Summary
Malakit yeşil tahlil protokolü, ısı şoku proteini 90 (Hsp90) baskılayıcılarını ve ATP'ye bağımlı enzimlere karşı diğer inhibitör bileşikleri keşfetmek için basit ve uygun maliyetli bir yöntemdir.
Abstract
Isı şoku proteini 90 (Hsp90), çoklu onkojenik proteinler üzerindeki chaperoning etkisi nedeniyle umut verici bir antikanser hedefidir. Hsp90'ın aktivitesi, adenozin trifosfatı (ATP) adenozin difosfata (ADP) ve serbest fosfata hidrolize etme kabiliyetine bağlıdır. Hsp90'ın ATPaz aktivitesi chaperoning fonksiyonu ile bağlantılıdır; ATP, Hsp90'ın N-terminal alanına bağlanır ve bağlanmasını bozmanın Hsp90 fonksiyonunu bastırmada en başarılı strateji olduğu bulunmuştur. ATPaz aktivitesi, ATP hidrolizi tarafından oluşturulan serbest fosfat miktarını belirleyen kolorimetrik malakit yeşil testi ile ölçülebilir. Burada, malakit yeşil fosfat tahlil kiti kullanılarak maya Hsp90'ın ATPaz aktivitesini belirlemek için bir prosedür açıklanmaktadır. Ayrıca, gerçek bir inhibitör olarak geldanamisin alarak Hsp90 inhibitörlerinin keşfi için ayrıntılı talimatlar verilmiştir. Son olarak, bu tahlil protokolünün inhibitör moleküllerinin maya Hsp90'a karşı yüksek verimli taraması (HTS) yoluyla uygulanması tartışılmıştır.
Introduction
Isı şoku proteini 90 (Hsp90), kanserin gelişmesinden ve ilerlemesinden sorumlu proteinlerin stabilitesini koruyan moleküler bir şaperondur. Ek olarak, antineoplastik ajanlara karşı direnç gelişmesinden sorumlu proteinler de Hsp901'in müşterileridir. Hsp90, toplam proteinlerin% 2'sinden azını oluşturabileceği normal hücrelere kıyasla, tüm kanser hücresi tiplerinde (hücresel proteinlerin% >90'ı) her yerde aşırı eksprese edilir. Dahası, kanser hücrelerinin Hsp90'ı eş-şaperonlarla birlikte bir komplekste bulunurken, normal bir hücrede ağırlıklı olarak serbest, kompleks olmayan bir durumda bulunur 2,3. Son yıllarda, birkaç Hsp90 inhibitörünün in vitro ve in vivo çalışmalarda senolitik etkilere sahip olduğu gösterilmiştir ve burada farelerin ömrünü önemli ölçüde iyileştirmiştir 4,5,6. Yukarıda belirtilen tüm bulgular, Hsp90 inhibitörlerinin birden fazla kanser türünde, daha az yan etki ve daha az direnç geliştirme şansı ile etkili olabileceğini doğrulamaktadır. Hsp90'ın chaperoning fonksiyonu, ATP'yi Hsp90'ın N-terminal alanına bağlayarak ve ADP ve serbest fosfat7'ye hidrolize ederek gerçekleştirilir. Hsp90'ın ATP bağlanma cebine rekabetçi bir şekilde bağlanan küçük moleküllerin, proteinin chaperoning etkisini başarıyla bastırdığı bulundu. Bugüne kadar, bu, bu tür inhibitörlerin klinik çalışmalara ulaştığı gerçeğiyle desteklenen Hsp90 inhibisyonu için en iyi strateji olmaya devam etmektedir8. Bunlardan biri olan Pimitespib, Haziran 2022'de gastrointestinal stromal tümörün (GIST) tedavisi için Japonya'da onaylandı9. Bu, şaperonun uyuşturulabilirliğinin 1994 yılında kurulmasından bu yana onaylanan ilk Hsp90 inhibitörüdür10.
Malakit yeşil tahlili, inorganik fosfatın tespiti için basit, hassas, hızlı ve ucuz bir prosedürdür, istenen hedef11'e karşı bileşiklerin otomasyonu ve yüksek verimli taraması (HTS) için uygundur. Tahlil, küçük laboratuvar ölçekli kurulumlarda ve HTS 12,13,14,15,16,17'de Hsp90 inhibitörlerinin taranması için başarıyla kullanılmıştır. Tahlil, Hsp90'ın ATPaz aktivitesi nedeniyle oluşan serbest inorganik fosfatı belirleyen kolorimetrik bir yöntem kullanır. Bu nicelemenin temeli, serbest fosfat ve molibden arasında bir fosfomolibdat kompleksinin oluşmasıdır ve daha sonra yeşil bir renk oluşturmak için malakit yeşili ile reaksiyona girer (Şekil 1). Bu hızlı renk oluşumu bir spektrofotometrede veya bir plaka okuyucuda 600-660 nm18,19 arasında ölçülür.
