Summary
Het doel van dit protocol is om gedetailleerde richtlijnen te geven over de juiste monstervoorbereiding voor lipide- en metabolietanalyse in kleine weefsels, zoals de Drosophila-hersenen , met behulp van matrixondersteunde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) massaspectrometrie beeldvorming.
Abstract
Lipid profiling, of lipidomics, is een gevestigde techniek die wordt gebruikt om het volledige lipidegehalte van een cel of weefsel te bestuderen. Informatie verkregen uit lipidomics is waardevol bij het bestuderen van de paden die betrokken zijn bij ontwikkeling, ziekte en cellulair metabolisme. Veel gereedschappen en instrumentaties hebben lipidomics-projecten ondersteund, met name verschillende combinaties van massaspectrometrie en vloeistofchromatografietechnieken. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI) is onlangs naar voren gekomen als een krachtige beeldvormingstechniek die conventionele benaderingen aanvult. Deze nieuwe techniek biedt unieke informatie over de ruimtelijke verdeling van lipiden binnen weefselcompartimenten, die voorheen onbereikbaar was zonder het gebruik van overmatige modificaties. De voorbeeldvoorbereiding van de MSI-aanpak van MALDI is van cruciaal belang en is daarom de focus van dit artikel. Dit artikel presenteert een snelle lipidenanalyse van een groot aantal Drosophila-hersenen ingebed in optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) om een gedetailleerd protocol te bieden voor de voorbereiding van kleine weefsels voor lipidenanalyse of metaboliet- en kleine molecuulanalyse via MALDI MSI.
Introduction
Lipiden zijn betrokken bij een breed scala aan biologische processen en kunnen grofweg worden ingedeeld in vijf categorieën op basis van hun structurele diversiteit: vetzuren, triacylglycerolen (TAGs), fosfolipiden, sterollipiden en sfingolipiden1. De fundamentele functies van lipiden zijn het leveren van energiebronnen voor biologische processen (d.w.z. TAGs) en het vormen van cellulaire membranen (d.w.z. fosfolipiden en cholesterol). Er zijn echter aanvullende rollen van lipiden opgemerkt in ontwikkeling en ziekten en zijn uitgebreid bestudeerd op biomedisch gebied. Rapporten hebben bijvoorbeeld aangetoond dat vetzuren van verschillende lengtes unieke therapeutische rollen kunnen hebben. Korte vetzuurketens kunnen betrokken zijn bij verdedigingsmechanismen tegen auto-immuunziekten, middellange vetzuurketens produceren metabolieten die aanvallen kunnen verminderen en lange vetzuurketens genereren metabolieten die kunnen worden gebruikt om metabole stoornissen te behandelen2. In het zenuwstelsel is aangetoond dat van glia afgeleide cholesterol en fosfolipiden van vitaal belang zijn voor synaptogenese 3,4. Andere soorten lipiden zijn veelbelovend gebleken in medische toepassingen, waaronder sfingolipiden die worden gebruikt in medicijnafgiftesystemen en sacharines die worden gebruikt om het immuunsysteem te ondersteunen 5,6. De talrijke rollen en potentiële therapeutische toepassingen van lipiden op biomedisch gebied hebben lipidomics - de studie van de routes en interacties van cellulaire lipiden - tot een kritisch en steeds belangrijker veld gemaakt.
Lipidomics maakt gebruik van analytische chemie om het lipidoom op grote schaal te bestuderen. De belangrijkste experimentele methoden die in lipidomics worden gebruikt, zijn gebaseerd op massaspectrometrie (MS) in combinatie met verschillende chromatografie- en ionenmobiliteitstechnieken 7,8. Het gebruik van MS in het gebied is voordelig vanwege de hoge specificiteit en gevoeligheid, de snelheid van verwerving en de unieke mogelijkheden om (1) lipiden en lipidemetabolieten te detecteren die zelfs op lage en voorbijgaande niveaus voorkomen, (2) honderden verschillende lipideverbindingen in een enkel experiment te detecteren, (3) voorheen onbekende lipiden te identificeren en (4) onderscheid te maken tussen lipide-isomeren. Onder de ontwikkelingen in MS, waaronder desorptie-elektrospray-ionisatie (DESI), MALDI en secundaire ionenmassaspectrometrie (SIMS), is MALDI MSI naar voren gekomen als een krachtige beeldvormingstechniek die conventionele MS-gebaseerde benaderingen aanvult door unieke informatie te verstrekken over de ruimtelijke verdeling van lipiden binnen weefselcompartimenten 9,10.
