Summary
Il presente protocollo descrive la centrifugazione differenziale per isolare e caratterizzare EV rappresentative (esosomi e microvescicole) da MSC umane in coltura. Ulteriori applicazioni di questi veicoli elettrici sono spiegate anche in questo articolo.
Abstract
Le vescicole extracellulari (EV) sono nanoparticelle di membrana eterogenee rilasciate dalla maggior parte dei tipi cellulari e sono sempre più riconosciute come regolatori fisiologici dell'omeostasi dell'organismo e importanti indicatori di patologie; Nel frattempo, sta emergendo il loro immenso potenziale per stabilire terapie di malattia accessibili e controllabili. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) possono rilasciare grandi quantità di EV in coltura, che hanno dimostrato di promettere di avviare un'efficace rigenerazione dei tessuti e facilitare ampie applicazioni terapeutiche con una buona scalabilità e riproducibilità. C'è una crescente domanda di protocolli semplici ed efficaci per la raccolta e l'applicazione di MSC-EV. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato basato sulla centrifugazione differenziale per isolare e caratterizzare EV rappresentativi da MSC umane in coltura, esosomi e microvescicole per ulteriori applicazioni. L'adattabilità di questo metodo è dimostrata per una serie di approcci a valle, come l'etichettatura, il trapianto locale e l'iniezione sistemica. L'implementazione di questa procedura risponderà alla necessità di una raccolta e di un'applicazione semplici e affidabili di MSC-EV nella ricerca traslazionale.
Introduction
Le cellule staminali sono cellule pluripotenti indifferenziate con capacità di auto-rinnovamento e potenziale traslazionale1. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono facilmente isolate, coltivate, espanse e purificate in laboratorio, il che rimane caratteristico delle cellule staminali dopo più passaggi. Negli ultimi anni, prove crescenti hanno sostenuto l'opinione che le MSC agiscono in modo paracrino nell'uso terapeutico 2,3. Soprattutto la secrezione di vescicole extracellulari (EV) svolge un ruolo cruciale nel mediare le funzioni biologiche delle MSC. Come nanoparticelle membranose eterogenee rilasciate dalla maggior parte dei tipi di cellule, le EV consistono in sottocategorie denominate esosomi (Exos), microvescicole (MV) e corpi apoptotici ancora più grandi 4,5. Tra questi, Exos è l'EV più studiato con una dimensione di 40-150 nm, che è di origine endosomiale e attivamente secreto in condizioni fisiologiche. Le MV si formano spargendo direttamente dalla superficie della membrana plasmatica cellulare con un diametro di 100-1.000 nm, che sono caratterizzate da un'elevata espressione di fosfatidilserina e dall'espressione di marcatori superficiali di cellule donatrici6. Le EV contengono RNA, proteine e altre molecole bioattive, che hanno funzioni simili alle cellule madri e svolgono un ruolo significativo nella comunicazione cellulare, nella risposta immunitaria e nella riparazione dei danni tissutali7. Le MSC-EV sono state ampiamente studiate come un potente strumento terapeutico privo di cellule nella medicina rigenerativa8.
L'isolamento e la purificazione dei veicoli elettrici derivati da MSC è un problema comune nel campo della ricerca e dell'applicazione. Allo stato attuale, l'ultracentrifugazione differenziale e a gradiente di densità9, il processo di ultrafiltrazione10, la separazione immunomagnetica 11, il cromatografo ad esclusione molecolare 12 e il chip microfluidico13 sono metodi ampiamente impiegati nell'isolamento e nella purificazione delle EV. Con i vantaggi e gli svantaggi di ciascun approccio, la quantità, la purezza e l'attività dei veicoli elettrici raccolti non possono essere soddisfatti contemporaneamente14,15. Nel presente studio, viene mostrato in dettaglio il protocollo di centrifugazione differenziale di isolamento e caratterizzazione delle EV da MSC in coltura, che ha supportato un uso terapeutico efficiente 16,17,18,19,20. L'adattabilità di questo metodo per una serie di approcci a valle, come la marcatura fluorescente, il trapianto locale e l'iniezione sistemica, è stata ulteriormente esemplificata. L'implementazione di questa procedura risponderà alla necessità di una raccolta e di un'applicazione semplici e affidabili delle MSC-EV nella ricerca traslazionale.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della Quarta Università medica militare ed eseguite in conformità con la Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Sono stati utilizzati topi C57Bl/6 di otto settimane (nessuna preferenza per femmine o maschi). Le MSC derivate dal cordone ombelicale umano crioconservate (UCMSC), utilizzate per il presente studio, sono state ottenute da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). L'uso di cellule umane è stato approvato dal Comitato Etico della Quarta Università Medica Militare.
