胞核中，并且与许多细胞类型兼容，包括那些对转染技术不妥协的细胞类型，例如人胚胎干细胞，多能干细胞和神经元10，11，12.然而，低生存能力是电穿孔的潜在缺点;优化程序可以产生高水平的递送，同时限制毒性13。最近的一项研究表明，将CRISPR-Cas9组分电穿孔到初级小鼠和人肝细胞中作为一种高效的方法的可行性14.肝细胞中的 离体 电穿孔有可能应用于为肝脏的人类IMD生成新的小鼠模型。
该协议提供了详细的分步程序，用于从肝脏中分离小鼠肝细胞，随后电穿孔CRISPR-Cas9作为RNP复合物，由Cas9蛋白和合成单向导RNA（sgRNA）组成，或Cas9 mRNA与sgRNA结合以获得高水平的靶向基因编辑。此外，该协议还提供了在CRISPR-Cas9电穿孔到新分离的小鼠肝细胞后量化基因编辑效率，活力和功能的方法。
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Protocol
动物实验都是按照机构动物护理和使用委员会指南和克莱姆森大学批准的协议进行的。在8至10周龄的麻醉野生型C57BL / 6J小鼠中进行外科手术。
1. 动物手术
- 溶液和仪器的制备
注意：灌注溶液和麻醉鸡尾酒配方显示在 材料表中。- 制备灌注液 1（肝素、EGTA 和 EBSS）、灌注液 2（聚乙二醇、乙二醇、高分子灌注酶、氯化钙2 和镁质4）和灌注液 3（溶液 2 和自由酶）。确保溶液充分混合。
- 将水浴设置为42°C，并在开始程序之前预热灌注溶液1，2和3至少30分钟，并将它们保持在水浴中。
注意：灌注溶液1和2将螯合钙并冲洗肝脏中的血液。灌注溶液3含有消化酶自由酶，以解离细胞外基质。 - 将 150 mL DMEM + 10% 胎牛血清 （FBS） 放入锥形管中，并将其保存在冰上。
注意：该培养基将分别用于从肝囊中释放细胞并洗涤分离的肝细胞2.1和2.2。 - 将离心机置于4°C。
- 通过将管道的两端放入装有70%乙醇的烧瓶中并对乙醇循环三次来对泵管进行灭菌。
- 用蒸馏水清洗管子并清空。
- 用预热的30 mL灌注溶液1填充管子，然后填充8 mL灌注溶液2。如果管道仍有空间容纳更多流体，请用灌注溶液3填充管道的其余部分。切换到不同的灌注溶液时停止泵，以避免将气泡引入管道。
- 将多余的管子放入42°C水浴中以保持灌注溶液温暖。
- 将泵管的末端放在装有灌注溶液3的锥形管中，同时保持在水浴中。
注意：此步骤对于允许泵在灌注过程中连续填充灌注溶液3是必需的。
- 动物准备
- 通过腹膜内注射麻醉剂鸡尾酒以10-11.7μL / g体重的剂量麻醉小鼠。麻醉鸡尾酒的最终浓度为7.5毫克/毫升氯胺酮，0.25毫克/毫升乙酰丙嗪和1.5毫克/毫升甲苯噻嗪。
- 监测鼠标呼吸并检查鼠标是否对疼痛没有反应。等到小鼠的呼吸频率约为每分钟55-65次呼吸，对脚趾被捏住没有反应，并且尾巴松弛。此外，通过轻轻触摸闭合眼睛内侧的皮肤来检查睑板（眨眼）反射。如果小鼠眨眼或眼睛肌肉抽搐，请将整个麻醉鸡尾酒的剂量增加5-10μL。
- 将鼠标放在仰卧位，并使用针脚或胶带将四肢固定在表面上（补充图S1）。
- 用70%乙醇喷洒腹部，并用棉球拍干。
- 肝脏灌注
- 用剪刀在腹部皮肤上做一个U形的侧切口，并通过侧面扩大孔。
- 继续将皮肤打开到肋骨笼。
- 使用剪刀，切开腹膜，使腹腔暴露在肋骨笼中，小心不要划伤任何器官。使用镊子的背面或剪刀的钝表面将肠道移动到右侧。识别下腔静脉和门静脉（补充图S1）。
- 启动泵以冲洗预热灌注溶液通过导管。
- 停止泵，并在所有空气通过系统冲洗后取出导管。将连接到导管的针尖以与静脉10°-20°的角度插入下腔静脉。从导管中取出针头，然后以平行于静脉的运动轻轻地将导管推入静脉。
注意：用户应观察导管中血液的闪回，以验证静脉中的正确插管。 - 将导管连接到导管，而无需将导管进一步移动到静脉中。
- 以 2 毫升/分钟的流速启动泵。寻找肝脏立即变苍白，作为灌注成功的标志。
- 用剪刀切开门静脉。
- 逐渐将流速增加到 5 毫升/分钟。
- 使用镊子或棉签定期对大约切口部位的门静脉施加压力3秒，以阻断引流并促进良好的灌注。
- 一旦灌注溶液3流过，仔细监测肝脏的弹性。要确定肝脏是否软化，请用棉签或镊子轻轻按压肝脏，并检查肝脏上是否形成压痕。注意不要过度灌注，以避免细胞活力的损失。
- 一旦肝脏软化（在30-50 mL灌注溶液3流过后发生），停止泵，取出导管，然后仔细解剖肝脏。将肝脏放入含有冰冷DMEM + 10%FBS培养基的100毫米培养皿中。切除胆囊，小心不要溢出其内容物。旋转培养皿以轻轻去除可能的血凝块。
- 将肝脏转移到含有冰冷DMEM + 10%FBS培养基的新培养皿中。
2. 肝细胞分离
- 从肝囊中释放细胞。
- 将培养皿放在冰上，使用两对无菌镊子，轻轻撕开所有叶上的肝囊。使用细胞提升器或镊子在培养基中轻轻旋转肝脏以释放肝细胞。继续这个运动，直到肝脏变得非常小，悬浮液变成棕色和不透明。
