Summary
Malakittgrønn analyseprotokoll er en enkel og kostnadseffektiv metode for å oppdage varmesjokkprotein 90 (Hsp90) suppressorer, samt andre inhibitorforbindelser mot ATP-avhengige enzymer.
Abstract
Varmesjokkprotein 90 (Hsp90) er et lovende mål mot kreft på grunn av sin chaperoning effekt på flere onkogene proteiner. Aktiviteten til Hsp90 er avhengig av dens evne til å hydrolysere adenosintrifosfat (ATP) til adenosindifosfat (ADP) og fritt fosfat. ATPase-aktiviteten til Hsp90 er knyttet til dens chaperoning-funksjon; ATP binder seg til det N-terminale domenet til Hsp90, og å forstyrre bindingen ble funnet å være den mest vellykkede strategien for å undertrykke Hsp90-funksjonen. ATPase-aktiviteten kan måles ved en kolorimetrisk malakittgrønn analyse, som bestemmer mengden fritt fosfat dannet ved ATP-hydrolyse. Her beskrives en prosedyre for å bestemme ATPase-aktiviteten til gjær Hsp90 ved bruk av malakittgrønt fosfatanalysesett. Videre er detaljerte instruksjoner for oppdagelsen av Hsp90-hemmere ved å ta geldanamycin som en autentisk inhibitor gitt. Til slutt diskuteres anvendelsen av denne analyseprotokollen gjennom high-throughput screening (HTS) av inhibitormolekyler mot gjær Hsp90.
Introduction
Varmesjokkprotein 90 (Hsp90) er en molekylær anstand som opprettholder stabiliteten til proteiner som er ansvarlige for utvikling og progresjon av kreft. I tillegg er proteiner som er ansvarlige for utviklingen av resistens mot antineoplastiske midler også klienter av Hsp901. Hsp90 overuttrykkes allestedsnærværende i alle kreftcelletyper (>90% av cellulære proteiner), sammenlignet med normale celler hvor det kan utgjøre mindre enn 2% av totale proteiner. Videre ligger Hsp90 av kreftceller i et kompleks med co-chaperones, mens det i en normal celle hovedsakelig er tilstede i en fri, ikke-kompleks tilstand 2,3. I de senere år har flere Hsp90-hemmere vist seg å ha senolytiske effekter i in vitro og in vivo studier, hvor de har forbedret levetiden til musbetydelig 4,5,6. Alle de nevnte funnene underbygger det faktum at Hsp90-hemmere kan være effektive i flere krefttyper, med færre bivirkninger og reduserte sjanser for å utvikle resistens. Chaperoning-funksjonen til Hsp90 oppnås ved å binde ATP ved det N-terminale domenet til Hsp90 og hydrolysere det til ADP og fritt fosfat7. Små molekyler som konkurransedyktig binder seg til ATP-bindingslommen til Hsp90 ble funnet å lykkes med å undertrykke chaperoning-effekten av proteinet. Til dags dato er dette fortsatt den beste strategien for Hsp90-hemming, som støttes av det faktum at slike hemmere har nådd kliniske studier8. En av dem, Pimitespib, ble godkjent i Japan for behandling av gastrointestinal stromal tumor (GIST) i juni 20229. Dette er den første Hsp90-hemmeren som er godkjent siden medisinerbarheten til ledsageren ble etablert i 199410.
Malakittgrønnanalysen er en enkel, følsom, rask og billig prosedyre for påvisning av uorganisk fosfat, egnet for automatisering og høy gjennomstrømningsscreening (HTS) av forbindelser mot ønsket mål11. Analysen har blitt brukt til screening av Hsp90-hemmere i små laboratorieoppsett, samt i en HTS 12,13,14,15,16,17. Analysen bruker en kolorimetrisk metode som bestemmer det frie uorganiske fosfatet dannet på grunn av ATPase-aktiviteten til Hsp90. Grunnlaget for denne kvantifiseringen er dannelsen av et fosfolybdatkompleks mellom fritt fosfat og molybden, som deretter reagerer med malakittgrønt for å generere en grønn farge (figur 1). Denne raske fargedannelsen måles på et spektrofotometer, eller på en plateleser, mellom 600-660 nm18,19.
