Summary
Malachitgrøn assay-protokollen er en enkel og omkostningseffektiv metode til at opdage varmechokprotein 90 (Hsp90) suppressorer samt andre inhibitorforbindelser mod ATP-afhængige enzymer.
Abstract
Varmechokprotein 90 (Hsp90) er et lovende anticancermål på grund af dets chaperonerende effekt på flere onkogene proteiner. Aktiviteten af Hsp90 er afhængig af dets evne til at hydrolysere adenosintrifosfat (ATP) til adenosindiphosphat (ADP) og frit fosfat. ATPase-aktiviteten af Hsp90 er knyttet til dens chaperoning-funktion; ATP binder sig til Hsp90's N-terminale domæne, og afbrydelse af dets binding viste sig at være den mest succesrige strategi til at undertrykke Hsp90-funktionen. ATPaseaktiviteten kan måles ved et kolorimetrisk malachitgrønt assay, som bestemmer mængden af frit fosfat dannet ved ATP-hydrolyse. Her beskrives en procedure til bestemmelse af ATPaseaktiviteten af gær Hsp90 ved anvendelse af malachitgrønt fosfatanalysesæt. Yderligere gives detaljerede instruktioner til opdagelsen af Hsp90-hæmmere ved at tage geldanamycin som en autentisk hæmmer. Endelig diskuteres anvendelsen af denne assayprotokol gennem high-throughput screening (HTS) af inhibitormolekyler mod gær Hsp90.
Introduction
Varmechokprotein 90 (Hsp90) er en molekylær chaperon, der opretholder stabiliteten af proteiner, der er ansvarlige for udvikling og progression af kræft. Derudover er proteiner, der er ansvarlige for udviklingen af resistens over for antineoplastiske midler, også klienter af Hsp901. Hsp90 er allestedsnærværende i alle kræftcelletyper (>90% af cellulære proteiner) sammenlignet med normale celler, hvor det kan udgøre mindre end 2% af de samlede proteiner. Desuden befinder kræftcellernes Hsp90 sig i et kompleks med co-chaperoner, mens det i en normal celle overvejende er til stede i en fri, ukomplekset tilstand 2,3. I de senere år har flere Hsp90-hæmmere vist sig at have senolytiske virkninger i in vitro- og in vivo-studier, hvor de signifikant har forbedret levetiden for mus 4,5,6. Alle de ovennævnte resultater underbygger det faktum, at Hsp90-hæmmere kan være effektive i flere kræfttyper med færre bivirkninger og reducerede chancer for at udvikle resistens. Chaperoneringsfunktionen af Hsp90 opnås ved at binde ATP på det N-terminale domæne af Hsp90 og hydrolysere det til ADP og frit fosfat7. Små molekyler, der konkurrencedygtigt binder til ATP-bindingslommen af Hsp90, viste sig at undertrykke proteinets chaperonerende virkning. Til dato er dette fortsat den bedste strategi for Hsp90-hæmning, hvilket understøttes af, at sådanne hæmmere har nået kliniske forsøg8. En af dem, Pimitespib, blev godkendt i Japan til behandling af gastrointestinal stromal tumor (GIST) i juni 20229. Dette er den første Hsp90-hæmmer godkendt siden lægemidletgabilitet af chaperon blev etableret i 199410.
Malachitgrøn analyse er en enkel, følsom, hurtig og billig procedure til påvisning af uorganisk fosfat, egnet til automatisering og high-throughput screening (HTS) af forbindelser mod det ønskede mål11. Analysen er med succes blevet anvendt til screening af Hsp90-hæmmere i små laboratorieskalaopsætninger såvel som i en HTS 12,13,14,15,16,17. Assayet bruger en kolorimetrisk metode, der bestemmer det frie uorganiske fosfat dannet på grund af ATPase-aktiviteten af Hsp90. Grundlaget for denne kvantificering er dannelsen af et phosphomolybdatkompleks mellem frit phosphat og molybdæn, som efterfølgende reagerer med malachitgrøn for at generere en grøn farve (figur 1). Denne hurtige farvedannelse måles på et spektrofotometer eller på en pladelæser mellem 600-660 nm18,19.
