Summary
ここでは、白血病細胞の腹腔内注射を利用して、マウスの急性骨髄性白血病(AML)を確立し、増殖させます。この新しい方法は、AML細胞の連続移植に効果的であり、マウスへの静脈内注射で困難や矛盾を経験する可能性のある人の代替手段として役立ちます。
Abstract
急性骨髄性白血病(AML)および持続性白血病幹細胞(LSC)を含む関連する再発を治療するための新しい治療法の満たされていないニーズがあります。レシピエントマウスへの眼窩後注射によるこれらの細胞の移植の成功に基づく治療法をテストするための実験的なAMLげっ歯類モデルは、課題に満ちています。この研究の目的は、腹腔内経路を使用してAMLの堅牢なマウスモデルを生成するための簡単で信頼性が高く、一貫した方法を開発することでした。本プロトコールでは、骨髄細胞を、ヒトMLL−AF9融合癌タンパク質を発現するレトロウイルスで形質導入した。原発性AMLの発症におけるドナーLSCとしての系統陰性(Lin-)およびLin-Sca-1+c-Kit+(LSK)集団の効率が検証され、AMLを生成する新しい方法として腹腔内注射が採用されました。腹腔内注射と眼窩後注射の比較は、2つの方法を比較対照するために連続移植で行われました。ヒトMLL-AF9ウイルスで形質導入されたLin細胞とLSK細胞の両方が、レシピエントの骨髄と脾臓によく生着し、本格的なAMLを引き起こしました。ドナー細胞の腹腔内注射は、連続移植時にレシピエントにAMLを確立し、AML細胞の浸潤は、フローサイトメトリー、qPCR、および組織学的分析によってレシピエントの血液、骨髄、脾臓、および肝臓で検出されました。したがって、腹腔内注射は、ドナー白血病細胞の連続移植を用いたAML誘導の効率的な方法です。
Introduction
急性骨髄性白血病(AML)は、予後不良の多様な病因の血液悪性腫瘍の一種です1。AML動物モデルの生成は、その複雑な変異と病理生物学を理解するための基礎を築き、新しい治療法を発見します2。マウスの白血病発生は、AMLを強力に誘導する混合系統白血病(MLL)遺伝子を含む融合癌タンパク質を発現するドナー細胞を移植して、ヒトの疾患を模倣することを含みます3。MLL遺伝子関連AML4の移植では、ドナー細胞の様々な細胞起源が報告されており、疾患起源の原因となる細胞についてはほとんど知られていない。
マウスへの移植のために複数の経路が開発されている。変異ドナー細胞を骨髄5に直接導入する大腿骨内注射ではなく、静脈副鼻腔神経叢、尾静脈、頸静脈を利用する静脈内注射がマウスAMLモデル6、7、8、9の作製に広く用いられている。眼窩後方(r.o.)注射の場合、体積制限、高い技術的要求、繰り返しの試行またはエラーの可能性の少なさ、潜在的な眼の損傷など、さまざまな固有の欠点が大きな障害であり、実行可能な代替手段が限られているか、まったくありません7。尾静脈注射は、局所的な怪我以外にも同様の問題を引き起こす可能性があります。手順を容易にするために、マウスはしばしば尾静脈を拡張するためにウォームアップする必要があります10。また、特にC57BL/6系統のマウスでは、追加の光源なしで尾静脈を見つけることは困難です。頸静脈注射の場合、研究担当者は静脈を特定し、起こりうる合併症を制限するために十分なトレーニングを必要とします。さらに、静脈洞と頸静脈の両方の注射を麻酔下で行う必要があり、これは別のレベルの複雑さを追加します。したがって、AMLマウスモデルの確立を促進するために、移植の新しいルートを模索するのは魅力的です。
腹腔内(i.p.)注射は、薬物、染料、および麻酔薬の投与に一般的に使用されます11、12、13、14、15;また、異所性造血のための造血細胞の導入16や、骨髄由来間葉系幹細胞の移植にも使用されています17、18、19、20、21。しかし、マウスの造血器悪性腫瘍の確立、特にAML疾患の進行を研究するためにめったに使用されていません。
本研究では、ドナー細胞としての系統陰性(Lin-)およびLin-Sca-1+c-Kit+(LSK)集団の移植効率を比較することに加えて、AMLマウスモデルの生成におけるi.p.注射の実現可能性について説明します。これらの知見は、AMLおよび関連する骨髄性白血病の実験モデルを簡単かつ効率的に生成する方法を提供する。このような方法は、疾患メカニズムの理解を深めるだけでなく、実験的治療法をテストするための比較的簡単なモデルを提供する可能性があります。