I denne protokollen er prosedyren for å utføre en malakittgrønn analyse med gjær Hsp90 og påfølgende identifisering av inhibitorer mot chaperonen beskrevet. Det naturlige produktmolekylet, geldanamycin (GA), som medisinerbarheten til Hsp90 først ble etablert, ble tatt som en autentisk inhibitor10. HTS har blitt en integrert del av det nåværende legemiddeloppdagelsesprogrammet, på grunn av tilgjengeligheten av et stort antall molekyler for testing. Denne teknikken har fått større betydning de siste 2 årene på grunn av det presserende behovet for å gjenbruke medisiner for behandling av Covid-19-infeksjon20,21. Derfor presenteres en detaljert oversikt over HTS av molekyler mot gjær Hsp90-protein ved å vedta malakittgrønnanalysemetoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Malakittgrønn analyse i laboratorieskala
- Forberedelse av analysebuffer
- Forbered analysebufferen i henhold til sammensetningen og preparatet presentert i tabell 1.
- Utarbeidelse av fosfatstandarder
- Bruk 1 mM fosfatstandard, gitt i malakittgrønn analysefosfatanalysesett (lagret ved 4 ° C).
- Pipette 40 μL 1 mM fosfatstandard i 960 μL ultrarent vann for å oppnå 40 μM fosfatoppløsning (premixløsning). Tilsett premixløsningen med ultrarent vann, i henhold til produsentens instruksjoner, for å danne en seriell fortynning av fosfat fra 0 til 40 μM.
- Fremstilling av gjær Hsp90
- Bruk gjær Hsp90 med en glyserollagerkonsentrasjon på 0,66 mg / ml. Tine på is rett før bruk.
- Bruk 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) gjær Hsp90 for målbar ATPase-aktivitet. Kontroller at den optiske tetthetsforskjellen etter tilsetning av malakittgrønt reagens mellom blank og positiv kontroll er minst 0,5 og mindre enn 1,0. Her ble absorbansforskjellen mellom blank (uten Hsp90) og positiv kontroll (med Hsp90) funnet å være 0,510.
- Forberedelse av ATP
- Overfør 1 mg ATP til et hetteglass som inneholder 453,39 mikroliter ultrarent vann for å oppnå 4 ml stamoppløsning. Utfør vektberegninger basert på vannfri ATP (molekylvekt [m.w.] = 551.14). Forbered ATP frisk, da det spontant kan hydrolysere over tid.
- Tilsett 4 μL ATP-lagerløsning til hver brønn for å gi en endelig brønnkonsentrasjon på 0,2 mM (endelig totalanalysebrønnvolum på 80 μL). Legg til ATP som den siste komponenten i reaksjonen, ved hjelp av en flerkanals pipette slik at alle reaksjonene starter samtidig.
- Fremstilling av geldanamycin (GA)
- Forbered en 10 mM lager av GA ved å oppløse 1 mg i 178,37 μL DMSO (m.w. = 560,64). Bruk stamoppløsningen til å forberede 4 mM, 0,8 mM, 0,16 mM, 0,032 mM, 0,0064 mM og 0,00128 mM oppløsning i DMSO ved seriell fortynning.
- Tilsett 2 μL av disse stamløsningene til hver brønn for å oppnå en endelig brønnkonsentrasjon på henholdsvis 0,1 mM, 0,02 mM, 0,004 mM, 0,0008 mM, 0,00016 mM og 0,000032 mM.
- Forbered brønnene som beskrevet i tabell 2 og tabell 3, med brønnene som inneholder blank (buffer + vann + DMSO) og negativ kontroll (Hsp90 i buffer + vann + DMSO). Brønnene som inneholder GA (Hsp90 i buffer + vann + GA) tjener som den positive kontrollen.
- Klargjøring av brønnplater og rekkefølge av tilsetning
- Forbered 96-brønnsplater med oppsettet presentert i tabell 2. For forbindelser som viser absorbans ved 620 nm, lag en separat brønn for registrering av absorbansen ved denne bølgelengden. Ikke klargjør en separat brønn for GA, da GA ikke viser absorbans ved 620 nm for konsentrasjonen som brukes i analysen.
