Summary
该仔猪模型包括手术器械、窒息直至心脏骤停、复苏和复苏后观察。该模型允许每只动物进行多次采样，并且通过使用连续侵入性动脉血压、心电图和非侵入性心输出量监测，它提供了围产期窒息和新生儿心肺复苏中的血流动力学和心脏病理生理学知识。
Abstract
新生仔猪已被广泛用作围产期窒息的转化模型。2007年，我们通过引入心脏骤停来调整成熟的仔猪窒息模型。这使我们能够研究严重窒息对关键结局的影响，包括恢复自主循环（ROSC）所需的时间，以及根据心肺复苏替代方案进行胸外按压的效果。由于仔猪和人类新生儿在解剖学和生理学上的相似性，仔猪是心肺复苏和血流动力学监测研究的良好模型。事实上，这种心脏骤停模型通过对复苏方案、病理生理学、生物标志物和血流动力学监测新方法的研究，为指南的制定提供了证据。值得注意的是，偶然发现相当一部分仔猪在心脏骤停期间具有无脉电活动（PEA）可能会增加该模型的适用性（即，它可用于研究围产期以外的病理生理学）。然而，模型生成在技术上具有挑战性，需要各种技能、专职人员以及措施的良好平衡，包括手术方案和镇静剂/镇痛药的使用，以确保合理的生存率。在本文中，详细描述了该协议，以及多年来对该协议进行调整的经验。
Introduction
围产期窒息是由出生前、出生期间和/或出生后气体交换受损（低氧血症和高碳酸血症）引起的。它导致流向重要器官的血流量减少（缺血），随后出现呼吸道和代谢性混合性酸中毒。围产期窒息是一种常见的分娩并发症，每年导致全世界580,000名婴儿死亡1。正如联合国可持续发展目标3.2（即新生儿死亡率<每1000例活产12例和5岁以下儿童死亡率<每1000例活产25例）2所述，降低这一数字对于减少新生儿和5岁以下儿童的死亡至关重要。
临床上，窒息表现为新生儿缺氧缺血性脑病 （HIE）、呼吸抑制和循环衰竭3 （即重要器官缺氧缺血的症状和体征）4。因此，窒息婴儿可能需要治疗脑病，包括癫痫发作，以及先进的呼吸和循环支持。在全球范围内，每年有多达1000万婴儿需要某种形式的干预，例如触觉刺激，600万至700万婴儿在出生时需要辅助通气5。因此，围产期窒息给卫生保健系统带来巨大压力，并具有相关的社会经济影响。为了减轻围产期窒息造成的全球疾病负担，我们的研究小组认为，科学研究应调查以下重点领域：预防，包括改善产前和产科护理和随访;预后生物标志物;并优化产房复苏和稳定6.
新生儿仔猪和近期妊娠期的人类婴儿具有相似的解剖学和病理生理学7。虽然没有围产期窒息和心脏骤停的动物模型可以产生围产期过渡失败导致窒息和心脏骤停的全部方面，但仔猪是很好的转化模型。
早在 1970 年代，我们就开发了成年猪的缺氧模型8.它被研究组9成功改进，从而提供了围产期窒息10,11,12,13,14,15,16,17,18的仔猪模型。2007年，在奥斯陆大学医院11,13,15,16的外科研究所进行了仔猪心脏骤停的首次实验。逮捕模型为指南制定提供了证据10,13,15,16,19,20，以及生理研究和设备/诊断工具测试的巨大机会14,21，复苏方案（随机对照研究）13,15,16，22，以及血液和组织生物标志物10,12,20。因此，该模型已被证明是通用的，并且传统上使用一个实验系列来回答几个研究问题。这很重要，并且符合实验动物研究23的三个R（减少，替换和改进）（即减少为科学目的而牺牲的动物数量的原理）。
在以下方案中，详细描述了围产期窒息的仔猪模型，包括如何诱导、定义和确定心脏骤停。该模型已经过改进，以尽量减少接触镇静剂和手术干预，包括机械通气、窒息、复苏、复苏后观察以及血液、尿液和脑脊液标本的采集。我们的小组传统上也从死后的重要器官收集组织，但本协议中没有详细描述组织收集的过程。该模型模拟了混合呼吸和代谢性酸中毒的缺氧损伤，这反映了窒息人类新生儿的生物化学。通过侵入性血压（BP）和心率（HR）、脉搏血氧饱和度（PO）、心电图（ECG）、阻抗心动图（ICG）和近红外光谱（NIRS）评估对仔猪进行密切监测，可以详细研究围产期窒息的生理学，特别是心脏。
该模型在技术上具有挑战性，因为需要药物、手术干预和诱导心脏骤停的方法进行非常精细的平衡，以确保合理的生存率。进行实验需要充分的准备和一支敬业且运作良好的团队。实验动物的选择似乎在确保实验成功方面也起着重要作用。在本文中，我们详细描述了该协议及其经验。
Protocol
该方案已获得挪威食品安全局的批准（批准号：25030），实验是根据欧洲、挪威和机构法规进行的。复制该模型需要根据机构和国家法规获得动物实验的伦理批准，并确保根据三个Rs23进行实验。所有处理动物的人员都需要根据欧盟指令 2010/63/EU 24 的第 23 条和第24 条或同等规定获得职能 A、B 和 D 的认证。在整个实验过程中仔细监测动物，并调整麻醉、呼吸机设置、温度和动物位置，以确保动物的健康。定期批判性地评估模型及其应用，并根据要求和可能进行改进。
注意：本研究中使用的仔猪年龄为12-36小时，体重1.7-2.3公斤，性别分布均匀，是挪威地方品种，杜洛克人和约克郡人的混合种族，并且基因未改变。协议的步骤1和步骤2包括适用于整个实验的全身麻醉和数据采样程序，步骤3-10详细说明了实验程序，包括动物的准备，手术干预，窒息直至心脏骤停，复苏和复苏后观察。
1.麻醉方案（时间：适用于整个实验）
- 在耳静脉的外周静脉导管中快速推注静脉注射芬太尼（50μg/kg）和戊巴比妥（15-20mg/kg）诱导麻醉。
注意：芬太尼如果吸入或摄入是有害的，会刺激眼睛和皮肤。它也是一种受限制的药物。其供应和使用应根据限制药品的规定进行监测和管制。戊巴比妥如果摄入是有害的，会刺激眼睛和皮肤。 - 用静脉注射芬太尼（50μg/kg/h）维持麻醉直至窒息，然后在窒息期间停止，并在自发循环（ROSC）恢复后以25μg/kg/h重新开始。
注意：该模型中使用的高剂量芬太尼麻醉源于数十年来在新生儿科医生和儿科麻醉师的合作努力下改进该模型。高剂量芬太尼麻醉与成人和新生儿的心血管和血流动力学稳定性25,26有关。然而，一项针对新生仔猪的研究表明，芬太尼的使用与心率和心输出量 （CO） 降低以及平均动脉压 （MAP）、左心室舒张末期压和总外周阻力指数27 有关。 - 在整个实验过程中监测仔猪的健康状况。检查肌肉张力并评估生命体征，以确保仔猪被彻底麻醉。如果仔猪出现窘迫迹象，根据临床判断额外静脉注射芬太尼或静脉注射戊巴比妥。