- 从平板中取出肝组织的残留物，并使用设置为低速的25mL血清学移液器，小心地将细胞悬浮液转移到装有100μm细胞过滤器的50mL锥形管（在冰上预冻）中。
- 将新鲜的冰冷DMEM + 10%FBS培养基加入培养皿中，以冲洗并从表面收集剩余的细胞并转移到50 mL锥形管中。重复此步骤，直到收集完所有单元格。
- 清洗和纯化非实质细胞中的肝细胞。
- 在4°C下以50× g 在低减速或没有任何制动器的情况下将收集在50mL锥形管中的细胞离心5分钟。
- 丢弃含有碎屑和非实质细胞的上清液，并通过轻轻旋转管将沉淀重悬于剩余的上清液中。重悬沉淀后，加入30毫升新鲜冰冷的DMEM + 10%FBS培养基。
- 重复离心（步骤2.2.1）和洗涤（步骤2.2.3）三次。
- 将最终的细胞沉淀重悬于10 mL冰冷的DMEM + 10%FBS培养基中。
注意：用于重悬颗粒的培养基体积取决于颗粒大小。如果颗粒明显小于15毫米，请使用1-5毫升冰冷的DMEM + 10%FBS培养基。
- 细胞活力定量
- 在微量离心管中，将50μL0.4%台盼蓝溶液加入350μL肝细胞电镀培养基（PM）中。然后，加入100μL细胞悬浮液以进行最终的1：5稀释，并上下移液多次以混合。
- 使用血细胞计数器计数细胞密度和活力。计数时，将肝细胞悬浮液放在冰上，然后将冰桶放在设置为30rpm的轨道振荡器上，以防止肝细胞沉降。
- 如果细胞活力<70%，请按照下面的Percoll处理和离心步骤进行操作。
- 用10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）以9：1的比例稀释Percoll。
- 将肝细胞悬浮液与稀释的Percoll以1：1的比例混合。
- 在4°C下以200× g 离心10分钟。
- 丢弃含有死细胞的上清液。将颗粒重悬于冰冷的DMEM + 10%FBS培养基中。
- 再次计数细胞。
- 检测肝细胞的平板性
- 使用1.5mL预热PM，以0.5×每mL10 6个细胞的密度将一些细胞铺在胶原I包被的6 孔板上。
- 在轨道振荡器上将剩余的细胞保持在冰上，直到准备好进行电穿孔。
- 将细胞板置于37°C的水套CO2 培养箱中，以从北到南和从东到西的动作水平和垂直轻轻移动板以确保均匀的电镀。每1.5小时重复两次。
- 在接种后3小时验证细胞附着。
注意：至少60%的细胞应粘附在板上，作为优质肝细胞的指标。 - 在接种后24小时将培养基改为预热的肝细胞维持培养基（MM），以维持培养物中的细胞。
- 糖原染色
- 在细胞附着在6孔胶原I包被板上后，从培养的细胞中取出用过的培养基。
- 将细胞在冰冷的乙醇中固定10-15分钟。
- 用无菌水彻底清洗。
- 在1%高碘酸水溶液中孵育5分钟，然后用无菌水洗涤。
- 在100%希夫试剂中孵育30分钟。
注意：在加入细胞之前，不得稀释希夫试剂。 - 在10分钟内用水洗涤三次。
- 安装在安装介质中。
- 在明场设置上使用显微镜成像。
3. 设计用于克里斯普瑞-卡斯9基因编辑的sgRNA
注意：本节描述了靶向小鼠羟基苯基丙酮酸双加氧酶（Hpd）基因的sgRNA的设计，作为原理验证基因编辑，以破坏与肝脏IMD相关的治疗靶基因。
- 使用引用的软件15设计针对Hpd的引导序列。
- 使用Ensembl基因组浏览器验证 Hpd 的序列。
- 使用以下参数设计gRNA：20个核苷酸的单导引长度和NGG（N可以是任何核苷酸）原间隔邻接基序（PAM）序列。
- 从 Hpd 中的外显子 3 中选择一个目标区域。
- 从目标区域生成具有目标命中和目标外分数的引导序列列表。
注意：目标命中分数表示给定设计的预测目标编辑效率：分数越高，编辑效率越高。脱靶分数与指导序列的特异性相关：分数越高表示脱靶编辑的可能性越低。理想情况下，两个分数都应该很高：目标得分>60，脱靶得分>50。 - 选择目标命中和脱靶分数最高的指导序列。将含有引导序列的sgRNA化学合成。
4. 电穿孔和细胞培养
- 制备CRISPR-Cas9基板、培养基、电池和电穿孔仪器
- 将整个随附的补充剂添加到PM中，并在37°C水浴中加热10分钟。
- 按下 电源 按钮打开电穿孔设备，然后按 x 按钮，然后按 向下箭头 按钮设置电穿孔程序，直到程序 T-028 出现在屏幕上。
- 通过将1.5 mL PM添加到六孔胶原I包衣板中，为电穿孔肝细胞准备目标孔。将板在37°C培养箱中孵育，直到准备使用。
- 将整个随附的补充剂加入电穿孔缓冲溶液中，并在室温下孵育10分钟。
注意：在小瓶上标记电穿孔缓冲液的有效期（补充添加日期后3个月）。 - 从包装中取出电穿孔容器，并为每个样品贴上标签。
