Summary
В настоящем протоколе описывается дифференциальное центрифугирование для выделения и характеристики репрезентативных ВВ (экзосом и микровезикул) из культивируемых МСК человека. Дальнейшее применение этих электромобилей также объясняется в этой статье.
Abstract
Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой гетерогенные мембранные наночастицы, высвобождаемые большинством типов клеток, и они все чаще признаются физиологическими регуляторами гомеостаза организма и важными индикаторами патологий; В то же время появляется их огромный потенциал для создания доступных и контролируемых методов лечения заболеваний. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) могут высвобождать большое количество EV в культуре, что обещает ускорить эффективную регенерацию тканей и облегчить обширное терапевтическое применение с хорошей масштабируемостью и воспроизводимостью. Существует растущий спрос на простые и эффективные протоколы для сбора и применения MSC-EV. Здесь представлен подробный протокол, основанный на дифференциальном центрифугировании, для выделения и характеристики репрезентативных EV из культивируемых человеческих МСК, экзосом и микровезикул для дальнейшего применения. Показана адаптивность этого метода для ряда последующих подходов, таких как маркировка, местная трансплантация и системная инъекция. Реализация этой процедуры позволит удовлетворить потребность в простом и надежном сборе и применении MSC-EV в трансляционных исследованиях.
Introduction
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные плюрипотентные клетки со способностью к самообновлению и трансляционным потенциалом1. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) легко выделяются, культивируются, расширяются и очищаются в лаборатории, что остается характерным для стволовых клеток после многократного прохождения. В последние годы появляется все больше данных, подтверждающих мнение о том, что МСК действуют в паракринном режиме при терапевтическом использовании 2,3. В частности, секреция внеклеточных везикул (ВВ) играет решающую роль в опосредовании биологических функций МСК. Как гетерогенные мембранные наночастицы, высвобождаемые из большинства типов клеток, EV состоят из подкатегорий, называемых экзосомами (Exos), микровезикулами (MV) и даже более крупными апоптотическими телами 4,5. Среди них наиболее широко изученным ЭВ размером 40-150 нм является Exos, который имеет эндосомальное происхождение и активно секретируется в физиологических условиях. МВ образуются путем осыпания непосредственно с поверхности клеточной плазматической мембраны диаметром 100-1000 нм, которые характеризуются высокой экспрессией фосфатидилсерина и экспрессией поверхностных маркеров донорскихклеток6. EV содержат РНК, белки и другие биологически активные молекулы, которые имеют функции, аналогичные родительским клеткам, и играют важную роль в клеточной коммуникации, иммунном ответе и восстановлении повреждений тканей7. MSC-EV широко исследовались как мощный бесклеточный терапевтический инструмент в регенеративной медицине8.
Выделение и очистка электромобилей, полученных из MSC, является распространенной проблемой в области исследований и применения. В настоящее время дифференциальное ультрацентрифугирование и градиентплотности 9, процессультрафильтрации 10, иммуномагнитная сепарация11, хроматограф 12 молекулярного исключения и микрофлюидный чип13 широко используются при выделении и очистке электромобилей. Учитывая преимущества и недостатки каждого подхода, количество, чистота и активность собранных электромобилей не могут быть удовлетворены одновременно14,15. В настоящем исследовании подробно показан протокол дифференциального центрифугирования выделения и характеристики ЭВ из культивируемых МСК, который поддерживает эффективное терапевтическое использование 16,17,18,19,20. Далее была показана адаптивность этого метода к ряду последующих подходов, таких как флуоресцентная маркировка, местная трансплантация и системная инъекция. Реализация этой процедуры позволит удовлетворить потребность в простом и надежном сборе и применении MSC-EV в трансляционных исследованиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Четвертого военно-медицинского университета и выполнены в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Использовались восьминедельные мыши C57Bl / 6 (без предпочтения ни самок, ни самцов). Криоконсервированные МСК, полученные из пуповины человека (UCMSC), используемые для настоящего исследования, были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Использование клеток человека было одобрено Комитетом по этике Четвертого военно-медицинского университета.