Bu protokolde, maya Hsp90 ile malakit yeşil bir tahlil yapılması ve daha sonra şaperona karşı inhibitörlerin tanımlanması prosedürü açıklanmaktadır. Hsp90'ın uyuşturulabilirliğinin ilk kez kurulduğu doğal ürün molekülü geldanamisin (GA), otantik bir inhibitör10 olarak alınmıştır. HTS, test için çok sayıda molekülün mevcudiyeti nedeniyle mevcut ilaç keşif programının ayrılmaz bir parçası haline gelmiştir. Bu teknik, Covid-19 enfeksiyonunun tedavisi için ilaçların yeniden kullanılmasına acil ihtiyaç duyulması nedeniyle son 2 yılda daha fazla önem kazanmıştır20,21. Bu nedenle, moleküllerin HTS için maya Hsp90 proteinine karşı malakit yeşil tahlil yöntemi benimsenerek ayrıntılı bir taslak sunulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Laboratuvar ölçeğinde malakit yeşil tahlili
- Tahlil tamponunun hazırlanması
- Tahlil tamponunu, Tablo 1'de sunulan bileşim ve preparasyona göre hazırlayın.
- Fosfat standartlarının hazırlanması
- Malakit yeşil tahlil fosfat tahlil kitinde (4 °C'de depolanan) sağlanan 1 mM fosfat standardını kullanın.
- 40 μM fosfat çözeltisi (ön karışım çözeltisi) elde etmek için 960 μL ultra saf suda 40 μL 1 mM fosfat standardı pipet. Fosfatın 0 ila 40 μM arasında seri seyreltilmesini sağlamak için üreticinin talimatlarına göre ultra saf su ile ön karışım çözeltisini ekleyin.
- Maya Hsp90 hazırlanması
- Maya Hsp90'ı 0.66 mg / mL'lik bir gliserol stok konsantrasyonu ile kullanın. Kullanmadan hemen önce buz üzerinde çözün.
- Ölçülebilir ATPaz aktivitesi için 8 μL (5.98 μg, 0.80 μM) maya Hsp90 kullanın. Malakit yeşil reaktifin eklenmesinden sonra boş ve pozitif kontrol arasındaki optik yoğunluk farkının en az 0,5 ve 1,0'dan az olduğunu kontrol edin. Burada boşluk (Hsp90 olmadan) ve pozitif kontrol (Hsp90 ile) arasındaki absorbans farkı 0.510 olarak bulunmuştur.
- ATP'nin hazırlanması
- 4 mM stok çözeltisi elde etmek için 1 mg ATP'yi 453.39 μL ultra saf su içeren bir şişeye aktarın. Susuz ATP'ye dayalı ağırlık hesaplamaları yapın (moleküler ağırlık [m.w.] = 551.14). ATP'yi taze olarak hazırlayın, çünkü zamanla kendiliğinden hidrolize olabilir.
- 0,2 mM'lik bir nihai kuyu konsantrasyonu (nihai toplam tahlil kuyusu hacmi 80 μL) vermek için her bir kuyucuğa 4 μL ATP stok çözeltisi ekleyin. Tüm reaksiyonların aynı anda başlaması için çok kanallı bir pipet kullanarak reaksiyonun son bileşeni olarak ATP'yi ekleyin.
- Geldanamisin (GA) hazırlanması
- 1 mg'ı 178.37 μL DMSO'da (m.w. = 560.64) çözerek 10 mM'lik bir GA stoğu hazırlayın. Stok çözeltisini kullanarak, seri seyreltme ile DMSO'da 4 mM, 0,8 mM, 0,16 mM, 0,032 mM, 0,0064 mM ve 0,00128 mM çözelti hazırlayın.
- Sırasıyla 0,1 mM, 0,02 mM, 0,004 mM, 0,0008 mM, 0,00016 mM ve 0,000032 mM'lik bir nihai kuyu konsantrasyonu elde etmek için her bir kuyucuğa bu stok çözeltilerinden 2 μL ekleyin.
- Kuyuları Tablo 2 ve Tablo 3'te açıklandığı gibi, boşluk (tampon + su + DMSO) ve negatif kontrol (tampon + su + DMSO'da Hsp90) içeren kuyularla hazırlayın. GA içeren kuyular (tampon + su + GA'da Hsp90) pozitif kontrol görevi görür.