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Protocol
すべての実験は、ペンシルベニア州立大学の施設内動物管理および使用委員会によって事前に承認されました。
1. 緩衝液および試薬の調製
- アンピシリン補充(AP)LB寒天プレート(滅菌10cmプレート)を準備する。これを行うには、10 gのLBブロスを400 mLの蒸留水に寒天で溶解し、攪拌し、容量を500 mLまで上げます。オートクレーブ滅菌し、溶液を冷まし、溶液にアンピシリン(ストック:150 mg/mL)0.5 mLを加え、振って混合します。アルコールランプの近くの滅菌10 cmプレートに18 mLの溶液をすぐに加え、室温で固化させ、さらに使用するまでプレートを逆さまに4°Cで保管します。
- 寒天を含まないLB10 gを500 mLの蒸留水に溶解してLB培地を調製します。オートクレーブ滅菌し、溶液を冷まし、溶液にアンピシリン(ストック:150 mg/mL)0.5 mLを加え、振って混合します。
- 5 mLのペニシリン/ストレプトマイシンと10 mLの熱不活化ウシ胎児血清(hiFBS)を485 mLの1xダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に加えて、フローバッファーを調製します。
注意: 加熱してFBSを不活性化するには、解凍したFBSボトルを56°Cの水浴に入れます。ボトルが転倒したり、水浴に沈んだりしないようにしてください。温度は完全な劣化にとって重要です。これを確実にするには、ボトルを水浴に入れた後、温度が56°Cで安定するまで待ちます。ボトルを10分ごとに3回静かに回転させます。血清を30分以上インキュベートしないでください。 - 440 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に50 mLのhiFBS、5 mLのL-グルタミン、および5 mLのペニシリン/ストレプトマイシンを加えて、維持培地を準備します。445 mLのDMEM培地に50 mLのhiFBSと5 mLのL-グルタミンを加えてトランスフェクション培地を調製します。
- 4.145 gのNH4Cl、0.504 gのNaHCO3、および16.81 mgのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を500 mLの蒸留水に加えて、赤血球(RBC)溶解バッファーを調製します。416.5 mLのIMDM培地に75 mLのhiFBS、5 gのウシ血清アルブミン(BSA)、0.5 mLの10 mg/mLインスリン、2.5 mLの4 mg/mLホロトランスフェリン、3.5 μLのβ-メルカプトエタノール、5 mLのL-グルタミン、および0.5 mLのシプロフロキサシンを加えて、不完全なイスコーブ改変ダルベッコ培地(IMDM)培地を調製します。
- サイトカインの濃度が1x IMDM培地の2倍の量である2x IMDM培地を10 mL調製し、50 ng/μL mr-SCFを10 μL、25 ng/μL mr-Flt3Lを20 μL、10 ng/μL mr-IL-6を20 μL、10 ng/μL mr-IL-3を20 μL、10 mg/mLインスリンを10 μL添加し、 50 μLの4 mg/mLホロトランスフェリンを9.87 mLの不完全なIMDM培地に入れます。
注:使用前に、フローバッファー、RBC溶解バッファー、メンテナンス培地、トランスフェクション培地、および不完全なIMDM培地がフィルター滅菌されていることを確認してください。
2. プラスミド形質転換
- 20 μLのα-Selectコンピテントセルを氷上で解凍します。1 μL(~2 ng)のMSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3プラスミド22 を融解したコンピテントセルに加え、チューブをタップして穏やかに混合します。氷上で反応を30分間インキュベートします。
- 混合物を42°Cの加熱ブロック中で40秒間インキュベートすることにより、ヒートショックを与える。すぐにチューブを氷上に2分間移します。
- 1 mLのLB培地(アンピシリンなし)をチューブに加え、37°C、200 rpmで1時間振とうします。
