Este protocolo describe una metodología para evaluar la función de los canales iónicos activados mecánicamente en células uroteliales nativas utilizando el sensor fluorescente de Ca2+ GCaMP5G.
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Artículo de método
Ex Vivo Análisis de transitorios de Ca2+ activados mecánicamente en células uroteliales
En este artículo
Resumen
Resumen
Los canales iónicos activados mecánicamente son transductores biológicos que convierten estímulos mecánicos como las fuerzas de estiramiento o cizallamiento en señales eléctricas y bioquímicas. En los mamíferos, los canales activados mecánicamente son esenciales para la detección de estímulos externos e internos en procesos tan diversos como la sensación táctil, la audición, la regulación del volumen de glóbulos rojos, la regulación de la presión arterial basal y la sensación de plenitud de la vejiga urinaria. Si bien la función de los canales iónicos activados mecánicamente se ha estudiado ampliamente en el entorno in vitro utilizando la técnica patch-clamp, evaluar su función en su entorno nativo sigue siendo una tarea difícil, a menudo debido al acceso limitado a los sitios de expresión de estos canales (por ejemplo, terminales aferentes, células de Merkel, barorreceptores y túbulos renales) o dificultades para aplicar la técnica patch-clamp (p. ej., las superficies apicales de las células paraguas uroteliales). Este protocolo describe un procedimiento para evaluar transitorios de Ca 2+ evocados mecánicamente utilizando el sensor fluorescente GCaMP5G en una preparación urotelial ex vivo, una técnica que podría adaptarse fácilmente para el estudio de eventos de Ca2+ evocados mecánicamente en otras preparaciones de tejidos nativos.
Introducción
Las células epiteliales en el tracto urinario están sujetas a fuerzas mecánicas a medida que el filtrado urinario viaja a través de las nefronas, y la orina se bombea fuera de la pelvis renal y viaja a través de los uréteres para almacenarse en la vejiga urinaria. Se ha reconocido desde hace mucho tiempo que las fuerzas mecánicas (por ejemplo, esfuerzo cortante y estiramiento) ejercidas por los fluidos sobre las células epiteliales que recubren el tracto urinario regulan la reabsorción de proteínas en el túbulo proximal y de solutos en la nefrona distal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11
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Protocolo
El cuidado y manejo de los animales se llevó a cabo de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh. Para el presente estudio se utilizaron ratones hembra C57Bl/6J de 2-4 meses de edad. Los ratones se obtuvieron comercialmente (ver Tabla de Materiales).
1. Montaje y configuración del equipo
- Realice imágenes de Ca2+ con un microscopio vertical equipado con una cámara de alta resolución y una fuente de luz estable (consulte la Tabla de materiales).
- Adquiera las imágenes con un software compatible con microscopio q....
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Resultados
El presente protocolo describe una técnica para evaluar transitorios de Ca 2+ evocados mecánicamente en células paraguas utilizando el sensor fluorescente de Ca2+ GCaMP5G. La transducción adenoviral se empleó para expresar GCaMP5G en células uroteliales debido a su alta eficiencia y porque produce un elevado nivel de expresión. Las imágenes fluorescentes de criosecciones teñidas de una vejiga transducida se muestran en la Figura 2D. Para estos experimentos, la expresión.......
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Discusión
Todos los organismos, y aparentemente la mayoría de los tipos de células, expresan canales iónicos que responden a estímulos mecánicos 20,33,34,35,36,37. La función de estos canales activados mecánicamente se ha evaluado predominantemente con la técnica patch-clamp. Sin embargo, debido a problemas de accesibilidad, los estudi.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01DK119183 (a G.A. y M.D.C.) y S10OD028596 (a G.A.) y por los Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores del Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 20x Objetivo | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G & frac34; ” catéter | Medline | Corredera Suresite IV | |
| 4x Objetivo | Olympus | UPlanFL N | |
| Convertidor analógico/digital | Molecular Devices | Digidata 1440A Anticuerpo | |
| anti-GFP | Abcam | Ab6556 | |
| Divisor de haz | Chroma | T495lpxr | |
| Controlador de temperatura bipolar | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M |
| solución cellSens software | Olympus | Imaging | |
| software CMOS cámara | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Burro anti-conejo conjugado a Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | de Microsoft Corporation | ||
| Croma | ET470/40X | ||
| Capilares de vidrio Corning 8250 vidrio | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucosa | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Calentador en línea | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Fuente de luz | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Tubo de bomba colectora | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Tubo de bomba colector | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Ratones | Jackson Lab | 664 | 2-4 meses de edad hembra C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulador | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscopio | Olympus | BX51W | |
| Medios de montaje con DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade con DAPI |
| NaCl | Software Sigma | S7653 | |
| pClamp | Molecular Devices | versión 10.4 | Electrofisiología patch-clamp software de adquisición y análisis de datos |
| Bomba peristáltica | Gilson | Minipuls 3 | |
| Actuador piezoeléctrico | Thorlabs | PAS005 | |
| Soporte de pipeta | World Precision Instruments | ||
| Extractor de pipetas | Narishige | PP-830 | |
| Base calefactada de intercambio rápido con perfusión y kit de anillo adaptador | QE-1 | Warner Instruments | se adapta a platos de 35 mm |
| Rodamina-faloidina | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Versión 14.0 | Software de análisis de datos y gráficos científicos |
| Elastómero de silicona | Dow | Sylgard 184 | |
| Controlador piezoeléctrico de bucle abierto de un solo canal | Thorlabs | MDT694B | |
| Almohadilla de soporte de rejilla cuadrada | Ted Pella | 10520 | |
| Sutura | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Varilla de montaje de teflón | Hecho | a medida Úselo para montar el actuador piezoeléctrico en el micromanipulador | |
| Tubo | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 PULGADAS, OD 1/8 PULGADAS |
| Dispositivo de E/S digitales USB | National Instruments | NI USB-6501 |
Referencias
- Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat. Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).
- Engbretson, B. G., Stoner, L. C.
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Reimpresiones y permisos