- Kuyu plakalarının hazırlanması ve ekleme sırası
- Tablo 2'de sunulan düzen ile 96 delikli plakalar hazırlayın. 620 nm'de absorbans gösteren bileşikler için, bu dalga boyunda absorbansı kaydetmek için ayrı bir kuyu hazırlayın. GA için ayrı bir kuyu hazırlamayın, çünkü GA, tahlilde kullanılan konsantrasyon için 620 nm'de absorbans göstermez.
- Her bir bileşeni, Tablo 3'te gösterildiği gibi, her bir bileşenin toplam hacmiyle hazırlayın.
- Her kuyuya ultra saf su ekleyerek tahlil kuyuları kurun. Bunu takiben, gerekli miktarda tahlil tamponu ve bir bileşik çözelti (örneğin, GA çözeltisi) ekleyin.
- Ardından, uygun kuyucuklara Hsp90 ekleyin ve plakaları oda sıcaklığında bir plaka çalkalayıcıda 2 dakika çalkalayın.
- Çok kanallı pipet kullanarak 4 μL ATP çözeltisi ekleyin. Plakayı alüminyum folyoya sarın ve oda sıcaklığında bir plaka çalkalayıcıda (200 rpm) 2 dakika çalkalayın. Plakayı 3 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Malakit yeşil reaktifinin hazırlanması ve eklenmesi
- Malakit yeşil reaktifi, A (3M HCl'de amonyum molibdat) ve B (malakit yeşili ve polivinil alkol) reaktiflerinden oluşur. Kullanmadan önce reaktifi oda sıcaklığına getirin. A ve B reaktiflerini 100:1 oranında (1.000 μL:10 μL) karıştırın. Bunu kullanmadan önce 3 saat içinde hazırlayın, çünkü kararsızdır ve 3 saat sonra ayrışmaya başlar.
- Adım 1.6.5'in 3 saatinden sonra, çok kanallı bir pipet kullanarak ATP ile aynı sırada eklenen 20 μL malakit yeşil reaktifi ekleyerek reaksiyonu durdurun.
- Oda sıcaklığında 15 dakikalık bir inkübasyondan sonra, plakanın emilimini bir plaka okuyucuda 620 nm'de ölçün.
2. Hsp90 inhibitörlerinin malakit yeşil tahlili ile yüksek verimli taranması
NOT: Yüksek verimli tarama protokolü, laboratuvar ölçeğindeki metodolojiye benzer. Her durumda son kuyu hacmi 80 μL'dir. Bununla birlikte, reaktiflerin eklenme sırasına göre küçük bir fark vardır. Laboratuvar ölçeğinde tabanlı yöntemde, çözelti ilavesinin beş aşaması vardır (34 μL su, 32 μL tampon, DMSO'da 2 μL bileşik, 8 μL Hsp90 ve son olarak 4 μL ATP çözeltisi). Buna karşılık, HTS ile üç ekleme aşaması vardır (Hsp90 maya içeren 40 μL tampon çözeltisi, bileşikleri içeren 18 μL suda 2 μL DMSO ve son olarak suda çözünmüş 20 μL ATP). HTS kurulumunda doğru şekilde pipetlenebilen minimum çözelti miktarı 20 μL'dir. Bu nedenle, laboratuvar ve HTS ölçekleri arasında pipetlemede bir fark gözlenir.
- Tahlil tamponunun hazırlanması (pH 7.4)
- HTS'de laboratuvar ölçeğinde malakit yeşil tahlili ile aynı tamponu kullanın (Tablo 1).
- Maya Hsp90 hazırlanması
- Gliserol stok konsantrasyonu 0.66 mg / mL olan protein kullanın. Kullanmadan hemen önce buz üzerinde çözün.
- Her bir kuyucukta 8 μL (5.98 μg, 0.80 μM) maya Hsp90 kullanın, bu da ölçülebilir ATPaz aktivitesi sağlar.
- Her bir kuyucuk için proteini (8 μL) tamponda (32 μL) seyreltin. Her bir kuyu için nihai toplam çalışma hacmi, toplam 80 μL'lik bir tahlil hacminde 40 μL'dir.
- 0,8 mM ATP'nin hazırlanması
- 0,8 mM'lik bir çözelti elde etmek için 1 mg ATP'yi 2.267 μL damıtılmış suda çözün. Her bir kuyu için toplam çalışma hacmi, 80 μL'lik toplam tahlil hacminde 20 μL'dir.
- Geldanamisin (GA)/test bileşiklerinin hazırlanması
- DMSO'da adım 1.5'te olduğu gibi 0,8 mM'lik bir GA stoğu hazırlayın. 80 μM'lik nihai konsantrasyon vermek için GA stokunun 10 μL'sini 90 μL su ile seyreltin.
