Summary
Formålet med denne protokol er at give detaljeret vejledning om korrekt prøveforberedelse til lipid- og metabolitanalyse i små væv, såsom Drosophila-hjernen , ved hjælp af matrixassisteret laserdesorption / ionisering (MALDI) massespektrometribilleddannelse.
Abstract
Lipidprofilering eller lipidomics er en veletableret teknik, der bruges til at studere hele lipidindholdet i en celle eller et væv. Oplysninger erhvervet fra lipidomics er værdifulde i studiet af de veje, der er involveret i udvikling, sygdom og cellulær metabolisme. Mange værktøjer og instrumenter har hjulpet lipidomics projekter, især forskellige kombinationer af massespektrometri og væskekromatografi teknikker. Matrixassisteret laserdesorption / ioniseringsmassespektrometribilleddannelse (MALDI MSI) er for nylig opstået som en kraftfuld billeddannelsesteknik, der supplerer konventionelle tilgange. Denne nye teknik giver unik information om den rumlige fordeling af lipider i vævsrum, som tidligere var uopnåelig uden brug af overdrevne modifikationer. Prøveforberedelsen af MALDI MSI-tilgangen er kritisk og er derfor fokus for dette papir. Dette papir præsenterer en hurtig lipidanalyse af et stort antal Drosophila-hjerner indlejret i optimal skæretemperaturforbindelse (OCT) for at give en detaljeret protokol til fremstilling af små væv til lipidanalyse eller metabolit og analyse af små molekyler gennem MALDI MSI.
Introduction
Lipider er involveret i en bred vifte af biologiske processer og kan bredt klassificeres i fem kategorier baseret på deres strukturelle mangfoldighed: fedtsyrer, triacylglyceroler (TAGs), fosfolipider, sterollipider og sphingolipider1. Lipidernes grundlæggende funktioner er at tilvejebringe energikilder til biologiske processer (dvs. TAGs) og danne cellulære membraner (dvs. fosfolipider og kolesterol). Imidlertid er yderligere roller af lipider blevet noteret i udvikling og sygdomme og er blevet grundigt undersøgt på det biomedicinske område. For eksempel har rapporter vist, at fedtsyrer af forskellig længde kan have unikke terapeutiske roller. Korte fedtsyrekæder kan være involveret i forsvarsmekanismer mod autoimmune sygdomme, mellemlange fedtsyrekæder producerer metabolitter, der kan afbøde anfald, og lange fedtsyrekæder genererer metabolitter, der kan bruges til behandling af metaboliske lidelser2. I nervesystemet har glia-afledt kolesterol og fosfolipider vist sig at være afgørende for synaptogenese 3,4. Andre typer af lipider har vist løfte i medicinske applikationer, herunder sphingolipider anvendes i lægemiddelafgivelsessystemer og saccharolipider, der anvendes til at understøtte immunsystemet 5,6. De mange roller og potentielle terapeutiske anvendelser af lipider på det biomedicinske område har gjort lipidomics - undersøgelsen af veje og interaktioner mellem cellulære lipider - et kritisk og stadig vigtigere felt.
Lipidomics gør brug af analytisk kemi til at studere lipidomet i stor skala. De vigtigste eksperimentelle metoder, der anvendes i lipidomics, er baseret på massespektrometri (MS) kombineret med forskellige kromatografi- og ionmobilitetsteknikker 7,8. Brugen af MS i området er fordelagtig på grund af dets høje specificitet og følsomhed, erhvervelseshastighed og unikke evner til (1) at detektere lipider og lipidmetabolitter, der forekommer selv ved lave og forbigående niveauer, (2) detektere hundredvis af forskellige lipidforbindelser i et enkelt eksperiment, (3) identificere tidligere ukendte lipider og (4) skelne mellem lipidisomerer. Blandt udviklingen inden for MS, herunder desorptionselektrosprayionisering (DESI), MALDI og sekundær ionmassespektrometri (SIMS), har MALDI MSI vist sig som en kraftfuld billeddannelsesteknik, der supplerer konventionelle MS-baserede tilgange ved at give unik information om den rumlige fordeling af lipider i vævsrum 9,10.