- チューブを室温で500 x g で4分間遠心分離し、0.9 mLの上清を廃棄します。沈殿物を残りの0.1 mLのLB培地に再懸濁します。
- 形質転換したコンピテントセルを、予め温めた(37°C)APLB寒天プレート上に広げます。プレートを逆さまにして37°Cで12〜16時間インキュベートします。
- 単一のコロニーを選び、形質転換細胞を10 mLのAP LB培地中で37°C、200 rpmで一晩消費します。
- フラスコ内の500 mLのAP LB培地に5 mLの消費形質転換コンピテントセルを加え、フラスコを37°Cおよび200 rpmで一晩インキュベートします。
- 製造元の指示に従ってプラスミド抽出キットを使用してプラスミドを抽出し、0.5 mLのオートクレーブ処理した超純水に再懸濁します。分光光度計を用いてプラスミドを定量する。
3. フェニックスエコトロピック(pECO)細胞のトランスフェクション
- 2 x 106 pECO細胞/プレートを、37°Cの加湿5%CO2 インキュベーター内の10 cmプレート内の維持培地で培養します。 pECO細胞が指数関数的成長期に維持され、継代前に活発に分裂していることを確認してください。
- 細胞が80%コンフルエントになったら、プレートを5 mLのDPBSで2回洗浄し、1 mLのトリプシンをプレートに加え、加湿した5%CO2 インキュベーター内で37°Cで2分間インキュベートします。滅菌済みの15 mLチューブで5 mLの維持培地で細胞を回収し、4°Cおよび400 x g で3分間遠心分離します。細胞ペレットを5 mLの維持培地に再懸濁します。
- 10 μLの細胞懸濁液と10 μLのトリパンブルーを混合し、10 μLを血球計算盤にロードして細胞をカウントします。
総細胞数/mL = (カウントされた細胞の総数 x 希釈係数 x 104 細胞/mL)/ カウントされたマスの数)
トランスフェクション用の5 mLの維持培地を使用して2 x 10 6細胞/ディッシュを6 cmディッシュに播種し、37°Cの加湿5%CO2 インキュベーターで細胞を培養します。 - 培養18時間後に細胞が50%〜60%コンフルエントになったら、維持培地を5 mLのトランスフェクション培地と交換します。
- トランスフェクション前に、トランスフェクション試薬を室温で少なくとも 30 分間保持してください。
- 5.5 μgのMSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3プラスミド22 を滅菌1.5 mLチューブ内の0.5 mLのプレーンDMEM培地に加えます。チューブを軽くたたいて穏やかに混ぜ、10分間放置します。
- 14.6 μL(プラスミド量の3倍、v/w)のトランスフェクション試薬をチューブに加え、10分ごとにチューブを3回軽くたたきます。
- トランスフェクション培地中のpECO細胞を含むディッシュのすべての領域に混合物を均一に滴下します。皿を前後に10回、横に10回ゆっくりと動かします。加湿した5%CO2 インキュベーターで皿を37°Cで48時間インキュベートします。
- 22に記載の緑色蛍光タンパク質(GFP)の蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーによりトランスフェクション効率を測定する。細胞は最初にFSC-A/FSC-H、FSC-AおよびSSC-Aにゲーティングされ、シングレットを獲得します。GFP+集団は、トランスフェクトされていない細胞と比較することにより、FL1プロット上でゲートされます。
- 上清を収集し、0.45 μmシリンジフィルターを通して滅菌50 mLチューブにろ過します。上清はすぐに形質導入に使用するか、液体窒素で急速凍結し、さらに使用するまで-80°Cで保存してください。
注:pECO細胞は適切に混合され、皿に均一に播種されなければなりません。播種中に皿を前後に10回、横に10回動かして、細胞を広げます。播種する細胞数は、カウントのばらつきに応じて変化し得る。培養18時間後に50%〜60%のコンフルエントを達成できる最適な播種細胞数を見つけるには、段階希釈で細胞を播種することが役立ちます。
4.レンチウイルス形質導入
- CO2チャンバーで8〜10週齢のCD45.1雌C57BL6 / Jマウス(レシピエントマウスあたり2〜3匹のドナーマウス)を安楽死させます。.