1. Coltura di cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs)
- Preparare gli accessori e le soluzioni necessarie per il lavoro sperimentale, tra cui pipette, punte per pipette, capsula di Petri da 10 cm, apparecchiature termostatiche (bagno d'acqua), guanti di gomma, alcool al 75%, terreno di coltura (incubato a 37 °C), siero bovino fatale (FBS) e soluzione 100x di penicillina-streptomicina (P/S) (vedere Tabella dei materiali).
- Preparare il mezzo essenziale minimo alfa (α-MEM) disponibile in commercio integrando con 20% FBS e 1% P/S.
NOTA: Diluire tutte le soluzioni utilizzate per l'isolamento e l'analisi dei veicoli elettrici in acqua filtrata ultrapura realizzata dal sistema di purificazione dell'acqua filtrata ultrapura (vedere Tabella dei materiali). - Recuperare le MSC derivate dal cordone ombelicale umano crioconservate (UCMSC) dall'azoto liquido fondendole in un bagno d'acqua a 37 °C.
- Trasferire rapidamente e delicatamente la sospensione di cellule fuse in un tubo da 15 mL con 5 mL di terreno di coltura (fase 1.2). Centrifugare a 4 °C, 500 x g per 5 min.
- Rimuovere il surnatante con una pipetta sterile e trattenere il precipitato cellulare. Aggiungere 2 ml di terreno di coltura nella provetta della centrifuga e risospendere delicatamente le cellule.
- Seminare le cellule in una capsula di Petri da 10 cm e aggiungere 8 ml di terreno di coltura per un totale di 10 ml.
- Coltura di MSC a 37 °C in 5% di CO2 nell'incubatore cellulare.
2. Centrifugazione differenziale per l'isolamento di Exos e MV
- Quando le MSC raggiungono il >90% di confluenza, sostituire il terreno di coltura con α-MEM integrato con il 20% di FBS impoverito di EV e l'1% di P/S per 8 ml di ogni piatto.
NOTA: Centrifugare FBS a 4 °C, 1,50.000 x g durante la notte per rimuovere EV e altre impurità. - Dopo 48 ore di coltura, raccogliere il terreno di coltura (fase 2.1) in provette da centrifuga da 50 ml.
- Centrifugare il terreno di coltura MSC a 4 °C, 800 x g per 10 min.
- Rimuovere i frammenti cellulari e i detriti cellulari trasferendo il surnatante in tubi conici puliti da 1,5 ml.
NOTA: L'utilizzo di tubi conici da 1,5 mL è necessario per aumentare la resa EV. - Centrifugare il surnatante a 4 °C, 16.000 x g per 30 min. Il pellet è MV. MV da ogni piatto di cellule sono stati risospesi con 50 μL di PBS.
- Trasferire il surnatante ottenuto per centrifugazione al punto 2.5 mediante pipetta in provette da ultracentrifuga pulita. Centrifugare a 1,50.000 x g per 2 h a 4 °C.
- Scartare il surnatante e raccogliere il residuo, che è Exos. Risospendere Exos da sette piatti di cellule in 50 μL di PBS.
NOTA: gli UCMSC di sesto passaggio vengono utilizzati per l'isolamento EV. Per ottenere abbastanza MV ed Exos per uso sperimentale, di solito sono necessari 7-8 piatti di cellule coltivate. I campioni EV vengono utilizzati immediatamente per le successive fasi di caratterizzazione o per applicazioni terapeutiche, che è meglio non conservare.
ATTENZIONE: Evitare il congelamento e lo scongelamento ripetuti dei veicoli elettrici, ed è meglio conservare i veicoli elettrici a 4 °C a breve termine e non a -80 °C.
3. Rilevamento del numero di particelle e distribuzione dimensionale dei veicoli elettrici da MSC
NOTA: Per la valutazione della distribuzione dimensionale, l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) viene eseguita da un analizzatore di tracciamento delle nanoparticelle disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali).
- Diluire 1 μL di EV (dalla fase 2.5 e dalla fase 2.7) in 1.499 μL di PBS e mescolare abbastanza in una provetta da 15 ml.