1. Культура мезенхимальных стволовых клеток человека (МСК)
- Подготовьте принадлежности и растворы, необходимые для экспериментальной работы, включая пипетки, наконечники для пипеток, чашку Петри 10 см, термостатическое оборудование (водяная баня), резиновые перчатки, 75% спирт, питательную среду (инкубированную при 37 °C), смертельную бычью сыворотку (FBS) и 100-кратный раствор пенициллина-стрептомицина (P/S) (см. Таблицу материалов).
- Подготовьте коммерчески доступную альфа-минимальную эссенциальную среду (α-MEM), добавив 20% FBS и 1% P/S.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавьте все растворы, используемые для выделения и анализа электромобилей, в сверхчистой фильтрованной воде, изготовленной системой очистки сверхчистой фильтрованной воды (см. Таблицу материалов). - Извлеките криоконсервированные МСК, полученные из пуповины человека (UCMSCs), из жидкого азота, расплавив их на водяной бане с температурой 37 °C.
- Быстро и аккуратно перенесите расплавленную клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл с 5 мл питательной среды (этап 1.2). Центрифуга при 4 °C, 500 x g в течение 5 мин.
- Удалите надосадочную жидкость стерильной пипеткой и удерживайте клеточный осадок. Добавьте 2 мл питательной среды в центрифужную пробирку и осторожно ресуспендируйте клетки.
- Засейте клетки в 10-сантиметровую чашку Петри и добавьте 8 мл питательной среды в общей сложности 10 мл.
- Культивирование МСК при 37 °C в 5%CO2 в клеточном инкубаторе.
2. Дифференциальное центрифугирование для выделения экзо и мв
- Когда МСК вырастут до >90% слияния, замените питательную среду α-MEM с добавлением 20% FBS, обедненного EV, и 1% P/S для 8 мл каждого блюда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифуга FBS при 4 °C, 1 50 000 x г в течение ночи для удаления EV и других примесей. - После 48 ч культивирования соберите питательную среду (этап 2.1) в центрифужные пробирки объемом 50 мл.
- Центрифугируйте питательную среду MSC при 4 °C, 800 x g в течение 10 мин.
- Удалите фрагменты клеток и клеточный мусор, перенеся надосадочную жидкость в чистые конические трубки объемом 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование конических трубок объемом 1,5 мл необходимо для увеличения выхода EV. - Центрифугируйте надосадочную жидкость при 4 °C, 16 000 x g в течение 30 мин. Гранулы представляют собой MV. MV из каждой чашки ячеек ресуспендировали с 50 мкл PBS.
- Перенесите надосадочную жидкость, полученную центрифугированием на шаге 2.5, с помощью пипетки в чистые ультрацентрифужные пробирки. Центрифуга при 1 50 000 x g в течение 2 ч при 4 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость и соберите остаток, которым является Exos. Ресуспендирование Exos из семи чашек клеток в 50 мкл PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: UCMSC шестого прохода используются для изоляции электромобилей. Чтобы получить достаточное количество MV и Exos для экспериментального использования, обычно требуется 7-8 тарелок культивируемых клеток. Образцы EV сразу же используются для следующих этапов определения характеристик или для терапевтического применения, которое лучше не хранить.
ВНИМАНИЕ: Избегайте повторного замораживания и оттаивания электромобилей, и лучше всего хранить электромобили при температуре 4 ° C в краткосрочной перспективе, а не при -80 ° C.
3. Детектирование количества частиц и распределения EV по размерам из МСК
ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки распределения по размерам анализ отслеживания наночастиц (NTA) выполняется с помощью коммерчески доступного анализатора отслеживания наночастиц (см. Таблицу материалов).
- Разбавьте 1 мкл EV (начиная с шага 2.5 и шага 2.7) в 1,499 мкл PBS и перемешайте достаточное количество в пробирке объемом 15 мл.
- Используйте анализатор слежения в соответствии с инструкциями производителя. Во-первых, запустите совместимое программное обеспечение (см. Таблицу материалов).
- Заполните ячейку для образцов дистиллированной водой, а затем дайте прибору начать проверку ячейки.
