Summary
Her anvendes intraperitoneal injektion af leukæmiceller til at etablere og udbrede akut myeloid leukæmi (AML) hos mus. Denne nye metode er effektiv til serietransplantation af AML-celler og kan tjene som et alternativ for dem, der kan opleve vanskeligheder og uoverensstemmelser med intravenøs injektion hos mus.
Abstract
Der er et udækket behov for nye behandlinger til behandling af akut myeloid leukæmi (AML) og det tilhørende tilbagefald, der involverer stamceller fra vedvarende leukæmi (LSC'er). En eksperimentel AML-gnavermodel til test af terapier baseret på vellykket transplantation af disse celler via retro-orbitale injektioner i modtagermus er fyldt med udfordringer. Formålet med dette studie var at udvikle en nem, pålidelig og konsistent metode til at generere en robust murinmodel af AML ved hjælp af en intra-peritoneal vej. I denne protokol blev knoglemarvsceller transduceret med et retrovirus, der udtrykte humant MLL-AF9-fusionsoncoprotein. Effektiviteten af afstamningsnegative (Lin-) og Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) populationer som donor-LSC'er i udviklingen af primær AML blev testet, og intraperitoneal injektion blev vedtaget som en ny metode til at generere AML. Sammenligning mellem intra-peritoneale og retro-orbitale injektioner blev udført i serielle transplantationer for at sammenligne og kontrastere de to metoder. Både Lin- og LSK-celler transduceret med human MLL-AF9-virus indpodede godt i knoglemarven og milten hos modtagere, hvilket førte til en fuldblæst AML. Den intraperitoneale injektion af donorceller etablerede AML hos modtagere ved serietransplantation, og infiltrationen af AML-celler blev påvist i blod, knoglemarv, milt og lever hos modtagere ved flowcytometri, qPCR og histologiske analyser. Således er intra-peritoneal injektion en effektiv metode til AML-induktion ved hjælp af seriel transplantation af donorleukæmiske celler.
Introduction
Akut myeloid leukæmi (AML) er en type hæmatologisk malignitet af forskellig ætiologi med dårlig prognose1. Genereringen af AML-dyremodeller lægger grundlaget for forståelsen af dens komplekse variationer og patobiologi i et forsøg på at opdage nye terapier2. Leukemogenese hos mus involverer transplantation af donorceller, der udtrykker fusionsoncoproteiner, herunder fusioner, der involverer genet for blandet afstamning leukæmi (MLL) for kraftigt at inducere AML for at efterligne sygdommen hos mennesker3. Forskellige cellulære oprindelser af donorceller er blevet rapporteret i transplantationen af MLL-genassocieret AML4, hvor meget lidt er kendt om de celler, der er ansvarlige for sygdommens oprindelse.
Der er udviklet flere ruter til transplantation i mus; I stedet for en intra-femoral injektion, som direkte introducerer mutante donorceller i knoglemarv5, er en intravenøs injektion, der udnytter venøs sinusplexus, halevene og jugularvene, blevet brugt i vid udstrækning til at generere murin AML-modeller 6,7,8,9. I tilfælde af retroorbital injektion (r.o.) har forskellige iboende ulemper, såsom volumenbegrænsning, høj teknisk efterspørgsel, få chancer for gentagne forsøg eller fejl og potentielle øjenskader, været store anstødssten med begrænsede eller ingen levedygtige alternativer7. Haleveneinjektion kan have lignende problemer udover lokale skader; For at lette proceduren skal mus ofte opvarmes for at udvide deres haleårer10. Det er også svært at lokalisere halevenen uden en ekstra lyskilde, især i C57BL/6-stammen hos mus. Til jugular veneinjektion kræver forskningspersonale tilstrækkelig uddannelse til at lokalisere venen og begrænse mulige komplikationer. Derudover skal både venøse sinus- og jugularveneinjektioner udføres under anæstesi, hvilket tilføjer et andet niveau af kompleksitet. Det er derfor fristende at udforske nye veje til transplantation for at lette etableringen af AML-murinmodeller.
Intra-peritoneal (i.p.) injektion er almindeligt anvendt til at administrere lægemidler, farvestoffer og anæstetika 11,12,13,14,15; Det er også blevet brugt til at introducere hæmatopoietiske celler til ektopisk hæmatopoiesis16 og til at transplantere knoglemarvsafledte mesenkymale stamceller i forskellige musemodeller17,18,19,20,21. Det er dog sjældent blevet brugt til at etablere hæmatopoietiske maligniteter hos mus, især til at studere AML-sygdomsprogression.
Denne undersøgelse beskriver gennemførligheden af ip-injektion i genereringen af AML-musemodeller ud over at sammenligne transplantationseffektiviteten af afstamningsnegative (Lin-) og Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) populationer som donorceller. Disse resultater giver en enkel og effektiv måde at generere eksperimentelle modeller af AML og relaterede myeloide leukæmier. En sådan metode har potentiale til at fremme vores forståelse af sygdomsmekanismerne samt give en relativt nem model til at teste eksperimentelle terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter blev forhåndsgodkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Pennsylvania State University.
1. Fremstilling af buffere og reagenser
- Forbered ampicillin suppleret (AP) LB agar plader (sterile 10 cm plader). For at gøre dette opløses 10 g LB bouillon med agar i 400 ml destilleret vand, omrøres og bringes volumenet op til 500 ml. Steriliser opløsningen ved autoklavering, lad derefter opløsningen køle af, tilsæt 0,5 ml ampicillin (lager: 150 mg / ml) i opløsningen, og ryst den for at blande. Tilsæt straks 18 ml opløsning til en steril 10 cm plade nær en alkohollampe, lad den størkne ved stuetemperatur, og opbevar pladerne på hovedet ved 4 °C indtil yderligere brug.
- Forbered LB-medier ved at opløse 10 g LB uden agar i 500 ml destilleret vand. Opløsningen steriliseres ved autoklavering, lad opløsningen køle af, tilsæt 0,5 ml ampicillin (lager: 150 mg / ml) i opløsningen, og ryst den for at blande.