- Uygun tahlil kuyularında 80 μM GA çözeltisinin 20 μL'sini kullanın (nihai toplam tahlil kuyusu hacmi = 80 μL), 20 μM'lik bir nihai kuyu konsantrasyonu verir. Bu olumlu bir kontrol görevi görür.
- Test bileşikleri için, DMSO'da değerlendirme için istenen konsantrasyonlarına göre çözeltiler hazırlayın.
- Boş (tampon + su + DMSO) ve negatif kontrol kuyularına (tampon + su + DMSO'da Hsp90) ek olarak 90 μL suya 10 μL DMSO hazırlayın. Test bileşiklerini benzer şekilde 100 μM nihai kuyu konsantrasyonunda hazırlayın.
- Tahlil plakalarının tasarımı ve ekleme sırası
- Tahlili kurmak için dört ana plaka, bir bileşik plaka ve reaktif stokları içeren dört ek plaka kullanın (Şekil 2 ve Tablo 4).
- Ek olarak, plaka A, her bir kuyucuğa 90 μL tahlil tamponu ekleyin; ek olarak B plakası, her bir kuyucuğa Hsp90 ile 90 μL tampon ekleyin; C ve D plakalarına ek olarak, her bir kuyucuğa sırasıyla 90 μL ATP ve 90 μL malakit yeşil reaktifi ekleyin (Tablo 5 ve Tablo 6).
- Ek plaka A ve plaka B'den, otomatik bir çok kanallı dağıtım sistemi kullanarak, her bir kuyucuktan sırasıyla ana plaka 1 ve 2 ve 3 ve 4'e 40 μL çözelti aktarın. Burada Biomek(R) FXP laboratuvar otomasyon iş istasyonu kullanılmıştır (Şekil 2 ve Tablo 6).
- Bileşik plakanın her bir kuyucuğundan, çözeltinin 20 μL'sini 1, 2, 3 ve 4 numaralı ana plakalara aktarın (Şekil 2). Plakaları bir çalkalayıcıda (200 rpm) 1 dakika çalkalayın.
- C (ATP) ek plakasının her bir kuyucuğundan, 20 μL çözeltiyi 1, 2, 3 ve 4 numaralı ana plakalara aktarın (Şekil 2). Plakaları bir çalkalayıcıda (200 rpm) 1 dakika çalkalayın.
- Plakaları 37 ° C'de 3 saat boyunca inkübe edin.
- Malakit yeşil reaktifini adım 1.7'ye göre hazırlayın. 3 saat sonra, 20 μL malakit yeşil reaktifini D ek plakasından 1, 2, 3 ve 4 numaralı ana plakaların kuyucuklarına aktarın (Şekil 2).
- Oda sıcaklığında 15 dakikalık bir inkübasyondan sonra, plakanın emiliminin bir plaka okuyucuda 620 nm'de olduğunu ölçün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tahlil sonuçları, serbest fosfat iyon konsantrasyonuna bağlı absorbans açısından yorumlanır. 620 nm'de Hsp90 mayası tarafından ATP hidrolizine bağlı serbest fosfat ile emilimi,% 100 ATPaz aktivitesi veya sıfır yüzde protein inhibisyonu olarak kabul edilir. Proteinin inhibisyonu, ATP hidrolizinin (daha az serbest fosfat) kesilmesine yol açar. bu da 620 nm'de azalan absorbans açısından yansır.
Laboratuvar ölçeğinde malakit yeşil tahlilinin sonuçları
Fosfat standardı için standart grafik Şekil 3'te gösterilmiştir. Hsp90'ın aktivitesi, ATP'yi ADP'ye ve inorganik fosfata (Pi) hidrolize etme kabiliyeti açısından ölçülür. Daha yüksek bir serbest fosfat konsantrasyonu, malakit yeşili ile karmaşık oluşumda bir artışa yol açar, bu da 620 nm'de tespit edilebilen yoğun bir yeşil renge neden olur (Şekil 4).
İnhibisyon yüzdesi aşağıdaki denklemle hesaplanır:
% İnhibisyon 
Hsp90'ın absorbansı sıfır yüzde inhibisyonu (% 100 ATPaz aktivitesi) olarak kabul edildi. ATPaz aktivitesinin yüzdesi, proteinin GA tarafından doza bağımlı inhibisyonunu ölçmek için kullanılır. GA'nın proteini doza bağımlı bir şekilde, IC50 değeri 0.85 μM ile inhibe ettiği gözlendi (Şekil 5 ve Tablo 7).