Den typiske arbejdsgang for lipidomics består af prøveforberedelse, dataindsamling ved hjælp af massespektrometriteknologi og dataanalyse11. Undersøgelsen af lipider og metabolitter i prøver har ført til fremkomsten af teknikker til at forstå de fysiologiske og patologiske tilstande af metaboliske processer i organismer. Mens forståelse af biologiske interaktioner er vigtig, gør følsomheden af lipider og metabolitter dem vanskelige at afbilde og identificere uden farvestoffer eller anden modifikation. Ændringer i metabolitniveauer eller fordeling kan føre til fænotypiske ændringer. Et værktøj, der bruges til metabolomisk profilering, er MALDI MSI, en etiketfri, in situ-billeddannelsesteknik , der er i stand til at detektere hundredvis af molekyler samtidigt. MALDI-billeddannelse giver mulighed for visualisering af metabolitter og lipider i prøver, samtidig med at deres integritet og rumlige fordeling bevares. Tidligere teknologi til lipidprofilering involverede brugen af radioaktive kemikalier til individuelt at kortlægge lipider, mens MALDI-billeddannelse giver afkald på dette og giver mulighed for påvisning af en række lipider samtidigt.
Lipidmetabolisme og homeostase spiller vigtige funktioner i cellefysiologi, såsom vedligeholdelse og udvikling af nervesystemet. Et væsentligt aspekt af nervesystemets lipidmetabolisme er lipidkredsløbet mellem neuroner og gliaceller, som medieres af molekylære bærerlipoproteiner, herunder lipoproteiner med meget lav densitet (VLDL), lipoproteiner med lav densitet (LDL) og lipoproteiner med høj densitet (HDL)12. Lipoproteiner indeholder apolipoproteiner (Apo), såsom ApoB og ApoD, der fungerer som strukturelle blokke af lipidlast og som ligander til lipoproteinreceptorer. Neuron-glia crosstalk af lipider involverer flere spillere såsom glia-afledt ApoD, ApoE og ApoJ og deres neuronale LDL-receptorer (LDLR'er)13,14. I Drosophila er apolipophorin, et medlem af ApoB-familien, en stor hæmolymph lipidbærer15. Apolipophorin har to nært beslægtede lipophorinreceptorer (LpR'er), LpR1 og LpR2, som er homologer af pattedyr LDLR 15,16. I tidligere undersøgelser blev den astrocytudskilte lipocalin Glial Lazarillo (GLaz), en Drosophila-homolog af human ApoD, og dens neuronale receptor LpR1 opdaget til kooperativt at formidle neuron-glia lipid shuttling og dermed regulere dendritmorfogenese17. Derfor blev det spekuleret i, at tabet af LpR1 ville medføre et fald i det samlede lipidindhold i Drosophila-hjernen. MALDI MSI ville være et passende værktøj til profilering af lipidindholdet i små væv af LpR1-/- mutante og vildtype Drosophila-hjerner, som demonstreret i denne undersøgelse.
På trods af MALDI MSI's voksende popularitet hæmmer instrumentets høje omkostninger og eksperimentelle kompleksitet ofte dets implementering i individuelle laboratorier. Således udføres de fleste MALDI MSI-undersøgelser ved hjælp af delte kernefaciliteter. Som med andre anvendelser af MALDI MSI er en omhyggelig prøveforberedelsesproces for lipidomics afgørende for at opnå pålidelige resultater. Men fordi prøvediasforberedelse typisk udføres i individuelle forskningslaboratorier, er der mulighed for variation i MALDI MSI-erhvervelse. For at bekæmpe dette har dette papir til formål at give en detaljeret protokol til prøveforberedelse af små biologiske prøver forud for MALDI MSI-måling ved hjælp af lipidanalyse af en stor gruppe voksne Drosophila-hjerner i positiv iontilstand som et eksempel11,17. Imidlertid påvises nogle fosfolipidklasser og størstedelen af små metabolitter positivt ved MALDI-billeddannelse i negativ iontilstand, som tidligere er beskrevet11. Derfor håber vi med disse to eksempelstudier at give detaljerede prøveforberedelsesprotokoller for forskellige kombinationer: fritstående stort væv versus indlejret lille væv, optøningsmontering versus varmglasmontering og positiv iontilstand versus negativ iontilstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Indlejring af fluehoved
BEMÆRK: Hele proceduren tager ~ 45-60 min.
- Forbered det optimale skæretemperaturforbindelsestrin (OCT-forbindelse) med en plan overflade.