- Forbered flowbuffer ved at tilsætte 5 ml penicillin/streptomycin og 10 ml varmeinaktiveret føtalt bovint serum (hiFBS) i 485 ml 1x Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS).
BEMÆRK: For at deaktivere FBS ved opvarmning skal du placere optøede FBS-flasker i et 56 °C vandbad. Sørg for, at flaskerne ikke vælter eller på anden måde bliver nedsænket i vandbadet. Temperaturen er kritisk for fuldstændig nedbrydning; For at sikre dette skal du vente, indtil temperaturen stabiliserer sig ved 56 °C, efter at du har sat flaskerne i vandbadet. Hvirvl forsigtigt flaskerne hvert 10. minut tre gange. Lad ikke serummet inkubere i mere end 30 minutter. - Forbered vedligeholdelsesmedier ved at tilføje 50 ml hiFBS, 5 ml L-glutamin og 5 ml penicillin / streptomycin i 440 ml af Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM). Forbered transfektionsmedier ved at tilføje 50 ml hiFBS og 5 ml L-glutamin i 445 ml DMEM-medier.
- Forbered røde blodlegemer (RBC) lysisbuffer ved at tilsætte 4,145 g NH4Cl, 0,504 g NaHCO3 og 16,81 mg ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) i 500 ml destilleret vand. Forbered ufuldstændige Iscoves modificerede Dulbeccos medium (IMDM) medier ved at tilføje 75 ml hiFBS, 5 g bovin serumalbumin (BSA), 0,5 ml 10 mg / ml insulin, 2,5 ml 4 mg / ml holo-transferrin, 3,5 μL β-mercaptoethanol, 5 ml L-glutamin og 0,5 ml ciprofloxacin i 416,5 ml IMDM-medier.
- Der fremstilles 10 ml 2x IMDM-medier, hvor koncentrationen af cytokiner er dobbelt så stor som i 1x IMDM-medier, ved tilsætning af 10 μL 50 ng/μL mr-SCF, 20 μL 25 ng/μL mr-Flt3L, 20 μL 10 ng/μL mr-IL-6, 20 μL 10 ng/μL mr-IL-3, 10 μL 10 mg/ml insulin, og 50 μL 4 mg/ml holo-transferrin i 9,87 ml ufuldstændigt IMDM-medie.
BEMÆRK: Sørg for, at flowbuffer, RBC-lysisbuffer, vedligeholdelsesmedier, transfektionsmedier og ufuldstændige IMDM-medier filtreres før brug.
2. Plasmid transformation
- Optø 20 μL α-Vælg kompetente celler på is. Der tilsættes 1 μL (~2 ng) MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3-plasmid22 til optøede kompetente celler og blandes forsigtigt ved at banke på røret. Inkuber reaktionen på is i 30 min.
- Blandingen varmechokkes ved inkubation i 40 s i en varmeblok på 42 °C. Overfør straks røret på is i 2 min.
- Der tilsættes 1 ml LB-substrat (uden ampicillin) til glasset, og der rystes ved 37 °C og 200 o/min i 1 time.
- Centrifuger glasset ved stuetemperatur ved 500 x g i 4 minutter og kassér 0,9 ml supernatant. Resuspender bundfaldet i de resterende 0,1 ml LB-medier.
- De transformerede kompetente celler spredes på forvarmede (37 °C) AP LB-agarplader. Pladen inkuberes på hovedet ved 37 °C i 12-16 timer.
- Vælg en enkelt koloni, og brug de transformerede celler i 10 ml AP LB-medier natten over ved 37 °C og 200 omdr./min.
- Der tilsættes 5 ml brugte transformerede kompetente celler til 500 ml AP LB-medier i en kolbe, og kolben inkuberes natten over ved 37 °C og 200 omdr./min.
- Uddrag plasmidet ved hjælp af et plasmidekstraktionssæt i henhold til producentens anvisninger og resuspender i 0,5 ml autoklaveret ultrarent vand. Kvantificer plasmidet ved hjælp af et spektrofotometer.
3. Transfektion af Phoenix Ecotropic (pECO) celler
- Kultur 2 x 106 pECO-celler/plade i vedligeholdelsesmedier i 10 cm plader i en befugtet 5 % CO2 inkubator ved 37 °C. Sørg for, at pECO-cellerne opretholdes i eksponentiel vækstfase og aktivt deler sig før passage.
- Når cellerne bliver 80% sammenflydende, vaskes pladerne med 5 ml DPBS to gange, tilsættes 1 ml trypsin til pladen og inkuberes i en befugtet 5% CO 2 -inkubator ved 37 ° C i2 min. Cellerne høstes med 5 ml vedligeholdelsesmedier i et sterilt 15 ml rør og centrifugeres ved 4 °C og 400 x g i 3 minutter. Resuspender cellepillen i 5 ml vedligeholdelsesmedie.
- Bland 10 μL cellesuspension og 10 μL trypanblåt og læg 10 μL på et hæmocytometer for at tælle cellerne.
Celler i alt/ml = (Samlet antal celler x Fortyndingsfaktor x 104 celler/ml)/ Antal tællede kvadrater)
Der sås 2 x 106 celler/fad i 6 cm skåle ved hjælp af 5 ml vedligeholdelsesmedier til transfektion og dyrkning af cellerne i en befugtet 5 % CO2 inkubator ved 37 °C. - Udskift vedligeholdelsesmediet med 5 ml transfektionsmedier, når cellerne bliver 50% -60% sammenflydende efter 18 timers kultur.
- Opbevar transfektionsreagenset ved stuetemperatur i mindst 30 minutter før transfektion.
- Der tilsættes 5,5 μg MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3-plasmid22 til 0,5 ml almindeligt DMEM-medie i et sterilt 1,5 ml glas. Bland det forsigtigt ved at banke på røret og lad det sidde i 10 minutter.