- マウスの全身を70%エタノールで滅菌する。発泡スチロールボード上の滅菌外科用パッドにマウスを置き、マウスの足パッドを通して脚を固定します。
- 正中線で腹腔の上の皮膚を切り、鋭い端の滅菌ハサミで後肢に向かって皮下空間を広げます。
- 腹部の正中線から足首まで切開を伸ばします。鋭利な滅菌ハサミの刃で後ろ足の下の皮下スペースを広げます。
- 鋭い端の滅菌ハサミでアキレス腱を切ります。歯付きの鉗子を使用して腱を保持し、大腿骨に取り付けられたもう一方の端を切断して腓腹筋を取り除きます。
- 鋭利な滅菌ハサミで膝に取り付けられた大腿四頭筋腱を切ります。歯のある鉗子を使用して腱を保持し、大腿骨に取り付けられた筋肉の頭を切断して腓腹筋を取り除きます。
- 脛骨に取り付けられた端の大腿骨を囲む他の筋肉を鋭い端の滅菌ハサミで切ります。
- 鋭い先端の滅菌ハサミで足首を切り、脛骨が無傷のままであることを確認します。歯付きの鉗子を使用して大腿骨の遠位端を保持し、鋭利な滅菌ハサミで股関節を切断し、大腿骨頭が無傷のままであることを確認します。
- 脛骨と大腿骨を滅菌15mLチューブのフローバッファーに移します。
- 脛骨と大腿骨を手で膝を折って分離します。膝蓋骨、軟骨、大腿骨顆を取り除き、脛骨プラトーと遠位大腿骨を手で露出させます。滅菌ガーゼを使用して筋肉を取り除き、骨をフローバッファーに浸します。
- 大腿骨頸部を切断し、23 G針付きの10 mLシリンジを使用して、大腿骨の両端からフローバッファーで骨髄細胞を洗い流します。
- 脛骨くるぶしを切断し、23 G針付きの10 mLシリンジを使用して、脛骨の両端からフローバッファーで骨髄細胞を洗い流します。
- 18 Gの針を備えた10 mLシリンジを使用して上下にピペッティングすることにより、細胞を分散させます。単一細胞懸濁液を4°C、400 x g で3分間遠心分離します。
- 上清を廃棄し、細胞を5 mLのRBC溶解バッファーに再懸濁して、赤血球を3分間溶解します。
- 5 mLのフローバッファーを加えて溶解を停止し、細胞懸濁液を4°C、400 x g で3分間遠心分離します。
- 70 μmのセルストレーナーを滅菌済みの50 mLチューブに置きます。ペレットを5 mLのフローバッファーで懸濁し、混合し、セルストレーナーを通過させて細胞を回収します。
- フローバッファーで細胞濃度を丸底ポリプロピレンチューブで1 x 108/mLに調整します。
- 製造元の指示に従ってマウス造血細胞分離キットを使用してLin- 細胞を選択します。
- APC結合抗マウスCD117(c-Kit)およびPE-Cy7結合抗マウスLy-6A/E(Sca-1)用の1 x 104 細胞のチューブを100 μLのバッファーに3本、単一抗体染色コントロール2本用に脇に置いておきます。単一抗体染色コントロールのそれぞれに1 μLの抗体(0.2 mg/mLストックから)を使用します。
- チューブ内の残りの細胞を、400 μL中の両方の抗体(0.2 mg/mLストックからそれぞれ4 μL)で染色します。 チューブを氷上で暗闇で0.5〜1時間インキュベートします。
- 染色後、1 mLのフローバッファーを加えて細胞を洗浄し、4°Cおよび400 x g で3分間遠心分離します。
- 非染色コントロールおよび単一抗体染色コントロールの細胞を100 μLのフローバッファーに再懸濁します。二重抗体染色細胞を1 mLのフローバッファーに再懸濁して選別します。
- 造血幹細胞(HSC)を、23、24に記載のセルソーターを用いてLSK集団として選別する。
- 染色中に、次のように滅菌した6 cmディッシュにレトロネクチンをコーティングします:PBSで100 μg/mLのレトロネクチンストックを準備し、0.9 mLのPBSと0.1 mLのレトロネクチンを6 cmディッシュに加えます。皿を滅菌フードに室温で2時間コーティングします。次に、レトロネクチンを除去し、0.5 mLのろ過した2%BSA(PBS中)で30分間皿をブロックします。皿を5 mLのPBSで2回洗浄すると、皿は形質導入の準備が整います。
- 選別されたHSCまたは選別されていないLin- 細胞を4°Cおよび400 x g で3分間遠心分離し、3 mLの2x(サイトカイン)IMDM培地と3 mLのウイルス上清(ステップ3.10から生成)にレトロネクチンコーティングディッシュに再懸濁します。加湿した5%CO2 インキュベーターで皿を37°Cで6時間または24時間インキュベートします。