- Oct tilsættes i en plastkryomold (15 mm x 15 mm x 5 mm) til halvdelen af kryompildybden, og undgå bobledannelse. Lad formen stå på en plan overflade i flere minutter, og overfør den derefter til tøris.
- Hold kryoflen flad på tørisen, og lad OCT danne en flad og jævn overflade. Vent, indtil OCT er fuldt størknet i formen. Brug straks de frosne OCT-trin, eller opbevar dem ved -80 °C.
- Bedøv voksne fluer ved hjælp af CO2 (dvs. en CO2-pude ).
- Forbered en petriskål indeholdende et stykke laboratorieserug. Brug vand til at fugte en del af kluden for at reducere den statiske elektricitet. Hold kluden halvt våd og halvt tør.
- Under dissekering af scope 1 skal du bruge tang til at skære fluehovedet. Saml 4-5 hoveder hver gang og læg dem på det tørre område af laboratorieserviet.
BEMÆRK: Samlingen af 4-5 hoveder tager ~ 2 minutter.
- OLT-stadiet overføres fra tøris til dissektionsomfanget.
- Tag OCT-scenen fra tøris til mikroskop 2, overfør straks hovederne til OCT-scenen, og arranger dem hurtigt, hvilket tager ~ 30 s for at undgå OCT-smeltning. Efterlad ~ 1 mm tom plads omkring hver fluehjerne for at sikre tilstrækkelig støtte fra OCT og 4-5 mm tom plads fra kanten af blokken for at give tilstrækkelig plads til at håndtere sektionen. Hvis proboscis er for lang, skal du fjerne spidsen; hvis det ikke er for længe, skal du holde det intakt. Sæt OCT-scenen tilbage på tørisen, og lad den forblive tændt i ~ 3 minutter for at sikre, at OCT-scenen forbliver frossen og fast.
- Når OCT-scenen er tilbage på tørisen og venter på størkning, skal du samle endnu en runde hoveder. Trin 1.2 og 1.3 gentages for at overføre yderligere prøver til den resterende plads på scenen.
BEMÆRK: Otte hoveder fremstilles normalt for hver genotype, og fire genotyper anvendes i et OCT-trin i dette laboratorium. - Brug to dissektionsmikroskoper side om side for at undgå at ændre fokus og øge den tid, det tager at overføre og arrangere hovederne på OCT-scenen og for at mindske risikoen for, at OCT-stadiet smelter.
- Når alle fluehovederne er justeret, så lad OCT-scenen sidde på tørisen i yderligere 5-10 min.
- Tag OCT-scenen væk fra tørisen, læg den på en flad overflade (bænk), og tilsæt derefter hurtigt en stor mængde OCT-forbindelse for at dække alle prøverne og fyld hele kryomolen, hvilket tager ~ 3 s.
- Cryomolden overføres straks til tøris og fryser hele OCT-blokken indeholdende det indlejrede væv. Lad OCT-scenen sidde på tørisen i yderligere 5-10 min. Mærk prøverne på kanten af kryomolen.
- De frosne prøver opbevares ved −80 °C, indtil de er klar til sektionering.
2. Kryosectioning af vævet
BEMÆRK: Når du håndterer indiumtinoxidoxid (ITO) glider, skal du altid bære handsker for at undgå vævskontaminering. Det anbefales også at bære en maske for at undgå at trække vejret direkte på diaset.
- Bekræft den ITO-belagte side ved at teste ledningsevnen af ITO-gliderne ved hjælp af et voltmeter indstillet til modstand. Marker siden med en modstandsmåling som den side, der skal klæbe vævet til. Mærk det, og indstil altid en laboratorierieti på bunden af diaset for at undgå snavskontaminering.
- Lad vævene balancere i kryostatkammeret i 30-45 min.
- For at undgå smeltning af OCT skal du placere alle de nødvendige værktøjer såsom tang og en tyndspidset kunstnerbørste i kryostatkammeret på forhånd for at forkøle dem.
- Rengør kryostaten, helst med 70% ethanol. Tør rullepladen og scenen og fjern brugte knive. Brug yderligere rene klude for at sikre, at ethanolen er fordampet, og at alle overflader er tørre, før sektioneringen begynder.
- Temperaturen i kryostatkammeret og prøvehovedet justeres i henhold til vævstype (f.eks. −14 °C for lever, −20 °C for muskler og −25 °C for hud10; −18 °C for fluehoveder i denne protokol).
