Summary
本手稿的目的是描述 试剂盒V558Δ/+小鼠模型以及成功解剖和处理小鼠标本的技术。
Abstract
胃肠道间质瘤（GIST）是最常见的人肉瘤，通常由KIT受体中的单个突变驱动。在各种肿瘤类型中，已经开发了许多小鼠模型，以研究下一代癌症疗法。然而，在GIST中，大多数 体内 研究使用具有固有局限性的异种移植小鼠模型。在这里，我们描述了一种免疫功能正常的，基因工程化的胃肠道间质瘤小鼠模型，该模型含有 KitV558Δ / + 突变。在这个模型中，突变的KIT是负责大多数GIST的癌基因，由其内源性启动子驱动，导致GIST模仿人类GIST中的组织学外观和免疫浸润。此外，该模型已成功用于研究靶向分子和免疫疗法。在这里，我们描述了 KitV558Δ/+ 小鼠群落的繁殖和维护。此外，本文详细介绍了 KitV558Δ/+ 小鼠中GIST，引流肠系膜淋巴结和邻近盲肠的治疗和获取，以及用于分子和免疫学分析的样品制备。
Introduction
GIST是人类最常见的肉瘤，在美国发病率约为6，000例1。GIST似乎起源于称为Cajal间质细胞的胃肠道起搏器细胞，通常由酪氨酸激酶KIT或PDGFRA2中的单个突变驱动。手术是 GIST 的主要治疗方法，可以治愈，但晚期疾病患者可以使用酪氨酸激酶抑制剂 （TKI） 伊马替尼进行治疗。自20多年前推出以来，伊马替尼已经改变了GIST的治疗模式，将晚期疾病的生存率从1年提高到5年以上3，4，5。不幸的是，由于获得性KIT突变，伊马替尼很少能治愈，因此需要新的治疗方法来治疗这种肿瘤。
小鼠模型是研究癌症新疗法的重要研究工具。GIST6，7中已经开发并研究了多种皮下异种移植和患者来源的异种移植模型。然而，免疫缺陷小鼠不能完全代表人类GIST，因为GISTs根据其致癌突变具有不同的免疫谱，并且改变胃肠道肿瘤微环境可改善TKI治疗的效果8，9。KitV558Δ/+小鼠在 Kit 外显子 11 中具有杂合子种系缺失，该基因系对并列膜结构域进行编码，这是人类 GIST10 中最常见的突变位点。KitV558Δ/+小鼠发展出具有100%外显率的单个盲肠GIST，并且肿瘤具有与人类GIST8，11，12，13相似的组织学，分子信号传导，免疫浸润和对治疗的反应。在这里，我们描述了KitV558Δ / +小鼠中的育种，处理以及标本分离和处理，用于GIST中的分子和免疫学研究。
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Protocol
根据NIH指南和宾夕法尼亚大学IACUC的批准，所有小鼠都住在宾夕法尼亚大学的无病原体条件下。安乐死是按照宾夕法尼亚大学实验动物资源标准操作程序进行的。
1. 试剂盒V558Δ/+ 小鼠育种
- 使用 C57BL/6J 鼠标将套件 V558Δ/+ 鼠标反向交叉 10 次以上，放到 C57BL/6J 背景上。为此，将雄性 试剂盒V558Δ / + 小鼠与雌性C57BL / 6J小鼠以1：2的比例繁殖。
注意：纯合 试剂盒V558Δ/ V558Δ 基因型在子宫内是致命的。可以将雌性 KitV558Δ / + 小鼠与雄性C57BL / 6J小鼠繁殖，但窝大小约为雌性野生型C57BL / 6J小鼠的一半。此外，雌性 KitV558Δ/+ 小鼠在4个月大后产生有限的窝。 - 通过脚趾剪裁对7-14天的幼崽进行基因分型，以确认 是否存在KitV558Δ/+ 基因型。使用前瞻引物：《中共中央》;记者1：中科院;反向引物：TTGCGTC和记者2：用于基因分型的TCTC。
2. 套件V558Δ/+ 小鼠治疗
- 治疗前，年龄和性别与 试剂盒V558Δ/+小鼠相匹配。在队列中使用年龄和性别匹配的小鼠，因为来自雌性 KitV558Δ / + 小鼠的肿瘤比雄性小鼠大。在8-12周龄时治疗小鼠，此时肿瘤建立（图1）。
- 给予酪氨酸激酶抑制剂口服或腹膜内（IP）注射; 试剂盒V558Δ/+ 肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂敏感。在饮用水中以600mg / L的剂量提供伊马替尼，或注射45mg / kg，每日两次。如步骤3所示，在解剖肿瘤后使用数字秤测量肿瘤重量减轻，在用伊马替尼治疗后1周约为50%，在4周时约为80%（图2）。
3. 试剂盒V558Δ/+ 小鼠器官采集
- 通过CO2 麻醉以每分钟60%的腔室体积的流速对小鼠实施安乐死。呼吸停止后将小鼠留在腔室中至少2分钟，然后进行宫颈脱位以确认死亡。