- Tilsæt 14,6 μL (3x plasmidmængden; v / w) transfektionsreagens til røret og bank forsigtigt røret hvert 10. minut tre gange.
- Tilsæt blandingen ensartet dråbevis til alle områder af skålene med pECO-cellerne i transfektionsmedier. Flyt forsigtigt opvasken frem og tilbage 10 gange og sidelæns 10 gange. Opvasken inkuberes i en befugtet 5% CO2 inkubator ved 37 °C i 48 timer.
- Transfektionseffektiviteten måles ved florescensmikroskopi og flowcytometri for grønt fluorescerende protein (GFP) som beskrevet i22. Cellerne er først gated på FSC-A / FSC-H og FSC-A og SSC-A for at erhverve singlets. GFP + -populationen er lukket på FL1-plot ved at sammenligne den med ikke-transfekterede celler.
- Supernatanterne opsamles og filtreres gennem et 0,45 μm sprøjtefilter i et sterilt 50 ml glas. Supernatanterne anvendes straks til transduktion eller snapfryses i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C indtil yderligere anvendelse.
BEMÆRK: pECO-celler skal blandes korrekt og podes ensartet i retter. Lad cellerne sprede sig ved at flytte opvasken frem og tilbage 10 gange og sidelæns 10 gange under såning. Cellenummeret, der skal podes, kan variere afhængigt af variationerne i tællingen. For at finde det optimale såcellenummer, der kan opnå 50% -60% sammenløb efter 18 timers kultur, er såning af celler med serielle fortyndinger nyttige.
4. Lentiviral transduktion
- Aflive 8-10 uger gamle CD45.1 kvindelige C57BL6/J-mus (to til tre donormus pr. modtagermus) i et CO2 kammer.
- Steriliser hele musens krop med 70% ethanol. Placer musene på en steril kirurgisk pude på et isoporbræt og fastgør benene gennem musepotepuderne.
- Skær huden over bughulen ved midterlinjen og udvid det subkutane rum mod bagbenene med en steril saks i skarpe ender.
- Forlæng snittet fra den abdominale midterlinje ned til anklerne. Udvid det subkutane rum under bagbenene med knivene på steril saks i skarpe ender.
- Skær akillessenen med en steril saks i skarpe ender. Hold senen ved hjælp af tang med tænder og skær den anden ende, der er fastgjort til lårbenet for at fjerne gastrocnemius muskelen.
- Klip quadriceps senen fastgjort til knæet med skarp ende steril saks. Hold senen ved hjælp af tang med tænder og skær muskelhovederne fastgjort til lårbenet for at fjerne gastrocnemius muskel.
- Skær de andre muskler omkring lårbenet i enden, der er fastgjort til skinnebenet, med en steril saks i skarpe ender.
- Klip anklen med en steril saks i skarpe ender, og sørg for, at skinnebenet forbliver intakt. Hold den distale ende af lårbenet ved hjælp af tang med tænder og klip hofteleddet med en steril saks i skarp ende, hvilket sikrer, at lårbenshovedet forbliver intakt.
- Overfør skinneben og lårben til flowbuffer i et sterilt 15 ml rør.
- Adskil skinnebenet og lårbenet ved at bryde knæet med hånden. Fjern patella, brusk og lårbenskondyler for at udsætte tibialplateauet og det distale lårben manuelt. Fjern musklerne ved hjælp af en steril gasbind og blød derefter knoglerne i strømningsbuffer.
- Skær lårbenshalsen og skyl knoglemarvscellerne med flowbuffer fra begge ender af lårbenet ved hjælp af en 10 ml sprøjte med en 23 G kanyle.
- Skær tibial malleolus og skyl knoglemarvscellerne med flowbuffer fra begge ender af skinnebenet ved hjælp af en 10 ml sprøjte med en 23 G nål.
- Spred cellerne ved pipettering op og ned med en 10 ml sprøjte med en 18 G kanyle. Centrifuger enkeltcellesuspensionen ved 4 °C og 400 x g i 3 minutter.
- Supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes i 5 ml RBC-lysebuffer for at lysere RBC'erne i 3 minutter.
- Der tilsættes 5 ml flowbuffer for at stoppe lysisen, og cellesuspensionen centrifugeres ved 4 °C og 400 x g i 3 minutter.
- Anbring en 70 μm cellesi på et sterilt 50 ml rør. Suspender pelleten med 5 ml flowbuffer, bland og passér gennem cellesilen for at opsamle cellerne.
- Juster cellekoncentrationen med flowbuffer til 1 x 108/ml i rundbundede polypropylenrør.
- Vælg Lin- celler ved hjælp af et musehæmatopoietisk celleisoleringssæt i henhold til producentens anvisninger.
- Hold tre rør med 1 x 104 celler til side i 100 μL buffer til en ubesmittet kontrol og to enkelt antistoffarvede kontroller til APC-konjugeret anti-mus CD117 (c-Kit) og PE-Cy7-konjugeret anti-mus Ly-6A / E (Sca-1). Brug 1 μL antistof (fra 0,2 mg/ml stam) til hver af de enkelte antistoffarvede kontroller.
- Plet resten af cellerne i et rør med begge antistoffer (4 μL af hver fra 0,2 mg / ml lagre) i 400 μL. Inkuber rørene på is i mørke i 0,5-1 time.
- Efter farvning vaskes cellerne ved tilsætning af 1 ml flowbuffer og centrifugeres ved 4 °C og 400 x g i 3 minutter.
- Resuspender cellerne til den ufarvede kontrol og de enkelte antistoffarvede kontroller i 100 μL flowbuffer. Resuspender dobbeltantistoffarvede celler i 1 ml flowbuffer til sortering.
- Sorter hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) som en LSK-population ved hjælp af en cellesortering som beskrevet i23,24.