- Monter vævet på prøveholderen ved hjælp af OCT. Pas på at bruge nok OCT til at dække bunden af OCT-blokken og monter blokken så flad som muligt.
- Placer et rent blad i scenen og lås det. Placer prøvens hoved mod scenen efter behov for at opnå den ønskede skærevinkel.
- Prøveblokken placeres i en retning, hvor alle genotyper/behandlingsgrupper er placeret lodret til bladet.
BEMÆRK: Dette sikrer et ensartet skæreplan og undgår krydskontaminering fra forskellige grupper. Hvis du skærer en anden vævsblok, skal du skifte til et nyt blad mellem prøverne for at forhindre krydskontaminering.
- Prøveblokken placeres i en retning, hvor alle genotyper/behandlingsgrupper er placeret lodret til bladet.
- Begynd at skære i tykke sektioner (50-100 μm), indtil interesseområdet (f.eks. Det ønskede område af hjernen) er fundet.
- Børst konstant ekstra stykker af med en forkølet kunstnerbørste for at holde scenen ren.
- Skift tykkelsen af sektionerne til 10-12 μm, når det ønskede område er nået.
- Juster kammertemperaturen lidt efter behov. Indstil for eksempel en højere temperatur, hvis sektionen har tendens til at flage eller falde let fra hinanden.
BEMÆRK: Den anbefalede temperatur for OCT-blokke er -18 °C.
- Juster kammertemperaturen lidt efter behov. Indstil for eksempel en højere temperatur, hvis sektionen har tendens til at flage eller falde let fra hinanden.
- Saml forsigtigt det ønskede afsnit og hold det til ITO-diaset. Udfør denne operation i kryostatkammeret.
- Tag et ITO-dias ved stuetemperatur, og placer det over sektionen, gå forsigtigt og hurtigt hen til sektionen, så sektionen klæber til diaset uden at efterlade spor på kryostattrinnet.
BEMÆRK: OCT smelter og klamrer sig til diaset.
- Tag et ITO-dias ved stuetemperatur, og placer det over sektionen, gå forsigtigt og hurtigt hen til sektionen, så sektionen klæber til diaset uden at efterlade spor på kryostattrinnet.
- Læg diaset til side i et stativ eller en laboratorieserstat uden for kryostaten mellem samlingerne af flere sektioner.
- Hvis sammenligning på tværs af forskellige prøver af den samme kohorte er ønsket, skal du placere sektionerne fra flere prøver på et enkelt dias for samtidig analyse og minimal variation. Adskil om nødvendigt til to dias, da MALDI-målholderen kan rumme to dias i en enkelt kørsel.
- Transporter diasene i en vakuumboks til en ekssikkator med tørremiddel som bundlag. Tør gliderne under et vakuum i 30-60 min.
BEMÆRK: Alternativt, hvis laboratoriet ikke er udstyret med en vakuumdisikator, skal diasene opbevares ved -20 ° C under hele processen indtil opbevaring ved -80 ° C inden for 24 timer eller forsendelse på tøris for at undgå forringelse af lipider eller metabolitter. - Fortsæt til matrixaflejring. Der anvendes 2,5-dihydroxybenzoesyre (DHB) i methanol/vand (70/30, v/v) som matrix.
- Hvis dias ikke køres med det samme, skal du enten opbevare diasene ved -80 °C (op til 1 måned for flyvehjerneafsnit og 6 måneder for gnaverhjerneafsnit) eller straks sende prøven til MALDI-kernefaciliteter med tilstrækkelig tøris. For optimal opbevaring og forsendelse skal du placere diasene i en glidetransportør og forsegle åbningen sikkert med voksfilm. Forsegl med en lynlåspose, læg den i en anden lynlåspose, der indeholder tørremiddel, og mærk ydersiden.
BEMÆRK: Se tidligere arbejde for de følgende trin i diasscanning, matrixaflejring og MALDI-billeddannelsesprocedurer11. - Matrixaflejring udføres ved hjælp af den automatiske HTX M5-matrixsprøjte og en 40 mg/ml opløsning af DHB i methanol/vand (70/30, v/v). Sprøjt matrixen med en tilpasset strømningshastighed på 0,12 ml /min og en dysetemperatur på 85 ° C i 10 passager. Brug etN2-gastryk på 10 psi.
