Summary
El objetivo de este manuscrito es describir el modelo de ratón KitV558Δ/+ y las técnicas para la disección y el procesamiento exitosos de especímenes de ratón.
Abstract
El tumor del estroma gastrointestinal (GIST) es el sarcoma humano más común y generalmente es impulsado por una sola mutación en el receptor KIT. En todos los tipos de tumores, se han desarrollado numerosos modelos de ratón para investigar la próxima generación de terapias contra el cáncer. Sin embargo, en GIST, la mayoría de los estudios in vivo utilizan modelos de ratón de xenoinjerto que tienen limitaciones inherentes. Aquí, describimos un modelo de ratón inmunocompetente y genéticamente modificado de tumor del estroma gastrointestinal que alberga una mutación KitV558Δ / + . En este modelo, el KIT mutante, el oncogén responsable de la mayoría de los GIST, es impulsado por su promotor endógeno que conduce a un GIST que imita la apariencia histológica y el infiltrado inmune visto en los GIST humanos. Además, este modelo se ha utilizado con éxito para investigar tanto terapias moleculares como inmunes dirigidas. Aquí, describimos la cría y el mantenimiento de una colonia de ratones KitV558Δ / + . Además, este documento detalla el tratamiento y la obtención de GIST, el drenaje del ganglio linfático mesentérico y el ciego adyacente en ratones KitV558Δ / + , así como la preparación de muestras para análisis moleculares e inmunológicos.
Introduction
GIST es el sarcoma más común en humanos con una incidencia de aproximadamente 6.000 casos en los Estados Unidos de América1. El GIST parece originarse en las células marcapasos gastrointestinales llamadas células intersticiales de Cajal, y generalmente es impulsado por una sola mutación en la tirosina quinasa KIT o PDGFRA2. La cirugía es el pilar del tratamiento para el GIST y puede ser curativa, pero los pacientes con enfermedad avanzada pueden ser tratados con el inhibidor de la tirosina cinasa (TKI), imatinib. Desde su introducción hace más de 20 años, imatinib ha transformado el paradigma de tratamiento en GIST, mejorando la supervivencia en enfermedad avanzada de 1 a más de 5 años 3,4,5. Desafortunadamente, imatinib rara vez es curativo debido a mutaciones KIT adquiridas, por lo que se necesitan nuevos tratamientos para este tumor.
Los modelos de ratón son una importante herramienta de investigación en la investigación de nuevas terapias en cáncer. Se han desarrollado e investigado múltiples modelos de xenoinjerto subcutáneo y xenoinjerto derivado del paciente en GIST 6,7. Sin embargo, los ratones inmunodeficientes no representan completamente el GIST humano, ya que los GIST albergan perfiles inmunes diferenciales dependiendo de su mutación oncogénica, y la alteración del microambiente tumoral gastrointestinal mejora los efectos de la terapia TKI 8,9. El ratón KitV558Δ/+ tiene una deleción heterocigota de la línea germinal en el exón Kit 11, que codifica el dominio yuxtamembrana, el sitio más comúnmente mutado en GIST10 humano. Los ratones KitV558Δ/+ desarrollan un GIST cecal único con penetrancia del 100%, y los tumores tienen histología, señalización molecular, infiltración inmune y respuesta a la terapia similares a GISThumanos 8,11,12,13. Aquí, describimos la cría, el tratamiento y el aislamiento y procesamiento de muestras en ratones KitV558Δ / + para su uso en investigación molecular e inmunológica en GIST.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los ratones fueron alojados en condiciones libres de patógenos en la Universidad de Pensilvania de acuerdo con las pautas de los NIH y con la aprobación de la Universidad de Pensilvania IACUC. La eutanasia se realizó siguiendo los procedimientos operativos estándar de Recursos Animales de Laboratorio de la Universidad de Pensilvania.
1. KitV558Δ / + cría de ratones
- Retrocruce los ratones KitV558Δ/+ más de 10 veces sobre un fondo C57BL/6J utilizando ratones C57BL/6J. Para hacer esto, críe los ratones machos KitV558Δ / + con ratones hembra C57BL / 6J en una proporción de 1: 2.
NOTA: El genotipo homocigoto Kit V558Δ/V558Δ es letal en el útero. Es posible criar ratones hembra KitV558Δ / + con ratones machos C57BL / 6J, pero el tamaño de la camada es aproximadamente la mitad que el visto en ratones hembras de tipo salvaje C57BL / 6J. Además, los ratones hembra KitV558Δ / + producen camadas limitadas después de los 4 meses de edad. - Genotipar a las crías a los 7-14 días de edad mediante el recorte de los dedos de los pies para confirmar la presencia del genotipo KitV558Δ/+ . Utilice la imprimación delantera: TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; reportero 1: CCTCGACAACCTTCCA; imprimación inversa: TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT; y reportero 2: TCTCCTCGACCTTCCA para genotipado.