I denne protokol beskrives proceduren for udførelse af et malachitgrønt assay med gær Hsp90 og efterfølgende identifikation af inhibitorer mod chaperonen. Det naturlige produktmolekyle, geldanamycin (GA), med hvilket lægemiddelbarheden af Hsp90 først blev etableret, blev taget som en autentisk hæmmer10. HTS er blevet en integreret del af det nuværende lægemiddelforskningsprogram på grund af tilgængeligheden af et stort antal molekyler til testning. Denne teknik har fået større betydning i de sidste 2 år på grund af det presserende behov for genanvendelse af lægemidler til behandling af Covid-19-infektion20,21. Derfor præsenteres en detaljeret oversigt over HTS af molekyler mod gær Hsp90-protein ved at vedtage den malachitgrønne analysemetode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Malakitgrøn analyse i laboratorieskala
- Fremstilling af assaybuffer
- Forbered analysebufferen i henhold til sammensætningen og præparatet præsenteret i tabel 1.
- Fremstilling af fosfatstandarder
- Brug 1 mM fosfatstandard, der leveres i det malakitgrønne assayphosphatassaysæt (opbevares ved 4 °C).
- Pipette 40 μL 1 mM fosfatstandard i 960 μL ultrarent vand for at opnå 40 μM fosfatopløsning (forblandingsopløsning). Tilsæt forblandingsopløsningen med ultrarent vand i henhold til producentens anvisninger for at danne en seriel fortynding af fosfat fra 0 til 40 μM.
- Tilberedning af gær Hsp90
- Brug gær Hsp90 med en glycerollagerkoncentration på 0,66 mg / ml. Optø på is lige før brug.
- Brug 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) gær Hsp90 til målbar ATPase-aktivitet. Kontroller, at forskellen i optisk densitet efter tilsætning af malachitgrønt reagens mellem blindprøven og den positive kontrol er mindst 0,5 og mindre end 1,0. Her viste absorbansforskellen mellem blindprøven (uden Hsp90) og positiv kontrol (med Hsp90) sig at være 0,510.
- Forberedelse af ATP
- Overfør 1 mg ATP til et hætteglas indeholdende 453,39 μL ultrarent vand for at opnå 4 mM stamopløsning. Udfør vægtberegninger baseret på vandfri ATP (molekylvægt [m.w.] = 551,14). Forbered ATP frisk, da det spontant kan hydrolysere over tid.
- Der tilsættes 4 μL ATP-stamopløsning til hvert hul for at opnå en endelig brøndkoncentration på 0,2 mM (endeligt totalt analysebrøndvolumen på 80 μL). Tilsæt ATP som den sidste komponent til reaktionen ved hjælp af en multikanalpipette, så alle reaktionerne starter samtidigt.
- Fremstilling af geldanamycin (GA)
- Forbered en 10 mM bestand GA ved at opløse 1 mg i 178,37 μL DMSO (m.w. = 560,64). Brug stamopløsningen til at forberede 4 mM, 0,8 mM, 0,16 mM, 0,032 mM, 0,0064 mM og 0,00128 mM opløsning i DMSO ved seriel fortynding.
- Der tilsættes 2 μL af disse stamopløsninger til hvert hul for at opnå en endelig brøndkoncentration på henholdsvis 0,1 mM, 0,02 mM, 0,004 mM, 0,0008 mM, 0,00016 mM og 0,000032 mM.
- Brøndene fremstilles som beskrevet i tabel 2 og 3 med hullerne indeholdende blindprøven (buffer + vand + DMSO) og negativ kontrol (Hsp90 i buffer + vand + DMSO). Brøndene indeholdende GA (Hsp90 i buffer + vand + GA) tjener som den positive kontrol.
- Forberedelse af brøndplader og rækkefølge af tilsætning
- Forbered 96-brøndsplader med layoutet vist i tabel 2. For forbindelser, der viser absorbans ved 620 nm, fremstilles et separat hul til registrering af absorbansen ved denne bølgelængde. Der fremstilles ikke et separat hul til GA, da GA ikke viser absorbans ved 620 nm for den koncentration, der anvendes i analysen.