- 对所有器械进行消毒，在整个过程中戴上手套，并保持无菌区域。用70%乙醇准备皮肤。用剪刀做一个2厘米的中线垂直切口，然后进入腹腔。锐利地裂开任何腹腔内粘连。
- 要切除引流肠系膜淋巴结，请按照以下步骤操作。
- 识别盲肠并更好地抬起其肠系膜。大约在结肠肠系膜底部的中间，识别肠系膜淋巴结并急剧解剖。淋巴结是灰白色的，大小约为0.5厘米x 0.5厘米。
- 根据需要将淋巴结组织分成三部分，以进行蛋白质分离、组织学和单细胞悬浮液。对于单细胞悬浮液，将淋巴结组织置于20 mL血清游离培养基（RPMI）中并保持在冰上。
- 要隔离GIST和盲肠，请按照以下步骤操作。
- 试剂盒V558Δ/+小鼠中的盲肠大多被GIST取代。小心地将回肠结肠连接处与肿瘤的底部分开。要收集盲肠，再次将结肠分开，在肿瘤底部的近端2厘米处。
- 在50%-60%的 KitV558Δ / + 小鼠中，肿瘤的头部含有盲肠组织的盖子，其通常含有浆液，但可能很少含有脓液（图3）。尖锐地解剖帽状组织，使其远离肿瘤组织。
- 根据需要将肿瘤组织和/或盲肠分成三部分，用于蛋白质分离、组织学和单细胞悬浮液。对于单细胞悬浮液，将肿瘤组织或盲肠置于含有2%FCS的HBSS中，足以覆盖样品并保持在冰上。
4. GIST组织的蛋白质印迹分析
- 制备含有50mM三氢盐酸盐（pH 7.5），150mM氯化钠，5mM EDTA，1%非变性洗涤剂，2mM Na3VO4，1 mM PMSF，10mM NaF和20μl/ ml蛋白酶抑制剂混合物的组织裂解缓冲液。
- 通过混合1800 mL去离子水，2 mL吐温20和200 mL 10x三进制缓冲盐水（TBS），制备1x Tris缓冲盐水溶液和1%吐温20（TBST）。
- 将步骤3.4.3中的组织重悬于FACS管中，在5mL / g组织裂解缓冲液中，并用机械均质机以15，000rpm在冰上匀浆两次。在冰上孵育裂解物30分钟。
- 将裂解物转移到1.5 mL微量离心管中。在4°C下以最大速度离心20分钟。 将上清液转移到新的微量离心管中。
- 电泳在4%至15%梯度凝胶上裂解物，然后转移到硝酸纤维素膜上，如14中所述。
- 在1x TBS中洗涤一次膜5分钟，然后在5%牛奶中阻断膜1小时。再次，在1x TBS中洗涤一次膜10分钟。
- 将膜在一抗中以1：1000在4°C下以5%BSA稀释过夜。在1x TBST中洗涤膜3x，每次10分钟。将具有稀释的1：2500的二抗的印迹在室温下在2.5%牛奶中孵育1小时。
- 在1x TBS中洗涤一次膜5分钟。加入足够的HRP底物以覆盖膜，通常为200-500μL，并使用数字成像仪检测和量化化学发光。
5. GIST组织的免疫组化
- 将步骤3.3.2或3.4.3中的组织固定在4%多聚甲醛中，在4°C下过夜。将组织储存在70%的EtOH中，直到准备好进行处理。将厚度为 5 μm 的块嵌入和切片到载玻片上，如15，16 所述。
- 使用碱性免疫检测试剂盒完成免疫组化检测，如前述17所述。
6. 肠系膜淋巴结单细胞悬液
- 将RPMI培养基与步骤3.3.2中的淋巴结标本倒在100μm过滤器上。将过滤器移至新的50 mL锥形和麦芽浆淋巴结，并用3 mL塑料注射器的软端。用 20 mL RPMI 培养基清洗过滤器。
- 在4°C下以450× g 离心滤液5分钟。吸出上清液。
- 将沉淀重悬于PBS（珠状缓冲液）中的20 mL 1%FBS中，并倒在40μm过滤器上。收集细胞滤液。使用血细胞计数器计数细胞。
- 在4°C下以450× g 离心滤液5分钟。吸出上清液。以6 x 107 个细胞/ mL重悬于磁珠缓冲液中以进行流式细胞术。
7. GIST的单细胞悬浮液
- 通过添加250mg胶原酶IV，一片无EDTA蛋白酶抑制剂和100μLDNase I至50mL HBSS来制备胶原酶缓冲液。在室温下旋转10分钟直至溶解。
- 将GIST放入无菌皿中，加入2.5 mL胶原酶缓冲液。使用无菌手术刀和剪刀切碎肿瘤，直到肿瘤呈细小碎片状。使用大口径移液管将肿瘤和胶原酶吸入50 mL管中。
- 在37°C下以100rpm的振荡培养箱中孵育30分钟。用2 mLFBS进行淬灭反应。
- 将胶原酶与GIST标本一起倒在100μm过滤器上，并用3mL塑料注射器的软端捣碎肿瘤，并收集在50mL管中。用 20 毫升 HBSS 清洗过滤器。将滤液在450× g，4°C下离心5分钟。吸出上清液。
- 将沉淀重悬于20 mL磁珠缓冲液中，并倒入40μm过滤器上。收集滤液并使用血细胞计数器计数细胞。将滤液在450× g，4°C下离心5分钟。吸出上清液。以6 x 107 个细胞/ mL重悬于磁珠缓冲液中以进行流式细胞术。