2. KitV558Δ/+ tratamiento de ratón
- La edad y el sexo coinciden con los ratones KitV558Δ / + antes del tratamiento. Use los ratones emparejados por edad y sexo en cohortes, ya que los tumores de ratones hembra KitV558Δ / + son más grandes que los de ratones machos. Tratar a los ratones a las 8-12 semanas de edad, momento en el que se establecen los tumores (Figura 1).
- Administrar inhibidores de la tirosina cinasa por vía oral o por inyección intraperitoneal (i.p.); Los tumoresKit V558Δ/+ son sensibles a los inhibidores de la tirosina cinasa. Proporcionar imatinib en una dosis de 600 mg/L en agua potable o inyecciones i.p. de 45 mg/kg dos veces al día. Medir la reducción de peso del tumor utilizando básculas digitales después de la disección del tumor como se muestra en el paso 3, que es de aproximadamente el 50% a la semana 1 y el 80% a las 4 semanas después del tratamiento con imatinib (Figura 2).
3. KitV558Δ / + cosecha de órganos de ratón
- Sacrificar ratones por narcosis de CO2 a un caudal del 60% de volumen de la cámara por minuto. Deje a los ratones en la cámara durante al menos 2 minutos después de que la respiración haya cesado, luego realice una dislocación cervical para confirmar la muerte.
- Esterilice todos los instrumentos, use guantes durante todo el procedimiento y mantenga un campo estéril. Preparar la piel con etanol al 70%. Haga una incisión vertical de 2 cm en la línea media con tijeras y entre en la cavidad abdominal. Lisa bruscamente cualquier adherencia intraabdominal.
- Para extirpar el ganglio linfático mesentérico drenante, siga los pasos que se describen a continuación.
- Identifique el ciego y levante su mesenterio de manera superior. Aproximadamente a mitad de camino a la base del mesenterio colónico, identifique el ganglio linfático mesentérico y diseccionarlo bruscamente. El ganglio linfático es blanquecino y de aproximadamente 0,5 cm x 0,5 cm de tamaño.
- Divida el tejido de los ganglios linfáticos en tercios para el aislamiento de proteínas, histología y suspensión de células individuales, según sea necesario. Para suspensiones unicelulares, coloque el tejido de los ganglios linfáticos en 20 ml de medios libres de suero (RPMI) y manténgalo en hielo.
- Para el aislamiento del GIST y el ciego, siga los pasos que se describen a continuación.
- El ciego en los ratones KitV558Δ /+ es reemplazado principalmente por un GIST. Divida cuidadosamente la unión ileocólica de la base del tumor. Para recoger el ciego, divida el colon de nuevo, 2 cm proximal a la base del tumor.
- En el 50%-60% de los ratones KitV558Δ/+ , la cabeza del tumor contiene una tapa de tejido cecal, que generalmente contiene líquido seroso, pero rara vez puede contener pus (Figura 3). Diseccionar bruscamente el tejido de la tapa lejos del tejido tumoral.
- Divida el tejido tumoral y / o el ciego en tercios para el aislamiento de proteínas, histología y suspensión de una sola célula, según sea necesario. Para suspensiones unicelulares, coloque el tejido tumoral o el ciego en HBSS con 2% de FCS, suficiente para cubrir la muestra y mantenerla en hielo.
4. Análisis de Western blot del tejido GIST
- Preparar tampón de lisis tisular que contenga 50 mM TrisHCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% detergente no desnaturalizante, 2 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 10 mM NaF y 20 μl/ml de mezcla inhibidora de la proteinasa.
- Prepare una solución salina tamponada 1x Tris con Tween 20 al 1% (TBST) combinando 1800 ml de agua desionizada, 2 ml de Tween 20 y 200 ml de solución salina tamponada tris (TBS) 10 veces.
- Resuspenda el tejido del paso 3.4.3 en un tubo FACS en 5 ml/g de tampón de lisis tisular y homogeneizar dos veces con un homogeneizador mecánico a 15.000 rpm durante 15 s sobre hielo. Incubar lisado durante 30 min sobre hielo.
- Transfiera el lisado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrífuga a velocidad máxima durante 20 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga.