De typische workflow van lipidomics bestaat uit monstervoorbereiding, data-acquisitie met behulp van massaspectrometrietechnologie en data-analyse11. De studie van lipiden en metabolieten in monsters heeft geleid tot de opkomst van technieken om de fysiologische en pathologische omstandigheden van metabole processen in organismen te begrijpen. Hoewel het begrijpen van biologische interacties belangrijk is, maakt de gevoeligheid van lipiden en metabolieten ze moeilijk in beeld te brengen en te identificeren zonder kleurstoffen of andere modificaties. Veranderingen in metabolietniveaus of distributie kunnen leiden tot fenotypische veranderingen. Een hulpmiddel dat wordt gebruikt voor metabolomische profilering is MALDI MSI, een labelvrije, in situ beeldvormingstechniek die in staat is om honderden moleculen tegelijkertijd te detecteren. MALDI-beeldvorming maakt de visualisatie van metabolieten en lipiden in monsters mogelijk met behoud van hun integriteit en ruimtelijke verdeling. Eerdere technologie voor lipidenprofilering omvatte het gebruik van radioactieve chemicaliën om lipiden individueel in kaart te brengen, terwijl MALDI-beeldvorming hiervan afziet en tegelijkertijd een reeks lipiden kan detecteren.
Lipidenmetabolisme en homeostase spelen belangrijke functies in de celfysiologie, zoals het onderhoud en de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Een essentieel aspect van het lipidenmetabolisme van het zenuwstelsel is de lipide-shuttling tussen neuronen en gliacellen, die wordt gemedieerd door moleculaire dragerlipoproteïnen, waaronder lipoproteïne met zeer lage dichtheid (VLDL), lipoproteïnen met lage dichtheid (LDL) en lipoproteïnen met hoge dichtheid (HDL)12. Lipoproteïnen bevatten apolipoproteïnen (Apo), zoals ApoB en ApoD, die functioneren als structurele blokken lipidelading en als liganden voor lipoproteïnereceptoren. De neuron-glia kruisverwijzing van lipiden omvat meerdere spelers zoals glia-afgeleide ApoD, ApoE en ApoJ, en hun neuronale LDL-receptoren (LDLRs)13,14. In Drosophila is apolipophorine, een lid van de ApoB-familie, een belangrijke hemolymfe-lipidedrager15. Apolipophorine heeft twee nauw verwante lipoforinereceptoren (LpR's), LpR1 en LpR2, die homologen zijn van zoogdier LDLR15,16. In eerdere studies werden de astrocyten-uitgescheiden lipocaline Glial Lazarillo (GLaz), een Drosophila homoloog van menselijk ApoD, en zijn neuronale receptor LpR1 ontdekt om coöperatief neuron-glia lipide shuttling te bemiddelen, waardoor de dendrietmorfogenese wordt gereguleerd17. Daarom werd gespeculeerd dat het verlies van LpR1 een afname van het totale lipidengehalte in de Drosophila-hersenen zou veroorzaken. MALDI MSI zou een geschikt hulpmiddel zijn voor het profileren van de lipide-inhoud in kleine weefsels van LpR1−/− mutante en wild-type Drosophila-hersenen, zoals aangetoond in deze studie.
Ondanks de groeiende populariteit van MALDI MSI, belemmeren de hoge kosten en experimentele complexiteit van het instrument vaak de implementatie ervan in individuele laboratoria. De meeste MSI-onderzoeken van MALDI worden dus uitgevoerd met behulp van gedeelde kernfaciliteiten. Net als bij andere toepassingen van MALDI MSI is een zorgvuldig monstervoorbereidingsproces voor lipidomics van cruciaal belang om betrouwbare resultaten te bereiken. Omdat monsterdiapreparatie echter meestal wordt uitgevoerd in individuele onderzoekslaboratoria, is er een mogelijkheid van variatie in MALDI MSI-acquisitie. Om dit te bestrijden, beoogt dit artikel een gedetailleerd protocol te bieden voor de monstervoorbereiding van kleine biologische monsters voorafgaand aan MALDI MSI-meting met behulp van lipidenanalyse van een grote groep volwassen Drosophila-hersenen in positieve ionenmodus als voorbeeld11,17. Sommige fosfolipideklassen en de meerderheid van de kleine metabolieten worden echter gunstig gedetecteerd door MALDI-beeldvorming in negatieve ionenmodus, die eerder werd beschreven11. Daarom hopen we met deze twee voorbeeldstudies gedetailleerde monstervoorbereidingsprotocollen van verschillende combinaties te bieden: vrijstaand groot weefsel versus ingebed klein weefsel, dooimontage versus warmschuifmontage en positieve ionmodus versus negatieve ionmodus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Inbedding van de vliegkop
OPMERKING: De hele procedure duurt ~ 45-60 min.
- Bereid de optimale fase van de snijtemperatuurverbinding (OCT-compound) voor met een vlak oppervlak.