- Hver bestanddel fremstilles med det samlede volumen af hver bestanddel, som vist i tabel 3.
- Opsæt analysebrønde ved at tilføje ultrarent vand til hver brønd. Herefter tilsættes den nødvendige mængde analysebuffer og en sammensat opløsning (for eksempel GA-opløsning).
- Derefter tilsættes Hsp90 til de relevante huller, og pladerne rystes i 2 minutter på en pladeryster ved stuetemperatur.
- Der tilsættes 4 μL ATP-opløsning ved hjælp af en flerkanalspipette. Pak pladen ind i aluminiumsfolie og ryst i 2 minutter på en pladeryster (200 o / min) ved stuetemperatur. Pladen inkuberes ved 37 °C i 3 timer.
- Fremstilling og tilsætning af malachitgrønt reagens
- Det malachitgrønne reagens består af reagenser A (ammoniummolybdat i 3M HCI) og B (malachitgrøn og polyvinylalkohol). Reagenset bringes til stuetemperatur før brug. Reagenserne A og B blandes i forholdet 100:1 (1.000 μL:10 μL). Forbered dette inden for 3 timer før brug, da det er ustabilt og begynder at nedbrydes efter 3 timer.
- Efter 3 timer i trin 1.6.5 standses reaktionen ved tilsætning af 20 μL malachitgrønt reagens tilsat i samme rækkefølge som ATP ved hjælp af en flerkanalspipette.
- Efter 15 minutters inkubation ved stuetemperatur måles pladens absorbans ved 620 nm i en pladelæser.
2. High-throughput screening af Hsp90-hæmmere ved malachitgrøn assay
BEMÆRK: Protokollen for high-throughput screening svarer til laboratorieskalametoden. Det endelige brøndvolumen er i hvert tilfælde 80 μL. Der er dog en lille forskel i rækkefølgen af tilsætning af reagenser. I den laboratorieskalabaserede metode er der fem trin af opløsningstilsætning (34 μL vand, 32 μL buffer, 2 μL forbindelse i DMSO, 8 μL Hsp90 og endelig 4 μL ATP-opløsning). I modsætning hertil er der med HTS tre tilsætningstrin (40 μL bufferopløsning indeholdende gær Hsp90, 2 μL DMSO i 18 μL vand indeholdende forbindelserne og endelig 20 μL ATP opløst i vand). Den mindste mængde opløsning, der kan pipetteres nøjagtigt i HTS-opsætningen, er 20 μL. Derfor observeres en forskel i pipettering mellem laboratorie- og HTS-skalaer.
- Fremstilling af analysebuffer (pH 7,4)
- Brug den samme buffer i HTS som til malakitgrøn analyse i laboratorieskala (tabel 1).
- Tilberedning af gær Hsp90
- Brug protein med en glycerolstammekoncentration på 0,66 mg / ml. Optø på is lige før brug.
- Brug 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) gær Hsp90 i hver brønd, hvilket giver målbar ATPase-aktivitet.
- Fortynd proteinet (8 μL) i buffer (32 μL) for hvert hul. Det endelige samlede arbejdsvolumen for hvert hul er 40 μL i et samlet analysevolumen på 80 μL.
- Fremstilling af 0,8 mM ATP
- 1 mg ATP opløses i 2.267 μL destilleret vand for at opnå en 0,8 mM opløsning. Det samlede arbejdsvolumen for hvert hul er 20 μL i et samlet analysevolumen på 80 μL.
- Fremstilling af geldanamycin (GA)/teststoffer
- Forbered en 0,8 mM bestand af GA i DMSO, som i trin 1.5. 10 μL af GA-stammen fortyndes med 90 μL vand for at opnå en slutkoncentration på 80 μM.
- Der anvendes 20 μL af 80 μM GA-opløsningen i passende analysebrønde (endeligt totalt analysehulvolumen = 80 μL), hvilket giver en slutkoncentration i boringen på 20 μM. Dette tjener som en positiv kontrol.