- Forbered hver bestanddel med det totale volumet av hver bestanddel, som presentert i tabell 3.
- Sett opp analysebrønner ved å legge ultrarent vann til hver brønn. Etter dette legger du til den nødvendige mengden analysebuffer og en sammensatt løsning (for eksempel GA-løsning).
- Tilsett deretter Hsp90 i de aktuelle brønnene, og rist platene i 2 minutter på en tallerkenrister ved romtemperatur.
- Tilsett 4 μL ATP-løsning ved hjelp av en flerkanalspipett. Pakk platen inn i aluminiumsfolie og rist i 2 min på en tallerkenrister (200 o / min) ved romtemperatur. Inkuber platen ved 37 °C i 3 timer.
- Fremstilling og tilsetning av malakittgrønt reagens
- Malakittgrøntreagenset består av reagenser A (ammoniummolybdat i 3M HCl) og B (malakittgrønn og polyvinylalkohol). Bring reagenset til romtemperatur før bruk. Bland reagenser A og B i forholdet 100:1 (1000 μL:10 μL). Forbered dette innen 3 timer før bruk, siden det er ustabilt og begynner å brytes ned etter 3 timer.
- Etter 3 timer i trinn 1.6.5, stopp reaksjonen ved å tilsette 20 μL malakittgrønt reagens, tilsatt i samme rekkefølge som ATP, ved bruk av en flerkanalspipettte.
- Etter en 15 minutters inkubasjon ved romtemperatur måles absorberingen av platen ved 620 nm i en plateleser.
2. Høy gjennomstrømningsscreening av Hsp90-hemmere ved malakittgrønn analyse
MERK: Protokollen for screening med høy gjennomstrømning ligner på laboratorieskalametodikken. Det endelige brønnvolumet i hvert tilfelle er 80 μL. Det er imidlertid en liten forskjell i rekkefølgen av tilsetning av reagenser. I laboratorieskalabasert metode er det fem trinn av løsningstilsetning (34 μL vann, 32 μL buffer, 2 μL-forbindelse i DMSO, 8 μL Hsp90 og til slutt 4 μL ATP-løsning). I motsetning til dette er det med HTS tre stadier av tilsetning (40 μL bufferoppløsning inneholdende gjær Hsp90, 2 μL DMSO i 18 μL vann som inneholder forbindelsene, og til slutt 20 μL ATP oppløst i vann). Minste mengde løsning som kan pipetteres nøyaktig i HTS-oppsettet er 20 μL. Derfor observeres en forskjell i pipettering mellom laboratorie- og HTS-skalaer.
- Fremstilling av analysebuffer (pH 7,4)
- Bruk samme buffer i HTS som for labskala malakittgrønn analyse (tabell 1).
- Fremstilling av gjær Hsp90
- Bruk protein med en glyserollagerkonsentrasjon på 0,66 mg / ml. Tine på is rett før bruk.
- Bruk 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) gjær Hsp90 i hver brønn, noe som gir målbar ATPase-aktivitet.
- Fortynn proteinet (8 μL) i buffer (32 μL) for hver brønn. Det endelige totale arbeidsvolumet for hver brønn er 40 μL i et totalt analysevolum på 80 μL.
- Tilberedning av 0,8 mM ATP
- Oppløs 1 mg ATP i 2,267 μL destillert vann for å oppnå en 0,8 mM løsning. Det totale arbeidsvolumet for hver brønn er 20 μL i et totalt analysevolum på 80 μL.
- Fremstilling av geldanamycin (GA)/testforbindelser
- Forbered en 0,8 mM lager av GA i DMSO, som i trinn 1,5. Fortynn 10 μL av GA-bestanden med 90 μL vann for å gi en endelig konsentrasjon på 80 μM.
- Bruk 20 μL av 80 μM GA-løsningen i egnede analysebrønner (endelig totalt analysebrønnvolum = 80 μL), noe som gir en endelig brønnkonsentrasjon på 20 μM. Dette fungerer som en positiv kontroll.