2.数据采样和配准（时间：适用于整个实验）
- 为每头仔猪打印纸质箱登记表（CRF）。CRF 包含有关心率、血压（包括 MAP）、血氧饱和度 （SpO2）、局部脑血氧饱和度 （NIRS）、体温、提供的额外药物和颤抖的信息。
- 在CRF上，给仔猪一个ID号，并在首页上记录仔猪的体重和性别。
- 在稳定期和诱导窒息之前每5分钟进行一次登记。诱导窒息后，在10分钟后进行第一次登记，然后每5分钟进行一次，直到心脏骤停。如果达到 ROSC，请在 ROSC 后尽快进行登记，ROSC 后的第一个小时每 5 分钟一次，然后在观察期的剩余时间内每 30 分钟进行一次。
- 在通用报告格式上，说明何时收集不同的标本。
- 在稳定开始时收集全血和血浆，就在诱导窒息之前，心脏骤停时，在ROSC，ROSC后30分钟，60分钟，120分钟，240分钟和540分钟，以及研究结束时（570分钟）。
注意：计算每头仔猪可以抽取多少血液很重要。例如，从较小的仔猪、不稳定的仔猪和因颈部手术而失血的仔猪中抽取较少的血液。在整个实验过程中，从酸碱状态观察血红蛋白（Hb）也很重要。在这项研究中，排除了Hb<6 g/dL的仔猪。 - 在ROSC后240分钟和研究结束时（570分钟）收集尿液。
- 在稳定开始时，在诱导窒息之前，在诱导窒息后10分钟，然后每5分钟一次，直到心脏骤停。在心脏骤停时、ROSC、ROSC、ROSC 后 5 分钟、15 分钟、30 分钟、60 分钟、120 分钟、240 分钟和 540 分钟以及研究结束时（570 分钟）测量酸碱状态。
- 在研究结束时收集脑脊液（CSF）（570分钟）。
- 在稳定开始时收集全血和血浆，就在诱导窒息之前，心脏骤停时，在ROSC，ROSC后30分钟，60分钟，120分钟，240分钟和540分钟，以及研究结束时（570分钟）。
- 从中央动脉导管收集全血和血浆。
- 将 2 mL 血液从中央动脉导管抽取到肝素注射器中，并放在一边。
- 然后，将2.5毫升血液提取到新的肝素注射器中。将 0.5 mL 最后抽取的全血放入微量离心管中，并在液氮中快速冷冻。
- 将剩余的2mL置于适当大小的EDTA小瓶中，并在4°C下以1,700× g 离心10分钟。将血浆（从血沉棕黄层和红细胞中分离为顶层）移液到微量离心管中，并在液氮中快速冷冻。
- 从中央动脉导管中再抽取 0.2 mL 血液到新的肝素注射器中。将注射器放入酸碱机中（见 材料表），并填写相关信息（ID，时间点和仔猪的温度）。
- 将抽出到第一个肝素注射器的血液推回动脉导管。用肝素化生理盐水冲洗动脉导管，以确保所有血液返回仔猪循环。
- 通过耻骨上抽吸尿液收集尿液。
- 找到地标：第三低和第二低的对之间的区域，脐部下方约 2 厘米，中线外侧几毫米。
- 使用带有 23 G 套管的 10 mL 注射器。垂直推进套管约 1 厘米，然后吸出直到注射器充满尿液。将尿液放入低温管中，并在液氮中快速冷冻。
- 通过腰椎穿刺收集脑脊液。
- 将小猪侧放，将后肢向上拉向胸部。定位地标：仔猪髂嵴水平的脊柱标签之间。
- 在脊柱标签之间稍微推进 21 G 套管，直到脑脊液出现。将脑脊液放入微量离心管中，并在液氮中快速冷冻。
- 使用数据采集和分析软件（见 材料表）收集连续心电图和有创动脉血压数据（见步骤6和步骤7）。使用市售的近红外光谱仪（见 材料表）执行近红外光谱（见步骤7）。
3. 准备（时间：数周至数月，根据需要）
- 获得动物实验的伦理批准。
- 联系猪户，组织仔猪的选择（年龄：12-36小时，性别分布均匀，体重：1.7-2.3公斤），交货日期和运输安排。
注意：选择来自同一种族（在本研究中，挪威地方品种，杜洛克和约克郡的混合）和农场的仔猪，理想情况下来自同一窝和狭窄的年龄范围内，对于减少生物和生理差异很重要。 - 确保人员在设定的日期可用。
- 检查所有必要的设备是否可用，以及所有仪器和观察工具是否正常工作。检查窒息气体的有效期（8%O 2,92%N2），并且它不是空的。
- 设置实验室和所有设备，以便为接收仔猪做好准备。校准所有必要的设备。
- 在随机对照试验的情况下进行样本量估计，并准备仔猪的随机化。
4.接收仔猪（时间：从10分钟到2小时，取决于仔猪的数量）
- 在实验当天组织将家猪从农场运送到手术设施。用细木屑和热水袋覆盖容器“地板”，以保持仔猪的温度。在容器上打毛刺孔，以保证空气流通。
- 从农场主那里获取有关仔猪年龄和体重的信息。抵达时验证其体重。
- 通过将脉搏血氧仪（PO）探头（见材料表）放在仔猪的后肢上来测量SpO2和HR，而仔猪在容器中保持平静和放松。
- 准备好所有器械，并打开手术台上电加热床垫上的热量。
- 让仔猪在容器中休息，直到团队中的每个人都准备好进行麻醉诱导和手术干预。
5. 诱导麻醉、插管和机械通气（时间：15分钟）
- 准备静脉通路和插管设备。
- 将PO探头涂在后肢上，以监测麻醉和插管诱导期间的氧合和HR。
- 确保一号人抱着襁褓中的小猪保持静止和平静。确保二号患者将外周静脉导管插入耳静脉。用大约 1 mL 生理盐水冲洗导管以确认放置。用胶带固定导管。
- 将推注剂量的芬太尼和戊巴比妥注射到耳静脉中（如步骤1.1中所述）。用 1 mL 生理盐水冲洗导管。通过评估戒断反射检查仔猪是否被麻醉。
- 确保该人将仔猪置于仰卧位。张开嘴，用10厘米x 10厘米的纱布拭子将舌头拉出。保持喉部在一条直线上。
- 确保二人使用喉镜（见 材料表）抬起舌头。推进喉镜以提升会厌并观察声带。推进气管插管（ETT，见 材料表）通过声带。
注意：使用有袖带的ETT可能会使ETT通过声带的进展更具挑战性。如果插管困难，观察仔猪的生命体征尤为重要。如果生命体征下降，将面罩放在仔猪的鼻子上，将面罩连接到自动充气袋，并手动给仔猪通气，直到生命体征恢复正常。然后，再次尝试插管。如果仍然具有挑战性，请考虑给予额外剂量的戊巴比妥。在极少数情况下（例如，上气道异常），应进行气管切开术。然而，如果有经验丰富的工作人员，插管通常很容易进行。 - 将ETT连接到自充气袋（见 材料表），然后开始手动通风。