- For testforbindelser fremstilles opløsninger i DMSO i henhold til deres ønskede koncentration til evaluering.
- Der fremstilles 10 μL DMSO i 90 μL vand til tilsætning til blindprøve (buffer + vand + DMSO) og negative kontrolhuller (Hsp90 i buffer + vand + DMSO). Teststofferne fremstilles på lignende måde ved en 100 μM endelig brøndkoncentration.
- Design af analyseplader og rækkefølge af tilsætning
- Brug fire hovedplader, en sammensat plade og fire tillægsplader indeholdende lagre af reagenser til at oprette analysen (figur 2 og tabel 4).
- Desuden tilsættes plade A 90 μL analysebuffer i hvert hul; desuden plade B tilsættes 90 μL buffer med Hsp90 i hvert hul; desuden tilsættes henholdsvis plader C og D 90 μL ATP og 90 μL malachitgrønt reagens i hvert hul (tabel 5 og tabel 6).
- Fra tilsætningsplade A og plade B overføres 40 μL opløsning fra hvert hul til henholdsvis hovedplade 1 og 2 og 3 og 4 ved hjælp af et automatiseret flerkanalsdispensersystem. Her blev Biomek(R) FXP laboratorieautomatiseringsarbejdsstationen brugt (figur 2 og tabel 6).
- Fra hvert hul i den sammensatte plade overføres 20 μL af opløsningen til hovedplade 1, 2, 3 og 4 (figur 2). Ryst pladerne i 1 min i en ryster (200 o / min).
- Fra hvert hul i tilsætningspladen C (ATP) overføres 20 μL opløsning til hovedplade 1, 2, 3 og 4 (figur 2). Ryst pladerne i 1 min i en ryster (200 o / min).
- Pladerne inkuberes i 3 timer ved 37 °C.
- Forbered det malachitgrønne reagens i henhold til trin 1.7. Efter 3 timer overføres 20 μL malachitgrønt reagens fra tilsætningspladen D til hullerne på hovedplade 1, 2, 3 og 4 (figur 2).
- Efter 15 minutters inkubation ved stuetemperatur måles pladens absorbans ved 620 nm i en pladelæser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne af analysen fortolkes som absorbans på grund af fri fosfationkoncentration. Absorbansen af frit phosphat som følge af ATP-hydrolyse af gæren Hsp90 ved 620 nm betragtes som 100% ATPase-aktivitet eller nul procent proteinhæmning. Inhiberingen af protein fører til ophør af ATP-hydrolyse (mindre frit fosfat). hvilket afspejles i form af nedsat absorbans ved 620 nm.
Resultater af malakitgrøn analyse i laboratorieskala
Standardgrafen for fosfatstandarden er vist i figur 3. Aktiviteten af Hsp90 måles med hensyn til dets evne til at hydrolysere ATP til ADP og uorganisk fosfat (Pi). En højere fri fosfatkoncentration fører til en stigning i kompleks dannelse med malachitgrøn, hvilket forårsager en intens grøn farve, der kan påvises ved 620 nm (figur 4).
Den procentvise hæmning beregnes ved følgende ligning:
% hæmning 
Absorbansen af Hsp90 blev betragtet som nul procenthæmning (100 % ATPaseaktivitet). Den procentvise ATPase-aktivitet anvendes til måling af den dosisafhængige hæmning af proteinet ved GA. Det blev observeret, at GA hæmmede proteinet på en dosisafhængig måde med en IC50-værdi på 0,85 μM (figur 5 og tabel 7).
Sigmoidal kurvemetoden for grafsoftware blev brugt til at bestemme IC 50-værdien (koncentration, hvor molekylerne udviser50 % af Hsp90 ATPase-aktiviteten).