- For testforbindelser, lag løsninger i DMSO i henhold til ønsket konsentrasjon for evaluering.
- Forbered 10 μL DMSO i 90 μL vann for tilsetning til blank (buffer + vann + DMSO) og negative kontrollbrønner (Hsp90 i buffer + vann + DMSO). Klargjør testforbindelsene på lignende måte ved en endelig brønnkonsentrasjon på 100 μM.
- Design av analyseplater og rekkefølge av tilsetning
- Bruk fire hovedplater, en sammensatt plate og fire tilsetningsplater som inneholder lagre av reagenser for å sette opp analysen (figur 2 og tabell 4).
- I tillegg, plate A, tilsett 90 μL analysebuffer i hver brønn; i tillegg plate B, tilsett 90 μL buffer med Hsp90 i hver brønn; i tillegg plater C og D, tilsett henholdsvis 90 μL ATP og 90 μL malakittgrønt reagens i hver brønn (tabell 5 og tabell 6).
- Fra tilsetningsplate A og plate B overfører du 40 μL løsning fra hver brønn til hovedplate 1 og 2, og henholdsvis 3 og 4 ved hjelp av et automatisert flerkanals dispenseringssystem. Her ble Biomek(R) FXP laboratorieautomatiseringsarbeidsstasjon brukt (figur 2 og tabell 6).
- Fra hver brønn på forbindelsesplaten overføres 20 μL av løsningen til hovedplatene 1, 2, 3 og 4 (figur 2). Rist platene i 1 min i en shaker (200 o / min).
- Fra hver brønn på tilsetningsplaten C (ATP), overfør 20 μL oppløsning til hovedplatene 1, 2, 3 og 4 (figur 2). Rist platene i 1 min i en shaker (200 o / min).
- Inkuber platene i 3 timer ved 37 °C.
- Forbered malakittgrøntreagenset i henhold til trinn 1.7. Etter 3 timer overføres 20 μL malakittgrønt reagens fra tilsetningsplate D til brønnene på hovedplatene 1,2, 3 og 4 (figur 2).
- Etter en 15 min inkubasjon ved romtemperatur, måle absorberingen av platen er på 620 nm i en plateleser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene av analysen tolkes med hensyn til absorbans på grunn av konsentrasjonen av fritt fosfation. Absorbansen ved fritt fosfat på grunn av ATP-hydrolyse av gjæren Hsp90 ved 620 nm betraktes som 100% ATPase-aktivitet, eller null prosentvis proteininhibering. Inhiberingen av protein fører til opphør av ATP-hydrolyse (mindre fritt fosfat). som gjenspeiles i form av redusert absorbans ved 620 nm.
Resultater av lab-skala malakittgrønn analyse
Standardgrafen for fosfatstandarden er vist i figur 3. Aktiviteten til Hsp90 måles i form av dens evne til å hydrolysere ATP til ADP og uorganisk fosfat (Pi). En høyere fri fosfatkonsentrasjon fører til en økning i kompleksdannelse med malakittgrønn, noe som forårsaker en intens grønn farge som kan påvises ved 620 nm (figur 4).
Den prosentvise hemmingen beregnes av følgende ligning:
% Hemming 
Absorbansen av Hsp90 ble ansett som null prosentvis hemming (100 % ATPase-aktivitet). Den prosentvise ATPase-aktiviteten brukes til å måle den doseavhengige inhiberingen av proteinet ved GA. Det ble observert at GA hemmet proteinet på en doseavhengig måte, med en IC50-verdi på 0,85 μM (figur 5 og tabell 7).
Den sigmoidale kurvetilnærmingen til grafisk programvare ble brukt til å bestemme IC 50-verdien (konsentrasjon hvor molekylene utviser50 % av Hsp90 ATPase-aktiviteten).