注:本研究では、Lin- 細胞は実験デザインに応じて選別または未選別のいずれかでした。
5.連続移植(図1)
注:主なレシピエントマウスは、8〜10週齢の雄C57BL6 / Jマウス(CD45.2)でした。彼らは、移植の3日前から移植後7日まで、日和見消化器感染症を予防するために抗生物質を含む水を 自由摂取 で提供されました。一次レシピエントマウスは、移植25の3時間前に亜致死的照射(4.75Gy)した。イソフルランは腹腔内注射のマウスには適用されなかった。
- 6時間または24時間形質導入後、室温および400 x g で3分間遠心分離して細胞を回収します。必要に応じて、トリプシンを使用して皿の底に付着した細胞を収集します。上清を廃棄し、細胞を予熱したPBSに再懸濁します。レシピエントの数に応じてPBSの容量を決定します(すなわち、眼窩後注射と腹腔内注射のレシピエントの場合はそれぞれ0.1 mL /マウスと0.5 mL /マウス)。
- 致死下照射されたレシピエントマウスをイソフルランチャンバーに入れます(酸素の流量は1.0 L / minに設定され、イソフルランの気化器は5%に設定されます)。麻酔下での乾燥を防ぐために、目に湿った軟膏を塗ります。マウスは、心拍が毎分60拍に低下すると、さらなる処置の準備ができている。
- 一次レシピエントマウスに、眼窩後(0.1 mL/マウス)7 または腹腔内(0.5 mL/マウス)26 に27 G1/2針で細胞を注入します。マウスが胸骨横臥を維持するのに十分な意識を得るまで、マウスを継続的に観察します。移植後の健康状態についてマウスを毎日監視します。
- 1か月後、眼窩後出血によって毎週採血し、以下に説明するようにヘマベットで全血球数(CBC)を評価することにより白血球増加症を監視します。
- 麻酔後、イソフルランでマウスを横方向に置きます(酸素の流量は1.0 L / minに設定され、アイソフルランスの気化器は5%に設定されます)。マウスは、心拍が毎分60拍に低下すると、さらなる処置の準備ができている。
- 親指と人差し指で目を支えます。内眼窩を通して無菌ヘマクリット毛細血管で静脈洞叢を貫通する。
- 20〜25μLの血液をEDTA採血管に採取し、まぶたを閉じて出血を止めます。硫酸ゲンタマイシン点眼液を1滴目に塗ります。
- エンドポイントで、白血球(WBC)が4 x 10 4細胞/ μLに達したら、マウスをCO2チャンバーで安楽死させ、大腿骨と脛骨をフローバッファーで洗い流して骨髄細胞を分離し、続いてステップ4で述べたようにRBC溶解を行います。
- エンドポイントで、下記のように脾細胞を採取します。
- マウスをCO2 チャンバーで安楽死させる。発泡スチロールボード上の滅菌外科用パッドにマウスを置き、マウスの足パッドを通して脚を固定します。マウスの全身を70%エタノールで滅菌する。
- 正中線で皮膚と筋肉を切り、鋭い端の滅菌ハサミで腹腔を露出させます。鋭利な滅菌ハサミで脾臓を単離し、滅菌15 mLチューブのフローバッファーに入れます。
- 3 mLのフローバッファーを含む6 cmディッシュ内の70 μm滅菌ストレーナーを通して脾臓をメッシュします。細胞をディッシュから滅菌15 mLチューブに移し、単一細胞懸濁液を4°Cおよび400 x g で3分間遠心分離します。
- 上清を廃棄し、細胞を5 mLのRBC溶解バッファーに再懸濁して、赤血球を3分間溶解します。5 mLのフローバッファーを加えて溶解を停止し、細胞懸濁液を4°C、400 x g で3分間遠心分離します。
- 70 μmのセルストレーナーを滅菌済みの50 mLチューブに置きます。ペレットを5 mLのフローバッファーで懸濁し、混合し、セルストレーナーを通過させて細胞を回収します。
- 脾細胞と骨髄細胞をFITC結合抗マウスCD45.1抗体で染色し、フローサイトメーターで検出することにより、初代(1°)AML細胞を同定します。細胞は最初にFSC-A/FSC-H、FSC-AおよびSSC-Aにゲーティングされ、シングレットを獲得します。CD45.1+集団は、染色されていない細胞と比較することにより、FL1プロット上でゲートされます。
- 二次(2°)移植の場合は、1°レシピエントのCD45.1 AML脾臓細胞をPBS(0.1 mL /マウス)に再懸濁し、CD45.2雄C57BL6 / Jマウスに眼窩後注射します。並行して、1°I.p.レシピエントのAML脾臓細胞をPBS(0.5 mL /マウス)に再懸濁し、8〜12週齢の赤色蛍光タンパク質(RFP)発現 Ai14TdTomato 雄マウスに腹腔内注射します27。