- Откалибруйте прибор приготовленным стандартным раствором. Убедитесь, что количество частиц, отображаемое на интерфейсе обнаружения программного обеспечения, составляет от 50 до 400 (предпочтительно около 200). Нажмите кнопку ОК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте стандартный раствор, восстановив 1 мкл калибровочного раствора (см. Таблицу материалов) в 1 мл дистиллированной воды для получения первичного раствора, а затем возьмите 100 мкл первичного раствора и добавьте 25 мл дистиллированной воды для приготовления стандартного раствора (1:250 000). Храните этот рабочий реагент при температуре 4 °C в течение недели. - Промойте ячейку образца 5 мл дистиллированной воды.
- Перед анализом пробы промойте канал 1 мл дистиллированной воды. Убедитесь, что количество частиц, отображаемое в интерфейсе обнаружения программного обеспечения, меньше 10.
- Введите 1 мл образца EV, приготовленного на шаге 3.1. Выполните тест на везикулы в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.
ВНИМАНИЕ: Образец и дистиллированная вода вводятся шприцем объемом 1 мл с постоянной скоростью 0,5 мл / с под тщательным ручным контролем.
4. Характеристика морфологии ЭВ с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ)
- Разбавьте 1 мкл EV с шага 2.7 в 199 мкл PBS и достаточно перемешайте. Добавьте 20 мкл капель суспензии EV в квадратную сетку с формваром/углеродным покрытием (см. Таблицу материалов) и оставьте на 3 минуты.
- Удалите лишнюю жидкость небольшой фильтровальной бумагой и оставьте на 15 секунд, чтобы поверхность слегка подсохла.
- Отрицательно окрашивают образцы EV каплями фосфовольфрамовой кислоты 1,5% в течение 40 с.
- Удалите излишки фосфовольфрамовой кислоты и дайте ей постоять 15 с, чтобы слегка подсушить поверхность.
- Поместите образец, содержащий квадратную сетку с формваром/углеродным покрытием, в чистую посуду, покрытую фильтровальной бумагой. Наблюдайте и захватывайте изображения с помощью просвечивающего электронного микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом процессе в качестве примера берутся Exos.
5. Маркировка электромобилей, полученных из MSC
- После экстракции EVs (этап 2.5) ресуспендировать 250 мкл PBS в конической пробирке объемом 1,5 мл.
- Используйте еще одну коническую трубку объемом 1,5 мл для приготовления рабочего раствора красителя PKH26; используйте 1 мкл маркирующего реагента PKH26, разбавленного 250 мкл разбавителя C (компонент коммерчески доступного набора для маркировки EV, используемого для настоящего исследования, см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте рабочий раствор непосредственно перед использованием.
ВНИМАНИЕ: Чрезмерное использование красителя PKH26 или маркировка без предварительного разбавления могут повредить электромобили. - Смешайте ресуспендированные электромобили с рабочим раствором. Дайте ему постоять при комнатной температуре в течение 5 минут, а затем добавьте 500 мкл FBS, обедненного EV, чтобы остановить реакцию.
- Для MV центрифугу при 4 °C, 16 000 x g в течение 30 мин, и выбросьте надосадочную жидкость пипеткой. Добавьте 1 мл PBS, чтобы смыть остатки.
- Центрифугу при 4 °C, 16 000 x g в течение 30 мин, и выбросьте надосадочную жидкость, чтобы удалить несвязанный краситель.
- Ресуспендировать остаток 200 мкл PBS. Капните 20 мкл суспензии на предметное стекло и наблюдайте ее под флуоресцентным микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом процессе в качестве примера берутся MV.
6. Местная трансплантация и системная инъекция МСК-ЭВ
ПРИМЕЧАНИЕ: Для следующих процедур поместите электромобили на лед перед впрыском.
- Выполните местную трансплантацию, выполнив следующие действия.
- Обезболивают мышей 4% (об./об.) изофлураном. Поддерживайте анестезию на уровне 1-3% изофлурана во время процедуры.
- Перед операцией введите 5 мг / кг карпрофена (IP) для обезболивания, чтобы свести к минимуму постпроцедурную боль.
- Перед иссечением раны сбрейте дорсальные волосы и стерилизуйте дорсальную поверхность, применяя 3 чередующихся раунда 10% повидон-йода и 75% этанола.
- С помощью пуансона биопсии (см. Таблицу материалов) создайте рану на всю толщину диаметром 1 см на спинной коже.
- Ресуспендируют ЭВ, полученные из МСК, из двух чашек в 100 мкл PBS и вводят инъекцию в подкожный слой раневого ложа, вокруг каждой раны с четырьмя участками.
ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем на мышь вводят 100 мкг ЭВ (ЭВ из двух 10-сантиметровых тарелок клеток). Десять 10-сантиметровых тарелок MSC необходимы для получения достаточного количества EV для проведения эксперимента n = 5 в мышиной модели. - После обработки оберните мышей стерильной марлей и поместите их на теплоизоляционные прокладки (см. Таблицу материалов) до тех пор, пока они не проснутся.
- Следите за тем, чтобы мыши не оставались без присмотра, пока они не восстановят достаточное сознание. Не возвращайте мышей в компанию других животных до тех пор, пока они полностью не выздоровеют.
- При необходимости вводите дополнительные дозы анальгезии на 2-й и 3-й день после операции.
- Выполняют системную инъекцию.
- Ресуспендируют электромобили, полученные из МСК, в 200 мкл PBS, а затем смешивают с раствором гепарина в объемном соотношении 10:1.
- Поместите мышей в систему визуализации каудальной вены (см. Таблицу материалов). Нажмите переключатель, чтобы поднять рычаг.
- Перед внутривенной инъекцией продезинфицируйте хвостовую вену спиртовой прокладкой. Затем систематически вводят мышам суспензию, приготовленную на шаге 6.2.1, через хвостовую вену. В процедуре помогает иллюстратор хвостовой вены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вводите суспензию EV сразу после смешивания с гепарином. Вводится в среднем 100 мкг ЭВ на мышь (ЭВ из двух 10-сантиметровых чашек клеток). Десять 10-сантиметровых тарелок MSC необходимы для получения достаточного количества EV для проведения эксперимента n = 5 в мышиной модели.
ВНИМАНИЕ: Инъекция в вену хвоста мыши обычно ограничена объемом 200 мкл. Инъекция должна идти медленно и прекратиться, если вы видите удар или сопротивление, что говорит о том, что игла вышла из вены. Если мыши проявляют неблагоприятные клинические признаки, такие как скручивание и дрожь, это может быть шоковой реакцией на инъекцию большого объема, быструю инъекцию или токсичность / анафилаксию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MV и Exos из культивируемых UCMSC человека выделяют в соответствии с экспериментальным рабочим процессом (рис. 1). Результаты NTA показывают, что размер экзо из МСК человека колеблется от 40 нм до 335 нм с пиковым размером около 100 нм, а размер MV колеблется от 50 нм до 445 нм с пиковым размером 150 нм (рис. 2). Морфологическая характеристика экзосов, полученных из МСК, демонстрирует типичную форму чашечки (рис. 3). EV эффективно маркируются PKH26, что наблюдается как при грубом виде меченых гранул, так и при флуоресцентной микроскопии (рис. 4). Местные и системные инъекции ЭВ, полученных из МСК, выполняются вокруг кожной раны или через каудальную вену (рис. 5). Таким образом, Exos и MV успешно выделены и применены для последующих экспериментов.
Рисунок 1: Выделение MV и Exos из культивируемых МСК человека. Собирают питательные среды и проводят дифференциальное центрифугирование. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: NTA-анализ экзо и MV из MSC. Показано распределение частиц по размерам с репрезентативными изображениями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Морфологическая характеристика экзо из МСК с помощью ПЭМ. Отображаются чашеобразные экзосы. Масштабные линейки: 200 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Маркировка MV, полученных из MSC, методом PKH26. Гранулы MV, меченные PKH26, тщательно наблюдаются и просматриваются под флуоресцентным микроскопом. Масштабная линейка: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Управление электромобилями, полученными из MSC. (А) Местная трансплантация вокруг кожной раны и (Б) Системная инъекция через каудальную вену. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Электромобили начинают играть важную роль в различных биологических активностях, включая презентацию антигена, транспорт генетического материала, модификацию микроокружения клеток и другие. Кроме того, их широкое применение открывает новые подходы и возможности для диагностики и лечения заболеваний21. Реализация терапевтических применений ЭВ основана на успешном выделении и характеристике. Однако из-за отсутствия стандартизированных методов выделения и очистки, а также низкой эффективности экстракции исследования электромобилей были затруднены. В этой статье в основном представлен легко осуществимый протокол экстракции и характеристики ВВ из культивируемых МСК человека и дальнейшие применения, которые могут быть помечены и использованы для стимулирования восстановления тканей с помощью местной инъекции и лечения системных заболеваний путем внутривенной инъекции. Воспроизводимость МСК для выделения ВВ сохраняется за счет использования неонатального происхождения УКМСК, стандартной культуры клеток и отсутствия поздних пассажей. Хотя термины «экзо» и «MV» соответственно используются в этой рукописи для обозначения ВВ, собранных с дифференциальных скоростей центрифугирования, в будущих исследованиях потребуются дополнительные анализы, чтобы различать их происхождение, как рекомендовано в руководстве «Минимальная информация для исследований внеклеточных везикул» (MISEV2018)22 , например, с помощью визуализации живых клеток для наблюдения за производственным процессом и иммуноэлектронного микроскопа для обнаружения специфических маркеров. В целом, метод прост и, следовательно, легко масштабируется и воспроизводим, что будет полезно для этой области.