IC50 değerini (moleküllerin Hsp90 ATPaz aktivitesinin% 50'sini sergilediği konsantrasyon) belirlemek için grafik yazılımının sigmoidal eğri yaklaşımı kullanılmıştır.
Malakit yeşil testi ile Hsp90 inhibitörlerinin yüksek verimli taramasının (HTS) sonuçları
HTS, referans standardı olarak GA (20 μM nihai kuyu konsantrasyonu) alınarak test bileşikleri (kod 3 ila 96) ile çift olarak gerçekleştirildi. Bileşiklerin 620 nm'deki absorbansı bilinmemektedir ve bu nedenle tek başına bileşiklerin absorbansı kaydedilmiştir (ana plakalar 1 ve 2; Şekil 6). Ana plaka 3 ve 4'ün her bir kuyucuğu için absorbans değeri (Hsp90 ile; Şekil 7) plaka 1 ve 2'deki karşılık gelen absorbanstan düşüldü (tek başına bileşik). Hsp90'ın absorbansı %100 ATPaz aktivitesi olarak değerlendirildi.
İnhibisyon yüzdesi aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanmıştır:
% İnhibisyon
20 μM GA konsantrasyonu% 75.82 inhibisyon gösterdi. 100 μM bileşik 82, maya Hsp90 proteininin% 100 inhibisyonunu gösterirken, 6 ve 95 bileşikleri, 100 μM'de sırasıyla% 73.07 ve% 62.88 inhibisyon göstermiştir (Tablo 8). Diğer bileşikler proteini 100 μM'de% 50'den daha az baskıladı ve inaktif olarak kabul edildi.
Resim 1: Malakit yeşili (MG) reaktifinin reaksiyonları. (A) Malakit yeşilinin yapısı. (B) Malakit yeşil reaktifi A'nın (3 M HCl'de amonyum molibdat) Pi ile reaksiyonları ve daha sonra B reaktifi (polivinil alkolde malakit yeşili) ile reaksiyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: HTS protokolü için deneysel şema. Şekil, reaktiflerin ekleme plakalarından ana tahlil plakasına eklenme sırasını göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Standart fosfat konsantrasyonu için standart grafik. X ekseni, mikromolar içindeki Pi konsantrasyonunu temsil eder ve Y ekseninde 620 nm'de absorbans tasvir edilir. Hata çubukları iki örnek numarası arasındaki sapmayı temsil eder (n = 2). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Malakit yeşil reaktifi ilavesinden sonra renk gelişimi. Yeşil renk, yüksek fosfat konsantrasyonu ve daha fazla ATPaz aktivitesi ile daha yoğun hale gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Maya Hsp90'a karşı geldanamisin için IC50 hesaplaması. Her nokta iki belirlemenin ortalamasıdır (n = 2). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Malakit yeşil reaktifi ilavesinden sonra renk gelişimi. (A) Ana plakada renk gelişimi 1. A11 kuyusundaki pembe renk, bileşik renkten kaynaklanmaktadır. (B) Ana plakada renk gelişimi 2. A11 kuyusundaki pembe renk, bileşiğin renkli doğasından kaynaklanmaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Malakit yeşil reaktifi ilavesinden sonra renk gelişimi. Malakit yeşil reaktifinin eklenmesinden sonra renk gelişimi. (A) Ana plakada renk gelişimi 3. (B) Ana plakada renk gelişimi 4. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Stok çözümü | Son conc. | Seyreltme (Final/Stok) | 100 ml stok için gerekli miktar (Seyreltme × toplam hacim) |
| 1000 mM Tris-HCl, pH 7,4 | 200 mM | 0.2 | 20 mL |
| 1000 mM KCl | 40 mM | 0.04 | 4 mL |
| 1000 mM MgCl2 | 12 mM | 0.012 | 1,2 milyon L |
| Ultra saf su | NA | NA | 100 mL'ye kadar toplam hacim ekleyin |
Tablo 1: Tahlil tamponunun hazırlanması.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| A | Ultra saf su | Ultra saf su | Boş | Boş | |
| B | 4 μM PB | 4 μM PB | Negatif Kontrol | Negatif kontrol | |
| C | 8 μM PB | 8 μM PB | GA(100 μM) + Hsp90 | GA(100 μM) + Hsp90 | |
| D | 12 μM PB | 12 μM PB | GA(20 μM) + Hsp90 | GA(20 μM) + Hsp90 | |
| E | 16 μM PB | 16 μM PB | GA(4 μM) + Hsp90 | GA(4 μM) + Hsp90 | |
| F | 24 μM PB | 24 μM PB | GA(0,8 μM) + Hsp90 | GA(0,8 μM) + Hsp90 | |
| G | 32 μM PB | 32 μM PB | GA(0,16 μM) + Hsp90 | GA(0,16 μM) + Hsp90 | |
| H | 40 μM PB | 40 μM PB | GA(0,032 μM) + Hsp90 | GA(0,032 μM) + Hsp90 | |
| Not: Toplam kuyu hacmi 80 μL'dir. PB = Fosfat tampon standardı. | |||||
Tablo 2: 96 delikli plakanın düzeni.