- 通过 1） 通气时双侧和对称胸部抬起，2） 肺野上的双侧和对称呼吸音，上腹部没有空气进入的声音，3） SpO2 和 HR 反应，以及 4） ETT 内凝结，确认正确的 ETT 放置。如有疑问，也可以（半）定量测量过期的CO2 。
- 给 ETT 袖带充气。用纵向分成两半的胶带将ETT固定在12-13厘米的深度（对于2公斤仔猪）。将胶带覆盖在紧邻门牙远端的ETT部分周围，并继续围绕鼻子。
- 继续手动给仔猪通气，直到将其转移到手术干预台，在那里它连接到机械呼吸机。在桌子上，使用以下设置将 ETT 连接到机械呼吸机（见材料表）：P Insp = 15-20 cm H 2 O，Peep = 5.0 cm H2O，流量 Insp = 8.0 L/min，频率 =30 bpm，TInsp = 0.34 s。
注意：如果仔猪有SpO 2 <90%，则P蛋白和频率可能会增加，直到SpO2达到≥90%。 如果复苏方案不涉及不同 FiO2的比较，则可以使用辅助供氧。 - 放置直肠温度计，并用手术胶带将其固定在仔猪尾巴上。
- 通过调节仔猪下方加热床垫的温度和/或用热自来水填充橡胶/乳胶手套并将它们放在仔猪周围的毛巾中，用温暖的毯子/毛巾像巢一样覆盖仔猪，保持仔猪的温度（38.5-39.0°C）。在手术干预期间观察仔猪的温度，并根据需要采取温度稳定措施。
6. 手术干预（时间：20分钟）
- 准备所有必要的设备，并用生理盐水填充所有导管（图1）。在CRF上写下手术干预开始的时间。
- 使用3-5个手术海绵，用5 mg / mL有色氯己定对麻醉仔猪的皮肤进行消毒。
- 用手术刀在仔猪颈部右侧做一个2.5厘米长的皮肤切口。
- 使用眼睑牵开器将切口两侧的皮肤缩回。
- 使用动脉钳解剖并暴露颈内静脉（图2）。
- 在颈静脉下放置两条尼龙 3-0 缝合线以保持其稳定。
- 一只手握住其中一条缝合线，另一只手握住中心静脉导管（图3）。插入中心静脉导管，然后拔出针头。
- 将用于将静脉（和导管）周围的静脉固定在导管内部区域（图4）的缝合线之一。
注意：确保固定缝合线没有在导管周围绑得太紧，并且结位于导管远端的近端。 - 用 1 mL 生理盐水冲洗，以确认导管的正确放置。
- 用可吸收的4-0缝合线闭合皮肤。
- 将芬太尼50μg/kg/h和平衡的碳水化合物电解质溶液（10mg/mL葡萄糖，见 材料表）连接到中心静脉导管。
- 用手术刀在仔猪颈部左侧做一个2.5厘米长的皮肤切口。使切口比颈部右侧的切口稍微内侧。
- 使用眼睑牵开器将切口两侧的皮肤缩回。
- 然后，使用动脉钳解剖并暴露颈总动脉（胸锁乳突肌内侧）。
- 在颈总动脉下放置两条尼龙 3-0 缝合线以保持其稳定。
- 一只手握住其中一条缝合线，另一只手握住中央动脉导管。插入中央动脉导管，然后拔出针头。
- 将用于将动脉（和导管）周围的动脉固定在导管在动脉内的区域的缝合线之一。
注意：确保固定缝合线没有在导管周围绑得太紧，并且结位于导管远端的近端。 - 用 1 mL 生理盐水冲洗，以确认导管的正确放置。
- 使用可吸收的 4-0 缝合线将导管翼固定在皮肤上并闭合皮肤。
- 连接到有创动脉血压监测（见 材料表），并使用数据采集和分析软件开始记录。
注意：确保在心脏水平校准有创动脉血压传感器，以获得正确的血压读数。 - 用透明敷料覆盖。现在，中央动脉导管已经就位。
- 在CRF上写下手术结束的时间。
7.稳定（时间：至少1小时，但只要需要稳定手术后的仔猪和工作人员为诱导窒息做准备）
- 将仔猪连接到心电监护设备（见 材料表）。
- 在放置电极之前，根据需要剃除并去除头发。在胸部两侧放置两个电极 - 在每个上肢的内侧。将第三个电极放在脐带的左侧。
- 将引线连接到电极，然后使用数据采集和分析软件开始记录。
- 将仔猪连接到非侵入性一氧化碳监测设备（见 材料表）。
- 在放置电极之前，根据需要剃除并去除毛发（见 材料表）。将第一个电极放在仔猪头顶，就在眼睛后面，第二个电极放在颈部左侧，第三个电极放在腹部左侧，腋窝中部在脐部水平，第四个电极放在左大腿上。
- 在设备上填写相关信息，然后开始录制。由于内部存储器有限，请根据实验持续时间调整采样率。
- 将仔猪连接到近红外光谱监测。
- 在放置电极之前，根据需要剃除并去除头发。将NIRS电极（见 材料表）放在仔猪头顶，非侵入性CO电极后面，并用非透明胶带固定以防止光线照射。
- 如果适用，将仔猪连接到额外的监测设备，如果这是实验方案的一部分，则进行超声心动图检查。
- 将仔猪放在舒适的位置，最好是俯卧。
- 进行测量和登记，并在稳定期内记录CRF（见步骤2）。
- 观察仔猪在稳定期的温度、SpO2、HR、血压和颤抖。调整机械呼吸机设置和仔猪温度，并酌情给予额外麻醉。
8.诱导窒息和心脏骤停（时间：15-60分钟，因仔猪而异）
注意：所有相关人员在诱导窒息之前都需要了解自己的角色。
- 决定开始窒息的时间（基于稳定持续时间和人员的可用性），并将其写在 CRF 上。
- 在CRF上写下仔猪的生理测量值，并在诱导窒息之前采集血液样本。
- 在窒息开始前停止芬太尼静脉注射。
- 要开始窒息，请将机械呼吸机上的氧气拨盘转到100%，并将呼吸机上的氧气软管切换到窒息气体（8%O 2,92%N2）。
- 将呼吸机速率降低 10 次充气/分钟。
- 确保仔猪的SpO2 下降，以确定诱导成功。
- 窒息 10 分钟后，将呼吸机速率再降低 10 次充气/分钟。
- 窒息10分钟后，此后每5分钟一次，获取酸碱状态，并在CRF上写下仔猪的生理测量值。持续至心脏骤停。
- 窒息 20 分钟后，将呼吸机速率再降低 10 次充气/分钟。
- 窒息30分钟后，用动脉钳夹住ETT。
- 当MAP降至20毫米汞柱以下时，开始心脏连续听诊。
注意：心脏骤停定义为听诊和/或动脉管搏动丧失引起的听不到心跳。请注意，心电图上可能发生无脉性电活动（PEA）。 - 确保那个人一个听诊心脏。当心跳不再可闻（心脏骤停）时大声呼唤，同时取下 ETT 夹。确保二号人员将呼吸机上的窒息气软管切换回氧气出口。在CRF上记录心脏骤停的时间，并启动计时器。