В настоящем исследовании физиологические ВВ из МСК постепенно разделяются на MV и Exos путем дифференциального центрифугирования и ультрацентрифугирования. Здесь подчеркивается значимость замены α-MEM с добавлением 20% EV-обедненного FBS для сбора питательной среды. Этот шаг гарантирует, что извлеченные EV получены только из МСК, исключая возможность того, что EV могут быть получены из других мешающих веществ. Также очень важно смешать 10% раствор гепарина с раствором EV перед системной инъекцией. В последние годы несколько исследований показали, что ЭВ обладают прокоагулянтным действием, поэтому добавление гепарина во время системной инъекции необходимо, чтобы избежать образования тромба после инъекции, что в противном случае приводит к острой летальности мышей23. Во время реализации этого протокола могут возникнуть некоторые проблемы, требующие устранения неполадок. Например, если количество экстракции EV недостаточно, исследователи должны проследить его до этапа сбора надосадочной жидкости клетки. Во время надосадочной сборки клетки должны быть равномерно продуты, чтобы полностью собрать высвобожденные ВВ, удерживаемые во внеклеточном матриксе МСК. Другой потенциальный сбой возникает, когда мыши умирают вскоре после инъекции электромобилей. Помимо добавления гепарина перед инъекцией, как упоминалось выше, необходимо регулировать концентрацию вводимых EV (в среднем 100 мкг EV на мышь). Для проверки успешности инъекции может быть выполнена визуализация in vivo биораспределения меченных флуоресценцией ВВ или замороженных участков конкретных тканевых участков приживления (печень, селезенка и т. д.), о чем ранее сообщалось24. Кроме того, электромобили рекомендуется использовать как можно скорее после изоляции, а замораживание приведет к потере частиц, снижению чистоты и явлениям плавления, приводящим к образованию артефактных частиц25. Кроме того, общепринятая маркировка PKH26 увеличит размер EV26, и для сравнения можно использовать другие методы маркировки.
О существующих протоколах изоляции электромобилей в основном сообщается следующим образом: дифференциальное ультрацентрифугирование и ультрацентрифугирование с градиентомплотности 9, процессультрафильтрации 10, иммуномагнитная сепарация11, хроматограф 12 молекулярного исключения, микрофлюидный чип13 и технология осаждения на основе полимеров27. По сравнению с ультрацентрифугированием процесс ультрафильтрации является удобным методом экстракции и способствует обогащению EV в образцахбольшего объема 9,10, в то время как недостатком является загрязнение мембраны, что легко вызывает потерю образца. Иммуномагнитная сепарация подходит для разделения различных подтипов ЭВ, а полученные ЭВ имеют высокую чистоту. Недостатком этого способа является высокая стоимость при низкой урожайности11. EV, разделенные хроматографом молекулярного исключения, имеют высокую чистоту и высокий выход. Недостатком является то, что требуется специальное оборудование, которое не может быть использовано для нескольких образцов одновременно12. Микрофлюидные чипы предъявляют высокие требования к материалам и технологиям, имеют высокую стоимость, и трудно обрабатывать большие образцы13. Электромобили, разделенные с помощью технологии осаждения на основе полимеров, содержат загрязняющие вещества, не относящиеся к электромобилям, которые будут влиять на активность электромобилей14. Среди них дифференциальное центрифугирование и ультрацентрифугирование по-прежнему являются наиболее широко используемым методом разделения и очистки электромобилей и считаются золотым стандартом экстракции MSC-EV. Отделение и обогащение ЭВ из питательных сред МСК достигается шаг за шагом за счет сочетания различных времен и скоростей центрифугирования, что представляет собой оптимизированный метод. Примечательно, что экзо и MV, выделенные в этой рукописи, имеют сходное распределение по размерам, хотя MV, как правило, больше, что может быть связано с дифференциальным центрифугированием, которое имеет тенденцию индуцировать агрегацию наночастиц. Несмотря на то, что модифицированные методы могут работать лучше при поддержании размера электромобилей, дифференциальное центрифугирование является преимуществом высокой эффективности для разделенияэлектромобилей 28. Хотя для крупномасштабного производства электромобилей и производства GMP этот метод ограничен количеством сред, которые могут быть обработаны за один изолированный прогон, техническая система проста в настройке и применяется трансляционными проектами на крупных животных29,30. В любом случае, вышеуказанные методы разделения имеют свои преимущества и недостатки, и исследователи могут выбрать подходящий метод в соответствии с различными источниками электромобилей и целью исследования.