- 三次(3°)移植の場合、2°I.p.レシピエントの骨髄または腹腔から分離したAML細胞を再懸濁し、それぞれ Ai14TdTomato (RFP+)またはCD45.2マウスに腹腔内注射します。2°レシピエントの腹腔から単離したAML細胞を再懸濁し、 Ai14TdTomato (RFP+)マウスにr.o.注射により移植します。
注:2°移植では、末梢血中のCBCをモニタリングすることにより、2°レシピエントの疾患進行を特定しました。AMLの確立をさらに確認するために、心臓穿刺による末梢血全体、骨髄、脾臓、肝臓を採取しました。さらに、i.p.細胞を回収するためにi.p.洗浄を行った。単一細胞懸濁液は、上記のように骨髄、脾臓、およびi.p.洗浄から獲得した。これらの部位からの細胞を、RBC溶解後にフローサイトメーターで分析した。AML細胞はRFP陰性(RFP−)細胞として認識された。3°移植では、エンドポイントで血液、骨髄、脾臓、肝臓、およびi.p.細胞をサンプリングしました。RFPまたは CD45.1+ 細胞をAML細胞として同定し、フローサイトメトリーで調べました。2°および3°レシピエントマウスに照射または抗生物質水を与えなかった。
図1:骨髄造血幹細胞および連続移植におけるMLL-AF9ウイルス形質導入の概略図(1°、2°、および3°)。点線の網掛けボックスに示されているセルソーターを使用したSca-1およびc-Kitダブルポジティブ集団のソートは、リソースが許せばオプションと見なされます。図はBioRender(https://biorender.com/)を使用して作成されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
6.腹腔内洗浄
- 5 mLの不完全なIMDM培地を腹腔に2回注入し、15 mLの滅菌チューブに細胞を採取します。細胞懸濁液を室温および400 x g で3分間遠心分離する。AML細胞(4 x 105 細胞/マウス)を2°レシピエントの腹腔からi.p.注射 を介して 3°CD45.2レシピエントマウス(n = 3)に移植します。
7. 組織学的解析 28
- 安楽死時にマウスから脾臓、肝臓、大腿骨を分離します。それらを5 mLの10%(v / v)緩衝ホルマリンで固定します。比較のために健康な対応物から脾臓と肝臓をサンプリングします。
- 固定組織をパラフィンに埋め込み、それらを切片に切断する。切片をヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)色素で染色する。
- 組織学的分析用の互換性のあるソフトウェアをインストールした20倍の倍率で顕微鏡下で画像を取得します。
8. 半定量PCR(qPCR)の実施
- 製造元の指示に従ってRNA試薬中のRNAを調製します。
- 0.5〜1.0 μgのRNAを使用して、製造元の指示に従ってcDNA逆転写キットを使用してcDNAを合成します。
- cDNAを使用してqPCRキットを使用してqPCRを実行し、qPCRシステムでサンプルを実行します。次の事前検証済みの TaqMan プローブを使用します: KMT2A (MLL;参照シーケンス:NM_001197104(2)、IDT)29 および 18S リボソームRNA(Hs99999901_s1)。
- KMT2Aおよび18Sアンプリコンを2%アガロースゲルにロードして、発現を視覚化します。互換性のあるソフトウェアプログラムがインストールされているイメージャで画像を取得します。
9. データ処理
- 統計分析ソフトウェアを使用して結果を分析し、SEM±平均値として結果を提示します。 市販のイラストレーターツールを使用して図を生成します。
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Representative Results
r.o.とi.p.移植経路を用いたマウスAML細胞の移植効率の比較