- Voeg OCT toe aan een plastic cryomold (15 mm x 15 mm x 5 mm) tot de helft van de diepte van de cryomold en voorkom bubbelvorming. Laat de mal enkele minuten op een plat oppervlak liggen en breng deze vervolgens over op droogijs.
- Houd de cryomold plat op het droogijs en laat de OCT een vlak en egaal oppervlak vormen. Wacht tot de OCT volledig is gestold in de mal. Gebruik de bevroren OCT-stadia onmiddellijk of bewaar ze bij −80 °C.
- Verdoof volwassen vliegen met CO2 (d.w.z. een CO2-pad ).
- Maak een petrischaaltje met daarin een stukje laboratoriumdoekje. Gebruik water om een deel van het doekje te bevochtigen om de statische elektriciteit te verminderen. Houd het doekje half nat en half droog.
- Gebruik onder het ontleden van scope 1 een tang om de vliegenkop door te snijden. Verzamel elke keer 4-5 koppen en leg ze op het droge gedeelte van het laboratoriumdoekje.
OPMERKING: Het verzamelen van 4-5 koppen duurt ~ 2 minuten.
- Breng de OCT-fase over van droogijs naar de dissectiescope.
- Neem de OCT-fase van droogijs naar microscoop 2, breng de koppen onmiddellijk over naar de OCT-fase en rangschik ze snel, wat ~ 30 s duurt om OCT-smelten te voorkomen. Laat ~ 1 mm lege ruimte rond elk vliegenbrein om voldoende ondersteuning van de OCT en 4-5 mm lege ruimte vanaf de rand van het blok te garanderen om voldoende ruimte te bieden om het gedeelte te verwerken. Als de proboscis te lang is, verwijder dan de punt; als het niet te lang is, houd het dan intact. Leg het OCT-podium terug op het droogijs en laat het ~ 3 minuten aanblijven om ervoor te zorgen dat het OCT-podium bevroren en stevig blijft.
- Wanneer het OCT-stadium weer op het droogijs is en wacht op stolling, verzamel dan nog een ronde hoofden. Herhaal stap 1.2 en 1.3 om extra monsters over te brengen naar de resterende ruimte op het podium.
OPMERKING: Acht koppen worden meestal bereid voor elk genotype en vier genotypen worden gebruikt in één OCT-fase in dit laboratorium. - Gebruik twee dissectiemicroscopen, naast elkaar, om te voorkomen dat de focus verandert en de tijd die nodig is om de koppen op het OCT-stadium over te brengen en te rangschikken te verlengen en om het risico op smelten van de OCT-fase te verminderen.
- Nadat alle vliegenkoppen zijn uitgelijnd, laat je het OCT-podium nog 5-10 minuten op het droogijs zitten.
- Neem het OCT-stadium weg van het droogijs, leg het op een plat oppervlak (bank) en voeg dan snel een grote hoeveelheid OCT-verbinding toe om alle monsters te bedekken en vul de hele cryomold, die ~ 3 s duurt.
- Breng de cryomold onmiddellijk terug naar droogijs en vries het hele OCT-blok met de ingebedde weefsels in. Laat het OCT-podium nog 5-10 minuten op het droogijs zitten. Label de monsters op de rand van de cryomold.
- Bewaar de bevroren monsters bij −80 °C totdat ze klaar zijn voor de section.
2. Cryosectie van het weefsel
OPMERKING: Draag bij het hanteren van de indiumtinoxide (ITO) glijden te allen tijde handschoenen om weefselbesmetting te voorkomen. Het dragen van een masker wordt ook aanbevolen om te voorkomen dat u direct op de glijbaan ademt.
- Bevestig de ITO-gecoate zijde door de geleidbaarheid van de ITO-dia's te testen met behulp van een voltmeter die is ingesteld op weerstand. Markeer de zijkant met een weerstandsmeting als de kant om het weefsel aan te hechten. Label het en plaats altijd een laboratoriumdoekje op de bodem van de dia om diabesmetting te voorkomen.
- Laat de weefsels gedurende 30-45 minuten in evenwicht komen in de cryostaatkamer.
- Om het smelten van de OCT te voorkomen, plaatst u alle benodigde gereedschappen zoals een tang en een dunpuntige artist-borstel van tevoren in de cryostaatkamer om ze voor te koelen.
- Reinig de cryostaat, bij voorkeur met 70% ethanol. Veeg de rolplaat en het podium af en verwijder de gebruikte messen. Gebruik extra schone doekjes om ervoor te zorgen dat de ethanol is verdampt en dat alle oppervlakken droog zijn voordat het snijden begint.
- Pas de temperatuur van de cryostaatkamer en de monsterkop aan op basis van het type weefsel (bijv. −14 °C voor lever, −20 °C voor spieren en −25 °C voor huid10; −18 °C voor vliegenkoppen in dit protocol).