- Under farvning skal du belægge en steril 6 cm skål med retronectin som følger: Forbered 100 μg / ml lager af retronectin i PBS og tilsæt 0,9 ml PBS og 0,1 ml retronectin til en 6 cm skål. Overtræk fadet i en steril hætte ved stuetemperatur i 2 timer. Fjern derefter retronectinet og bloker skålen med 0,5 ml filtreret 2% BSA (i PBS) i 30 minutter. Fadet vaskes med 5 ml PBS to gange, og fadet er klar til transduktion.
- De sorterede HSC'er eller usorterede Lin-celler centrifugeres ved 4 °C og 400 x g i 3 minutter og resuspenderes i 3 ml 2x (cytokiner) IMDM-medier og 3 ml viral supernatant (genereret fra trin 3.10) i en retronectinbelagt skål. Opkuber skålen i en befugtet 5% CO2 inkubator ved 37 °C i 6 eller 24 timer.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev Lin-celler enten sorteret eller usorteret afhængigt af det eksperimentelle design.
5. Seriel transplantation (figur 1)
BEMÆRK: Primære modtagermus var 8-10 uger gamle C57BL6/J-hanmus (CD45.2). De fik vand ad libitum indeholdende antibiotika for at forhindre opportunistiske fordøjelsesinfektioner, fra 3 dage før transplantation til 7 dage efter transplantation. Primære recipientmus blev subletalt bestrålet (4,75 Gy) 3 timer før transplantation25. Isofluran blev ikke anvendt til mus med intraperitoneal injektion.
- Efter transduktion i 6 eller 24 timer høstes cellerne ved centrifugering ved stuetemperatur og 400 x g i 3 minutter. Brug trypsin til at samle cellerne, der er fastgjort til skålens bund, hvis det er nødvendigt. Supernatanten kasseres, og cellerne i forvarmet PBS resuspenderes. Bestem mængden af PBS afhængigt af antallet af modtagere (dvs. 0,1 ml / mus og 0,5 ml / mus for modtagere med henholdsvis retroorbitale og intra-peritoneale injektioner).
- De subletalt bestrålede recipientmus anbringes i et isoflurankammer (iltgennemstrømningen fastsættes til 1,0 l/min, og isofluranfordamperen sættes til 5 %). Påfør våd salve til øjnene for at forhindre tørhed under anæstesi. Musene er klar til yderligere procedurer, når hjerteslaget falder til 60 slag pr. Min.
- Injicer celler i primære recipientmus retro-orbitalt (0,1 ml/mus)7 eller intraperitonealt (0,5 ml/mus)26 med en 27 G1/2 nål. Observer musene kontinuerligt, indtil de får tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggende. Overvåg musene dagligt for deres velbefindende efter transplantationen.
- Efter 1 måned indsamles blod ugentligt ved retro-orbital blødning for at overvåge leukocytose ved at evaluere komplet blodtælling (CBC) på en hæmavet som beskrevet nedenfor.
- Placer musen sideværts efter anæstesi med isofluran (iltstrømningshastigheden indstilles til 1,0 l / min, og fordamperen af isoflurance indstilles til 5%). Musene er klar til yderligere procedurer, når hjerteslaget falder til 60 slag pr. Min.
- Proptose øjet med tommel- og pegefinger. Penetrer det venøse sinusplexus med et sterilt hemacrit-kapillarrør gennem den indre canthus.
- Saml 20-25 μL blod i et EDTA-blodopsamlingsrør og luk øjenlågene for at stoppe blødningen. Påfør en dråbe gentamicinsulfat oftalmisk opløsning på øjet.
- Ved endepunktet, når de hvide blodlegemer (WBC'er) når 4 x 10 4 celler / μL, aflives musen i et CO2 -kammer og isolerer knoglemarvscellerne ved at skylle lårbenene og skinnebenet med flowbuffer efterfulgt af RBC-lyse som nævnt i trin4.
- Ved slutpunktet høstes splenocytterne som nævnt nedenfor.
- Aflive musen i et CO2 kammer. Placer musene på en steril kirurgisk pude på et isoporbræt og fastgør benene gennem musepotepuderne. Steriliser hele musens krop med 70% ethanol.
- Skær huden og musklerne ved midterlinjen for at udsætte bughulen med en steril saks i skarpe ender. Isoler milten med en steril saks i skarpe ender og læg den i flowbuffer i et sterilt 15 ml rør.
- Milten snor sig gennem en 70 μm steril si i en 6 cm skål med 3 ml flowbuffer. Cellerne overføres fra skålen til et sterilt 15 ml rør og centrifugeres enkeltcellesuspensionen ved 4 °C og 400 x g i 3 minutter.
- Supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes i 5 ml RBC-lysebuffer for at lysere RBC'erne i 3 minutter. Der tilsættes 5 ml flowbuffer for at stoppe lysisen, og cellesuspensionen centrifugeres ved 4 °C og 400 x g i 3 minutter.
- Anbring en 70 μm cellesi på et sterilt 50 ml rør. Suspender pelleten med 5 ml flowbuffer, bland og passér gennem cellesilen for at opsamle celler.
- Identificer primære (1°) AML-celler ved at farve splenocytterne og knoglemarvscellerne med FITC-konjugeret anti-mus CD45.1-antistof og detektere på et flowcytometer. Cellerne er først gated på FSC-A / FSC-H og FSC-A og SSC-A for at erhverve singlets. CD45.1+ populationen er lukket på FL1-plottet ved at sammenligne den med ufarvede celler.
- Til sekundær (2°) transplantation resuspenderes CD45.1 AML-miltceller fra 1° ro.-modtagere i PBS (0,1 ml/mus) og injiceres retroorbitalt i CD45,2 C57BL6/J-hanmus. Parallelt resuspenderes AML-miltceller fra 1° ip-modtagere i PBS (0,5 ml / mus) og injiceres intraperitonealt i 8-12 uger gamle røde fluorescensprotein (RFP)-ekspressive Ai14TdTomato-hanmus 27.