| # | Boş | Negatif kontrol | Maya Hsp90 + GA |
| Tahlil tamponu | 40 μL | 32 μL | 32 μL |
| cesaret | 2 μL | 2 μL | - |
| GA | - | - | 2 μL |
| Hsp90 | - | 8 μL | 8 μL |
| ATP (4mM) | 4 μL | 4 μL | 4 μL |
| Ultra saf su | 34 μL | 34 μL | 34 μL |
| Toplam hacim | 80 μL | 80 μL | 80 μL |
Tablo 3: Her kuyunun bileşeni.
| Plaka Kimliği | Açıklama |
| 1 | Bileşik içeren ana plaka |
| 2 | Bileşik içeren ana plaka (plaka 1'in kopyası) |
| 3 | Hsp90 ve bileşik içeren ana plaka |
| 4 | Hsp90 ve bileşik içeren ana plaka (plaka 3'ün kopyası) |
| CP | Bileşik çözelti |
| A | Tampon çözeltisi |
| B | Hsp90 ile tampon çözeltisi |
| C | ATP çözümü |
| D | Malakit yeşil reaktif çözeltisi |
| Not: Tüm plakalar 96 kuyucuklu şeffaftır. Ana plaka: Son ATPaz reaksiyonunun gerçekleştiği plakalar. Plaka CP, A, B, C ve D, spesifik reaktifler içeren ek plakalardır. | |
Tablo 4: HTS testinde kullanılan plaka çeşitleri.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | CP | A | B | C | D | ||
| 1:10 DMSO'da bileşik/GA çözeltisi:su | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 90 μL | - | - | - | - | ||
| Hsp90 çözeltisi: tampon çözeltisi (1:4) | - | - | 40 μL | 40 μL | - | - | 90 μL | - | - | ||
| Tampon çözeltisi | 40 μL | 40 μL | - | - | - | 90 μL | - | - | - | ||
| ATP (0,8 mM) | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 20 μL | - | - | - | 90 μL | - | ||
| Malakit yeşil reaktifi | - | - | - | - | - | - | - | - | 90 μL | ||
| Toplam hacim | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | ||
| Not: GA = Geldanamisin. Ek plakalar CP, A, B, C ve D için, çözeltilerin ana plakalara mükemmel bir şekilde aktarılması için ekstra 10 μL alınır. | |||||||||||
Tablo 5: HTS protokolündeki her kuyunun bileşeni.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | DMSO+W | 9 | 17 | 25 | 33 | 41 | 49 | 57 | 65 | 73 | 81 | 89 |
| B | GA | 10 | 18 | 26 | 34 | 42 | 50 | 58 | 66 | 74 | 82 | 90 |
| C | 3 | 11 | 19 | 27 | 35 | 43 | 51 | 59 | 67 | 75 | 83 | 91 |
| D | 4 | 12 | 20 | 28 | 36 | 44 | 52 | 60 | 68 | 76 | 84 | 92 |
| E | 5 | 13 | 21 | 29 | 37 | 45 | 53 | 61 | 69 | 77 | 85 | 93 |
| F | 6 | 14 | 22 | 30 | 38 | 46 | 54 | 62 | 70 | 78 | 86 | 94 |
| G | 7 | 15 | 23 | 31 | 39 | 47 | 55 | 63 | 71 | 79 | 87 | 95 |
| H | 8 | 16 | 24 | 32 | 40 | 48 | 56 | 64 | 72 | 80 | 88 | 96 |
| Not: 3-96, Hsp90 inhibisyon potansiyelini değerlendirmek için kullanılan bileşik kodlardır. GA = Geldanamisin. W=Ultra saf su | ||||||||||||
Tablo 6: Ana plaka 1 ve 2 (Hsp90 olmadan) ve 3 ve 4 (Hsp90 ile) için kuyu plakası yerleştirilir.
| İyi Kurucu | % ATPaz etkinliği* | % inhibisyon |
| Hsp90 | 100 | 0.00 |
| GA(100 μM) | 17.46 | 82.55 |
| GA (20 μM) | 17.77 | 82.23 |
| GA(4 μM) | 18.27 | 81.73 |
| GA (0,8 μM) | 58.43 | 41.57 |
| GA (0,16 μM) | 91.38 | 8.62 |
| GA (0,032 μM) | 92.86 | 7.14 |
| *İki bağımsız belirleme ortalaması | ||
Tablo 7: Geldanamisinin yüzde inhibisyonu ve ATPaz aktivitesi.