- Utilizzare l'analizzatore di tracciamento seguendo le istruzioni del produttore. Innanzitutto, avviare il software compatibile (vedere Tabella dei materiali).
- Riempire la cella campione con acqua distillata, quindi consentire allo strumento di avviare il controllo della cella.
- Calibrare lo strumento con una soluzione standard preparata. Assicurarsi che il numero di particelle visualizzato sull'interfaccia di rilevamento del software sia compreso tra 50 e 400 (preferibilmente circa 200). Fare clic su OK.
NOTA: Preparare la soluzione standard ricostituendo 1 μL di soluzione di taratura (vedere Tabella dei materiali) in 1 mL di acqua distillata per generare una soluzione primaria, quindi prelevare 100 μL della soluzione primaria e aggiungere 25 mL di acqua distillata per preparare una soluzione standard (1:250.000). Conservare questo reagente di lavoro a 4 °C per una settimana. - Risciacquare la cella del campione con 5 ml di acqua distillata.
- Prima dell'analisi del campione, lavare il canale con 1 mL di acqua distillata. Assicurarsi che il numero di particelle visualizzato sull'interfaccia di rilevamento del software sia inferiore a 10.
- Iniettare 1 mL del campione EV preparato al punto 3.1. Eseguire il test delle vescicole secondo le istruzioni operative dello strumento.
ATTENZIONE: Il campione e l'acqua distillata vengono iniettati con una siringa da 1 mL ad una velocità costante di 0,5 mL/s sotto attento controllo manuale.
4. Caratterizzazione della morfologia delle EV mediante microscopio elettronico a trasmissione (TEM)
- Diluire 1 μL di EV dalla fase 2.7 in 199 μL di PBS e mescolare abbastanza. Aggiungere 20 μL di gocce di sospensione EV alla maglia quadrata formvar/rivestita di carbonio (vedere Tabella dei materiali) e lasciarla riposare per 3 minuti.
- Rimuovere il liquido in eccesso con una piccola carta da filtro e lasciarlo rimanere per 15 secondi per asciugare leggermente la superficie.
- Colorare negativamente i campioni di EV con goccioline di acido fosfotungstico all'1,5% per 40 s.
- Rimuovere l'acido fosfotungstico in eccesso e lasciarlo riposare per 15 s per asciugare leggermente la superficie.
- Inserire il campione contenente la maglia quadrata formvar/rivestita di carbonio in un piatto pulito coperto con carta da filtro. Osserva e cattura immagini con un microscopio elettronico a trasmissione.
NOTA: In questo processo, Exos sono presi come esempio.
5. Etichettatura dei veicoli elettrici derivati dalle MSC
- Dopo l'estrazione EVs (fase 2.5), risospendere con 250 μL di PBS in un tubo conico da 1,5 ml.
- Utilizzare un altro tubo conico da 1,5 ml per preparare la soluzione di lavoro del colorante PKH26; utilizzare 1 μL di reagente di etichettatura PKH26 diluito con 250 μL di diluente C (un componente del kit di etichettatura EV disponibile in commercio utilizzato per il presente studio, vedere Tabella dei materiali).
NOTA: preparare la soluzione di lavoro immediatamente prima dell'uso.
ATTENZIONE: Un eccessivo colorante PKH26 o etichettatura senza pre-diluizione rischia di danneggiare i veicoli elettrici. - Mescolare i veicoli elettrici risospesi con la soluzione di lavoro. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 5 minuti, quindi aggiungere 500 μL di FBS impoverito di EV per fermare la reazione.
- Per le MV, centrifugare a 4 °C, 16.000 x g per 30 minuti ed eliminare il surnatante con una pipetta. Aggiungere 1 mL di PBS per risciacquare il residuo.
- Centrifugare a 4 °C, 16.000 x g per 30 minuti ed eliminare il surnatante per rimuovere il colorante non legato.
- Risospendere il residuo con 200 μL di PBS. Far cadere 20 μL di sospensione sul vetrino e osservarlo al microscopio a fluorescenza.
NOTA: in questo processo, gli MV vengono presi come esempio.
6. Trapianto locale e iniezione sistemica di MSC-EV
NOTA: per le seguenti procedure, posizionare i veicoli elettrici sul ghiaccio prima dell'iniezione.