- Ved tertiær transplantation (3°) resuspenderes AML-celler, der er isoleret fra knoglemarven eller bughulen hos 2° ip-recipienter, og injiceres intraperitonealt i henholdsvis Ai14TdTomato (RFP+) eller CD45,2-mus. Resuspender AML-celler isoleret fra bughulen hos 2° ro-modtagere og transplanter dem ved r.o. injektion i Ai14TdTomato (RFP+) mus.
BEMÆRK: For 2° transplantation identificerede vi sygdomsprogressionen hos 2° modtagere ved at overvåge CBC i perifert blod. For yderligere at bekræfte etableringen af AML indsamlede vi hele perifert blod ved hjertepunktur samt knoglemarv, milt og lever. Desuden udførte vi i.p. skylning for at indsamle i.p. celler. Enkeltcellesuspensioner blev erhvervet fra knoglemarv, milt og i.p. skylning som beskrevet ovenfor. Celler fra disse steder blev analyseret på et flowcytometer efter RBC-lyse. AML-celler blev genkendt som RFP-negative (RFP-) celler. Til 3°-transplantation tog vi blodprøver fra blod, knoglemarv, milt, lever og ip-celler ved endepunktet; RFP- eller CD45.1+ celler blev identificeret som AML-celler og undersøgt ved flowcytometri. Der blev ikke givet bestråling eller antibiotikavand til 2° og 3° recipientmus.
Figur 1: Skematisk oversigt over MLL-AF9 viral transduktion i knoglemarvs-HSC'er og serietransplantation (1°, 2° og 3°). Sortering af dobbelt positiv population i Sca-1 og c-Kit ved hjælp af en cellesorterer, der vises i boksen med stiplet skygge, betragtes som valgfri, hvis ressourcerne tillader det. Figuren blev oprettet ved hjælp af BioRender (https://biorender.com/). Klik her for at se en større version af denne figur.
6. Intra-peritoneal skylning
- Injicer 5 ml ufuldstændigt IMDM-medie i bughulen to gange for at opsamle cellerne i et 15 ml sterilt rør. Centrifuger cellesuspensionen ved stuetemperatur og 400 x g i 3 min. Transplantere AML-celler (4 x 105 celler/mus) fra bughulen hos 2°-recipienter via i.p. injektion i 3° CD45.2-recipientmus (n = 3).
7. Histologisk analyse 28
- Isoler milt, lever og lårben fra mus ved eutanasi. Fastgør dem i 5 ml 10% (v / v) bufret formalin. Prøve milt og lever fra sunde modstykker til sammenligninger.
- Indlejr faste væv i paraffin og skær dem i sektioner. Plet sektionerne med hæmatoxylin og eosin (H&E) farvestoffer.
- Få billederne under et mikroskop ved 20x forstørrelse installeret med en kompatibel software til histologisk analyse.
8. Udførelse af semikvantitativ PCR (qPCR)
- Forbered RNA'er i RNA-reagens i henhold til producentens anvisninger.
- Brug 0,5-1,0 μg RNA'er til at syntetisere cDNA ved hjælp af et cDNA-revers transkriptionssæt i henhold til producentens anvisninger.
- Brug cDNA til at udføre qPCR ved hjælp af et qPCR-kit og kør prøverne i et qPCR-system. Brug følgende prævaliderede TaqMan-sonder: KMT2A (MLL; Ref Seq: NM_001197104(2), IDT)29 og 18S ribosomalt RNA (Hs99999901_s1).
- Læg KMT2A og 18S amplicons på en 2% agarosegel for at visualisere udtrykket. Hent billeder i et imager installeret med det kompatible softwareprogram.
9. Databehandling
- Analyser resultater ved hjælp af statistisk analysesoftware og præsenter resultaterne som gennemsnittet ± SEM. Generer tal ved hjælp af et kommercielt illustratorværktøj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sammenligning af transplantationseffektiviteten af murin AML-celler ved hjælp af r.o. og i.p. transplantationsveje
Tidligere blev etablering af 1° AML rapporteret i recipientmus retro-orbitalt transplanteret med MLL-AF9-transducerede LSK-celler, og transplantationsevnen af 1° AML-celler blev påvist ved serietransplantation30. Denne undersøgelse er den første, der vurderer muligheden for at anvende knoglemarvsceller til transplantation. Tilstedeværelsen af afvigende leukocytose (figur 2A) og øget infiltration af leukæmiske celler (CD45.1+) i knoglemarv og milt (figur 2B) understøtter muligheden for at bruge knoglemarvsLinceller til at generere 1° AML. For at sammenligne sygdomsinduktionsperioden blev to donormus pr. modtager aflivet for at isolere enten LSK eller Lin-celler. Fra resultaterne blev der ikke observeret signifikante forskelle i 1° recipienter transplanteret med LSK eller Lin-celler (figur 2C).
Under undersøgelsen af metastaser på 1° AML blev det opdaget, at AML-cellerne spredte sig i bughulen hos 1°-modtagere af MLL-AF9-transducerede Lin-celler (supplerende figur 1). Dette fund inspirerede udforskningen til at teste, om ip-injektion kunne anvendes i dannelsen af murin AML, hvilket kan tjene som en ny og lettere transplantationsvej. På grund af succesen med at bruge knoglemarvspopulationen som AML-donorceller bekræftede aktuelle data etableringen af 1° AML via i.p. injektion af MLL-AF9-transducerede knoglemarvs-Lin-celler, som det ses i form af leukocytose (figur 2D) og tilstedeværelsen af AML-celler (CD45.1+) i knoglemarv og milt hos modtagermus (figur 2E). Transplantation via ip-injektion tog imidlertid længere tid at udvikle AML end via r.o.-injektion, på trods af at modtagerne fik et tilsvarende antal donorceller (figur 2F). Desuden syntes mus transplanteret retro-orbitalt med flere Lin-celler (5,125 x 10 6 celler / mus) i figur 2F at udvikle AML hurtigere end dem, der transplanteres med færre Lin-celler (3,69 x 10 6 celler / mus) i figur 2C.