BEMÆRK: Hvis N2-gastrykket i sprøjten sænkes til under 5 psi, slukker en sikkerhedsmekanisme i sprøjten straks for at undgå beskadigelse af sprøjten med en sprøjtehastighed på 1.300 mm/min, 2 mm sporafstand, 3 l/min strømningshastighed og 40 mm dysehøjde. - Brug et MALDI time of flight (TOF) MS-instrument (se materialetabellen) i positiv iontilstand til at opnå et massespektrum inden for masseområderne fra m/z 50-1.000.
- For at kalibrere instrumentet skal du placere 0,5 μL rød fosforemulsion i acetonitril på ITO-diasene og bruge dets spektre til at kalibrere instrumentet i masseområdet 50-1.000 m/z ved at anvende en kvadratisk kalibreringskurve2.
- Indstil laserspotdiametrene til Medium, da det er den modulerede stråleprofil for 40 μm rasterbredde, og indsaml billeddata ved at opsummere 500 billeder med en lasergentagelseshastighed på 1.000 Hz pr. Array-position.
- Brug software (se materialetabellen) til at registrere og behandle spektraldataene. Udfør billeddataanalyse ved hjælp af RMS-normalisering (root mean square) for at generere ionbilleder ved en binbredde på ±0.10 Da. Juster spektrene for både OCT og hjernevæv fra det samme eksperiment ved hjælp af softwaren til at evaluere de overlappende toppe og ionundertrykkelsesinterferensen af OCT (supplerende figur S1). Efter forsøget behandles MALDI-diasene indeholdende vævsprøverne ved hæmatoxylin og eosinfarvning (H&E), som tidligere beskrevet11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabet af den neuronale receptor LpR1 af den astrocyt-udskillede lipocalin Glial Lazarillo (GLaz), en Drosophila homolog af human ApoD, blev antaget at kunne forårsage et fald i det samlede lipidindhold i Drosophila hjernen. For at teste dette blev MALDI MSI brugt til at profilere lipiderne i LpR1-/- mutante og vildtype Drosophila-hjerner , som uddybes nedenfor.
Eksperimentet blev udført i henhold til arbejdsgangen vist i figur 1. Voksne fluehjerner blev høstet som beskrevet ovenfor. De blev indlejret i OCT, og tøris blev brugt til at fryse OCT-blokken. OCT-vævsblokken blev kryosektioneret ved 12 μm tykkelse og ved -18 °C for både prøvehovedet og kammeret. ITO-dias med kryosektion monteret på dem blev udtørret i et vakuum i 30 minutter ved stuetemperatur. Dernæst blev matrixaflejring udført ved anvendelse af den automatiske HTX M5 matrixsprøjte og en 40 mg /ml opløsning af DHB i methanol / vand (70/30, v / v).
MALDI time of flight (TOF) MS Autoflex instrument i positiv ion-tilstand erhvervede et massespektrum inden for masseområderne fra 50-1.000 m / z. Spektret af både OCT og hjernevæv fra det samme eksperiment blev justeret i SCiLS for at evaluere de overlappende toppe og ionundertrykkelsesinterferensen fra OCT (supplerende figur S1).
Resultaterne i figur 2 viser outputbilleder fra MALDI MSI-dataanalysesoftware af udvalgte m/z-spektre, hvor de valgte værdier viste en signifikant forskel i lipidfordeling mellem LpR1 knockout og vildtype Drosophila. Scanningerne afslørede en generel reduktion i lipidindholdet i LpR1-/- mutanten. Hvert spektrum blev analyseret manuelt, og analytidentifikation blev opnået ved krydshenvisning af METLIN-databaser og tidligere offentliggjorte undersøgelser 3,4. Triacylglycerol (TAG) og phosphatidylglycerol (PG) blev stærkt udtrykt i kontrolhjerner sammenlignet med LpR1-/- mutanten (viser op til en 10 gange ændring i TAG). Derudover blev diglycerol (DAG), phosphatidylcholin (PC) og phosphatidyl-ethanolamin (PE) også minimalt udtrykt i LpR1−/− mutantgenotypen.