Resultater af high-throughput screening (HTS) af Hsp90-hæmmere ved malachitgrøn analyse
HTS blev udført med teststoffer (kode 3 til 96) i to eksemplarer ved at tage GA (20 μM endelig brøndkoncentration) som referencestandard. Forbindelsernes absorbans ved 620 nm var ikke kendt, og absorbansen af forbindelserne alene blev derfor registreret (hovedplader 1 og 2; Figur 6). Absorbansværdien for hvert hul i hovedplader 3 og 4 (med Hsp90; Figur 7) blev fratrukket den tilsvarende absorbans i plade 1 og 2 (forbindelsen alene). Absorbansen af Hsp90 blev betragtet som 100% ATPaseaktivitet.
Den procentvise hæmning blev beregnet ved hjælp af følgende formel:
% hæmning
20 μM GA-koncentrationen viste 75,82% hæmning. En 100 μM forbindelse 82 viste 100% hæmning af gær Hsp90-proteinet, mens forbindelser 6 og 95 udviste henholdsvis 73,07% og 62,88% hæmning ved 100 μM (tabel 8). De andre forbindelser undertrykte proteinet med mindre end 50% ved 100 μM og blev anset for at være inaktive.
Figur 1: Reaktioner af malachitgrønt (MG) reagens. (A) Malachitgrøns struktur. (B) Reaktioner af malachitgrønt reagens A (ammoniummolybdat i 3 M HCI) med Pi og efterfølgende reaktion med reagens B (malachitgrøn i polyvinylalkohol). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksperimentelt skema for HTS-protokol. Figuren viser rækkefølgen af tilsætning af reagenser til hovedanalysepladen fra tilsætningspladerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Standardplot for standardfosfatkoncentration. X-aksen repræsenterer Pi-koncentration i mikromolar, og absorbans ved 620 nm er afbildet på Y-aksen. Fejlbjælkerne repræsenterer afvigelsen mellem de to stikprøvetal (n = 2). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Farveudvikling efter tilsætning af malachitgrønt reagens. Den grønne farve bliver mere intens med høj fosfatkoncentration og mere ATPase-aktivitet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: IC 50 beregning for geldanamycin mod gær Hsp90. Hvert punkt er et gennemsnit af to bestemmelser (n = 2). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Farveudvikling efter tilsætning af malachitgrønt reagens . (A) Farveudvikling i hovedplade 1. Den lyserøde farve i A11-brønden skyldes den sammensatte farve. (B) Farveudvikling i hovedplade 2. Den lyserøde farve i A11-brønden skyldes forbindelsens farvede natur. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Farveudvikling efter tilsætning af malachitgrønt reagens. Farveudvikling efter tilsætning af malachitgrønt reagens. (A) Farveudvikling i hovedplade 3. (B) Farveudvikling i hovedplade 4. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Lager opløsning | Endelig konc. | Fortynding (endelig/lager) | Mængde, der kræves til 100 ml lager (fortynding × samlet volumen) |
| 1000 mM Tris-HCI, pH 7,4 | 200 mM | 0.2 | 20 ml |
| 1000 mM KCl | 40 mM | 0.04 | 4 ml |
| 1000 mM MgCl2 | 12 mM | 0.012 | 1,2 ml |
| Ultrarent vand | NA | NA | Tilføj til 100 ml samlet volumen |
Tabel 1: Fremstilling af analysebuffer.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| En | Ultrarent vand | Ultrarent vand | Hvid | Hvid | |
| B | 4 μM PB | 4 μM PB | Negativ kontrol | Negativ kontrol | |
| C | 8 μM PB | 8 μM PB | GA(100 µM) + Hsp90 | GA(100 µM) + Hsp90 | |
| D | 12 μM PB | 12 μM PB | GA(20 µM) + Hsp90 | GA(20 µM) + Hsp90 | |
| E | 16 μM PB | 16 μM PB | GA(4 µM) + Hsp90 | GA(4 µM) + Hsp90 | |
| F | 24 μM PB | 24 μM PB | GA(0,8 μM) + HSP90 | GA(0,8 μM) + HSP90 | |
| G | 32 μM PB | 32 μM PB | GA(0,16 μM) + HSP90 | GA(0,16 μM) + HSP90 | |
| H | 40 μM PB | 40 μM PB | GA(0,032 μM) + HSP90 | GA(0,032 μM) + HSP90 | |
| Seddel: Det samlede brøndvolumen er 80 μL. PB = Fosfatbufferstandard. | |||||
Tabel 2: Layoutet af 96-brøndpladen.