- Ejecute lisados en un gel de gradiente de 4% a 15%, luego transfiera a una membrana de nitrocelulosa, como se describe en14.
- Lave la membrana una vez en 1x TBS durante 5 min y luego bloquee la membrana en leche al 5% durante 1 h. Nuevamente, lave la membrana una vez en 1x TBS durante 10 min.
- Incubar membrana en anticuerpo primario diluido 1:1000 en BSA al 5% a 4 °C durante la noche. Lave la membrana 3x en 1x TBST durante 10 min cada una. Incubar blot con anticuerpo secundario diluido 1:2500 en leche al 2,5% durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lave la membrana una vez en 1x TBS durante 5 min. Agregue suficiente sustrato HRP para cubrir la membrana, generalmente 200-500 μL, y use un generador de imágenes digital para detectar y cuantificar la quimioluminiscencia.
5. Inmunohistoquímica del tejido GIST
- Fije el tejido del paso 3.3.2 o 3.4.3 en paraformaldehído al 4% a 4 °C durante la noche. Almacene el tejido en 70% de EtOH hasta que esté listo para el procesamiento. Incrustar y sección bloques de 5 μm de espesor en portaobjetos de vidrio, como se describe15,16.
- Detección inmunohistoquímica completa mediante un kit básico de inmunodetección, como se describió anteriormente17.
6. Suspensión unicelular del ganglio linfático mesentérico
- Vierta el medio RPMI con una muestra de ganglios linfáticos del paso 3.3.2 sobre un filtro de 100 μm. Mueva el filtro a un nuevo ganglio linfático cónico de 50 ml y puré con el extremo blando de una jeringa de plástico de 3 ml. Filtro de lavado con 20 mL de soporte RPMI.
- Centrifugar el filtrado a 450 x g a 4 °C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
- Resuspend pellet en 20 mL de 1% FBS en PBS (bead buffer) y vierte sobre un filtro de 40 μm. Recoger el filtrado celular. Cuente las células con un hemocitómetro.
- Centrifugar el filtrado a 450 x g a 4 °C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante. Resuspend en tampón de perlas a 6 x 107 células/ml para citometría de flujo.
7. Suspensión unicelular de GIST
- Prepare el tampón de colagenasa agregando 250 mg de colagenasa IV, una tableta de inhibidor de la proteasa libre de EDTA y 100 μL de DNasa I a 50 ml de HBSS. Girar durante 10 min a temperatura ambiente hasta que se disuelva.
- Coloque GIST en un plato estéril y agregue 2.5 ml de tampón de colagenasa. Picar el tumor usando un bisturí estéril y tijeras hasta que el tumor esté en fragmentos finos. Use una pipeta de orificio grande para aspirar el tumor y la colagenasa en un tubo de 50 ml.
- Incubar en una incubadora de agitación a 100 rpm a 37 °C durante 30 min. Reacción de enfriamiento con 2 mL de FBS.
- Vierta la colagenasa con una muestra de GIST sobre un filtro de 100 μm y triture el tumor con el extremo blando de una jeringa de plástico de 3 ml y recójala en un tubo de 50 ml. Filtro de lavado con 20 mL de HBSS. Centrifugar el filtrado a 450 x g, 4 °C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el pellet en 20 ml de tampón de perlas y vierta sobre un filtro de 40 μm. Recoge el filtrado y cuenta las células usando un hemocitómetro. Centrifugar el filtrado a 450 x g, 4 °C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante. Resuspend en tampón de perlas a 6 x 107 células/ml para citometría de flujo.
8. Suspensión unicelular de ciego
- Prepare el tampón de colagenasa como en el paso 7.1. Usando tijeras, divida el ciego longitudinalmente para exponer la mucosa interna. Cortar en secciones de 0,5 cm y colocar en un tubo de 50 ml con 5 ml de HBSS con 2% de FBS. Agitar vigorosamente durante 30 s, centrifugar a 450 x g durante 20 s, luego aspirar el sobrenadante.
- Añadir 5 mL de HBSS con 2 mM de EDTA. Incubar en una incubadora de agitación a 37 °C a 100 rpm durante 15 min. Centrífuga a 450 x g durante 20 s. Aspirar el sobrenadante.
- Agregue 5 ml de HBSS. Agitar vigorosamente durante 30 s, centrifugar a 450 x g durante 20 s, luego aspirar el sobrenadante. Repite una vez más.
- Añadir 5 ml de tampón de colagenasa. Incubar en una incubadora de agitación a 37 °C durante 30 min a 100 rpm. Agitar vigorosamente cada 10 min. Reacción de enfriamiento con 2 mL de FBS.