Figur 1: Arbejdsgang for MALDI-TOF massespektrometri billeddannelse. (A) Drosophila hjerner er justeret i OCT placeret oven på tøris. (B-D) Vævsblokken kryosektioneres i 12 μm tykke sektioner ved -15 °C. Sektionen er fladtrykt ved hjælp af en forkølet børste og optøsmeltet på den ITO-belagte side af et glasglas, der holdes ved stuetemperatur. (E) Diaset er markeret med fiduciale markører, belagt med matrix og anbragt i MALDI-instrumentet. (F) MALDI-billedet af en Drosophila-hjerne opnås ved 40 μm opløsning ved anvendelse af DHB som matrix. Områderne øjne (rød, m/z 370.2), hovedvæv (grøn, m/z 184.1) og hjerne (blå, m/z 788.6) er vist i det overlejrede flerkanalsbillede. (G) H&E-farvning udføres på samme vævssektion efter MALDI MSI. (H) Arbejdsgangen for prøveforberedelse, opbevaring og transport. Skalastænger = 500 μm (F,G). Forkortelser: MALDI-TOF = matrixassisteret laserdesorption/ioniseringstid for flyvning; OCT = optimal skæretemperaturforbindelse; ITO = indiumtinoxid; DHB = 2,5,-dihydroxybenzoesyre; H&E = hæmatoxylin og eosin; MSI = massespektrometri billeddannelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative billeder fra MALDI MS-analyse, der afslører et generelt fald i lipidindholdet i LpR1-/- mutanthjernen. Repræsentative H&E-farvede voksne flyvehjerneafsnit vises (til venstre). Lipidarterne, deres respektive m/z-værdier og skalaerne på varmekortet er som angivet. Nederst vises den gennemsnitlige reduktionsfold i LpR1-/- mutanten sammenlignet med kontrollerne fra mindst fire biologiske replikater som tal ved siden af pilene. Skala bar = 1 mm. Dette tal er blevet ændret fra Yin et al.17. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur S1: Massespektre af OCT og Drosophila hjernevæv. Kryosektionerne af Drosophila hjerne OCT-blok fra figur 1 blev dækket jævnt med DHB-matrix før MALDI-billeddannelse. Massespektret for den udvalgte blanke OCT-region og hjernevævsregion fra både kontrol- og mutantfluer blev vist i intervallet m/z 1-1.000 og m/z 520-900 (lipidberiget). OLT's interferens er forbundet med både ionundertrykkelsesfænomener og overlappende signalproblemer. Forkortelser: OCT = optimal skæretemperaturforbindelse; DHB = 2,5-dihydroxybenzoesyre; MALDI = matrixassisteret laserdesorption/ionisering. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som demonstreret i undersøgelsen af variationerne i lipidsammensætning i mutante og vildtype Drosophila-hjerner kan MALDI MSI være en værdifuld etiketfri billeddannelsesteknik til in situ-analyse af molekylære distributionsmønstre i organer af små insekter. Faktisk, fordi lipider er fordelt i både hjernevæv og fedtlegemer af Drosophila-hoveder, kan konventionelle lipidomics-tilgange baseret på væskekromatografi og massespektrometri (LC-MS) kun detektere kombinerede signaler fra begge regioner, når helhovedekstraktion anvendes. Generelt er differentiel lipidomics analyse af underregioner inden for organer af et så lille insekt som Drosophila en meget besværlig og udfordrende opgave for LC-MS tilgange18. Det ville kræve disse opdeling af disse regioner, hvilket medfører store udfordringer. I modsætning hertil giver MALDI MSI tilstrækkelig opløsning til at skelne mellem forskellige anatomiske strukturer, selv inden for den lille Drosophila-hjerne. Fordelen ved et minimum af vævsbehov sammenlignet med konventionel LC-MS kan også anvendes på dyrebare prøver såsom kliniske biopsier. Desuden kunne de prøvebilleder, der blev udarbejdet til MALDI MSI, også undersøges ved hjælp af komplementære teknikker såsom TOF-SIMS og immunhistokemi, hvilket ville muliggøre integration af data opnået fra tværfaglige tilgange19,20.
Et af de vigtigste trin i MALDI MSI er prøveforberedelsen - den del af eksperimentet, der tegner sig for de fleste forskelle i resultaterne fra metabolomics-undersøgelser udført i forskellige laboratorier21. Hovedmålet her er at give en omfattende, men praktisk prøveforberedelsesprotokol til MALDI MSI-analyse af lipider og metabolitter i organismer så små som Drosophila-insekter i håb om at hjælpe forskere med implementeringen af MALDI MSI i deres studier fra grundlæggende biologi til translationel videnskab.