- 根据协议分配设置FiO 2（在本研究中，仔猪随机接受FiO2为0.21或1.0）。按如下方式设置呼吸机设置：P Insp = 30 cm H 2 O，窥视= 5.0 cmH2O，流量 = 8.0 L/min，频率 = 40 bpm，TInsp = 0.34 s。
- 从心脏骤停时间点抽取血液样本，如步骤2.5中所述。
9. 心肺复苏（CPR）（时间：0-15分钟）
注意：心肺复苏术可以根据国际复苏联络委员会 （ILCOR） 指南28 进行，胸外按压通气比为 3：1，或者根据研究目的采用不同的胸外按压通气比。
- 如果使用 ILCOR 推荐的 3：1 心肺复苏术，请执行以下步骤。
- 心脏骤停后对仔猪进行机械通气30秒。然后，开始胸外按压，目标是胸外按压通气比为 3：1。
注意：由于呼吸机执行通气而不是人，因此胸外按压和通气有时可能同时进行/不协调。 - 将胸部压缩至胸廓前后径的 1/3 深度，允许胸部完全后坐，并使用双拇指环绕手技术。目标是产生收缩压 ≥20 mm Hg。
- 胸外按压 30 秒后静脉注射肾上腺素 （0.02-0.03 mg/kg），然后每 3 分钟进行一次心肺复苏术（最多四剂）。每次肾上腺素给药后用 1 mL 生理盐水冲洗。
- 心脏骤停后对仔猪进行机械通气30秒。然后，开始胸外按压，目标是胸外按压通气比为 3：1。
- 通过观察动脉血压示踪和心电图确定 ROSC，并通过心脏听诊确诊。ROSC 的定义是稳定的、无辅助的心率≥ 100 bpm。
- 继续复苏工作直到ROSC或最多15分钟。如果心肺复苏术在 15 分钟内不成功，请停止复苏，说明死亡时间，并在 CRF 上记录。
- 如果复苏工作成功，请在 CRF 上写下 ROSC 的时间、以秒为单位的心肺复苏持续时间以及施用的肾上腺素剂量。
- 在ROSC后尽快采集血液样本和CRF登记，并按照步骤2中所述继续登记9.5小时（570分钟）。
10. ROSC后观察（时间：9.5小时）
- 重新开始芬太尼静脉输注，初始剂量为 25 μg/kg/h，并根据临床效果/要求逐渐调整剂量。
注意：在窒息期间和之后，代谢率降低，因此芬太尼IV的剂量较低。然而，一些仔猪可能需要更高的输注率，因此，观察仔猪的生命体征和反射很重要。 - 仔细监测仔猪9.5小时。根据需要调整机械呼吸机设置，以保持 SpO 2 ≥90% 并保持正常碳酸血症（温度调节的 CO2 （pCO2） 分压为 5-7.5 kPa）。
- 将仔猪温度保持在38.5-39.0°C，并按照指示进行温度校正措施。
注意：仔猪在窒息期间和之后往往会体温过低。 - 按照通用报告格式的规定，在预定的时间点采集样本和CRF登记（步骤2）。
- 在ROSC观察后9.5小时，对仔猪实施安乐死（步骤11）。
注意：一些仔猪可能无法在ROSC观察后的整个9.5小时内存活。如果仔猪表现出明显痛苦和病情恶化的迹象，请更早地进行安乐死。
11. 安乐死（时间：10分钟）
- 用必要的手术设备、用于储存组织样本的小瓶和用于快速冷冻样本的液氮准备解剖台。
- 如步骤2中所述收集研究结束（570分钟）样品。
- 静脉注射戊巴比妥150mg / kg。进行解剖，将器官样品放入标记的低温管中，并在液氮中快速冷冻。如果需要，将一半大脑储存在福尔马林中。
- 将实验样品（全血、血浆、尿液、脑脊液和器官样品）放入-80°C冰箱中，或按照计划分析以其他方式储存。
图1：带有手术工具的无菌台。 在颈部手术开始之前，手术工具准备好并存放在无菌台上。 请点击此处查看此图的大图。
图2：颈内静脉。 解剖后的颈内静脉游离并暴露。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：插入中心静脉导管。 缝合线在插入中心静脉导管之前固定。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：用于固定中心静脉导管的缝合线。 缝合线绑在静脉（和导管）周围，以将导管固定在静脉内。 请点击此处查看此图的大图。
Representative Results
仔猪被仪器化和稳定后，使用数据采集和分析软件连续收集心电图和血压测量值。窒息期间的血流动力学变化可以在软件中轻松看到（图5）。血压在窒息期间逐渐下降，直到血压 = 0 时心脏骤停。达到 ROSC 后，血压升高，然后在一段时间后，它再次恢复正常。血压和心电图数据可用于不同类型的分析，例如，心肺复苏期间冠状动脉灌注压的计算以及窒息前、窒息期间和/或之后血压和心电图节律和形态的变化。
通过阻抗心动图（一种无创心输出量测量）连续监测心搏输出量和心脏指数21。为了研究心脏损伤，测量氧化应激和厌氧代谢的心肌标志物19。此外，可以在血浆中测量包括心肌肌钙蛋白T在内的心肌酶（结果尚未发表）。
窒息会改变仔猪的生理机能。图6显示了HR（图6A）、MAP（图6B）、pH（图6C）、pCO2（图6D）、碱过量（图6E）和乳酸（图6F）在整个实验过程中如何变化的示例。正如预期的那样，窒息期间 MAP、pH 和碱过量降低，而 pCO2 和乳酸增加（混合性呼吸道和代谢性酸中毒）。在实验即将结束时，这些值将归一化。
历史上，实验是用气管造口仔猪11,13,15,16,19（即无泄漏气道）进行的。为了限制手术压力，仔猪在2019年的实验中用无袖口ETT对仔猪进行气管插管。在这些实验21中，观察到显着较低的ROSC率。因此，在最近的实验中，我们比较了使用无套囊与有囊ETT的ROSC率。当使用无囊ETT时，7/19仔猪达到ROSC，当使用有囊ETT时，5/5仔猪达到ROSC（p = 0.012）（未发表的结果）。这一发现支持了该模型中无泄漏气道的重要性。
图 5：使用数据采集和分析软件进行连续数据采样。 数据采集和分析软件中连续数据采样的示例。（A）整个实验的血压。（B）血压和心电图的逐搏复合体。实验的不同部分在图（A）中标记：1）窒息开始，2）心脏骤停和心肺复苏，3）ROSC。 请点击此处查看此图的大图。
图6：整个实验过程中心血管和代谢变量的变化。演示不同变量在整个实验中如何变化。显示的六个时间点如下：缺氧开始前（基线），缺氧10分钟，心脏骤停，ROSC，ROSC后120分钟和研究结束（ROSC后570分钟）。（A）心率（HR），（B）平均动脉压（MAP），（C）pH值，（D）CO 2分压（pCO2），（E）碱过量和（F）乳酸。请点击此处查看此图的大图。