8. 盲肠单细胞悬浮液
- 按照步骤7.1制备胶原酶缓冲液。使用剪刀，纵向分开盲肠以暴露内粘膜。切成 0.5 厘米的切片，放入 50 mL 管中，管内含 5 mL HBSS，含 2% FBS。剧烈摇动30秒，以450× g 离心20秒，然后吸出上清液。
- 加入 5 毫升 HBSS 和 2 米米 EDTA。在37°C的振荡培养箱中以100rpm孵育15分钟。以450 x g 离心20秒。吸出上清液。
- 加入 5 毫升哈佛商学院。剧烈摇动30秒，以450× g 离心20秒，然后吸出上清液。再次重复。
- 加入 5 mL 胶原酶缓冲液。在37°C的振荡培养箱中以100rpm孵育30分钟。每 10 分钟用力摇晃一次。用2 mLFBS进行淬灭反应。
- 将胶原酶与盲肠标本倒在100μm过滤器上，并用3 mL塑料注射器的软端捣碎。用 20 毫升 HBSS 清洗过滤器。收集滤液。
- 在4°C下以450× g离心滤液5分钟。 吸出上清液。将沉淀重悬于20 mL珠缓冲液中，并倒在40μm过滤器上。收集滤液并使用血细胞计数器计数细胞。
- 在4°C下以450× g离心滤液5分钟。 吸出上清液。以6 x 107 个细胞/ mL重悬于磁珠缓冲液中以进行流式细胞术。
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Representative Results
KitV558Δ/+小鼠模型允许在免疫功能小鼠模型中研究治疗方法。由于进行性肠梗阻，KitV558Δ / +小鼠的平均寿命为8个月（图4）。来自KitV558Δ / +小鼠的肿瘤表达GIST的规范标志物，包括酪氨酸激酶KIT和跨膜通道DOG1（图5）以及转录因子ETV1（未显示）。可以研究肿瘤KIT信号通路的变化，例如下游标志物ERK和AKT（图6），或与人类GIST8，11，12，13密切相关的免疫微环境。MRI8或CT（图7）也可用于跟踪肿瘤体积，作为肿瘤反应的准确测量。在成像前1小时给予未经处理的试剂盒V558Δ / +小鼠口服200μL胃格拉芬。CT成像在万岁CT 80平台上完成。使用斐济软件进行3D重建，该软件也可以测量肿瘤体积。
图1：雄性和雌性 试剂盒V558Δ / + 小鼠中肿瘤重量的比较。 分离来自9周龄未经治疗的 试剂盒V558Δ / + 雄性和雌性小鼠的肿瘤并称重（n = 15只小鼠/组）。数据表示均值±均值标准误（SEM）;使用学生的 t 检验计算p值;* = P < 0.05。 请点击此处查看此图的大图。
图2：伊马替尼对 试剂盒V558Δ / + 小鼠肿瘤的影响。 将试剂盒V558Δ / + 小鼠用载体或600mg / L伊马替尼在饮用水中处理1或4周。分离肿瘤并称重（n = 4-5只小鼠/组）。数据表示平均±SEM;使用单向方差分析与邦费罗尼后检验进行比较来计算p值，以比较各个组;* = P < 0.05。 请点击此处查看此图的大图。
图3： 试剂盒V558Δ / + 肿瘤帽。 来自 试剂盒V558Δ / + 小鼠的肿瘤的代表性照片，其盲肠帽含有浆液。 请点击此处查看此图的大图。
图4： 试剂盒V558Δ/+ 小鼠的寿命。 未处理的 试剂盒V558Δ / + 小鼠的存活率跟踪>400天（n = 43只小鼠）。 请点击此处查看此图的大图。
图5：免疫组化分析。KitV558Δ/+肿瘤的代表性组织学，其中比例尺为40μm.缩写：H&E =苏木精和曙红染色;Kit = GIST和受体酪氨酸激酶的规范标记;Dog1 = GIST的规范标记，在阴离子传输中起作用。请点击此处查看此图的大图。
图6：分子信号分析.KitV558Δ / +小鼠在饮用水中用载体或600mg / L伊马替尼处理1周。在分析前6小时给予小鼠单次腹腔注射载体或45mg / kg伊马替尼。通过蛋白质印迹检查来自KitV558Δ / +肿瘤的蛋白质裂解物（n = 2只小鼠/组）。简称：P Kit =磷酸化试剂盒受体酪氨酸激酶;T kit = 总 Kit 受体酪氨酸激酶;P ERK = 磷酸化丝裂原活化蛋白激酶;T ERK = 总丝裂原活化蛋白激酶;P AKT = 磷酸化丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶;T AKT = 总丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。请点击此处查看此图的大图。