- 在PCR分条管中，通过将30μgsgRNA与300 pmol的Cas9蛋白结合来制备Cas9 RNP复合物，并在室温下孵育复合物10分钟。通过将30微克的sgRNA与4 μL的Cas9 mRNA（1 μg/ μL）结合来制备Cas9 mRNA。将mRNA-sgRNA混合物储存在冰上直至电穿孔。单独制备含有1.0μgeGFP mRNA的管子，以验证使用荧光显微镜进行电穿孔成功。
- 在100×g下以1.2×106 个细胞在100× g 下离心2分钟。
- 从细胞沉淀中除去上清液，并沿着管壁的一侧加入每次反应100μL电穿孔溶液。通过用手轻轻摇动管子将肝细胞重悬于电穿孔溶液中。
- 将脆皮质酸钙蛋白和核糖核酸电穿孔到肝细胞中
- 一旦肝细胞均匀地分散在电穿孔溶液中，将100μL肝细胞悬浮液转移到含有Cas9复合物的条管中。
注意：转移肝细胞时使用宽孔移液器吸头以保持细胞活力。 - 将带状孔的内容物转移到电穿孔容器中。
- 将核壳体放入电穿孔装置上的插槽中。通过按 x 按钮电穿孔肝细胞。电穿孔后，等待设备上弹出一个显示 “确定”的屏幕。再次按下 x 按钮并取出容器。
- 将电穿孔容器在冰上孵育15分钟。
- 向电穿孔容器中加入500μL预热PM。
- 将300μL电穿孔反应转移到预热板上的每个目标孔中。
注意：每个电穿孔反应应该有两个目标孔。一口井将用于量化基因编辑效率;另一口孔将用于MTT和白蛋白测定。 - 为了防止肝细胞积聚在孔的中心，通过以从北到南和东西的运动水平和垂直轻轻移动板来分散细胞。确保板在移动时与培养箱架保持接触。在电镀电穿孔肝细胞后15，30，45，60和90分钟重复该运动。
- 将板在37°C孵育过夜。
- 接种细胞24小时后，从指定用于基因编辑分析的孔中取出培养基，并用0.25mg / mL基底膜基质覆盖物代替。
注意：如果储存在冰箱中，将膜基质转移到4°C并使其解冻。由于基底膜基质在10°C以上是固体，因此基底膜基质保持在冰上或4°C直到准备使用至关重要。
- 一旦肝细胞均匀地分散在电穿孔溶液中，将100μL肝细胞悬浮液转移到含有Cas9复合物的条管中。
5.计算与MM混合的膜基质的体积，得到0.25mg / mL的最终浓度
注意：对于6孔板，每孔需要2 mL覆盖物。
6.将计算出的膜基质体积加入冰冷MM中，上下移液10次，混合均匀
- 将覆盖混合物缓慢移液在细胞顶部，并将板放回37°C培养箱中。
- 每24小时用新鲜的维护介质替换培养基。
- 在电镀后24小时，从指定用于MTT和白蛋白测定的孔中转移条件培养基。将条件培养基储存在微量离心管中，直到准备好进行白蛋白测定。继续进行步骤7.1进行MTT测定。
注意：将调质培养基储存在4°C下进行短期储存（不到一天）。为了延长储存时间，将培养基储存在-80°C。
7. 电穿孔小鼠肝细胞的递送效率、活力和靶向编辑分析
- 使用 MTT 测定进行活力测量
- 通过将1mL PBS加入一个5mg MTT小瓶中来制备12 mM MTT储备溶液。
- 向孔中加入150μLMTT储备溶液并孵育24小时。
- 孵育后，向每个孔中加入1.5mL十二烷基硫酸钠 - 盐酸盐（SDS-HCl）溶液，然后移液器混合。
- 将板在37°C下孵育4小时，并寻找培养基颜色从透明到紫色的变化以指示活细胞。
- 使用移液管再次混合每个样品，并使用酶标仪读取570nm处的吸光度。
- 使用等式 （1） 计算 Cas9 处理样品的归一化活力：
（1）
- 白蛋白测定以评估肝细胞功能
- 将50μL调节培养基转移到白蛋白试剂盒提供的板中的孔中。覆盖孔并在室温下孵育2小时。
- 用200μL洗涤缓冲液洗涤孔5x。
- 倒置板以清空纸巾上的每个孔，然后轻拍几次。
- 洗涤后，向每个孔中加入白蛋白测定试剂盒中提供的50μL生物素化抗体，并在室温下孵育1小时。
- 重复步骤5.2.2-5.2.3以洗涤孔。
- 向每个孔中加入白蛋白测定试剂盒中提供的50μL链霉亲和素 - 过氧化物酶，并在室温下孵育30分钟。
- 重复步骤 5.2.2。
- 每孔加入白蛋白测定试剂盒中提供的50μL致色性底物，并在室温下孵育30分钟。轻轻敲击盘子以确保均匀混合。用移液器吸头去除任何气泡。
- 最后，向每个孔中加入50μL终止溶液，并寻找从黄色到蓝色的颜色变化以指示功能细胞。
- 立即使用酶标仪读取450nm处的吸光度。
- 估计用eGFP mRNA电穿孔的孔中的递送效率。
- 电穿孔后24小时捕获肝细胞的相差和绿色荧光图像。在井内的不同位置拍摄三张图像。
- 将单元格的图像上传到图像J。在“ 图像 ”选项卡下，选择“ 类型| 16 位 ”以将图像转换为灰度。
- 若要突出显示图像中的单元格结构，请在“ 图像 ”选项卡下，选择“ 调整|阈值。调整滑块以突出显示单元格。
- 在“ 进程 ”选项卡下，选择“ 减去背景” 以消除背景噪音。
- 通过单击“ 分析 ”选项卡对单元格进行计数，然后选择“ 分析粒子”。单击 “确定” 生成计数粒子的列表。