| İyi Kurucu | Abs (A) | İyi Kurucu | Abs (B) | B-A | % ATPaz etkinliği* | % inhibisyon |
| Boş | 0.281 | Negatif kontrol | 0.663 | 0.383 | 100 | 0 |
| GA (20 μM) | 0.295 | GA (20 μM)+Hsp90 | 0.388 | 0.093 | 24.18 | 75.82 |
| Bileşik 6 (100 μM) | 0.3 | Bileşik 6 (100 μM) + Hsp90 | 0.403 | 0.103 | 26.93 | 73.07 |
| Bileşik 82 (100 μM) | 0.49 | Bileşik 82 (100 μM) + Hsp90 | 0.462 | -0.028 | -7.32 | 107.32 |
| Bileşik 95 (100 μM) | 0.327 | Bileşik 95 (100 μM) + Hsp90 | 0.469 | 0.142 | 37.12 | 62.88 |
Tablo 8: Geldanamisin ve seçilmiş bileşiklerin yüzde inhibisyonu ve ATPaz aktivitesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hsp90, yeni antikanser ilaç moleküllerinin keşfi için önemli bir hedeftir. Uyuşturulabilirliğinin kurulduğu 1994 yılından bu yana10, 18 molekül klinik çalışmalara ulaşmıştır. Şu anda, yedi molekül tek başına veya kombinasyon halinde22 klinik çalışmaların çeşitli aşamalarındadır. Tüm bu küçük moleküller N-terminal ATP bağlanma inhibitörleridir. Şaperonu inhibe etmenin diğer yolları (C-terminal inhibitörleri, orta alan inhibitörleri) N-terminal inhibitörleri kadar hızlı ilerlememiştir. Bu nedenle, N-terminal ATP bağlanma inhibitörü bileşikleri hala klinik olarak pazarlanabilir bir moleküle ilerleme vaat etmektedir. Ayrıca, Haziran 2022'de onaylanan tek Hsp90 inhibitörü (Japonya'da GIST tedavisi için Pimitespib), bir N-terminal ATP bağlayıcı molekül9'dur. Ancak bugüne kadar tek bir molekül dünyanın diğer bölgelerinde pazarlanabilir bir aşamaya ulaşmamıştır23,24. Bu başarısızlığın, formülasyon sorunları, ototoksisite gibi toksisiteye ek olarak moleküllerin üretim maliyeti ve az sayıda bileşikle ilişkili kardiyotoksisite dahil olmak üzere birkaç ana nedeni vardır. Bu olumsuz etkilerin üstesinden gelmek için, Hsp90 N-terminal seçici inhibitörleri (alfa ve beta) şimdiaraştırılmaktadır 25,26,27. Yukarıda belirtilen tüm tartışmalar, ATP bağlama yarığına bağlanarak Hsp90 aktivitesini baskılayacak olan bileşiklerin HTS taramasını garanti eder.
İlaçların keşfi için yapılan testlerin hızlı, uygun maliyetli, hassas, kolayca tekrarlanabilir olması ve daha az tehlikeli kimyasallar ve / veya koşullar kullanması gerekir. Ek olarak, bir laboratuvar ölçeğinde ve bir HTS kurulumunda rahatça gerçekleştirilmelidir. Mevcut Hsp90 ATPaz inhibitör testlerinin ayrıntılı bir analizi yapıldı ve malakit yeşil fosfat testinin verilen kurumsal kurulumdaki herkes arasında en uygun olduğu bulundu. Diğer tahlil sistemleri bir HTS sisteminde otomasyon dostu değildi (piruvat / laktat dehidrogenaz eşleşmiş enzim)28,29; floresan polarizasyon testi30, sintilasyon yakınlık testleri, yüzey plazmon rezonans testi ve zaman çözümlü floresan rezonans enerji transferi (TR-FRET) gibi pahalı 28,29; zaman alıcı (TR-FRET)28,29; veya sintilasyon yakınlık testleri28,29 gibi radyasyon tehlikelerine sahipti. Bu nedenle, yeni Hsp90 N-terminal ATP bağlanma inhibitörlerinin tanımlanması için laboratuvar ölçeği veya HTS olarak basit bir malakit yeşil testi bu protokolde sunulmuştur.