- Vierta la colagenasa con una muestra de ciego sobre un filtro de 100 μm y triture con el extremo blando de una jeringa de plástico de 3 ml. Filtro de lavado con 20 mL de HBSS. Recoger filtrado.
- Centrifugar el filtrado a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante. Resuspenda la bolita en 20 ml de tampón de perlas y vierta sobre un filtro de 40 μm. Recolecte el filtrado y cuente las células usando un hemocitómetro.
- Centrifugar el filtrado a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante. Resuspend en tampón de perlas a 6 x 107 células/ml para citometría de flujo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El modelo de ratón KitV558Δ/+ permite la investigación terapéutica en un modelo de ratón inmunocompetente. Los ratones KitV558Δ/+ tienen una vida útil promedio de 8 meses debido a la obstrucción intestinal progresiva (Figura 4). Los tumores de ratones KitV558Δ/+ expresan marcadores canónicos de GIST incluyendo la tirosina quinasa KIT y el canal transmembrana DOG1 (Figura 5),así como el factor de transcripción ETV1 (no mostrado). Los tumores se pueden estudiar para detectar cambios en la vía de señalización kit, como los marcadores aguas abajo ERK y AKT (Figura 6), o el microambiente inmune que imita de cerca el GIST humano 8,11,12,13. La resonancia magnética8 o la tomografía computarizada (Figura 7) también se pueden usar para rastrear el volumen del tumor como una medición precisa de la respuesta del tumor. Un ratón KitV558Δ/+ no tratado recibió 200 μL de gastrograffina por vía oral 1 h antes de la toma de imágenes. Las imágenes por TC se completaron en una plataforma vivaCT 80. La reconstrucción 3D se realizó con el software Fiji, que también puede medir el volumen del tumor.
Figura 1: Comparación de los pesos tumorales en ratones Macho y hembra KitV558Δ/+ . Se aislaron y pesaron tumores de ratones machos y hembras KitV558Δ/+ no tratados de 9 semanas de edad (n = 15 ratones/grupo). Los datos representan la media ± el error estándar de media (SEM); los valores de p se calcularon utilizando una prueba t de Student; * = P < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Efecto de imatinib en tumores de ratones KitV558Δ/+. Los ratones Kit V558Δ/+ fueron tratados con vehículo o 600 mg/L de imatinib en agua potable durante 1 o 4 semanas. Los tumores fueron aislados y pesados (n = 4-5 ratones/grupo). Los datos representan la media ± SEM; los valores de p se calcularon mediante una comparación unidireccional de ANOVA con una prueba posterior a Bonferroni para la comparación de grupos individuales; * = P < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: KitV558Δ/+ tumor con tapa. Foto representativa de un tumor de un ratón KitV558Δ/+ con una tapa cecal que contiene líquido seroso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Vida útil de los ratones KitV558Δ/+ . La supervivencia de los ratones KitV558Δ/+ no tratados se rastreó durante > 400 días (n = 43 ratones). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis inmunohistoquímico. Histología representativa de un tumor KitV558Δ/+ donde la barra de escamas es de 40 μm. Abreviaturas: H&E = tinción de hematoxilina y eosina; Kit = una marca canónica de GIST y receptor tirosina quinasa; Dog1 = un marcador canónico de GIST con papel en el transporte de aniones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Análisis de señalización molecular. Los ratones Kit V558Δ/+ fueron tratados con vehículo o 600 mg/L de imatinib en agua potable durante 1 semana. Los ratones recibieron una sola inyección i.p. de vehículo o 45 mg/kg de imatinib 6 h antes del análisis. Los lisados de proteínas de los tumores KitV558Δ/+ fueron examinados por western blot (n = 2 ratones/grupo). Abreviaturas: P Kit = tirosina quinasa del receptor kit fosforilado; T kit = tirosina quinasa total del receptor kit; P ERK = proteína quinasa activada por mitógeno fosforilado; T ERK = proteína quinasa activada por mitógenos totales; P AKT = proteína quinasa fosforilada de serina-treonina; T AKT = proteína quinasa serina-treonina total. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Análisis por imágenes por TC. Reconstrucción por TC 3D de un ratón KitV558Δ/+ no tratado que demuestra un tumor (flecha) en la pelvis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El modelo de ratón KitV558Δ/+ es una poderosa herramienta de investigación en el análisis molecular e inmunológico de GIST. Aunque la estrategia de mejoramiento requiere un solo cruce, el uso de cohortes de ratones KitV558Δ / + en experimentos que analizan la respuesta tumoral requiere una reproducción extensa. Los ratones deben ser emparejados por edad y sexo para garantizar pesos tumorales similares, y el 10% de los ratones mueren antes de las 8 semanas de edad cuando se establecen los tumores. Las estrategias de reproducción menos extensas son posibles si se utilizan técnicas de imagen avanzadas como la tomografía computarizada o la resonancia magnética para rastrear el volumen tumoral dentro de ratones individuales. No obstante, los ratones KitV558Δ/+ se han cruzado con éxito a otros modelos de ratón knock-out o inducibles, revelando importantes mecanismos inmunes y moleculares12.