- Monteer het weefsel op de monsterhouder met OCT. Zorg ervoor dat u voldoende OCT gebruikt om de basis van het OCT-blok te bedekken en monteer het blok zo plat mogelijk.
- Plaats een schoon mes in het podium en vergrendel het. Plaats de kop van het monster naar behoefte in de richting van het podium om de gewenste snijhoek te bereiken.
- Plaats het monsterblok in een richting waarin alle genotypen/behandelingsgroepen verticaal ten opzichte van het blad zijn geplaatst.
OPMERKING: Dit zorgt voor een consistent snijvlak en voorkomt kruisbesmetting door verschillende groepen. Als u een ander blok weefsel snijdt, schakel dan over op een nieuw mes tussen de monsters om kruisbesmetting te voorkomen.
- Plaats het monsterblok in een richting waarin alle genotypen/behandelingsgroepen verticaal ten opzichte van het blad zijn geplaatst.
- Begin met snijden in dikke delen (50-100 μm) totdat het interessante gebied (bijvoorbeeld het gewenste gebied van de hersenen) is gevonden.
- Borstel voortdurend extra stukken af met een voorgekoelde artiestenborstel om het podium schoon te houden.
- Verander de dikte van de secties in 10-12 μm zodra het gewenste gebied is bereikt.
- Pas de kamertemperatuur indien nodig enigszins aan. Stel bijvoorbeeld een hogere temperatuur in als het gedeelte de neiging heeft om te schilferen of gemakkelijk uit elkaar te vallen.
OPMERKING: De aanbevolen temperatuur voor OCT-blokken is −18 °C.
- Pas de kamertemperatuur indien nodig enigszins aan. Stel bijvoorbeeld een hogere temperatuur in als het gedeelte de neiging heeft om te schilferen of gemakkelijk uit elkaar te vallen.
- Verzamel zorgvuldig het gewenste gedeelte en plak het op de ITO-dia. Voer deze bewerking uit in de cryostaatkamer.
- Neem een ITO-dia op kamertemperatuur en plaats deze over de sectie, benader de sectie voorzichtig en snel zodat de sectie zich aan de dia hecht zonder sporen achter te laten op het cryostaatstadium.
OPMERKING: De OCT zal smelten en zich vastklampen aan de dia.
- Neem een ITO-dia op kamertemperatuur en plaats deze over de sectie, benader de sectie voorzichtig en snel zodat de sectie zich aan de dia hecht zonder sporen achter te laten op het cryostaatstadium.
- Plaats de schuif opzij in een rek of laboratoriumdoekje buiten de cryostaat tussen de verzamelingen van meerdere secties.
- Als vergelijking tussen verschillende steekproeven van hetzelfde cohort gewenst is, plaatst u de secties van meerdere monsters op één dia voor gelijktijdige analyse en minimale variatie. Indien nodig gescheiden van twee dia's, omdat de MALDI-doelhouder plaats biedt aan twee dia's in één keer.
- Transporteer de dia's in een vacuümdoos naar een exsiccator met droogmiddel als onderste laag. Droog de dia's onder een vacuüm gedurende 30-60 min.
OPMERKING: Als alternatief, als het laboratorium niet is uitgerust met een vacuümdesiccator, moeten de dia's gedurende het hele proces op −20 °C worden bewaard tot opslag bij −80 °C binnen 24 uur of verzending op droogijs om verslechtering van lipiden of metabolieten te voorkomen. - Ga verder met matrixdepositie. Gebruik 2,5-dihydroxybenzoëzuur (DHB) in methanol/water (70/30, v/v) als matrix.
- Als dia's niet onmiddellijk worden uitgevoerd, bewaar de dia's dan bij −80 °C (tot 1 maand voor vliegenhersenensecties en 6 maanden voor knaagdierhersensecties), of verzend het monster onmiddellijk naar MALDI-kernfaciliteiten met voldoende droogijs. Voor optimale opslag en verzending plaatst u de dia's in een schuiftransporter en sluit u de opening veilig af met wasfolie. Sluit af met een ritszak, plaats deze in een andere ritszak met droogmiddel en label de buitenkant.
OPMERKING: Raadpleeg eerder werk voor de gevolgde stappen van diascanning, matrixdepositie en MALDI-beeldvormingsprocedures11. - Matrixdepositie uitvoeren met behulp van de automatische HTX M5 matrixsproeier en een 40 mg/ml oplossing dhb in methanol/water (70/30, v/v). Spuit de matrix met een aangepast debiet van 0,12 ml/min en een nozzletemperatuur van 85 °C gedurende 10 gangen. Gebruik een N2 gasdruk van 10 psi.