Resultater av høy gjennomstrømningsscreening (HTS) av Hsp90-hemmere ved malakittgrønn analyse
HTS ble utført med testforbindelser (kode 3 til 96) i to eksemplarer ved å bruke GA (20 μM endelig brønnkonsentrasjon) som referansestandard. Absorbansen ved 620 nm av forbindelsene var ikke kjent, og dermed ble absorbansen av forbindelsene alene registrert (hovedplatene 1 og 2; Figur 6). Absorbansverdien for hver brønn på hovedplatene 3 og 4 (med Hsp90; Figur 7) ble trukket fra tilsvarende absorbans i plate 1 og 2 (forbindelse alene). Absorbansen av Hsp90 ble ansett som 100 % ATPase-aktivitet.
Den prosentvise hemmingen ble beregnet ved hjelp av følgende formel:
% Hemming
20 μM GA-konsentrasjonen viste 75,82 % hemming. En 100 μM forbindelse 82 viste 100% hemming av gjær Hsp90-proteinet, mens forbindelser 6 og 95 viste henholdsvis 73,07% og 62,88% hemming ved 100 μM (tabell 8). De andre forbindelsene undertrykte proteinet med mindre enn 50% ved 100 μM og ble ansett å være inaktive.
Figur 1: Reaksjoner av malakittgrønt (MG) reagens. (A) Struktur av malakittgrønn. (B) Reaksjoner av malakittgrønt reagens A (ammoniummolybdat i 3 M HCl) med Pi, og påfølgende reaksjon med reagens B (malakittgrønn i polyvinylalkohol). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksperimentelt skjema for HTS-protokoll. Figuren viser rekkefølgen for tilsetning av reagenser til hovedanalyseplaten fra tilsetningsplatene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Standard plott for standard fosfatkonsentrasjon. X-aksen representerer Pi-konsentrasjon i mikromolar, og absorbans ved 620 nm er avbildet på Y-aksen. Feilfeltene representerer avvik mellom de to utvalgsnumrene (n = 2). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Fargeutvikling etter tilsetning av malakittgrønt reagens. Den grønne fargen blir mer intens med høy fosfatkonsentrasjon og mer ATPase-aktivitet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: IC50-beregning for geldanamycin mot gjær Hsp90. Hvert punkt er et gjennomsnitt av to bestemmelser (n = 2). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Fargeutvikling etter tilsetning av malakittgrønt reagens. (A) Fargeutvikling i hovedplate 1. Den rosa fargen i A11-brønnen skyldes den sammensatte fargen. (B) Fargeutvikling i hovedplate 2. Den rosa fargen i A11-brønnen skyldes forbindelsens fargede natur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Fargeutvikling etter tilsetning av malakittgrønt reagens. Fargeutvikling etter tilsetning av malakittgrønt reagens. (A) Fargeutvikling i hovedplate 3. (B) Fargeutvikling i hovedplate 4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Lagerløsning | Endelig konstitusjon. | Fortynning (endelig / lager) | Mengde som kreves for 100 ml lager (fortynning × totalvolum) |
| 1000 mM Tris-HCl, pH 7,4 | 200 mM | 0.2 | 20 ml |
| 1000 mM KCl | 40 mM | 0.04 | 4 ml |
| 1000 mM MgCl2 | 12 mM | 0.012 | 1,2 ml |
| Ultrarent vann | NA | NA | Legg til 100 ml totalt volum |
Tabell 1 Forberedelse av analysebuffer.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| En | Ultrarent vann | Ultrarent vann | Blank | Blank | |
| B | 4 μM PB | 4 μM PB | Negativ kontroll | Negativ kontroll | |
| C | 8 μM PB | 8 μM PB | GA (100 μM) + Hsp90 | GA (100 μM) + Hsp90 | |
| D | 12 μM PB | 12 μM PB | GA (20 μM) + Hsp90 | GA (20 μM) + Hsp90 | |
| E | 16 μM PB | 16 μM PB | GA (4 μM) + Hsp90 | GA (4 μM) + Hsp90 | |
| F | 24 μM PB | 24 μM PB | GA (0,8 μM) + Hsp90 | GA (0,8 μM) + Hsp90 | |
| G | 32 μM PB | 32 μM PB | GA (0,16 μM) + Hsp90 | GA (0,16 μM) + Hsp90 | |
| H | 40 μM PB | 40 μM PB | GA (0,032 μM) + Hsp90 | GA (0,032 μM) + Hsp90 | |
| Notat: Det totale brønnvolumet er 80 μL. PB = fosfatbufferstandard. | |||||
Tabell 2: Oppsettet av 96-brønnplaten.