Bu tahlildeki en büyük endişe, fosfat iyonları ile değerlendirilecek tamponların ve bitki ekstraktlarının kontaminasyonudur ve bu da yanlış sonuçlara yol açabilir. ATP'nin reaksiyon pH'ında enzimatik olmayan hidrolizi de yanlış sonuçlara yol açabilir. Yukarıda belirtilen problemler fosfatsız tamponlar (pH 7.4) kullanılarak çözülmüştür. Ek olarak, tampon + su + DMSO ile bir boşluk gerçekleştirildi ve daha sonra pozitif kontrol / numune bileşiklerinin absorbans değeri boş değerden çıkarıldı. Bu tahlil prosedüründe uyulması gereken bir önlem, ATP'nin çok kanallı pipet yoluyla her bir kuyucuğa aynı anda eklenmesi gibi reaktiflerin eklenmesine sıkı sıkıya bağlı kalmaktır. Bu, reaksiyonun her kuyucukta aynı anda, aynı inkübasyon süresinde ve daha sonra malakit yeşil reaktifinin eklenmesinden sonra aynı absorbans ölçümünde başlaması içindir. ATPaz reaksiyonu zamana oldukça duyarlıdır ve bu nedenle reaksiyon başlatma ve sonlandırma zamanında, inkübasyon süresinde ve absorbans kaydetme süresinde hafif bir değişiklik tahlil sonuçlarını büyük ölçüde etkileyebilir. Ayrıca, 10 μL% 34 sodyum sitrat çözeltisinin eklenmesi (ATPaz reaksiyonunu söndürmek için kullanılır) standart eğrinin doğrusallığını etkiler ve bu nedenle tahlil protokolümüze dahil edilmemiştir.
Bu tahlilin tek sınırlaması, 620 nm'de Hsp90 mayası tarafından ATP'den salınan serbest fosfat ile gösterilenden daha yüksek absorbans gösteren bileşiklerin değerlendirilmesidir. Yanlış pozitif veya yanlış negatif, bu tür bileşiklerin durumunda ortaya çıkabilir. Bununla birlikte, bu tür bileşiklerle karşılaşma şansı çok nadirdir. Bu, bitki özlerinin ve / veya özellikle bir bileşik karışımının bulunduğu fraksiyonlarının değerlendirilmesinde sorunlu olabilir.
Sonuç olarak, laboratuvar ölçeğinden HTS'ye ölçek büyütme işlemi Hsp90 maya ile başarıyla gerçekleştirilmiştir. HTS'de olduğu gibi laboratuvar ölçeğinde de kademeli tahlil protokolü, dünya çapındaki bilim adamlarının yeni Hsp90 inhibitörlerinin keşfi için bu prosedürü benimsemelerine yardımcı olacaktır. Ek olarak, protokol ATPaz inhibitörlerinin Hsp70, Grp94, Lon proteaz, Proteaz Ti, AAA proteazlar gibi diğer ATP bağımlı proteinlere karşı keşfi için uyarlanabilir31,32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Rakip finansal çıkarlar yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Kore Ulusal Araştırma Vakfı'nın (NRF) doktora sonrası araştırmacısı olan Kore Araştırma Bursu (KRF) programı tarafından desteklenmiştir ve bilim ve BİT Bakanlığı (NRF-2019H1D3A1A01102952) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, bu projeye mali yardım sağladıkları için KIST intramural hibesine ve Okyanuslar ve Balıkçılık Bakanlığı hibe numarası 2MRB130'a müteşekkirdir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
References
- Workman, P. Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone. Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).
- Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).
- Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
- Dutta Gupta, S., Pan, C. H. Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents. International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging. Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).
- Pearl, L. H., Prodromou, C. Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).
- Park, H. -K., et al. Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1. Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).
- Hoy, S. M.
- Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).
- Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
- Sheikha, G. A., Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).
- Al-Sha'er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).
- Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).
- Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure. Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).
- Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors. Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).
- Dutta Gupta, S., et al. 2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead. Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).
- Feng, J., et al. An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application. Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).
- Gupta, S. D., et al. Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors. International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).
- Zhao, Y., et al. High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors. Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).
- Giri, A. K., Ianevski, A. High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers. Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).
- Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. Advanced Studies in Experimental and Clinical. , Apple Academic Press. 107-122 (2021).
- Jaeger, A. M., Whitesell, L.
- Yang, S., Xiao, H., Cao, L. Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment. Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074 (2021).
- Mishra, S. J., et al. The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).
- Khandelwal, A., et al. Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor. Nature Communications. 9 (1), 425 (2018).
- Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells. ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).
- Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).
- Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases. Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747 (2021).
- Howes, R., et al. A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90. Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).
- Opalińska, M., Jańska, H. AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis. Cells. 7 (10), 163 (2018).
- Ambrose, A. J., Chapman, E. Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).
- Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity. Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).