OPMERKING: Als de N2-gasdruk in de sproeier onder 5 psi wordt verlaagd, zal een veiligheidsmechanisme in de sproeier de verwarming onmiddellijk uitschakelen om schade aan de sproeier te voorkomen met een sproeisnelheid van 1.300 mm / min, 2 mm spoorafstand, 3 L / min debiet en 40 mm nozzlehoogte. - Gebruik een MALDI time of flight (TOF) MS-instrument (zie de tabel met materialen) in positieve ionmodus om een massaspectrum te verkrijgen binnen het massabereik van m/z 50-1.000.
- Om het instrument te kalibreren, spot u 0,5 μL rode fosforemulsie in acetonitril op de ITO-dia's en gebruikt u de spectra om het instrument te kalibreren in het massabereik van 50-1.000 m / z door een kwadratische kalibratiecurve2 toe te passen.
- Stel de laserspotdiameters in op Medium, omdat dit het gemoduleerde bundelprofiel is voor een rasterbreedte van 40 μm, en verzamel beeldgegevens door 500 opnamen op te tellen met een laserherhalingssnelheid van 1.000 Hz per arraypositie.
- Gebruik software (zie de Materiaaltabel) om de spectrale gegevens vast te leggen en te verwerken. Voer beeldgegevensanalyse uit met behulp van rms-normalisatie (root mean square) om ionenbeelden te genereren met een bakbreedte van ±0,10 Da. Lijn de spectra van zowel het OCT- als het hersenweefsel uit hetzelfde experiment uit met behulp van de software om de overlappende pieken en de iononderdrukkingsinterferentie van de OCT te evalueren (aanvullende figuur S1). Verwerk na het experiment de MALDI-dia's met de weefselmonsters door hematoxyline- en eosinekleuring (H&E), zoals eerder beschreven11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het verlies van de neuronale receptor LpR1 van de astrocyten-uitgescheiden lipocaline Glial Lazarillo (GLaz), een Drosophila homoloog van menselijk ApoD, werd verondersteld een afname van het totale lipidegehalte in de Drosophila hersenen te kunnen veroorzaken. Om dit te testen, werd MALDI MSI gebruikt om de lipiden in LpR1−/− mutante en wild-type Drosophila hersenen te profileren, wat hieronder wordt uitgewerkt.
Het experiment werd uitgevoerd volgens de workflow in figuur 1. Volwassen vliegenhersenen werden geoogst zoals hierboven beschreven. Ze waren ingebed in OCT en droogijs werd gebruikt om het OCT-blok te bevriezen. Het OCT-weefselblok werd gecrycctioneerd met een dikte van 12 μm en met −18 °C voor zowel de monsterkop als de kamer. ITO-dia's met cryosecties erop werden gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een vacuüm uitgedroogd. Vervolgens werd matrixdepositie uitgevoerd met behulp van de automatische HTX M5 matrixspuit en een 40 mg/ml oplossing dhb in methanol/water (70/30, v/v).
Het MALDI time of flight (TOF) MS Autoflex-instrument in positieve ionmodus verwierf een massaspectrum binnen de massabereiken van 50-1.000 m/z. Het spectrum van zowel het OCT als het hersenweefsel van hetzelfde experiment werd uitgelijnd in SCiLS om de overlappende pieken en de ionenonderdrukkingsinterferentie van de OCT te evalueren (Supplemental Figure S1).
De resultaten in figuur 2 tonen uitvoerbeelden van MALDI MSI-data-analysesoftware van geselecteerde m/z-spectra waarbij de geselecteerde waarden een significant verschil in lipidenverdeling tussen LpR1 knock-out en wild-type Drosophila lieten zien. De scans onthulden een algemene vermindering van het lipidegehalte in de LpR1−/− mutant. Elk spectrum werd handmatig geanalyseerd en analytidentificatie werd bereikt door kruisverwijzingen te maken naar METLIN-databases en eerder gepubliceerde studies 3,4. Triacylglycerol (TAG) en fosfatidylglycerol (PG) kwamen sterk tot expressie in controlehersenen in vergelijking met de LpR1−/− mutant (met een 10-voudige verandering in TAG). Bovendien werden diglycerol (DAG), fosfatidylcholine (PC) en fosfatidyl-ethanolamine (PE) ook minimaal tot expressie gebracht in het LpR1−/− mutant genotype.