| # | Blank | Negativ kontroll | Gjær Hsp90 + GA |
| Analysebuffer | 40 μL | 32 μL | 32 μL |
| DMSO | 2 μL | 2 μL | - |
| GA | - | - | 2 μL |
| Hsp90 | - | 8 μL | 8 μL |
| ATP (4mM) | 4 μL | 4 μL | 4 μL |
| Ultrarent vann | 34 μL | 34 μL | 34 μL |
| Totalt volum | 80 μL | 80 μL | 80 μL |
Tabell 3: Bestanddel av hver brønn.
| Plate-ID | Forklaring |
| 1 | Hovedplate som inneholder forbindelse |
| 2 | Hovedplate inneholdende forbindelse (duplikat av plate 1) |
| 3 | Hovedplate med Hsp90 og sammensatt |
| 4 | Hovedplate med Hsp90 og forbindelse (duplikat av plate 3) |
| CP | Sammensatt løsning |
| En | Buffer løsning |
| B | Bufferløsning med Hsp90 |
| C | ATP-løsning |
| D | Malakitt grønn reagensløsning |
| Merk: Alle platene er 96-godt gjennomsiktige. Hovedplate: plater hvor den endelige ATPase-reaksjonen finner sted. Plate CP, A, B, C og D er addisjonsplater som inneholder spesifikke reagenser. | |
Tabell 4: Typer plater som brukes i HTS-analysen.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | CP | En | B | C | D | ||
| Sammensatt/GA-løsning i 1:10 DMSO:vann | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 90 μL | - | - | - | - | ||
| Hsp90-løsning: bufferløsning (1:4) | - | - | 40 μL | 40 μL | - | - | 90 μL | - | - | ||
| Buffer løsning | 40 μL | 40 μL | - | - | - | 90 μL | - | - | - | ||
| ATP (0,8 mM) | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 20 μL | - | - | - | 90 μL | - | ||
| Malakitt grønn reagens | - | - | - | - | - | - | - | - | 90 μL | ||
| Totalt volum | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | ||
| Notat: GA = Geldanamycin. For addisjonsplater CP, A, B, C og D tas det 10 μL ekstra for perfekt overføring av løsninger til hovedplatene. | |||||||||||
Tabell 5: Bestanddel av hver brønn i HTS-protokollen.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| En | DMSO+W | 9 | 17 | 25 | 33 | 41 | 49 | 57 | 65 | 73 | 81 | 89 |
| B | GA | 10 | 18 | 26 | 34 | 42 | 50 | 58 | 66 | 74 | 82 | 90 |
| C | 3 | 11 | 19 | 27 | 35 | 43 | 51 | 59 | 67 | 75 | 83 | 91 |
| D | 4 | 12 | 20 | 28 | 36 | 44 | 52 | 60 | 68 | 76 | 84 | 92 |
| E | 5 | 13 | 21 | 29 | 37 | 45 | 53 | 61 | 69 | 77 | 85 | 93 |
| F | 6 | 14 | 22 | 30 | 38 | 46 | 54 | 62 | 70 | 78 | 86 | 94 |
| G | 7 | 15 | 23 | 31 | 39 | 47 | 55 | 63 | 71 | 79 | 87 | 95 |
| H | 8 | 16 | 24 | 32 | 40 | 48 | 56 | 64 | 72 | 80 | 88 | 96 |
| Merk: 3-96 er sammensatte koder for evaluering av Hsp90 hemmingspotensial. GA = Geldanamycin. W=Ultrarent vann | ||||||||||||
Tabell 6: Brønnplate lå ut for hovedplate 1 og 2 (uten Hsp90), og 3 og 4 (med Hsp90).