- Eseguire il trapianto locale seguendo i passaggi seguenti.
- Anestetizzare i topi con isoflurano al 4% (vol/vol). Mantenere l'anestesia all'1% -3% di isoflurano durante la procedura.
- Prima dell'intervento chirurgico, somministrare 5 mg / kg di carprofen (IP) per l'analgesia per ridurre al minimo il dolore post-procedurale.
- Prima dell'escissione della ferita, radersi i peli dorsali e sterilizzare la superficie dorsale applicando 3 cicli alternati di 10% di iodio povidone e etanolo al 75%.
- Utilizzando un punzone bioptico (vedi Tabella dei materiali), creare una ferita a tutto spessore di 1 cm di diametro sulla pelle dorsale.
- Risospendere le EV derivate da MSC da due piatti in 100 μL di PBS e somministrare l'iniezione nello strato sottocutaneo del letto della ferita, attorno a ciascuna ferita con quattro siti.
NOTA: viene iniettata una media di 100 μg di EV per topo (EV da due capsule di cellule da 10 cm). Sono necessari dieci piatti da 10 cm di MSC per produrre abbastanza EV per impostare un esperimento di n = 5 in un modello murino. - Dopo il trattamento, avvolgere i topi con una garza sterile e posizionarli su tamponi termoisolanti (vedi Tabella dei materiali) fino al loro risveglio.
- Assicurarsi che i topi non siano lasciati incustoditi fino a quando non hanno riacquistato sufficiente coscienza. Non restituire i topi alla compagnia di altri animali fino a quando non si sono completamente ripresi.
- Somministrare ulteriori dosi di analgesia il giorno 2 e il giorno 3 post-operatorio, se necessario.
- Eseguire l'iniezione sistemica.
- Risospendere le EV derivate da MSC in 200 μL di PBS e quindi miscelare con soluzione di eparina in un rapporto di volume 10: 1.
- Posizionare i topi nel sistema di imaging della vena caudale (vedere Tabella dei materiali). Premere l'interruttore per sollevare la leva.
- Disinfettare la vena caudale usando un tampone imbevuto di alcool prima dell'iniezione endovenosa. Quindi, iniettare sistematicamente i topi con la sospensione preparata al punto 6.2.1 attraverso la vena caudale. La procedura è aiutata da un illustratore di vene della coda.
NOTA: Iniettare la sospensione EV immediatamente dopo la miscelazione con eparina. Viene iniettata una media di 100 μg EV per topo (EV da due capsule di cellule da 10 cm). Sono necessari dieci piatti da 10 cm di MSC per produrre abbastanza EV per impostare un esperimento di n = 5 in un modello murino.
ATTENZIONE: L'iniezione della vena della coda di topo è solitamente limitata a 200 μl di volume. L'iniezione deve andare lentamente e fermarsi se si vede un urto o resistenza, che suggerisce che l'ago è fuori dalla vena. Se i topi mostrano segni clinici avversi come arricciamento e tremore, questa potrebbe essere una risposta shock all'iniezione ad alto volume, all'iniezione rapida o alla tossicità / anafilassi.
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Representative Results
MV ed Exos da UCMSC umani in coltura vengono isolati seguendo il flusso di lavoro sperimentale (Figura 1). I risultati NTA dimostrano che la dimensione di Exos da MSC umane varia da 40 nm a 335 nm con una dimensione di picco di circa 100 nm, e la dimensione delle MV varia da 50 nm a 445 nm con una dimensione di picco di 150 nm (Figura 2). La caratterizzazione morfologica degli Exos derivati da MSC mostra una tipica forma a coppa (Figura 3). I veicoli elettrici sono marcati in modo efficiente da PKH26, che è osservato sia dalla vista grossolana come pellet marcati che dalla microscopia fluorescente (Figura 4). Le iniezioni locali e sistemiche di EV derivate da MSC vengono eseguite intorno alla ferita cutanea o attraverso la vena caudale (Figura 5). Pertanto, gli Exos e gli MV vengono isolati con successo e applicati per esperimenti successivi.