Figuur 1: Workflow van MALDI-TOF massaspectrometrie beeldvorming. (A) Drosophila-hersenen zijn uitgelijnd in OCT geplaatst op droogijs. (B-D) Het weefselblok wordt gecryopectioneerd in 12 μm dikke secties bij −15 °C. Het gedeelte wordt afgevlakt met een voorgekoelde borstel en ontdooit op de ITO-gecoate kant van een glasplaat die op kamertemperatuur wordt gehouden. (E) De dia is gemarkeerd met fiduciële markers, gecoat met matrix en in het MALDI-instrument geplaatst. (F) Het MALDI-beeld van een Drosophila-brein wordt verkregen met een resolutie van 40 μm met DHB als matrix. De gebieden van ogen (rood, m/z 370,2), hoofdweefsel (groen, m/z 184,1) en hersenen (blauw, m/z 788,6) worden weergegeven in de overlayed meerkanaals afbeelding. (G) H&E-kleuring wordt uitgevoerd op hetzelfde weefselgedeelte na MALDI MSI. (H) De workflow van monstervoorbereiding, opslag en transport. Schaalstaven = 500 μm (F,G). Afkortingen: MALDI-TOF = matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight; OCT = optimale snijtemperatuurverbinding; ITO = indiumtinoxide; DHB = 2,5,-dihydroxybenzoëzuur; H&E = hematoxyline en eosine; MSI = massaspectrometrie beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve beelden van MALDI MS-analyse die een algemene afname van het lipidengehalte in het LpR1−/− mutante brein laten zien. Representatieve H &E-gekleurde volwassen vliegenhersensecties worden getoond (links). De lipidesoorten, hun respectievelijke m/z-waarden en de schalen van de heatmap zijn zoals aangegeven. Onderaan wordt de gemiddelde reductieplooi van de LpR1−/− mutant ten opzichte van de controles van ten minste vier biologische replicaties weergegeven als getallen naast de pijlen. Schaalbalk = 1 mm. Dit cijfer is aangepast van Yin et al.17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Massaspectra van OCT en Drosophila hersenweefsel. De cryosecties van drosophila hersen OCT blok uit figuur 1 werden gelijkmatig bedekt met DHB matrix vóór MALDI beeldvorming. Het massaspectrum van het geselecteerde blanco OCT-gebied en hersenweefselgebied van zowel controle- als mutante vliegen werd weergegeven in het bereik van respectievelijk m / z 1-1.000 en m / z 520-900 (lipide-verrijkt). De interferentie van OCT wordt geassocieerd met zowel ionenonderdrukkingsverschijnselen als overlappende signaalproblemen. Afkortingen: OCT = optimale snijtemperatuur verbinding; DHB = 2,5-dihydroxybenzoëzuur; MALDI = matrix-geassisteerde laser desorptie/ionisatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals aangetoond in de studie naar de variaties in lipidesamenstelling in mutante en wild-type Drosophila hersenen, kan MALDI MSI een waardevolle labelvrije beeldvormingstechniek zijn voor in situ analyse van moleculaire distributiepatronen in organen van kleine insecten. Inderdaad, omdat lipiden worden verdeeld in zowel het hersenweefsel als het vetlichaam van Drosophila-hoofden, kunnen conventionele lipidomics-benaderingen op basis van vloeistofchromatografie en massaspectrometrie (LC-MS) alleen gecombineerde signalen uit beide regio's detecteren wanneer extractie van het hele hoofd wordt gebruikt. In grote lijnen is differentiële lipidomics-analyse van subregio's binnen organen van zo'n klein insect als Drosophila een zeer moeizame en uitdagende taak voor LC-MS-benaderingen18. Het zou een ontleding van die regio's vereisen, wat grote uitdagingen met zich meebrengt. MALDI MSI biedt daarentegen voldoende resolutie om verschillende anatomische structuren te onderscheiden, zelfs in het kleine Drosophila-brein. Het voordeel van een minimale hoeveelheid weefselbehoefte in vergelijking met conventionele LC-MS kan ook worden toegepast op kostbare monsters zoals klinische biopsieën. Bovendien zouden de monsterdia's die voor MALDI MSI zijn voorbereid, ook kunnen worden onderzocht met complementaire technieken zoals TOF-SIMS en immunohistochemie, die de integratie van de gegevens verkregen uit multidisciplinaire benaderingen mogelijk zouden maken19,20.
Een van de belangrijkste stappen in MALDI MSI is de monstervoorbereiding - het deel van het experiment dat de meeste verschillen in de resultaten van metabolomics-studies die in verschillende laboratoria zijn uitgevoerd, verklaart 21. Het belangrijkste doel hier is om een uitgebreid maar praktisch monstervoorbereidingsprotocol te bieden voor MALDI MSI-analyse van lipiden en metabolieten in organismen zo klein als Drosophila-insecten in de hoop onderzoekers te helpen bij de implementatie van MALDI MSI in hun studies van basisbiologie tot translationele wetenschap.