- 通过将绿色荧光图像中的计数颗粒数除以相应相差图像中计数的颗粒数来计算GFP阳性细胞的百分比。
- 分析目标Cas9活性
- 从电穿孔细胞中提取基因组DNA。
- 电穿孔3天后从板中取出培养基，并加入500μL0.25%胰蛋白酶。在37°C孵育5分钟。孵育后移液几次，以确保肝细胞已从板中分离出来。
- 将胰蛋白酶消化的细胞悬浮液转移到微量离心管中，并在室温下以800× g 在台式离心机中旋转10分钟。纺纱后，检查管子是否有颗粒。
- 通过移液除去含有胰蛋白酶的上清液。确保不要打扰颗粒。将沉淀重悬于80μLDNA提取溶液中。如果沉淀难以看到，则将管的内容物重悬于50μL DNA提取溶液中。
- 涡旋30秒，以确保颗粒重悬。将悬浮液转移到PCR分体条管中，并将其置于热循环仪中。在95°C下运行15分钟，在68°C下运行8分钟。
- PCR扩增靶位点。
- 按照下面描述的步骤，使用DNA聚合酶扩增 Hpd 靶向区域。
- 制备含有0.5μL 10 mM dNTPs，0.5μL10μM前向引物，0.5μL10μM反向引物，0.125μLTaq聚合酶，5μL从肝细胞中提取的基因组DNA和18.375μL无核酸酶水的反应。引物序列见 补充表S1 。
- 短暂涡旋并快速离心PCR混合物，以确保溶液位于管的底部。
- 将PCR混合物置于热循环仪中并在以下条件下扩增：94°C进行30秒变性，30次循环94°C进行30秒，57°C循环45秒退火，68°C增温1分钟，最终延长68°C5分钟。
注意：PCR反应的退火温度将根据引物的成分而变化。在进行PCR之前，请考虑使用熔解温度计算器。 - 为了确认正确的产品尺寸，将3μLPCR产物与2μL水和1μL6x染料混合。在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，并确认正确的产品尺寸。
- 使用磁珠纯化DNA。
注意：离心柱也可用于PCR清理。以下是使用磁珠纯化PCR产物的程序。- 从4°C中取出磁珠，使其达到室温。
- 短暂涡旋并快速离心PCR混合物。
- 加入相当于PCR混合物体积的1.8×珠体积的珠子。移液PCR微球混合10x以确保溶液均匀混合。
- 在室温下孵育10分钟。
- 将PCR磁珠混合物转移到PCR板上并将其放在磁板上。
- 将板在磁铁上孵育5分钟。5分钟后，检查溶液是否透明，并且磁珠已绑定到磁铁上，然后再进行下一步。
- 弃去上清液。
- 向孔中加入200μL70%乙醇并孵育30秒。
注意：在进行清理之前不久应制备70%乙醇，以防止DNA丢失。 - 弃去上清液并重复步骤7.4.4.8。
- 除去上清液，在室温下干燥3分钟以除去痕量乙醇。
- 从磁铁上取下板，向样品中加入22μL水。上下移液10倍，将水和珠子混合。
- 将样品在室温下孵育3分钟。
- 将板移回磁铁并孵育3分钟或直到溶液澄清。
- 将20μL样品转移到PCR管中。注意不要携带珠子。
- 通过桑格测序对纯化的DNA扩增子进行序列化。
- 将处理过的样品和对照（未处理）样品的 .ab1 序列文件上传到通过分解跟踪 （TIDE）16 以量化目标站点的插入量。
- 从电穿孔细胞中提取基因组DNA。
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Representative Results
从肝脏中分离出可平板的原代肝细胞
肝脏灌注和肝细胞分离的整个过程如图 1所示。在该实验中，使用了野生型，8-10周龄的C57BL6 / 6J小鼠。该程序预计每只小鼠产生20-50个×106 个细胞，存活率在85%至95%之间。如果活力<70%，则应遵循全唇处理以去除死细胞。新鲜分离的肝细胞应接种在胶原 I 包被或含氮组织培养板上。在电镀的3-12小时内，预计肝细胞将粘附在板上，并且细胞形态在24小时内呈现出典型的多边形或六边形外观（图2）。肝细胞是肝脏中唯一以糖原形式储存葡萄糖的细胞。为了验证分离细胞的纯度，在电镀后24小时使用元素酸 - 席夫试剂进行糖原染色。染色的肝细胞的细胞质呈洋红色（图3）。
将脆皮质酸钙蛋白和 mRNA 电穿孔到分离的小鼠肝细胞中
将新鲜分离的小鼠肝细胞电穿孔，电穿孔为eGFP mRNA，钙质9 mRNA以及Hpd靶向的sgRNA或与Hpd-sgRNA（RNP）复合的Cas9蛋白。Hpd-sgRNA用2'-O-甲基硫代磷酸酯键与5′和3′末端14上的前三个和最后三个连续核苷酸进行化学修饰。化脓性链球菌 Cas9用于实验。使用荧光显微镜在电穿孔后24小时对肝细胞进行成像，并在图像中计数GFP阳性细胞的百分比（图4A）。平均而言，89.8%[范围87.1%-92.4%]的肝细胞为GFP阳性。在电穿孔后3天，使用TIDE16分析了Hpd位点中Cas9诱导的插入和缺失（插入）。结果显示，用CRISPR-Cas9 mRNA电穿孔的肝细胞中的靶向浸入量为47.4%，Cas9 RNP的浸入量为78.4%（图4B）。进行MTT和白蛋白测定以评估电穿孔CRISPR-Cas9后的肝细胞活力和功能。MTT结果显示，用CRISPR-Cas9 mRNA和RNP处理的肝细胞的活力分别为35.4%和45.9%（图4C）。与MTT结果一致，用Cas9 mRNA处理的肝细胞的归一化白蛋白水平为31.8%，Cas9 RNP为34.5%（图4D）。