Las células tumorales de ratones KitV558Δ/+ se aíslan fácilmente mediante clasificación en columna para KIT (CD117) o citometría de flujo18. Las células tumorales aisladas de ratones KitV558Δ/+ se pueden cultivar in vitro12. En los primeros pasajes, las células tumorales aisladas de ratones KitV558Δ/+ retienen la expresión de KIT y se pueden utilizar para estudios in vitro . Sin embargo, después de varios pasajes, estas líneas celulares pierden expresión KIT, lo que limita su aplicabilidad. Como la mayoría de los modelos de ratón, los tumores KitV558Δ/+ no hacen metástasis, lo que limita el estudio del GIST extraintestinal. Del mismo modo, los tumores de ratones KitV558Δ / + solo ocurren en el ciego, y las células aisladas de los tumores KitV558Δ / + no crecen cuando se aíslan e inyectan en el hígado o el bazo, lo que limita la evaluación del microambiente tumoral de diferentes sitios de la enfermedad. Además, la mutación KitV558Δ/+ no tiene ningún impacto conocido en el desarrollo hematológico de las células en este modelo de ratón.
El microambiente inmune en tumores de ratones KitV558Δ / + contiene principalmente macrófagos seguidos de células T, que imitan de cerca el GISThumano 11. Sin embargo, es imperativo que la tapa cecal se extirpe completamente del tumor antes de evaluar el peso del tumor o el infiltrado inmune, ya que existen distintas poblaciones inmunes en el tumor frente al ciego. En nuestra experiencia, los pesos tumorales son comparables incluso entre aquellos con tapas, y no existe una asociación significativa entre la terapia con inhibidores de la tirosina cinasa y el desarrollo de una tapa cecal. Además, no hemos encontrado diferencias significativas en el microambiente tumoral comparando tumores con y sin casquetes cecales.
Se han desarrollado muchos modelos de ratón genéticamente modificados para su uso en la investigación del cáncer, especialmente desde el advenimiento de la edición de genes CRISPR. Mientras que numerosos modelos inmunocompetentes se basan en la activación mediada por cre-loxP de oncogenes o la inactivación de genes supresores de tumores, los tumores KitV558Δ/+ son impulsados por su promotor endógeno. En consecuencia, los hallazgos en el modelo de ratón KitV558Δ/+ son altamente traducibles a la enfermedad humana, particularmente en la evaluación de la señalización KIT19. De cara al futuro, el ratón KitV558Δ/+ debería seguir sirviendo como un modelo valioso a medida que se sigan explorando nuevas estrategias de tratamiento, incluido el bloqueo de puntos de control y la terapia CAR T, para el tratamiento de tumores de tejidos blandos, incluido el GIST.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Los ratones KitV558Δ/+ fueron modificados genéticamente y compartidos por el Dr. Peter Besmer10. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01 CA102613 y T32 CA251063.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| 3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
| 4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| 70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
| Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
| Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
| Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
| p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
| p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
| PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| vivaCT 80 platform | Scanco medical |
References
- Mastrangelo, G., et al. Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions. Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).
- Joensuu, H., DeMatteo, R. P. The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy. Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).
- Blanke, C. D., et al. Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT. Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).
- Demetri, G. D., et al. Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).
- Gold, J. S. Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors. Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).
- Huynh, H., et al. Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).
- Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
- Balachandran, V. P., et al. Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido. Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).
- Vitiello, G. A., et al. Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor. Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).
- Sommer, G., et al. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).
- Cavnar, M. J., et al. KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization. Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).
- Medina, B. D., et al. Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity. Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).
- Zhang, J. Q., et al. Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors. Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).
- General Protocol for Western Blotting. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf (2022).
- Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking: Methods and Protocols. , Springer. New York. 253-268 (2019).
- Sy, J., Ang, L. -C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Biobanking: Methods and Protocols. , Springer. New York. 269-278 (2019).
- Seifert, A. M., et al. PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors. Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).
- Liu, M., et al. Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST. Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).
- Rossi, F., et al. Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).