| # | Hvid | Negativ kontrol | Gær Hsp90 + GA |
| Assay buffer | 40 μL | 32 μL | 32 μL |
| DMSO | 2 μL | 2 μL | - |
| GA | - | - | 2 μL |
| HSP90 | - | 8 μL | 8 μL |
| ATP (4mM) | 4 μL | 4 μL | 4 μL |
| Ultrarent vand | 34 μL | 34 μL | 34 μL |
| Samlet volumen | 80 μL | 80 μL | 80 μL |
Tabel 3: Bestanddel af hver brønd.
| Plade ID | Forklaring |
| 1 | Hovedplade indeholdende forbindelse |
| 2 | Hovedplade indeholdende forbindelse (duplikater af plade 1) |
| 3 | Hovedplade med Hsp90 og compound |
| 4 | Hovedplade med Hsp90 og compound (duplikat af plade 3) |
| CP | Sammensat opløsning |
| En | Bufferopløsning |
| B | Bufferopløsning med Hsp90 |
| C | ATP-løsning |
| D | Malakit grøn reagensopløsning |
| Bemærk: Alle plader er 96-brønds gennemsigtige. Hovedplade: plader, hvor den endelige ATPase-reaktion finder sted. Plade CP, A, B, C og D er additionsplader, der indeholder specifikke reagenser. | |
Tabel 4: Typer af plader, der anvendes i HTS-assayet.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | CP | En | B | C | D | ||
| Forbindelse/GA-opløsning i 1:10 DMSO:vand | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 90 μL | - | - | - | - | ||
| Hsp90-opløsning: bufferopløsning (1:4) | - | - | 40 μL | 40 μL | - | - | 90 μL | - | - | ||
| Bufferopløsning | 40 μL | 40 μL | - | - | - | 90 μL | - | - | - | ||
| ATP (0,8 mM) | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 20 μL | - | - | - | 90 μL | - | ||
| Malakit grønt reagens | - | - | - | - | - | - | - | - | 90 μL | ||
| Samlet volumen | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | ||
| Seddel: GA = Geldanamycin. For tillægsplader CP, A, B, C og D tages der ekstra 10 μL for perfekt overførsel af opløsninger til hovedpladerne. | |||||||||||
Tabel 5: Bestanddel af hver brønd i HTS-protokollen.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| En | DMSO+W | 9 | 17 | 25 | 33 | 41 | 49 | 57 | 65 | 73 | 81 | 89 |
| B | GA | 10 | 18 | 26 | 34 | 42 | 50 | 58 | 66 | 74 | 82 | 90 |
| C | 3 | 11 | 19 | 27 | 35 | 43 | 51 | 59 | 67 | 75 | 83 | 91 |
| D | 4 | 12 | 20 | 28 | 36 | 44 | 52 | 60 | 68 | 76 | 84 | 92 |
| E | 5 | 13 | 21 | 29 | 37 | 45 | 53 | 61 | 69 | 77 | 85 | 93 |
| F | 6 | 14 | 22 | 30 | 38 | 46 | 54 | 62 | 70 | 78 | 86 | 94 |
| G | 7 | 15 | 23 | 31 | 39 | 47 | 55 | 63 | 71 | 79 | 87 | 95 |
| H | 8 | 16 | 24 | 32 | 40 | 48 | 56 | 64 | 72 | 80 | 88 | 96 |
| Bemærk: 3-96 er sammensatte koder til evaluering af Hsp90-hæmningspotentiale. GA = Geldanamycin. W=Ultrarent vand | ||||||||||||
Tabel 6: Brøndplade lagt ud til hovedplade 1 og 2 (uden Hsp90) og 3 og 4 (med Hsp90).