Discussion
这种仔猪模型耗时且技术上具有挑战性，有几个关键步骤。需要在药物、手术干预和诱导心脏骤停的方法方面保持良好的平衡，以确保合理的生存率。由于该协议持续时间相对较长，并且包括几个关键步骤，因此进行实验需要充分的准备和专门且运作良好的团队，并且实验应在具有大型动物研究经验的设施中进行。我们的研究团队已经对一到三头仔猪进行了平行实验。建议在实验过程中始终至少有两人在场，如果要同时用三头仔猪进行实验，则至少要有三人。
实验中特别关键和技术上具有挑战性的部分包括以下内容：1）确保所有设备都在工作，并且所有数据采样工具都可用，工作和校准;2）良好和令人满意的机械通气，特别是在窒息前和心肺复苏期间;3）手术干预;4）诱导窒息;5）确定心脏骤停;6） 心肺复苏术;7）标本取样，特别是在心脏骤停和ROSC等时间关键点。该方案中最关键的步骤是诱导窒息和确定心脏骤停。在第一个实验中，将CO2添加到窒息气体中以密切模拟围产期窒息10,11,13,14,15,16,20的混合呼吸和代谢性酸中毒。然而，在后来的实验7,21,22中，CO2气体不可用，机械通气速率的降低，然后在20-30分钟后钳夹ETT也观察到导致混合呼吸和代谢性酸中毒。心脏骤停时的高CO2水平不仅对模拟临床情况很重要，而且还可能影响ROSC。其原因可能是心脏骤停似乎发生在特定的pH值下，并且pH值取决于乳酸和CO2。由于高碳酸血症比乳酸酸中毒更容易逆转，因此主要是呼吸道酸中毒与代谢性酸中毒可能决定仔猪从窒息中恢复的速度。其他围产期窒息或HIE仔猪模型通常在心脏骤停前开始复氧/复苏，通常根据MAP值或窒息持续时间（例如，45分钟窒息29,2小时窒息30，MAP20mmHg 31，MAP30-35mmHg 30，MAP比基线低70%29,32).该模型的优点是，通过诱导心脏骤停，可以在心脏骤停之前、期间和之后研究新生儿心肺复苏术和样本数据。值得注意的是，偶然发现相当一部分仔猪在心脏骤停期间患有PEA 7,33可能会增加该模型在围产期以外的适用性34。
多年来，该模型经过改进，以尽量减少仔猪接触镇静剂和手术干预，并改善数据抽样和登记。先前的方案10,11,13,14,15,16,20包括用七氟醚诱导麻醉。这现在已经被放弃了，因为目前的协议涉及通过耳静脉和静脉药物直接建立静脉通路。这是可能的，因为只需在经过培训的提供者插入外周静脉导管之前将仔猪包裹在毛巾中即可避免仔猪窘迫。咪达唑仑也用于第一个实验方案;然而，进行绝大多数尸检的研究人员（R.S.）的主观评估是，如果使用咪达唑仑作为连续输注，则在尸检期间大脑状况更糟。因此，我们现在只使用芬太尼静脉注射来维持麻醉。如果仔猪出现窘迫迹象，而芬太尼和/或戊巴比妥无效，则可以推注剂量使用咪达唑仑;但是，我们几乎从未管理过它。
就其他改进而言，在以前的实验中，仔猪通过声门下切口放置紧密固定的气管插管进行气管切开术。该手术提供无泄漏的气道，但会给仔猪带来手术压力。另一方面，由于仔猪的上气道较大，使用无囊ETT时气管插管与显着渗漏有关。因此，我们开始使用有囊的ETT，这导致零泄漏和显着更高的ROSC率，与气管切开仔猪的实验相当。此外，在数据抽样方面也作了一些调整。以前的一些实验7,19,22,33,35,36涉及使用放置在左颈总动脉周围的流动探针。在过去的几年里，我们在奥斯陆的研究所还没有现成的这种流动探头。我们在埃德蒙顿的实验室仍然使用颈动脉血流探头，它的使用可能会为模型提供有价值的额外血流动力学数据。以前的一些实验还涉及使用放置在左心室的压力容量导管，将其推进到其中一个颈动脉中。胸外按压的施用混淆了压力容量导管注册，在某些情况下，甚至导致导管故障和破损。因此，在逮捕模式中放弃了它的使用。最近，非侵入性一氧化碳监测器已被添加到协议中，我们专注于优化心脏骤停和心肺复苏期间的心电图信号，因为它们可能会提供有关心电图形态和PEA的宝贵信息。最后，ROSC后的观察时间从4 h延长到9.5 h，因为4 h太短，无法检测组织病理学变化，细胞死亡和某些生物标志物的变化。
该模型最重要的局限性之一，以及通常使用仔猪作为转化模型，是与产房心肺复苏术不同，产后心肺转换已经在仔猪中发生。仔猪不太可能像窒息新生儿那样具有开放的胎儿心血管分流和高肺压。尽管Fugelseth等人37使用这种仔猪窒息模型（非心脏骤停）的先前版本进行的一项研究表明，在窒息期间，仔猪的血管分流可能会重新开放，但它们对通气和血流动力学支持的反应可能不同。因此，生理测量可能并不总是代表过渡期人类新生儿。仔猪和新生儿之间也存在一些解剖学差异，例如仔猪中较大的上气道，这会导致ETT泄漏（这意味着使用有囊的ETT很重要）和较高的基础温度。
尽管存在这些局限性，但全球研究界使用仔猪作为围产期窒息的转化模型有着悠久的传统。猪在解剖学、生理学、组织学、生物化学和炎症方面与人类相似38，除了足月出生体重较低（1.5-2.5公斤）外，新生仔猪的体型与人类新生儿相当相似。其大小和解剖结构使仪器、监测、成像和收集的生物标本能够与人类新生儿相媲美。该模型还允许进行复苏研究，因为胸外按压相对容易以与人类新生儿相同的方式进行，并且猪具有类似于人类的心脏解剖学和生理学39，包括冠状动脉血液分布，传导系统的血液供应，心肌的组织学外观以及对缺血性损伤的生化和代谢反应40.另一个重要因素是新生仔猪的围产期脑发育与人类新生儿相当41，窒息导致生化反应伴有高碳酸血症和混合性呼吸和代谢性酸中毒，类似于窒息新生儿。
总而言之，这种围产期窒息模型在技术上具有挑战性且耗时。然而，它提供了有关围产期窒息期间生理和血液动力学变化的宝贵信息，允许新生儿复苏研究，并提供有关心脏骤停之前、期间和之后生理变化的宝贵信息，这可能对围产期病学以外的其他医学研究领域感兴趣。
Disclosures