图1：肝细胞灌注和分离方案的示意图。 下腔静脉插管后，门静脉被切断，灌注液1、2和3泵入肝脏。肝囊破裂，细胞使用细胞提升器释放。将释放的细胞过滤并离心。 请点击此处查看此图的大图。
图2：新鲜分离的原代肝细胞。 从C57BL / 6J小鼠分离的肝细胞接种在具有肝细胞电镀介质的胶原I包被的6孔板上。电镀后24小时拍摄的图像。比例尺 = 400 μm .请点击此处查看此图的大图。
图3：糖原染色。 对新鲜分离的原代小鼠肝细胞进行糖原染色以确认纯度。在电镀后24小时使用希夫试剂进行染色。 染色肝细胞的细胞质呈洋红色。比例尺 = 100 μm .请点击此处查看此图的大图。
图4：将 Hpd靶向CRISPR-Cas9电穿孔到新鲜分离的原代小鼠肝细胞中。 （A）电穿孔后24 h新鲜分离的小鼠肝细胞的相差和绿色荧光显微镜图像。上行的图像是用eGFP mRNA转染的肝细胞，下行的图像是未转染的对照肝细胞。比例尺 = 400 μm. （B） 用于用 Cas9 mRNA 与 sgRNA 或 RNP 电穿孔的小鼠肝细胞的靶向插入。（C）在电穿孔后24小时在MTT测定中将活力归一化为未转染的对照肝细胞。（D）在电穿孔后24小时测量的条件培养基中的白蛋白水平归一化至未转染的对照肝细胞（n = 3），并进行两次技术重复。统计分析通过未配对的 t 检验进行。这个数字是从 14修改而来的。缩写：Hpd = 4-羟基苯基丙酮酸二加氧酶;CRISPR = 簇状规则间隔的短回文重复;Cas9 = 克里斯帕瑞相关蛋白9;单引导核糖核酸 = 单引导核糖核酸;RNP = 核糖核蛋白;插入 = 插入-删除;MTT = 3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5二苯基溴化四氮唑。 请点击此处查看此图的大图。
表1：肝灌注和肝细胞分离方案的故障排除。 此表突出显示了协议期间遇到的常见问题，并建议了可能的解决方案。 请按此下载此表格。
补充图S1：手术期间的小鼠腹腔。 导管插入肾分支（未见）之前的下腔静脉（蓝点）。缩写：L = 肝脏;K = 肾脏;I = 小肠。 请按此下载此档案。
补充表S1：Cas9指南和PCR引物序列。 用于靶向 Hpd 的 sgRNA 的指导序列和 PAM，以及用于扩增 Hpd 的 PCR 引物序列。缩写：Hpd = 4-羟基苯基丙酮酸二加氧酶;CRISPR = 簇状规则间隔的短回文重复;Cas9 = 克里斯帕瑞相关蛋白9;单引导核糖核酸 = 单引导核糖核酸;PAM = 原始间隔邻接基序。 请按此下载此表格。
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Discussion
肝细胞分离方案中概述的步骤具有挑战性，需要熟练练习。从肝脏中成功分离肝细胞有几个关键步骤。首先，下腔静脉的适当插管对于完全肝脏灌注至关重要。灌注后肝脏无变白表明导管移位（表1）。下腔静脉（逆行灌注）在手术中管，因为它比门静脉（顺行灌注）更简单，更容易获得17，18。一些方案使用缝合线来固定导管19;然而，缝合线使该过程复杂化。缝合导管可能会导致不良结果，例如导管错位并无法调整其位置。此外，可以在不取出针头的情况下在肝脏中进行插管，这可以进一步简化肝脏灌注。将泵连接到导管是不必要的，针头在静脉中。此外，意外拔出导管并形成血栓的可能性降低。仅插入相对于静脉的平坦角度的导管尖端可增强导管的套管。下腔静脉有几个分支，因此将导管插入错误的部位会导致身体另一部位而不是肝脏的灌注（表1）。因此，将导管放置在避开分支的部位至关重要。不同小鼠之间的血管结构会略有不同;因此，重要的是在插管前检查静脉以确定注射导管的最佳部位。取出针头后导管内的血液反冲洗是正确插管的极好迹象。当对门静脉施加压力时，也可以通过寻找肝脏肿胀来检查适当的插管（步骤1.3.13）。