В последние годы электромобили продемонстрировали большой потенциал в клинических применениях, таких как диагностиказаболеваний 31, лечение и в качестве носителей доставки лекарств32,33. Основываясь на их полезных свойствах, различные страны широко изучали электромобили в качестве терапевтических средств. В связи с этим были проведены исследования ВВ в лечении заболеваний и механизма, лежащего в основе роли ВВ в патогенезе заболевания. Текущий протокол выделения, характеристики и терапевтического применения ВВ из культивируемых МСК хорошо применяется. Например, местная доставка MSC-Exos в кожные раны способствует заживлению путем модуляции воспаления, а инъекция в хвостовые вены EV, полученных из MSC, может улучшить резистентность к инсулину в печени и стеатоз при сахарном диабете24 типа. Кроме того, терапевтические приложения, связанные с повышенным выходом и чистотой MSC-EV, находятся на горизонте, чтобы обеспечить осуществимые трансляционные стратегии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (32000974, 81930025 и 82170988) и Китайского фонда постдокторантуры (2019M663986 и BX20190380). Мы благодарны за помощь Национальному экспериментально-учебно-демонстрационному центру фундаментальной медицины (АМФУ) и Аналитической и испытательной центральной лаборатории Военно-медицинского инновационного центра Медицинского университета ВВС.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
| Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
| Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
| Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
| Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
| Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
| Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
| Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
| Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
| PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
| Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
| Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
| Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
| Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
| Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
| Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
| UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
| Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
| Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |
References
- Liu, S., et al. The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619 (2020).
- Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S. The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair. Journal of Cellular Physiology. 218 (2), 237-245 (2009).
- Zhou, Y., Yamamoto, Y., Xiao, Z., Ochiya, T. The immunomodulatory functions of mesenchymal stromal/stem cells mediated via paracrine activity. Journal of Clinical Medicine. 8 (7), 1025 (2019).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).
- Lei, L. M., et al.
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols In Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3 22 (2006).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3175-3180 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Liu, S., et al. MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus. Cell Metabolism. 22 (4), 606-618 (2015).
- Deng, C. L., et al. Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal MiR-21 as a therapeutic for retinal degeneration. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 1041-1061 (2021).
- Wu, M., et al. SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling. Cell Proliferation. 54 (7), 13074 (2021).
- Qiu, X., et al. Exosomes released from educated mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing via promoting angiogenesis. Cell Proliferation. 53 (8), 12830 (2020).
- He, X., et al. MSC-derived exosome promotes M2 polarization and enhances cutaneous wound healing. Stem Cells International. 2019, 7132708 (2019).
- Cheng, L., Hill, A. F.
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Nielsen, T., et al. Extracellular vesicle-associated procoagulant phospholipid and tissue factor activity in multiple myeloma. PLoS One. 14 (1), 0210835 (2019).
- Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
- Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
- Williams, A. M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).
- Li, Z., et al. Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).
- Nozaki, T., et al. Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).
- Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274 (2019).
- Kumar, A., et al. High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance. Nature Communications. 12 (1), 213 (2021).