作者与本文没有相关的利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们要感谢所有在我们的设施中帮助建立、开发和完善围产期窒息和心脏骤停仔猪模型的研究员和研究人员。我们要感谢挪威奥斯陆大学外科研究所和比较医学研究所动物研究机构的工作人员以及加拿大埃德蒙顿阿尔伯塔大学的研究技术人员多年来的合作。我们感谢奥斯陆大学医学生研究计划、挪威研究理事会以及挪威小岛屿发展中国家和死产协会对本出版物的经济支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid-base machine (ABL 800 Flex) | Radiometer Medical ApS, Brønshøj, Denmark | 989-963 | |
| AcqKnowledge 4.0 software for PC | Biopac Systems Inc., Goleta, CA, USA | ACK100W | |
| Adhesive aperture drape | OneMed Group Oy, Helsinki, Finland | 1505-01 | |
| Adrenaline (1 mg/mL) | Takeda AS, Asker, Norway | Vnr 00 58 50 | Dilute 1:10 in normal saline to 0.1 mg/mL |
| Arterial cannula 20 G 1,10 mm x 45 mm | Becton Dickinson Infusion Therapy, Helsingborg, Sweden | 682245 | |
| Arterial forceps | Any | ||
| Asphyxia gas, 8% oxygen in nitrogen | Linde Gas AS (AGA AS), Oslo, Norway | 110093 | |
| Benelyte, 500 mL | Fresenius Kabi, Norge AS, Halden, Norway | 79011 | |
| Biopac ECG and invasive blood pressure modules, Model MP 150 | Biopac Systems Inc., Goleta, CA 93117, USA | ECG100C, MP150WSW | |
| Box of cardboard for sample storage | Syhehuspartner HF, Oslo, Norway | 2000076 | |
| Cannula , 23G x 1 1/4"- Nr.14 | Beckton Dickinson S.A., Fraga, Spain | 300700 | |
| Cannula, 18G x 2" | Beckton Dickinson S.A., Fraga, Spain | 301900 | |
| Cannula, 21G x 1 1/2"- Nr.2 | Beckton Dickinson S.A., Fraga, Spain | 304432 | |
| Centrifuge (Megafuge 1.0R) | Heraeus instruments, Kendro Laboratory Products GmbH, Hanau, Germany | 75003060 | |
| Chlorhexidin colored 5 mg/mL | Fresenius Kabi Norge AS, Halden, Norway | 00 73 24 | |
| Combi-Stopper | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4495101 | |
| CRF form | Self-made | ||
| Desmarres eyelid retractor 13 cm x 18 mm | Any | ||
| Digital Thermometer ama-digit ad 15 th | Amarell, Kreuzwertheim, Germany | 9243101 | |
| ECG electrodes, Skintact | Leonhard Lang, Innsbruck, Austria | FS-TC1 /10 | |
| Electric heating mattress | Any | ||
| Extension set | Codan Medizinische Geräte GmbH & Co KG, Lensahn, Germany | 71.4021 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Hameln, Saksa, Germany | 00 70 16 | |
| Fine wood chips | Any | ||
| Finnpipette F1, 100-1000 µL | VWR, PA, USA | 613-5550 | |
| Fully equipped surgical room | |||
| Gas hose | Any | ||
| Gauze swabs 5 cm x 5 cm | Bastos Viegas,.a., Penafiel, Portugal | ||
| Heparin, heparinnatium 5000 IE/a.e./mL | LEO Pharma AS, Ballerup, Denmark | 46 43 27 | |
| HighClean Nonwoven Swabs, 10 cm x 10 cm | Selefa, OneMed Group Ay, Helsinki, Finland | 223003 | |
| ICON | Osypka Medical GmbH, Berlin, Germany | Portable non-invasive cardiometer | |
| ICON electrodes/ECG electrodes, Ambu WhiteSensor WSP25 | Ambu A/S, Ballerup, Denmark | WsP25-00-S/50 | |
| Infusomat Space medical pump | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 8713050 | |