Figura 1: Isolamento di MV ed Exos da MSC umane in coltura. Vengono raccolti terreni di coltura e viene eseguita la centrifugazione differenziale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Analisi NTA di Exos e MV da MSC. Viene rappresentata la distribuzione granulometrica con immagini rappresentative. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Caratterizzazione morfologica di Exos da MSC mediante TEM. Vengono visualizzati Exos a forma di coppa. Barre scala: 200 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Etichettatura delle MV derivate da MSC mediante PKH26. I pellet MV marcati con PKH26 sono grossolanamente osservati e visualizzati al microscopio fluorescente. Barra scala: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Somministrazione di EV derivati da MSC. (A) Trapianto locale intorno alla ferita cutanea e (B) Iniezione sistemica attraverso la vena caudale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Le EV stanno emergendo per svolgere un ruolo importante in diverse attività biologiche, tra cui la presentazione dell'antigene, il trasporto di materiale genetico, la modifica del microambiente cellulare e altri. Inoltre, la loro ampia applicazione offre nuovi approcci e opportunità per la diagnosi e il trattamento delle malattie21. L'implementazione delle applicazioni terapeutiche delle EV si basa sul successo dell'isolamento e della caratterizzazione. Tuttavia, a causa della mancanza di metodi di isolamento e purificazione standardizzati e della bassa efficienza di estrazione, la ricerca sui veicoli elettrici è stata ostacolata. Questo articolo introduce principalmente un protocollo di estrazione e caratterizzazione facilmente fattibile di EV da MSC umane in coltura e ulteriori applicazioni, che possono essere etichettate e utilizzate per promuovere la riparazione dei tessuti tramite iniezione locale e trattare le malattie sistemiche mediante iniezione endovenosa. La riproducibilità delle MSC per l'isolamento EV è preservata utilizzando l'origine neonatale delle UCMSC, la coltura standard di cellule e nessun passaggio tardivo. Sebbene i termini Exos e MV siano rispettivamente utilizzati in questo manoscritto per riferirsi alle EV raccolte dalle velocità di centrifugazione differenziale, saranno necessari ulteriori saggi negli studi futuri per distinguere le loro origini, come raccomandato dalla linea guida Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles (MISEV2018)22 , ad esempio mediante imaging di cellule vive per l'osservazione del processo di produzione e microscopio immunoelettronico per rilevare i marcatori specifici. Nel complesso, il metodo è semplice e quindi facilmente scalabile e riproducibile, il che sarà utile al campo.
Nel presente studio, le EV fisiologiche delle MSC vengono progressivamente separate in MV ed Exos mediante centrifugazione differenziale e ultracentrifugazione. Qui, viene sottolineata l'importanza di sostituire α-MEM integrato con FBS impoverito EV al 20% per la raccolta del terreno di coltura. Questo passaggio garantisce che i veicoli elettrici estratti derivino solo da MSC, escludendo la possibilità che i veicoli elettrici possano provenire da altre sostanze interferenti. È inoltre fondamentale miscelare la soluzione di eparina al 10% nella soluzione EV prima dell'iniezione sistemica. Negli ultimi anni, diversi studi hanno dimostrato che le EV hanno un effetto procoagulante, quindi l'aggiunta di eparina durante l'iniezione sistemica è necessaria per evitare la formazione di trombo dopo l'iniezione, che altrimenti porta alla letalità acuta dei topi23. Durante l'implementazione del protocollo potrebbero verificarsi alcuni problemi che richiedono la risoluzione dei problemi. Per un esempio importante, se la quantità di estrazione di EV non è sufficiente, i ricercatori dovrebbero risalire alla fase di raccolta del surnatante cellulare. Durante la raccolta del surnatante le cellule devono essere soffiate uniformemente per raccogliere completamente le EV rilasciate trattenute nella matrice extracellulare delle MSC. Un altro potenziale fallimento si verifica quando i topi muoiono subito dopo l'iniezione di EV. Oltre all'aggiunta di eparina prima dell'iniezione, come menzionato sopra, è necessario regolare la concentrazione di EV iniettati (una media di 100 μg EV per topo). Per verificare il successo dell'iniezione, è possibile eseguire l'imaging in vivo della biodistribuzione di EV marcati con fluorescenza o sezioni congelate di specifici siti tissutali di attecchimento (fegato, milza, ecc.), che è stato precedentemente riportato24. Inoltre, si raccomanda di utilizzare i veicoli elettrici il prima possibile dopo l'isolamento e lo stoccaggio congelato causerà perdita di particelle, riduzione della purezza e fenomeni di fusione che portano a particelle artefattuali25. Inoltre, l'etichettatura PKH26 comunemente adottata aumenterà la dimensione EV26 e altri metodi di etichettatura possono essere utilizzati per il confronto.