Naast de voorzorgsmaatregelen om veranderingen in de moleculaire profielen (zowel abundantie als ruimtelijke verdeling) te minimaliseren, zoals eerder besproken11, moeten verschillende andere praktijken worden aangepast bij het hanteren van kleine weefsels. Ten eerste moet de tijd tussen het oogsten van biologisch weefsel en het invriezen in de LGO worden geminimaliseerd om de kans op postmortale ischemie te verminderen21. Ten tweede moet men ervoor zorgen dat een vlakke fase van OCT wordt voorbereid voordat het weefsel in het blok wordt geplaatst, wat cruciaal is voor het hebben van secties van vergelijkbare vlakken over verschillende weefsels tijdens het snijden. Ten derde moet het snijden van kleinschalig biologisch weefsel of kostbare monsters voldoende worden geoefend vóór het experiment. Terwijl de OCT helpt bij het snijden van gelijkmatige secties, kunnen complicaties optreden in termen van weefselkrulling of schilfering. Om curling tegen te gaan, moet men het gedeelte een paar seconden op het podium laten rusten voordat de rolplaat wordt verwijderd. Met twee borstels kan de ene worden gebruikt om de bovenkant van de sectie stil te houden, terwijl de andere kan worden gebruikt om de sectie te ontvouwen. Zorg ervoor dat contact met het weefsel wordt geminimaliseerd door voornamelijk met de randen van de bloksecties te werken. Ten vierde, hoewel de dooi-montagemethode kan worden gebruikt voor minder vliegenhersenen (<10 hersenen), zou het onmogelijk zijn om een sectie met een groot aantal vliegenhersenen (>30 hersenen) over te brengen naar een koude ITO-glijbaan zonder een opmerkelijk aantal hersenen te verliezen, die gemakkelijk uit het blokgedeelte zouden vallen als ze eenmaal zijn opgetild. Daarom moet voor een snelle analyse van een groot aantal vliegenhersenen warmschuifmontage worden gebruikt. Met name het temperatuurverschil tussen de OCT-sectie en de dia zorgt ervoor dat de sectie zich zeer snel vastklampt en aan de glijbaan hecht. Daarom moet men de warme glijbaan niet tegen de sectie en het cryostaatstadium drukken; in plaats daarvan moet men de secties voorzichtig en snel benaderen om de sectie aan de ITO-dia te laten hechten zonder de cryostaatfase aan te raken. We hebben geen merkbaar spoor waargenomen van de secties die achterbleven op het cryostat-stadium in vergelijking met de dooimontagemethode. Ten vijfde is een uniforme en fijne depositie van de MALDI-matrix cruciaal om sterke en nauwkeurige ruimtelijke informatie te verkrijgen tijdens de acquisitie. Het wordt aanbevolen om een lege dia te gebruiken om de matrixafzetting te testen op de juiste dekking voordat u doorgaat naar de dia met het monster.
Met zijn groeiende populariteit en vooruitgang zal MALDI MSI naar verwachting een bredere gebruikersbasis bereiken en een standaardinstrument worden voor moleculaire massametingen van analyten zoals aminozuren, metabolieten, lipiden, peptiden en eiwitten, en andere kleine moleculen die rechtstreeks uit biologische weefsels worden geëxtraheerd10. Het heeft echter zijn eigen beperkingen en uitdagingen. Bij het voorbereiden van fragiele en kleinschalige monsters voor MALDI MSI zijn inbeddingsagenten zoals OCT nodig voor secties. OCT bevat echter een combinatie van polymeren (poly (vinylalcohol), polyethyleenglycerol en benzalkoniumchloride), waardoor een polymeer achtergrondsignaal ontstaat dat het analytsignaal kan verstoren22. Van alternatieve inbeddingsverbindingen zoals gelatine en carboxymethylcellulose (CMC) is gemeld dat ze minder ionenonderdrukkingseffecten vertonen. Gelatine vertoont minder intense signalen die meer verspreid zijn in het lage massabereik van 100-600 m/z 20,23,24. CMC is ook gebruikt in MALDI MSI van Drosophila om metabolieten zoals GABA te visualiseren, hoewel het vereist dat de koppen worden ondergedompeld in 70% ethanol voordat ze worden ingebed voor optimale hechting25.