| Godt konstituerende | % ATPase-aktivitet* | % hemming |
| Hsp90 | 100 | 0.00 |
| GA (100 μM) | 17.46 | 82.55 |
| GA (20 μM) | 17.77 | 82.23 |
| GA (4 μM) | 18.27 | 81.73 |
| GA (0,8 μM) | 58.43 | 41.57 |
| GA (0,16 μM) | 91.38 | 8.62 |
| GA (0,032 μM) | 92.86 | 7.14 |
| * Et gjennomsnitt av to uavhengige bestemmelse | ||
Tabell 7: Prosentvis hemming og ATPase-aktivitet av geldanamycin.
| Godt konstituerende | Abs (A) | Godt konstituerende | Abs (B) | B-A | % ATPase-aktivitet* | % hemming |
| Blank | 0.281 | Negativ kontroll | 0.663 | 0.383 | 100 | 0 |
| GA (20 μM) | 0.295 | GA (20 μM)+Hsp90 | 0.388 | 0.093 | 24.18 | 75.82 |
| Forbindelse 6 (100 μM) | 0.3 | Forbindelse 6 (100 μM) + Hsp90 | 0.403 | 0.103 | 26.93 | 73.07 |
| Forbindelse 82 (100 μM) | 0.49 | Forbindelse 82 (100 μM) + Hsp90 | 0.462 | -0.028 | -7.32 | 107.32 |
| Forbindelse 95 (100 μM) | 0.327 | Forbindelse 95 (100 μM) + Hsp90 | 0.469 | 0.142 | 37.12 | 62.88 |
Tabell 8: Prosentvis hemming og ATPase-aktivitet av geldanamycin og utvalgte forbindelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hsp90 er et betydelig mål for oppdagelsen av nye kreftmedisinmolekyler. Siden medisinerbarheten ble etablert i 199410, har 18 molekyler nådd kliniske studier. For tiden er syv molekyler i ulike faser av kliniske studier, enten alene eller i kombinasjon22. Alle slike små molekyler er N-terminale ATP-bindingshemmere. De andre måtene å hemme chaperonen på (C-terminale hemmere, mellomdomenehemmere) har ikke gått like raskt som N-terminale hemmere. Derfor holder de N-terminale ATP-bindende inhibitorforbindelsene fortsatt løfte om progresjon til et klinisk markedsførbart molekyl. Videre er den eneste Hsp90-hemmeren, godkjent i juni 2022 (Pimitespib for behandling av GIST i Japan), et N-terminal ATP-bindende molekyl9. Imidlertid har et enkelt molekyl til dags dato ikke nådd et salgbart stadium i andre deler av verden23,24. Det er flere hovedårsaker til denne feilen, inkludert formuleringsproblemer, kostnadene ved å produsere molekyler i tillegg til toksisitet som ototoksisitet og kardiotoksisitet forbundet med få forbindelser. For å overvinne disse bivirkningene blir Hsp90 N-terminale selektive hemmere (alfa og beta) nå utforsket25,26,27. All den nevnte diskusjonen garanterer HTS-screening av forbindelser, som vil undertrykke Hsp90-aktivitet ved å binde seg til ATP-bindingsspalten.
Analyser for oppdagelse av narkotika må være raske, kostnadseffektive, følsomme, lett reproduserbare og bruke mindre farlige kjemikalier og / eller forhold. I tillegg bør det utføres praktisk i laboratorieskala så vel som i et HTS-oppsett. En detaljert analyse av tilgjengelige Hsp90 ATPase-hemmende analyser ble utført, og malakittgrønn fosfatanalyse ble funnet å være den mest egnede blant alle i det gitte institusjonelle oppsettet. De andre analysesystemene var ikke automatiseringsvennlige i et HTS-system (pyruvat/laktatdehydrogenase-koblet enzym)28,29; dyre som fluorescenspolarisasjonsanalysen30, scintillasjonsnærhetsanalyser, overflateplasmonresonansanalyse og tidsløst fluorescensresonansenergioverføring (TR-FRET)28,29; tidkrevende som (TR-FRET)28,29; eller hadde strålingsfarer som scintillasjonsnærhetsanalyser28,29. Derfor presenteres en enkel malakittgrønn analyse som laboratorieskala eller HTS for identifisering av nye Hsp90 N-terminale ATP-bindingshemmere i denne protokollen.