これまで、MLL-AF9形質導入LSK細胞を眼窩後移植したレシピエントマウスで1°AMLの樹立が報告され、連続移植によって1°AML細胞の移植能が実証されました30。本研究は、骨髄リン細胞 を使用して移植を行う可能性を評価した最初の研究です。異常な白血球増加症の存在(図2A)と骨髄と脾臓における白血病細胞(CD45.1+)の浸潤の増加(図2B)は、骨髄リン細胞 を使用して1°AMLを生成する可能性を支持しています。疾患誘導期間を比較するために、レシピエント当たり2匹のドナーマウスを安楽死させ、LSKまたはLin− 細胞のいずれかを単離した。結果から、LSKまたはLin- 細胞を移植した1°レシピエントに有意差は観察されませんでした(図2C)。
1°AMLの転移の検査中に、AML細胞がMLL-AF9形質導入Lin-細胞によって1°レシピエントの腹腔内に広がることを発見しました(補足図1)。この発見は、移植の新しいより簡単なルートとして役立つ可能性のあるマウスAMLの生成にi.p.注射を採用できるかどうかをテストするための調査に影響を与えました。骨髄Lin-集団をAMLドナー細胞として使用することに成功したため、現在のデータでは、白血球増加症(図2D)およびレシピエントマウスの骨髄および脾臓におけるAML細胞(CD45.1+)の存在(図2E)の形で見られるように、MLL-AF9形質導入骨髄Lin-細胞のi.p.注射による1°AMLの確立が確認されました。しかし、i.p.注射による移植は、レシピエントが同数のドナー細胞を投与されたにもかかわらず、r.o.注射による移植よりもAMLの発症に時間がかかりました(図2F)。さらに、図2Fのより多くのLin細胞(5.125 x 106細胞/マウス)を眼窩後方に移植したマウスは、図2Cのより少ないLin細胞(3.69 x 106細胞/マウス)を移植したマウスよりも早くAMLを発症するように見えました。
1°のAMLレシピエント(図2F)の潜伏時間の固有の不一致のために、2°のレシピエントでのi.p.移植をテストする試みがなされました。2°移植の場合、腹腔内移植された1°レシピエントから単離された8 x 105 AML細胞を用いてiP.注射を行った。2°レシピエントは、移植後1か月以内に白血球増加症(図2G)と有意な肝脾腫(図2H)を示し、1°移植から明らかに進歩しました。この観察と一致して、AML細胞(RFP-)は、末梢血、骨髄、脾臓(図2I)、および腹腔(補足図1)でも検出されました。また、2°レシピエントの血液、脾臓、肝臓における癌遺伝子KMT2Aの発現も、AMLの正常な生成を確認しました(図2J)。さらに、組織学的分析は、腹腔内移植マウスの脾臓および肝臓における白血病細胞の浸潤をさらに実証した(図2K)。これらのデータは、i.p.注射で生成された1°AML細胞が2°レシピエントに移植可能であることを確認しています。さらに、レシピエントへのマウスあたり8 x 10 5 AML細胞のi.p.注射は、レシピエントへのマウスあたり8 x 105 AML細胞のr.o.注射と同等の生着を達成しました(図2L)。
LSCの重要な特徴の1つは、連続移植性です。したがって、2°レシピエントにおけるAMLの確立をさらに確認するために、このプロトコルは、2°I.P.移植からのAML細胞が連続移植可能なままであるかどうか、および3°移植でのI.P.注射による幹細胞移植の実現可能性を検証しようとしました。骨髄(0.5 mL PBS中の8 x 10 5白血病細胞/マウス)またはi.p.洗浄(0.5 mL PBS中の4 x 105白血病細胞/マウス)のいずれかから単離されたAML細胞を3°レシピエントに注入しました。異なるソースから生成されたドナー細胞を移植しましたが、3°レシピエントマウスは、白血球増加症(図3A)および肝脾腫(図3B)、血液、骨髄、および脾臓中の白血病細胞の存在(図3C)、およびKMT2Aの発現(図3D)を含むAML徴候(骨髄細胞およびi.p.細胞でそれぞれ3週間以内)を急性に示しました。).大腿骨と脾臓の組織学的観察は、白血病細胞の浸潤をさらに示しました(図3E)。比較として、2°レシピエントからの白血病脾細胞(4 x 105細胞)のRO注射は、白血球増加症(補足図2A)、肝脾腫(補足図2B)、および血液、骨髄、および脾臓へのAML細胞の浸潤を特徴とする3°レシピエントのAMLの生着と発症も同等でした(補足図2C)。
腹腔内移植はAML細胞の3°移植にも有効