图7：CT成像分析. 未经治疗的 试剂盒V558Δ / + 小鼠的3D CT重建，显示骨盆中的肿瘤（箭头）。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
试剂盒V558Δ/+小鼠模型是GIST分子和免疫学分析的强大研究工具。虽然育种策略需要单次杂交，但在分析肿瘤反应的实验中使用KitV558Δ/+小鼠队列需要广泛的育种。小鼠的年龄和性别应匹配，以确保相似的肿瘤重量，并且10%的小鼠在肿瘤建立时在8周龄之前死亡。如果使用先进的成像技术（如CT或MRI）来跟踪个体小鼠内的肿瘤体积，则可能采用不太广泛的育种策略。尽管如此，KitV558Δ/+小鼠已成功杂交到其他敲除或诱导小鼠模型，揭示了重要的免疫和分子机制12。
来自 KitV558Δ/+ 小鼠的肿瘤细胞很容易通过KIT（CD117）的柱分选或通过流式细胞术18分离。从 试剂盒V558Δ / + 小鼠中分离出的肿瘤细胞可以在 体外12中生长。在早期传代时，从 KitV558Δ / + 小鼠中分离的肿瘤细胞保留KIT表达，可用于 体外 研究。然而，在几次传代后，这些细胞系失去了KIT表达，限制了它们的适用性。像大多数小鼠模型一样， KitV558Δ / + 肿瘤不会转移，这限制了肠外GIST的研究。同样，来自 KitV558Δ/+ 小鼠的肿瘤仅发生在盲肠中，从 KitV558Δ/+ 肿瘤中分离出的细胞在分离并注射到肝脏或脾脏时不会生长，这限制了来自不同疾病部位的肿瘤微环境的评估。此外， KitV558Δ / + 突变对该小鼠模型中细胞的血液学发育没有任何已知影响。
来自 KitV558Δ / + 小鼠的肿瘤中的免疫微环境主要包含巨噬细胞，其次是T细胞，其与人类GIST11非常相似。然而，在评估肿瘤重量或免疫浸润之前，必须从肿瘤中完全切除盲肠帽，因为肿瘤与盲肠中存在不同的免疫群体。根据我们的经验，即使在有帽子的人中，肿瘤重量也是相当的，酪氨酸激酶抑制剂治疗与盲肠帽的发育之间没有显着的关联。此外，我们发现与有和没有盲肠帽的肿瘤相比，肿瘤微环境没有显着差异。
许多基因工程小鼠模型已被开发用于癌症研究，特别是自CRISPR基因编辑出现以来。虽然许多免疫活性模型依赖于cre-loxP介导的癌基因激活或肿瘤抑制基因的失活，但 KitV558Δ / +肿瘤是由其内源性启动子驱动的。因此， KitV558Δ/+小鼠模型中的研究结果高度可转化为人类疾病，特别是在KIT信号19的评估中。展望未来， KitV558Δ/+小鼠应继续作为有价值的模型，因为包括检查点阻断和CAR T疗法在内的新治疗策略将继续被探索用于治疗软组织肿瘤，包括GIST。
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Disclosures
作者没有利益冲突要披露。
Acknowledgments
KitV558Δ/+ 小鼠经过基因工程改造，由彼得·贝斯梅尔博士10共享。这项工作得到了NIH拨款R01 CA102613和T32 CA251063的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| 3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
| 4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| 70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
| Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
| Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
| Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
| p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
| p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
| PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| vivaCT 80 platform | Scanco medical |
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