在分离肝细胞时，第二个关键步骤是识别何时发生完全的肝脏消化。酶的质量和浓度对于适当的消化至关重要。与 20，21中发现的方案相反，该方案建议使用由两种胶原酶亚型组成的Liberase，因为它提供了比常规胶原酶22更好的酶活性一致性和减少的批次间差异。消化酶质量和活性的变化可能导致分离不一致。在消化过程中监测肝脏并在肝脏软化后立即停止消化至关重要。消化后的肝脏将是灵活的，并且通过使用镊子或棉签抑制肝脏来验证弹性的丧失，以确认压痕的形成而没有组织反弹。在该协议中，每个肝脏推荐的最大自由酶溶液量为50mL;体积越大会导致过度消化。如果完美进行插管，30 mL Liberase溶液足以实现适当的消化。该过程的最后关键步骤是分离和洗涤步骤。在解剖肝脏并将其转移到含有带有FBS的冰冷DMEM的无菌培养皿中后，避免将肝脏切成碎片至关重要。在这个阶段，使用细胞提升器轻轻地释放细胞并最大化细胞活力。倾斜培养皿以将肝脏浸没在DMEM中有助于将细胞从胶囊释放到悬浮液中，并且必须在冰上缓慢完成。在释放步骤中应该很容易破坏格利森的胶囊，并且介质应该变得浑浊和棕色。破坏胶囊时的困难是消化不良的指标（表1）。
该方案适用于在新分离的小鼠肝细胞中产生高水平的CRISPR-Cas9编辑。在研究中比较了由Cas9 RNP和mRNA产生的插入量。在用Cas9 RNP电穿孔的肝细胞中观察到比mRNA更高水平的基因编辑，这与其他研究的结果14，23，24一致。Cas9 RNP相对于mRNA的优势在于它提供了较低的脱靶编辑，因为Cas9蛋白在细胞中的存在时间比mRNA23，24短。由于sgRNA的效率因设计和靶位点而异，因此应设计和测试多个sgRNA在目的基因上的编辑效率。在具有高基因效率的sgRNA之间进行选择时，请选择更高特异性的评分设计。如果基因编辑一直很低，请考虑共同递送报告基因，例如eGFP mRNA，以确认递送。电穿孔后eGFP阳性细胞水平低可能表明电穿孔缓冲液过期，电穿孔装置问题或反应中的气泡。如果eGFP阳性细胞数量较多，但编辑效率较低，请在细胞系中测试sgRNA设计以确认编辑活性并调整电穿孔到细胞中的Cas9和sgRNA的量。最后，考虑用于评估编辑活动的方法。基于凝胶的检测，如T7内切酶I，由于切割部位1 bp错配的敏感性低，因此可以低估基因编辑。深度测序是量化Cas9基因编辑的最准确方法，特别是对于非靶位点的低编辑事件。
该方案的另一个具有挑战性的方面是在电穿孔后培养新鲜分离的肝细胞。用户必须在方案的每个步骤中轻轻处理细胞，以便在电穿孔后获得活的，可板的肝细胞。避免通过涡旋分散肝细胞;相反，轻轻地摇晃含有细胞的小瓶，直到细胞重新悬浮。转移肝细胞时，使用宽孔移液器吸头以保持活力。电穿孔后将比色皿在冰上孵育15分钟，使细胞膜重新密封并增强活力。接种后，将板置于培养箱中，以从北到南和东西的运动轻轻地水平和垂直移动板，以确保肝细胞均匀分散并保持细胞活力。如果肝细胞未能附着在板上，请考虑在电穿孔反应中将细胞数量增加到1.3×10 6 。
该协议的一个有希望的应用是生成肝脏人类IMD的小鼠模型。对于编码富马基乙酰乙酸水解酶（Fah）的基因呈阳性的小鼠肝细胞已被证明在 Fah缺乏（Fah/-）小鼠移植后有效地移植和重新填充肝脏25。开发肝脏IMD小鼠模型的一种新方法是将CRISPR-Cas9电冲入野生型小鼠肝细胞中以引入与疾病相关的编辑，然后在 Fah/ -小鼠中移植基因编辑的肝细胞。与用于重新填充肝脏的天然 Fah缺陷细胞相比，Cas9编辑的肝细胞在移植后具有天然的选择性优势。
总之，该协议使用户能够从小鼠肝脏中分离原代肝细胞，然后使用CRISPR-Cas9 mRNA和RNP进行基因编辑。该方案可以修改用于不同菌株的小鼠，以研究影响肝脏的各种类型的遗传疾病 在体外 和 体内 并测试治疗方法。
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Disclosures
作者没有要披露的竞争利益。
Acknowledgments
RNC获得了南卡罗来纳州生物工程再生和组织形成试点基金的资助，该基金由美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所（NIGMS），美国肝病研究基金会和美国基因&细胞治疗学会资助，拨款号为P30 GM131959，2021000920， 和2022000099分别。内容完全由作者负责，并不一定代表美国基因与细胞治疗学会或美国肝病研究协会基金会的官方观点。 图1 的原理图是用 BioRender.com 创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1402-4700 | |
| 6-well Collagen Plates | Advanced Biomatrix | 5073 | |
| accuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| All-in-one Fluorescent Microscope | Keyence | BZ-X810 | |
| Analog Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL | ThermoFisher Scientific | 2079GPK | |