I protocolli esistenti per l'isolamento delle EV sono principalmente riportati come segue: ultracentrifugazione differenziale e a gradiente di densità9, processo di ultrafiltrazione 10, separazione immunomagnetica11, cromatografo ad esclusione molecolare 12, chip microfluidico 13 e tecnologia di precipitazione a base polimerica27. Rispetto all'ultracentrifugazione, il processo di ultrafiltrazione è un metodo di estrazione conveniente e favorisce l'arricchimento di EV in campioni di volume maggiore 9,10, mentre lo svantaggio è che c'è inquinamento da membrana, che è facile causare la perdita di campioni. La separazione immunomagnetica è adatta per separare diversi sottotipi di EV e gli EV ottenuti hanno un'elevata purezza. Lo svantaggio di questo metodo è l'alto costo con bassa resa11. Gli EV separati dal cromatografo di esclusione molecolare hanno un'elevata purezza e un'alta resa. Lo svantaggio è che è necessaria un'attrezzatura speciale che non può essere utilizzata per più campioni contemporaneamente12. I chip microfluidici hanno requisiti elevati per materiali e tecnologia, con costi elevati, ed è difficile elaborare campioni di grandi dimensioni13. I veicoli elettrici separati dalla tecnologia di precipitazione a base polimerica contengono contaminanti non EV che influenzeranno l'attività dei veicoli elettrici14. Tra questi, la centrifugazione differenziale e l'ultracentrifugazione sono ancora il metodo più utilizzato per la separazione e la purificazione dei veicoli elettrici ed è considerato il gold standard per l'estrazione MSC-EV. La separazione e l'arricchimento dei veicoli elettrici dai terreni di coltura MSC sono ottenuti passo dopo passo attraverso la combinazione di diversi tempi e velocità di centrifugazione, che rappresenta un metodo ottimizzato. È da notare che Exos e MV isolati in questo manoscritto hanno distribuzioni di dimensioni simili, sebbene le MV tendano ad essere più grandi, il che potrebbe essere dovuto alla centrifugazione differenziale che tende a indurre l'aggregazione di nanoparticelle. Sebbene i metodi modificati possano funzionare meglio nel mantenimento delle dimensioni dei veicoli elettrici, la centrifugazione differenziale è vantaggiosa in termini di alta efficienza per la separazione dei veicoli elettrici28. Sebbene per la produzione su larga scala di veicoli elettrici e la produzione di GMP, questo metodo sia limitato dalla quantità di supporti che possono essere elaborati in un ciclo di isolamento, il sistema tecnico è facile da configurare ed è stato applicato da progetti traslazionali su animali di grossa taglia29,30. In ogni caso, i metodi di separazione di cui sopra hanno i loro vantaggi e svantaggi e i ricercatori possono scegliere il metodo appropriato in base alle diverse fonti di EV e allo scopo della ricerca.
Negli ultimi anni, le EV hanno mostrato un grande potenziale in applicazioni cliniche, come la diagnosi della malattia31, il trattamento e come portatori di somministrazione di farmaci32,33. Sulla base delle loro proprietà vantaggiose, vari paesi hanno ampiamente studiato le EV come agenti terapeutici. A questo proposito, sono stati condotti studi sulle EV nel trattamento della malattia e sul meccanismo alla base del ruolo delle EV nella patogenesi della malattia. L'attuale protocollo di isolamento, caratterizzazione e applicazione terapeutica delle EV da MSC in coltura è stato ben applicato. Ad esempio, la somministrazione locale di MSC-Exos nelle ferite cutanee promuove la guarigione mediante modulazione infiammatoria e l'iniezione di vene della coda di EV derivate da MSC può migliorare la resistenza epatica all'insulina e la steatosi nel diabete mellito di tipo 224. Inoltre, le applicazioni terapeutiche che comportano una maggiore resa e purezza delle MSC-EV sono all'orizzonte per fornire strategie traslazionali fattibili.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (32000974, 81930025 e 82170988) e della China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 e BX20190380). Siamo grati per l'assistenza del National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU) e del Analytical and Testing Central Laboratory of Military Medical Innovation Center dell'Air Force Medical University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
| Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
| Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
| Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
| Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
| Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
| Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
| Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
| Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
| PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
| Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
| Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
| Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
| Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
| Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
| Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
| UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
| Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
| Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |
References
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