| Invasive blood pressure monitoring system | Codan pvb Critical Care GmbH, Forstinning, Germany | 74.6604 | |
| Laryngoscope SunMed Greenlinen blade No 2 | KaWe Medical, Asperg, Germany | ||
| Leoni plus mechanical ventilator | Löwenstein Medical SE & Co. KG, Bad Ems, Germany | ||
| Liquid nitrogen 230 L | Linde Gas AS (AGA AS), Oslo, Norway | 102730 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 ml | Forsyningssenteret, Trondheim, Norway | 72.690.001 | |
| Microcuff endotracheal tube, size 3.5 | Avanos, GA, USA | 35162 | |
| Needle holder | Any | ||
| Neoflon, peripheral venous catheter, 24 G 0.7 mm x 19 mm | Becton Dickinson Infusion Therapy AB, Helsingborg, Sweden | 391350 | |
| Neonatal piglets 12-36 h of age | As young as possible | ||
| NIRS electrodes, FORE-SIGHT Single Non-Adhesive Sensor Kit Small | Cas Medical systems Inc., Branford Connecticut, USA | 01-07-2000 | |
| NIRS machine, FORE-SIGHT Universal, Cerebral Oximeter MC-202, Benchtop regional oximeter FORE-SIGHT | Cas Medical systems Inc., Branford Connecticut, USA | 01-06-2020 | May also use INVOS, Covidien |
| Normal saline, NaCl 9 mg/mL, 500 mL. | Fresenius Kabi Norge AS, Halden, Norway | Vare nr. 141387 | Unmixed |
| Normal saline, NaCl 9 mg/mL, 500 mL. | Fresenius Kabi Norge AS, Halden, Norway | 141388 | For IV blood pressure monitoring, add heparin (0.2 ml heparin 5000 IE/a.e./mL in 500 mL of 0.9% NaCl) |
| Nunc Cryogenic Tubes 1.8 mL | VWR, PA, USA | 479-6847 | |
| Original Perfusor Line, I Standard PE | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 8723060 | |
| Oxygen saturation monitor, MasimoSET, Rad 5 | Masimo, Neuchâtel, Switzerland | 9196 | |
| Oxygen saturation monitor, OxiMax N-65 | Covidien LP (formerly Nellcor Puritan Bennett Inc.), Boulder, CO, USA | N65-PDN1 | |
| Pentobarbital (100 mg/mL) | Norges Apotekerforening, Oslo, Norway | Pnr 811602 | |
| Pipette tips | VWR, PA, USA | 732-2383 | |
| Plastic container with holes | Any | Has to allow for circulation of air | |
| Printer labels B-492, hvit, 25 mm x 9 mm, 3000 labels | VWR, PA, USA | BRDY805911 | For nunc tubes |
| Razor, single use disposable | Any | ||
| Rubber gloves | Any | ||
| Rubber hot water bottles | Any | ||
| Self-inflating silicone pediatric bag 500 ml | Laerdal Medical, Stavanger, Norway | 86005000 | |
| Smallbore T-Port Extension Set | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 471954 | |
| Sterile surgical gloves latex, Sempermed supreme | Semperit Technische Produkte Ges.m.b.H., Vienna, Austria | size 7: 822751701 | Different sizes |
| Stethoscope | Any | ||