| Automated Cell Counter | Bio-Rad Laboratories | TC20 | |
| Blue Wax Dissection Tray | Braintree Scientific Inc. | DTW1 | 9" x 6.5" x 1/2"+F21 |
| Cell scraper/lifter | Argos Technologies | UX-04396-53 | Non-pyrogenic, sterile |
| Conical tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 339650 | |
| Conical tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Cotton applicators | Fisher Scientific | 22-363-170 | |
| Curved scissors | Cooper Surgical | 62131 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 351029 | 100mm,sterile |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25373-100 | 35mm, sterile |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | 250082 | |
| Falcon Cell strainer (70 µm) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Forceps | Cooper Surgical | 61864 | Euro-Med Adson Tissue Forceps |
| IV catheters | BD | 382612 | 24 G x 0.75 in |
| IV infusion set | Baxter | 2C6401 | |
| MyFuge 12 Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | 1220P38 | |
| Needles | Fisher Scientific | 05-561-20 | 25 G |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes |
| Peristaltic Pump | Masterflex | HV-77120-42 | 10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC |
| Precision pump tubing | Masterflex | HV-96410-14 | 25 ft, silicone |
| Primaria Culture Plates | Corning Life Sciences | 353846 | Nitrogen-containing tissue culture plates |
| Serological Pipets (25 mL) | Fisher Scientific | 12-567-604 | |
| Syringes | BD | 329464 | 1 mL, sterile |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | 1861096 | |
| Water bath | ALT | 27577 | Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 | IDT | 1081058 | |
| Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL | Fisher Scientific | NC9959336 | |
| CleanCap Cas9 mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7606-100 | |
| CleanCap EGFP mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7201-100 | |
| Corning Matrigel Matrix | Corning Life Sciences | 356234 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885076 | Low glucose, pyruvate |