| Godt bestanddel | % ATPase-aktivitet* | % hæmning |
| HSP90 | 100 | 0.00 |
| GA(100 μM) | 17.46 | 82.55 |
| GA (20 μM) | 17.77 | 82.23 |
| GA(4 μM) | 18.27 | 81.73 |
| GA (0,8 μM) | 58.43 | 41.57 |
| GA (0,16 μM) | 91.38 | 8.62 |
| GA (0,032 μM) | 92.86 | 7.14 |
| *Et gennemsnit af to uafhængige bestemmelser | ||
Tabel 7: Procentvis hæmning og ATPaseaktivitet af geldanamycin.
| Godt bestanddel | Abs (A) | Godt bestanddel | Abs (B) | B-A | % ATPase-aktivitet* | % hæmning |
| Hvid | 0.281 | Negativ kontrol | 0.663 | 0.383 | 100 | 0 |
| GA (20 μM) | 0.295 | GA (20 μM)+HSP90 | 0.388 | 0.093 | 24.18 | 75.82 |
| Forbindelse 6 (100 μM) | 0.3 | Forbindelse 6 (100 μM) + Hsp90 | 0.403 | 0.103 | 26.93 | 73.07 |
| Forbindelse 82 (100 μM) | 0.49 | Forbindelse 82 (100 μM) + Hsp90 | 0.462 | -0.028 | -7.32 | 107.32 |
| Forbindelse 95 (100 μM) | 0.327 | Forbindelse 95 (100 μM) + Hsp90 | 0.469 | 0.142 | 37.12 | 62.88 |
Tabel 8: Procentvis hæmning og ATPaseaktivitet af geldanamycin og udvalgte forbindelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hsp90 er et vigtigt mål for opdagelsen af nye anticancer-lægemiddelmolekyler. Siden dets lægemiddelbarhed blev etableret i 1994, har10, 18 molekyler nået kliniske forsøg. På nuværende tidspunkt er syv molekyler i forskellige faser af kliniske forsøg, enten alene eller i kombination22. Alle sådanne små molekyler er N-terminale ATP-bindende hæmmere. De andre midler til at hæmme chaperon (C-terminale hæmmere, mellemdomænehæmmere) er ikke gået så hurtigt som N-terminale hæmmere. Derfor har de N-terminale ATP-bindende inhibitorforbindelser stadig løfte om progression til et klinisk omsætteligt molekyle. Desuden er den eneste Hsp90-hæmmer, der blev godkendt i juni 2022 (Pimitespib til behandling af GIST i Japan), et N-terminal ATP-bindende molekyle9. Imidlertid har et enkelt molekyle til dato ikke nået et salgbart stadium i andre dele af verden23,24. Der er flere hovedårsager til denne fiasko, herunder formuleringsproblemer, omkostningerne ved at producere molekyler ud over toksicitet såsom ototoksicitet og kardiotoksicitet forbundet med få forbindelser. For at overvinde disse bivirkninger undersøges Hsp90 N-terminale selektive hæmmere (alfa og beta) nu25,26,27. Al den førnævnte diskussion berettiger HTS-screening af forbindelser, der vil undertrykke Hsp90-aktivitet ved at binde til dens ATP-bindingskløft.
Assays til opdagelse af lægemidler skal være hurtige, omkostningseffektive, følsomme, let reproducerbare og udnytte mindre farlige kemikalier og / eller forhold. Derudover skal det bekvemt udføres i laboratorieskala såvel som i en HTS-opsætning. En detaljeret analyse af tilgængelige Hsp90 ATPase-hæmmende assays blev foretaget, og malachitgrøn fosfatanalyse viste sig at være den mest egnede blandt alle i den givne institutionelle opsætning. De andre analysesystemer var ikke automatiseringsvenlige i et HTS-system (pyruvat/lactatdehydrogenasekoblet enzym)28,29; dyrt som fluorescenspolarisationsassay30, scintillationsnærhedsassays, overfladeplasmonresonansanalyse og tidsopløst fluorescensresonansenergioverførsel (TR-FRET)28,29; tidskrævende som (TR-FRET)28,29; eller havde strålingsfarer som scintillation proximity assays28,29. Derfor præsenteres et simpelt malachitgrønt assay som laboratorieskala eller HTS til identifikation af nye Hsp90 N-terminale ATP-bindingshæmmere i denne protokol.