| Stopcocks, 3-way, Discofix | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 16494C | |
| Stylet size 3.5 | Any | ||
| SunMed Greenlinen laryngoscope blade No 2 | KaWe Medical, Asperg, Germany | ||
| Surgical blade, size 15 | Swann Morton LTD, Sheffield England | 205 | |
| Surgical forceps | Any | ||
| Surgical scissors | Any | ||
| Surgical sponges, sterile | Mölnlycke Health Care, Göteborg, Sweden | C0130-3025 | |
| Surgical swabs | Mölnlycke Health Care, Göteborg, Sweden | 159860-00 | |
| Surgical tape Micropore 2.5 cm x 9.1 m | 3M Norge AS, Lillestrøm, Norway | 153.5 | |
| Suture, Monsoft Monofilament Nylon 3-0 | Covidien LP (formerly Nellcor Puritan Bennett Inc.), Boulder, CO, USA | SN653 | |
| Suture, Polysorb Braided Absorbable | Covidien LP (formerly Nellcor Puritan Bennett Inc.), Boulder, CO, USA | GL884 | |
| Syringe 0.01-1 mL Omnifix F Luer Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 9161406V | Used for acid base blood sampling. Flush with heparin |
| Syringe 10 mL Omnifix Luer Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4616103V | |
| Syringe 2.5 mL BD Plastipak | Beckton Dickinson S.A., Madrid, Spain | 300185 | Used for blood sampling. Flush with heparinized NaCl |
| Syringe 20 mL Omnifix Luer Loc Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4617207V | |
| Syringe 20 mL Omnifix Luer Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4616200V | |
| Syringe 5 mL Omnifix Luer Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4616057V | |
| Syringe 50 mL Omnifix Luer Lock Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4617509F | |
| Syringe 50 mL Omnifix Luer Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4616502F | |
| Table drape sheet, asap drytop | Asap Norway AS, Skien, Norway | 83010705 | |
| Tape Tensoplast 2.5 cm x 4.5 m | BSN Medical, Essity Medical Solutions, Charlotte, NC, USA | 66005305, 72067-00 | |
| Timer | Any | ||
| Towels | Any | ||
| Transparent IV-fixation | Mediplast AB, Malmö, Sweden | 60902106 | |
| Ultrasound gel | Optimu Medical Solutions Ltd. Leeds, UK | 1157 | |
| Ultrasound machine, LOGIQ e | GE Healthcare, GE Medical Systems, WI, USA | 5417728-100 | |
| Utility drape, sterile | OneMed Group Oy, Helsinki, Finland | 1415-01 | |
| Vacuette K3E K3EEDTA 2mL | Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Austria | 454222 | |
| Venflon Pro Safety 22 G 0.9 mm x 25 mm | Becton Dickinson Infusion Therapy, Helsingborg, Sweden | 393222 | |
| Ventilation mask made to fit tightly around a piglet snout | Any | Typically cone shaped | |
| Weight | Any |
References
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