| Ethanol 70% | VWR | 71001-652 | |
| Fetal bovine serum | Thermoscientific | 26140-079 | |
| Hepatocyte Maintenance Medium (MM) | Lonza | MM250 | |
| Hepatocyte Plating Medium (PM) | Lonza | MP100 | |
| Mouse Albumin ELISA Kit | Fisher Scientific | NC0010653 | |
| Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPL-1004 | |
| OneTaq HotStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0481L | |
| PBS 10x pH 7.4 | Thermoscientific | 70011-044 | No calcium or magnesium chloride |
| Percoll (PVP solution) | Santa Cruz Biotechnology | sc-500790A | |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | P7875-25G | |
| Permount Mounting Medium | VWR | 100496-550 | |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen Corporation | QE05090 | |
| Schiff’s fuchsin-sulfite reagent | Sigma-Aldrich | S5133 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | Phenol red |
| Vybrant MTT Cell Viability Assay | ThermoFisher Scientific | V13154 | |
| Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| EBSS | Fisher Scientific | 14155063 | Complete to 200 mL |
| EGTA (0.5 M) | Bioworld | 40520008-1 | 200 µL |
| HEPES (pH 7.3, 1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| CaCl2·2H20 (1.8 mM) | Sigma | C7902-500G | 360 µL of 1 M stock |
| EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) | Fisher Scientific | 14-155-063 | Complete to 200 mL |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| MgSO4·7H20 (0.8 mM) | Sigma | 30391-25G | 160 µL of 1 M stock |
| Perfusion Solution 3 | Prepared fresh prior to use | ||
| Solution 2 | 50 mL | ||
| Liberase | Roche | 5401127001 | 0.094 Wunsch units/mL |
| Mouse Anesthetic Cocktail | |||
| Acepromzine | 0.25 mg/mL final concentration | ||
| Ketamine | 7.5 mg/mL final concentration | ||
| Xylazine | 1.5 mg/mL final concentration | ||
| Software | URL | ||
| Benchling | https://www.benchling.com/ | ||
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| TIDE: Tracking of Indels by Decomposition | https://tide.nki.nl/ |
References
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