Den største bekymring i dette assay er forurening af buffere og planteekstrakter, der skal evalueres med fosfationer, hvilket kan føre til falske resultater. Den ikke-enzymatiske hydrolyse af ATP ved reaktionens pH kan også føre til falske resultater. De ovennævnte problemer blev løst ved anvendelse af fosfatfrie buffere (pH 7,4). Derudover blev der udført en blindprøve med buffer + vand + DMSO, hvorefter absorbansværdien af de positive kontrol-/prøveforbindelser blev trukket fra blindværdien. En forholdsregel, der skal følges i denne analyseprocedure, er streng overholdelse af tilsætning af reagenser, som tilsætning af ATP samtidigt til hver brønd via flerkanalpipette. Dette er således, at reaktionen starter på samme tid i hvert hul, samme inkubationstid og derefter ved samme måling af absorbans efter tilsætning af det malachitgrønne reagens. ATPase-reaktionen er meget tidsfølsom, og derfor kan en lille ændring i reaktionsinitierings- og afslutningstiden, inkubationstiden og tiden til registrering af absorbans drastisk påvirke analyseresultaterne. Endvidere påvirker tilsætningen af 10 μL 34% natriumcitratopløsning (anvendt til slukning af ATPase-reaktionen) lineariteten af standardkurven og blev derfor ikke inkluderet i vores assayprotokol.
Den eneste begrænsning ved dette assay er evalueringen af forbindelser, der viser absorbans højere end vist ved frit phosphat frigivet fra ATP af gæren Hsp90 ved 620 nm. En falsk positiv eller falsk negativ kan resultere i tilfælde af sådanne forbindelser. Imidlertid er chancerne for at støde på sådanne forbindelser meget sjældne. Dette kan være problematisk ved evaluering af planteekstrakter og/eller fraktioner heraf, hvor der er en blanding af forbindelser til stede.
Afslutningsvis blev opskalering fra laboratorieskala til HTS udført med succes med gær Hsp90. Den trinvise analyseprotokol på laboratorieskala såvel som i HTS vil hjælpe forskere over hele verden med at vedtage denne procedure til opdagelse af nye Hsp90-hæmmere. Derudover kan protokollen tilpasses til opdagelse af ATPase-hæmmere mod andre ATP-afhængige proteiner som Hsp70, Grp94, Lon-protease, Protease Ti, AAA-proteaser osv.31,32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Korea Research Fellowship (KRF) -programmet, postdoc ved National Research Foundation of Korea (NRF), finansieret af ministeriet for videnskab og IKT (NRF-2019H1D3A1A01102952). Forfatterne er taknemmelige for KIST intramural grant og Ministry of Oceans and Fisheries bevilling nummer 2MRB130 for at yde økonomisk bistand til dette projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
References
- Workman, P. Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone. Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).
- Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).
- Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
- Dutta Gupta, S., Pan, C. H. Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents. International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging. Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).
- Pearl, L. H., Prodromou, C. Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).
- Park, H. -K., et al. Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1. Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).
- Hoy, S. M.
- Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).
- Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
- Sheikha, G. A., Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).
- Al-Sha'er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).
- Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).
- Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure. Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).
- Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors. Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).
- Dutta Gupta, S., et al. 2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead. Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).
- Feng, J., et al. An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application. Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).
- Gupta, S. D., et al. Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors. International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).
- Zhao, Y., et al. High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors. Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).
- Giri, A. K., Ianevski, A. High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers. Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).
- Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. Advanced Studies in Experimental and Clinical. , Apple Academic Press. 107-122 (2021).
- Jaeger, A. M., Whitesell, L.
- Yang, S., Xiao, H., Cao, L. Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment. Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074 (2021).
- Mishra, S. J., et al. The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).
- Khandelwal, A., et al. Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor. Nature Communications. 9 (1), 425 (2018).
- Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells. ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).
- Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).
- Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases. Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747 (2021).
- Howes, R., et al. A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90. Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).
- Opalińska, M., Jańska, H. AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis. Cells. 7 (10), 163 (2018).
- Ambrose, A. J., Chapman, E. Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).
- Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity. Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).