På grund af den iboende inkonsekvens af inkubationstiden hos 1° AML-modtagere (figur 2F) blev der gjort forsøg på at teste i.p.-transplantationen hos 2°-modtagere. Til 2° transplantation blev i.p. injektion udført med 8 x 105 AML-celler isoleret fra intraperitonealt transplanterede 1°-modtagere. De 2° modtagere viste leukocytose (figur 2G) og signifikant hepatosplenomegali (figur 2H) på mindre end 1 måned efter transplantation, en klar fremgang fra 1° transplantation. I overensstemmelse med denne observation blev AML-celler (RFP-) også påvist i perifert blod, knoglemarv og milt (figur 2I) såvel som i bughulen (supplerende figur 1). Desuden bekræftede ekspressionen af onkogen KMT2A i blod, milt og lever hos 2°-modtagere også den vellykkede generering af AML (figur 2J). Desuden viste histologisk analyse yderligere infiltrationen af leukæmiske celler i milten og leveren hos intraperitonealt transplanterede mus (figur 2K). Disse data bekræfter, at i.p. injektionsgenererede 1° AML-celler kan transplanteres hos 2°-modtagere. Desuden opnåede i.p. injektion af 8 x 105 AML-celler pr. mus i recipienter sammenlignelig engraftment med r.o. injektion af 8 x 105 AML-celler pr. mus i recipienter (figur 2L).
En af nøglefunktionerne i LSC'er er serietransplantation; For yderligere at fastslå etableringen af AML hos 2°-recipienter forsøgte denne protokol således at verificere, om AML-celler fra 2° i.p.-transplantation forblev serietransplanteret, samt gennemførligheden af stamcelletransplantation ved i.p.-injektion i 3°-transplantation. AML-celler isoleret fra enten knoglemarv (8 x 105 leukæmiske celler/mus i 0,5 ml PBS) eller i.p. skylning (4 x 10 5 leukæmiske celler/mus i0,5 ml PBS) af 2° recipienter blev injiceret i 3° recipienter. Selvom de blev transplanteret med donorceller genereret fra forskellige kilder, udviste 3° modtagermus akut AML-tegn (inden for 3 og 4 uger for henholdsvis knoglemarvsceller og ip-celler), herunder leukocytose (figur 3A) og hepatosplenomegali (figur 3B), tilstedeværelsen af leukæmiske celler i blodet, knoglemarven og milten (figur 3C) og ekspressionen af KMT2A (figur 3D ). Histologisk observation af lårbenet og milten demonstrerede yderligere infiltrationen af leukæmiske celler (figur 3E). Til sammenligning var bl.a. injektion af leukæmiske splenocytter (4 x 105 celler) fra 2°-recipienter også i stand til at indpode og udvikle AML hos 3°-recipienter, karakteriseret ved leukocytose (supplerende figur 2A), hepatosplenomegali (supplerende figur 2B) og infiltration af AML-celler i blod, knoglemarv og milt (supplerende figur 2C).
Intra-peritoneal transplantation er effektiv selv ved 3° transplantation af AML-celler
Sammenlignet med 2°- og 3°-transplantationerne kunne man let konkludere, at 3°-transplantationen (figur 3F) skred meget hurtigere frem end 2°-transplantationen (figur 2L) for både i.p.- og r.o.-injektioner. Især i.p. injektion af 4 x 105 AML-celler/mus udviklede AML senere end r.o. injektion af samme antal AML-celler i 6 dage (figur 3F), hvilket muligvis indikerer den tid, der bruges på migrationen fra bughulen til knoglemarvsnichen. Interessant nok antydede den høje frekvens af leukæmiske celler i bughulen (supplerende figur S2) i de 3 ° transplanterede mus, at bughulen også kan give niche til hurtig ekspansion af leukæmiske celler. Desuden indikerede tilstedeværelsen af leukæmiske celler i bughulen hos 1 ° og 3 ° modtagere transplanteret retro-orbitalt den gensidige cirkulation af leukæmiske celler mellem bughulen og blodsystemet, hvilket retfærdiggjorde ip-transplantationen. Samlet set validerer disse resultater brugen af ip-injektion i serietransplantation af AML.