Den største bekymringen i denne analysen er forurensning av buffere og planteekstrakter som skal evalueres med fosfationer, noe som kan føre til falske resultater. Den ikke-enzymatiske hydrolysen av ATP ved reaksjonens pH kan også føre til falske resultater. De nevnte problemene ble løst ved å bruke fosfatfrie buffere (pH 7,4). I tillegg ble det utført et emne med buffer + vann + DMSO, og deretter trukket absorbansverdien av de positive kontroll-/prøveforbindelsene fra blankverdien. En forholdsregel som må følges i denne analyseprosedyren er streng overholdelse av tilsetning av reagenser, som tilsetning av ATP samtidig til hver brønn via flerkanalspipette. Dette er slik at reaksjonen starter samtidig i hver brønn, samme inkubasjonstid, og deretter ved samme måling av absorbans etter tilsetning av malakittgrønt reagens. ATPase-reaksjonen er svært tidsfølsom, og derfor kan en liten endring i reaksjonsinitierings- og avslutningstid, inkubasjonstid og tid for registrering av absorbans drastisk påvirke analyseresultatene. Videre påvirker tilsetningen av 10 μL 34% natriumcitratoppløsning (brukt til å slukke ATPase-reaksjonen) lineariteten til standardkurven, og ble derfor ikke inkludert i vår analyseprotokoll.
Den eneste begrensningen i denne analysen er evalueringen av forbindelser som viser absorbans høyere enn vist ved fritt fosfat frigjort fra ATP av gjæren Hsp90 ved 620 nm. En falsk positiv eller falsk negativ kan resultere i tilfelle av slike forbindelser. Imidlertid er sjansene for å møte slike forbindelser svært sjeldne. Dette kan være problematisk med evaluering av planteekstrakter og / eller deres fraksjoner spesielt, hvor en blanding av forbindelser er tilstede.
Avslutningsvis ble oppskalering fra laboratorieskala til HTS vellykket utført med gjær Hsp90. Den trinnvise analyseprotokollen på laboratorieskala så vel som i HTS vil hjelpe forskere over hele verden til å vedta denne prosedyren for oppdagelsen av nye Hsp90-hemmere. I tillegg kan protokollen tilpasses for oppdagelsen av ATPase-hemmere mot andre ATP-avhengige proteiner som Hsp70, Grp94, Lon protease, Protease Ti, AAA-proteaser, etc31,32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Korea Research Fellowship (KRF) -programmet, postdoktor ved National Research Foundation of Korea (NRF), finansiert av departementet for vitenskap og IKT (NRF-2019H1D3A1A01102952). Forfatterne er takknemlige for KIST intramural grant og Ministry of Oceans and Fisheries grant number 2MRB130 for å gi økonomisk støtte til dette prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
References
- Workman, P. Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone. Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).
- Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).
- Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
- Dutta Gupta, S., Pan, C. H. Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents. International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging. Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).
- Pearl, L. H., Prodromou, C. Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).
- Park, H. -K., et al. Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1. Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).
- Hoy, S. M.
- Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).
- Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
- Sheikha, G. A., Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).
- Al-Sha'er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).
- Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).
- Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure. Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).
- Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors. Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).
- Dutta Gupta, S., et al. 2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead. Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).
- Feng, J., et al. An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application. Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).
- Gupta, S. D., et al. Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors. International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).
- Zhao, Y., et al. High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors. Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).
- Giri, A. K., Ianevski, A. High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers. Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).
- Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. Advanced Studies in Experimental and Clinical. , Apple Academic Press. 107-122 (2021).
- Jaeger, A. M., Whitesell, L.
- Yang, S., Xiao, H., Cao, L. Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment. Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074 (2021).
- Mishra, S. J., et al. The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).
- Khandelwal, A., et al. Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor. Nature Communications. 9 (1), 425 (2018).
- Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells. ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).
- Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).
- Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases. Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747 (2021).
- Howes, R., et al. A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90. Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).
- Opalińska, M., Jańska, H. AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis. Cells. 7 (10), 163 (2018).
- Ambrose, A. J., Chapman, E. Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).
- Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity. Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).