Ud over forholdsreglerne for at minimere ændringer i de molekylære profiler (både overflod og rumlig fordeling) som tidligere diskuteret11, skal flere andre fremgangsmåder tilpasses ved håndtering af små væv. For det første bør tiden mellem biologisk vævshøstning og frysning i OCT minimeres for at reducere sandsynligheden for postmortemisk iskæmi21. For det andet bør man sikre, at der forberedes et fladt stadium af OCT, inden vævet placeres i blokken, hvilket er afgørende for at have sektioner fra sammenlignelige planer på tværs af forskellige væv under sektionering. For det tredje kræver skæring af småskala biologisk væv eller dyrebare prøver tilstrækkelig praksis inden eksperimentet. Mens OCT hjælper med at skære lige sektioner, kan der opstå komplikationer med hensyn til vævskrølling eller afskalning. For at bekæmpe curling skal man lade sektionen hvile på scenen i et par sekunder, før man fjerner rullepladen. Med to børster kan den ene bruges til at holde toppen af sektionen stille, mens den anden kan bruges til at folde sektionen ud. Der skal udvises forsigtighed for at minimere kontakten med vævet ved primært at arbejde med kanterne af bloksektionerne. For det fjerde, selvom optøningsmetoden kunne bruges til færre fluehjerner (<10 hjerner), ville det være umuligt at overføre et afsnit, der indeholder et stort antal fluehjerner (>30 hjerner) til et koldt ITO-dias uden at miste et bemærkelsesværdigt antal hjerner, som let ville falde ud af bloksektionen, når de først var løftet. Derfor skal der anvendes varmslidemontering til hurtig analyse af et stort antal fluehjerner. Især temperaturforskellen mellem OCT-sektionen og diaset får sektionen til at klæbe og klæbe til diaset meget hurtigt. Derfor bør man ikke trykke det varme dias mod sektionen og kryostatstadiet; i stedet skal man forsigtigt og hurtigt nærme sig sektionerne for at lade sektionen fastgøres til ITO-diaset uden at røre kryostatstadiet. Vi observerede ikke noget mærkbart spor af de sektioner, der blev efterladt på kryostatstadiet sammenlignet med optøningsmonteringsmetoden. For det femte er en ensartet og fin aflejring af MALDI-matrix afgørende for at opnå stærk og nøjagtig rumlig information under erhvervelsen. Det anbefales at bruge et tomt dias til at teste matrixaflejringen for korrekt dækning, inden du fortsætter til diaset, der indeholder prøven.
Med sin voksende popularitet og fremskridt forventes MALDI MSI at nå en bredere base af brugere og blive et standardværktøj til molekylære massemålinger af analytter såsom aminosyrer, metabolitter, lipider, peptider og proteiner og andre små molekyler direkte ekstraheret fra biologiske væv10. Det har dog sine egne begrænsninger og udfordringer. Ved forberedelse af skrøbelige og små prøver til MALDI MSI er indlejringsmidler som OCT nødvendige til sektionering. OCT indeholder imidlertid en kombination af polymerer (poly (vinylalkohol), polyethylenglycerol og benzalkoniumchlorid), som skaber et polymert baggrundssignal, der kan forstyrre analytsignalet22. Alternative indlejringsforbindelser såsom gelatine og carboxymethylcellulose (CMC) er blevet rapporteret at demonstrere mindre ionundertrykkelseseffekter. Gelatine viser mindre intense signaler, der er mere spredte i lavmasseområdet 100-600 m / z 20,23,24. CMC er også blevet brugt i MALDI MSI af Drosophila til at visualisere metabolitter som GABA, selvom det kræver nedsænkning af hovederne i 70% ethanol inden indlejring for optimal vedhæftning25.