Figur 2: Generering af murine AML-model ved 1°- og 2°-transplantation. (A) Komplet blodtælling (CBC; 1 x 10 3 celler/μL blod), WBC, neutrofil (NE), lymfocyt (LY), monocyt (MO), eosinofil (EO) og basofil (BA) profil af 1° recipientmus transplanteret retroorbitalt med MLL-AF9-transduceret knoglemarv Linceller (5,125 x 106 celler/mus) af hæmavet (n =3). (B) Flowcytometrisk analyse af hyppigheden af AML-celler (CD45.1+) i knoglemarv og milt hos 1° CD45.2-modtagermus transplanteret retroorbitalt med MLL-AF9-transducerede knoglemarvs-Lin- (5.125 x 106 celler/mus) celler (n = 3). (C) Inkubationsvarighed på 1° AML hos recipienter transplanteret retroorbitalt med MLL-AF9-transducerede LSK-celler fra knoglemarven (3,16 x 105 celler/mus isoleret fra to donorer, n = 4) eller Lin-celler (3,69 x 106 celler/mus isoleret fra to donorer, n = 3). Hver modtager modtog celler isoleret fra to donorer. (D) CBC-analyse af 1° recipientmus transplanteret intraperitonealt med MLL-AF9-transducerede knoglemarvsLinceller (5,125 x 106 celler/mus) af hæmavet (n = 4). (E) Flowcytometrisk analyse af hyppigheden af AML-celler (CD45.1+) i knoglemarv og milt hos 1° CD45.2-modtagermus transplanteret intraperitonealt med MLL-AF9-transducerede knoglemarvsLinceller (5,125 x 106 celler/mus, n = 3). F) Inkubationsvarighed på 1° AML hos recipienter transplanteret retroorbitalt (n = 3) eller intraperitonealt (n = 3) med MLL-AF9-transducerede knoglemarvs-Linceller. Hver modtager modtog det samme antal donorceller (5,125 x 106 celler/mus). G) CBC-analyse af 2°-recipienter transplanteret intraperitonealt med AML-celler (8 x 105 celler/mus) isoleret fra milten hos 1° i.p. transplanterede recipienter ved hæmavet (n = 3). (H) Vægt (mg) af milt og lever fra 2° recipientmus transplanteret intraperitonealt med AML-celler (8 x 105 celler/mus) isoleret fra milten hos 1° i.p. transplanterede recipienter. De skraverede områder repræsenterer de normale vægtområder for milt og lever. Repræsentativt billede af milt og lever fra 2° modtagermus og raske modstykker. (I) Flowcytometrisk analyse af hyppigheden af AML-celler (RFP-) i blod, knoglemarv og milt hos 2° RFP+ recipientmus transplanteret intraperitonealt med AML-celler (8 x 105 celler/mus) isoleret fra milten hos 1° i.p. transplanterede recipienter (n = 3). (J) Genekspression af KMT2A og 18S præsenteret som et DNA-bånd. RNA'er blev isoleret fra blod, knoglemarv, milt og lever fra 2° modtagermus transplanteret intraperitonealt med AML-celler (8 x 105 celler / mus) isoleret fra milten hos 1 ° i.p. transplanterede modtagere. (K) Repræsentative billeder af histologiske ændringer i milten (venstre panel) og leveren (højre panel) hos 2°-recipienter transplanteret intraperitonealt med AML-celler (8 x 105 celler/mus) isoleret fra milten hos 1° i.p. transplanterede recipienter og raske modstykker. L) Inkubationsvarighed på 2° AML hos recipienter transplanteret retroorbitalt (4 x 10 5/mus, n = 9) eller intraperitonealt (8 x 105/mus, n = 4) med AML-celler isoleret fra henholdsvis 1° r.o. og i.p. transplanterede recipienter. Resultaterne er gennemsnitlige ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: 3° transplantation af AML-celler via i.p.-transplantation. (A-E) 3° RFP+ eller CD45.2 modtagermus. Til venstre: i.p. injektion af AML-celler (8 x 105 celler/mus) fra knoglemarven hos 2°-modtagere. Til højre: i.p. injektion af AML-celler (4 x 105 celler/mus) fra bughulen (i.p.) hos 2° recipienter (n = 3). (A) CBC-analyse af 3° recipientmus foretaget af hemavet. B) Miltens og leverens vægt (mg) fra 3°-recipientmus. De skyggefulde områder repræsenterer miltens og leverens normale vægtområder. (C) Flowcytometrisk analyse af frekvensen af AML-celler (venstre: RFP-; højre: CD45.1+) i blod, knoglemarv og milt hos 3° modtagermus. (D) Genekspression af KMT2A og 18S præsenteret som et DNA-bånd. RNA'er blev isoleret fra blod, knoglemarv, milt og lever fra 3° modtagermus. (E) Repræsentative billeder af histologiske ændringer i milten (venstre panel) og lårbenet (højre panel) hos 3° modtagermus. F) Inkubationsvarighed på 3° AML hos recipienter transplanteret retroorbitalt (4 x 10 5 celler/mus, n = 3) eller intraperitonealt (4 x 105 celler/mus, n = 3) med AML-celler isoleret fra henholdsvis 2° r.o. og i.p. transplanterede recipienter. Resultaterne er gennemsnitlige ± SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Flowcytometrisk analyse af AML-celleinfiltration i bughulen. Hyppighed af AML-celler i peritonealskylning af 1°-recipienter transplanteret retroorbitalt (1°RO, n = 2), 2°-recipienter transplanteret intraperitonealt (2° IP, n = 2) og 3°-recipienter transplanteret via i.p. injektion med knoglemarvs-AML-celler (3°BM-IP, n = 3) og i.p. AML-celler (3° IP-IP, n = 3), samt 3°-recipienter transplanteret via r.o. injektion af AML-splenocytter (3° SP-RO, n = 3). Resultaterne er gennemsnitlige ± SEM. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: 3° transplantation af AML-splenocytter via r.o. injektion. A) CBC-analyse af 3° recipientmus retroorbitalt transplanteret med AML-celler (4 x 105 celler/mus) fra milten fra 2° recipientmus. B) Miltens og leverens vægt (mg) af 3° retroorbitalt transplanterede recipientmus. De skyggefulde områder repræsenterer miltens og leverens normale vægtområder. (C) Hyppighed af AML-celler (RFP-) i blod, knoglemarv og milt hos 3° retroorbitalt transplanterede recipientmus (n = 3). Resultaterne er gennemsnitlige ± SEM. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Disse ovenfor beskrevne undersøgelser giver understøttende bevis for, at transplantationen af Lin-celler er sammenlignelig med LSK-celler i dannelsen af 1° murine AML. Derudover viser de aktuelle data også, at ip-injektion er en effektiv og bekvem metode til at etablere murin AML sammenlignet med intravenøs (eller r.o.) injektion.
Ud over LSK-celler er andre populationer såsom granulocyt-monocytstamfader (GMP), almindelig lymfoid stamfader (CLP) og almindelig myeloid stamfader (CMP) rapporteret at blive substitueret som donorceller i dannelsen af 1 ° MLL-AF9-induceret AML med forskellige inkubationsvarigheder31,32, selvom kvantitativ sammenligning mangler for at foreslå det optimale valg. I den aktuelle undersøgelse havde Lin- og LSK-isoleret fra de samme donormus ingen åbenbar forskel i dannelsen af 1° MLL-AF9-induceret AML, da transducerede myeloide stamceller (Sca-1-) var i stand til at initiere AML33. I betragtning af den udgift og tid, der kræves til flowcytometribaseret sortering af LSK-population, understøtter disse undersøgelser brugen af Lin-populationen som donorceller til 1°-transplantation. Således er trinene fra 4.19 til 4.23 i denne protokol ikke nødvendige, men valgfrie og påvirker ikke det endelige resultat.