Ondanks de neiging van OCT tot signaalonderdrukking, gaat dit protocol door met het gebruik ervan vanwege het superieure vermogen van OCT om betrouwbare secties van een groot aantal monsters te bieden met behoud van hersenmorfologie. Onderzoekers hebben ontdekt dat, terwijl gelatine en CMC-sectie goed zijn bij hoge diktes zoals 20 μm, alleen OCT in staat is om opeenvolgende secties van 12 μm betrouwbaarte produceren 26. CMC en gelatine missen de structurele integriteit en strakke greep van weefsel dat OCT biedt, wat de limiet bepaalt van het aantal kleine weefsels zoals vliegenhersenen dat in één blok26 moet worden ondergebracht. Er is gemeld dat MS-signalen van OCT-ingebedde vliegsecties vergelijkbaar zijn met die ingebed in gelatine en CMC26. Onze ongepubliceerde gegevens gaven ook aan dat warm gemonteerde, OCT-ingebedde vliegenhersensecties robuuste lipidesignalen genereerden die vergelijkbaar zijn met op dooi gemonteerd gelatine-ingebed weefsel. Over het algemeen, vanwege het superieure vermogen van OCT om de integriteit van weefselmorfologie te behouden en nauwkeurige monstersectie mogelijk te maken in vergelijking met andere inbeddingsverbindingen, blijft het gebruik ervan met monsters met een hoge kwetsbaarheid, zoals arrays van Drosophila-hersenen , een optie. In dat scenario moet alleen de relatieve kwantificering van vergelijkingsmonsters uit hetzelfde experiment worden gemaakt, maar geen absolute kwantificering. Met betrekking tot onze gerapporteerde studie van het Drosophila-model in lipidenanalyse, werd geconcludeerd dat de voordelen van OCT opwegen tegen de beperkingen. Daarnaast moeten proefexperimenten worden uitgevoerd om te testen of de MS-signalen van de beoogde analyten door de OCT-signalen zouden worden gemaskeerd.
Bovendien moeten verschillende praktijken worden aangepast om de effecten van ionenonderdrukking te minimaliseren. Ten eerste moet men de monsters van verschillende groepen tegelijkertijd verwerken om dezelfde mate van ionenonderdrukking te garanderen, als die er is. Ten tweede moet men bij de selectie van het gebied dat van belang is voor MALDI-scanning het OCT-gebied vermijden en alleen het weefselgebied schetsen. Ten slotte moet een gebied van blanco OCT worden geselecteerd om te worden gescand als het negatieve besturingselement om de signalen van OCT uit te sluiten tijdens gegevensanalyse.
Het gebied van lipidomics ontstond in de vroege jaren 2000 en is de afgelopen jaren snel vooruitgegaan, grotendeels als gevolg van ontwikkelingen in massaspectrometrie, waaronder MALDI MSI27. Deze voortschrijdende technieken hebben geholpen bij het stimuleren van het veld in de richting van biologische en biomedische toepassingen. Lipidomics kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt in neurologische studies, omdat veranderingen in niveaus van hersenlipidenhandel en samenstelling kunnen worden gebruikt als biomarkers van ziekte. Bovendien heeft lipidomics geleid tot de identificatie van nieuwe signaalmoleculen, de ontwikkeling van werkzaamheidstests voor geneesmiddelen, de ontdekking van mechanismen die ten grondslag liggen aan pathofysiologische aandoeningen en meer28. Ondanks de opmerkelijke prestaties die het veld de afgelopen jaren heeft geleverd, zijn er nog steeds gebieden die om groei vragen. Het vermogen van een lipide om nauwkeurig te worden gekwantificeerd met behulp van de huidige technologie blijft bijvoorbeeld ter discussiestaan 29. Bovendien heeft het volledig in kaart brengen van het cellulaire lipidoom nog veel vooruitgang te boeken. De verwachting is dat deze gebieden, onder andere in het veld, de komende jaren een flinke groei zullen doormaken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy en Maya Hein worden ondersteund door de Sloan Foundation CUNY Summer Research Program (CSURP). Jun Yin wordt ondersteund door het intramurale onderzoeksprogramma van het National Institutes of Health Project Number 1ZIANS003137. Ondersteuning voor dit project werd geleverd door een PSC-CUNY Award aan Ye He en Rinat Abzalimov, gezamenlijk gefinancierd door The Professional Staff Congress en The City University of New York.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
| Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
References
- Park, J., et al. Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications. Biomolecules & Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).
- Augustin, K., et al. Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders. Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).
- Baldwin, K. T., Eroglu, C.
- Mauch, D. H., et al. Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol. Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis. Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).
- Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).
- Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).
- Yang, K., Han, X. Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences. Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).
- Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).
- Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e62008 (2020).
- Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10 (2018).
- Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization. Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).
- Wang, H., Eckel, R. H. What are lipoproteins doing in the brain. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).
- Palm, W., et al. Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition. PLoS Genetics. 8 (7), 1002828 (2012).
- Parra-Peralbo, E., Culi, J. Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism. PLoS Genetics. 7 (2), 1001297 (2011).
- Yin, J., et al. Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling. Nature Communications. 12 (1), 2408 (2021).
- Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI. Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).
- Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining. Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).
- Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).
- Dienel, G. A. Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures. Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).
- Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles. Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).
- Niehoff, A. C., et al. Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging. Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).
- Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head. Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).
- Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).
- Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).
- Han, X.
- Wang, M., Wang, C., Han, X. Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why. Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).