På trods af OCT's tendens til signalundertrykkelse fortsætter denne protokol med sin anvendelse på grund af OCT's overlegne evne til at tilvejebringe pålidelig sektionering af et stort antal prøver, samtidig med at hjernemorfologien bevares. Forskere har fundet ud af, at mens gelatine- og CMC-sektion godt ved høje tykkelser som 20 μm, er kun OCT i stand til at producere på hinanden følgende 12 μm sektioner pålideligt26. CMC og gelatine mangler den strukturelle integritet og stramme greb om væv, som OCT giver, hvilket sætter grænsen for antallet af små væv såsom fluehjerne, der skal rummes i en blok26. Det er blevet rapporteret, at MS-signaler fra OCT-indlejrede fluesektioner er sammenlignelige med dem, der er indlejret i gelatine og CMC26. Vores upublicerede data viste også, at varmmonterede, OCT-indlejrede fluehjerneafsnit genererede robuste lipidsignaler, der kunne sammenlignes med optømonteret gelatineindlejret væv. Samlet set på grund af OCT's overlegne evne til at bevare integriteten af vævsmorfologi og muliggøre præcis prøvesektionering sammenlignet med andre indlejringsforbindelser, er dets anvendelse med prøver af høj skrøbelighed, såsom arrays af Drosophila-hjerner , fortsat en mulighed. I dette scenario bør der kun foretages en relativ kvantificering af sammenligning af prøver fra det samme eksperiment, men ikke absolut kvantificering. Med hensyn til vores rapporterede undersøgelse af Drosophila-modellen i lipidanalyse blev det konkluderet, at fordelene ved OCT opvejer dens begrænsninger. Derudover skal der udføres forsøgsforsøg for at teste, om MS-signalerne fra de målrettede analytter vil blive maskeret af OCT-signalerne.
Desuden skal flere fremgangsmåder tilpasses for at minimere virkningerne af ionundertrykkelse. For det første bør man behandle prøverne fra forskellige grupper på samme tid for at sikre det samme omfang af ionundertrykkelse, hvis der er nogen. For det andet bør man ved udvælgelsen af den region, der er af interesse for MALDI-scanning, undgå OLT-regionen og kun skitsere vævsområdet. Endelig bør et område med tomt OLT udvælges til at blive scannet som den negative kontrol for at udelukke signalerne fra OLT under dataanalysen.
Området lipidomics opstod i begyndelsen af 2000'erne og har hurtigt avanceret i de senere år, hovedsagelig på grund af udviklingen inden for massespektrometri, herunder MALDI MSI27. Disse avancerede teknikker har hjulpet med at drive feltet mod biologiske og biomedicinske applikationer. For eksempel kan lipidomics anvendes i neurologiske undersøgelser, da ændringer i niveauer af hjernelipidhandel og sammensætning kan bruges som biomarkører for sygdom. Derudover har lipidomics ført til identifikation af nye signalmolekyler, udvikling af lægemiddeleffektivitetstest, opdagelse af mekanismer, der ligger til grund for patofysiologiske tilstande og mere28. På trods af de bemærkelsesværdige resultater, som feltet har opnået i de sidste par år, er der stadig områder, der kræver vækst. For eksempel er evnen til, at et lipid kan kvantificeres nøjagtigt ved hjælp af den nuværende teknologi, stadig under debat29. Derudover har den komplette kortlægning af det cellulære lipidom meget fremskridt at gøre. Det forventes, at disse områder, bl.a. på området, vil opleve betydelig vækst i de kommende år.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy og Maya Hein støttes af Sloan Foundation CUNY Summer Research Program (CSURP). Jun Yin understøttes af det intramurale forskningsprogram fra National Institutes of Health Project Number 1ZIANS003137. Støtte til dette projekt blev ydet af en PSC-CUNY Award til Ye He og Rinat Abzalimov, finansieret i fællesskab af The Professional Staff Congress og The City University of New York.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
| Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
References
- Park, J., et al. Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications. Biomolecules & Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).
- Augustin, K., et al. Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders. Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).
- Baldwin, K. T., Eroglu, C.
- Mauch, D. H., et al. Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol. Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis. Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).
- Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).
- Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).
- Yang, K., Han, X. Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences. Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).
- Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).
- Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e62008 (2020).
- Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10 (2018).
- Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization. Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).
- Wang, H., Eckel, R. H. What are lipoproteins doing in the brain. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).
- Palm, W., et al. Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition. PLoS Genetics. 8 (7), 1002828 (2012).
- Parra-Peralbo, E., Culi, J. Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism. PLoS Genetics. 7 (2), 1001297 (2011).
- Yin, J., et al. Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling. Nature Communications. 12 (1), 2408 (2021).
- Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI. Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).
- Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining. Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).
- Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).
- Dienel, G. A. Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures. Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).
- Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles. Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).
- Niehoff, A. C., et al. Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging. Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).
- Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head. Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).
- Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).
- Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).
- Han, X.
- Wang, M., Wang, C., Han, X. Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why. Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).