Med hensyn til mængden af donormus i 1° transplantation var en donor i stand til at levere ~ 1,0 til 1,5 x 105 LSK-celler, og en modtager transplanteret med denne mængde LSK-celler udviklede 1 ° AML på cirka 4 måneder. Men at øge antallet af donorer til at opbygge LSK-celler op til ~ 3 x 105 celler pr. Modtager kan forkorte inkubationsvarigheden til ~ 70 dage. To donorer bør således være nok til hurtigt at generere 1° AML. Dette princip gælder også for Lin-celler, hvor ~1,0 til 2,5 x 106 Lin-celler kan isoleres fra hver donormus. Men når donorcelletætheden blev øget, var behandlingstiden for leukenese betydeligt kortere. Disse data bør tages i betragtning, når antallet af donormus i trin 4.1 bestemmes.
Sammenlignet med r.o. injektion tog ip-injektion omkring ~ 20 dage mere at udvikle den fuldblæste 1 ° AML, men denne begrænsning blev overvundet ved at øge donorcellerne til i.p. injektion. På trods af en sådan tilsyneladende forskel viste begge metoder en lignende indkapslingsrate (>80 %) i knoglemarv og milt ved endepunktet, hvilket indikerer den generelle anvendelighed af ip-injektion i 1°-transplantation ved AML. Den relativt lange inkubationstid for 1° transplantation samt dens uforudsigelige sygdomsprogression med hensyn til inkonsekvens af latenstid hos modtagermus er en væsentlig begrænsning for kontrollerede forsøg, såsom farmakologiske interventioner og mekanistiske undersøgelser. Det anbefales derfor at anvende 1° leukæmiske celler til transplantation ved efterfølgende serielle transplantationer, typisk 2° transplantation (figur 1). Da der kan genereres op til 3 x 108 leukæmiske celler i milten (og 6 x 107 celler i knoglemarven) fra hver enkelt 1°-modtager ved endepunktet, hvilket ville være tilstrækkeligt til at udføre 2°-transplantation på mere end 300 mus, foreslås det at transplantere så mange celler som muligt til færre recipienter for at forkorte latenstiden og øge indkapslingshastigheden for 1° transplantation. hvilket er vigtigt for trin 4.1 og trin 5.2.
På grund af sin konsekvente og korte latenstid kan 2 ° transplantation anvendes i flere applikationer, herunder in vivo-eksperimenter nævnt ovenfor. Desuden letter i.p. injektion også proceduren for rigelig transplantation for uerfarne teknikere. Sammenlignet med r.o. injektionsvejen, som generelt genererer AML på 3 uger, tog i.p. injektionsmetoden lidt længere tid (~4 uger) med det samme antal donorceller for at etablere en fuldblæst AML. Selvom det er relativt lettere og mere bekvemt, kan forøgelse af det transplanterede celleantal eller udførelse af tertiær transplantation også fremskynde udviklingen af AML ved i.p. injektion.
Sammenfattende er den største begrænsning ved denne teknik den længere inkubationstid end intravenøs injektion med samme mængde donorceller i både 1 ° og 2 ° transplantationer. Det kan dog let overvindes ved at øge celleantallet, der skal transplanteres. Bortset fra de åbenlyse fordele har denne teknik også nogle andre anvendelser. For eksempel kan evnen til at anvende i.p. transplantationsmetoder også tjene til rutinemæssigt at dyrke disse celler uden behov for dyre in vitro kulturmedier. For at udvide anvendelsen af denne teknik i andre hæmatologiske maligniteter, såsom lymfoid leukæmi og kronisk myeloid leukæmi og patientafledte xenotransplantater, skal der udføres yderligere undersøgelser i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne takker Huck Institute's Flow Cytometry Core Facility og Histopathology Core Facility of the Animal Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, Pennsylvania State University, for at yde rettidig teknisk support. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra American Institute for Cancer Research (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA-projekt 4771, tiltrædelsesnummer 00000005 til KSP og RFP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| a-Select competent cells | Bioline | BIO-85027 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade | Gemini bio-products | Cat# 700-102P | |
| Ciprofloxacin HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-transferrin, bovine | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Insulin solution human | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamine 200 mM (100×) solution | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB broth, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Mouse Interleukin-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
| Mouse Interleukin-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
| Mouse Stem Cell Factor (SCF) | Gemini bio-products | Cat# 300-348P | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Reagent | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Commercial Assays | |||
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
| Instruments and Softwares | |||
| Adobe illustrator | Version 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys software program | Version 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism version 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Real time PCR system | Applied Biosystems | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging | G:Box Chemi |
References
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D.
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Ernst, P., et al. Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).
- Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models. Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).
- Zhan, Y., Zhao, Y. Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection. Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).
- Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes. Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. The Laboratory Mouse. , CRC Press Inc. (2001).
- Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).
- Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).
- Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Leong, S. -K., Ling, E. -A. Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route. Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).
- Ma, P., et al. Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice. International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation. Transfusion. 51, Suppl_4 106-117 (2011).
- Zhao, W., et al. Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).
- Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).
- Cheng, K., et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms. Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).
- Castelo-Branco, M., et al. Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis. PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).
- Bazhanov, N., et al. Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs. Stem Cell Research & Therapy. 7, 27 (2016).
- Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model. Cell Death & Disease. 7 (9), 2361 (2016).
- Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. Identification and isolation of hematopoietic stem cells. Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).
- Randall, T. D., Weissman, I. L. Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population. Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).
- Gott, K. M., et al. A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model. Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L.
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin. Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).
- Qian, F., et al. Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia. FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Chen, W., et al. Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells. Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).
- Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