2°および3°移植と比較して、i.p.およびr.o.注射の両方で、3°移植(図3F)は2°移植(図2L)よりもはるかに速く進行したという結論を簡単に結論付けることができました。特に、4 x 105 AML細胞/マウスのi.p.注射は、同数のAML細胞を6日間注射するよりも遅くAMLを発症し(図3F)、腹腔から骨髄ニッチへの移行に費やされた時間を示している可能性があります。興味深いことに、3°移植マウスの腹腔内の白血病細胞の高頻度(補足図S2)は、腹腔が白血病細胞の急速な増殖のためのニッチも提供する可能性があることを示唆しました。その上、眼窩後移植された1°および3°レシピエントの腹腔内の白血病細胞の存在は、腹腔と血液系の間の白血病細胞の相互循環を示し、i.p.移植を正当化した。まとめると、これらの知見は、AMLの連続移植におけるi.p.注射の使用を検証します。
図2:1°および2°移植におけるマウスAMLモデルの生成。 (A)MLL-AF9形質導入骨髄Lin-細胞(5.125 x 106細胞/マウス)をヘマベット(n = 3)により眼窩後移植した1°レシピエントマウスの完全血球計算(CBC;1 x 103細胞/μL血液)、WBC、好中球(NE)、リンパ球(LY)、単球(MO)、好酸球(EO)、および好塩基球(BA)プロファイル。(B)MLL-AF9形質導入骨髄Lin-(5.125 x 106細胞/マウス)細胞(n = 3)を眼窩後方に移植した1°CD45.2レシピエントマウスの骨髄および脾臓におけるAML細胞(CD45.1+)の頻度のフローサイトメトリー解析。(C)MLL-AF9形質導入骨髄LSK細胞(2人のドナーから単離された3.16 x 105細胞/マウス、n = 4)またはLin-細胞(2人のドナーから分離された3.69 x 106細胞/マウス、n = 3)で眼窩後移植されたレシピエントにおける1°AMLのインキュベーション期間。各レシピエントは、2人のドナーから単離された細胞を受け取りました。(D)MLL-AF9形質導入骨髄Lin-細胞(5.125 x 106細胞/マウス)をヘマベット(n = 4)で腹腔内移植した1°レシピエントマウスのCBC分析。(E)MLL-AF9形質導入骨髄Lin-細胞(5.125 x 106細胞/マウス、n = 3)を腹腔内に移植した1°CD45.2レシピエントマウスの骨髄および脾臓におけるAML細胞(CD45.1+)の頻度のフローサイトメトリー解析。(F)MLL-AF9形質導入骨髄Lin-細胞を用いて眼窩後方(n = 3)または腹腔内(n = 3)に移植されたレシピエントにおける1°AMLのインキュベーション期間。各レシピエントは、同量のドナー細胞(5.125 x 106細胞/マウス)を受け取った。(G)1°i.p.移植レシピエントの脾臓からヘマベット(n = 3)によって単離されたAML細胞(8 x 105細胞/マウス)を腹腔内に移植した2°レシピエントのCBC分析。(h)1°i.p.移植レシピエントの脾臓から分離したAML細胞(8 x 105細胞/マウス)を腹腔内に移植した2°レシピエントマウスの脾臓と肝臓の重量(mg)。影付きの領域は、脾臓と肝臓の通常の体重範囲を表しています。2°レシピエントマウスおよび健常対応物からの脾臓および肝臓の代表的な画像。(I)1°i.p.移植レシピエント(n=3)の脾臓から分離したAML細胞(8 x 105細胞/マウス)を腹腔内移植した2°RFP+レシピエントマウスの血液、骨髄、脾臓におけるAML細胞(RFP-)の頻度のフローサイトメトリー解析。(J)KMT2Aおよび18Sの遺伝子発現をDNAバンドとして提示。RNAは、1°i.p.移植レシピエントの脾臓から分離したAML細胞(8 x 105細胞/マウス)を腹腔内に移植した2°レシピエントマウスの血液、骨髄、脾臓、および肝臓から単離されました。(K)1°I.p.移植レシピエントと健常者の脾臓から分離したAML細胞(8 x 105細胞/マウス)を腹腔内に移植した2°レシピエントの脾臓(左パネル)と肝臓(右パネル)の組織学的変化の代表的な画像。(L)眼窩後(4 x 10 5 /マウス、n = 9)または腹腔内(8 x 105 /マウス、n = 4)に移植されたレシピエントにおける2°AMLのインキュベーション期間それぞれ1°ROおよびi.p.移植レシピエントから分離されたAML細胞。結果はSEM±平均値です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:i.p.移植によるAML細胞の3°移植。 (A-E)3°RFP+またはCD45.2レシピエントマウス。左:2°レシピエントの骨髄からのAML細胞(8 x 105細胞/マウス)のi.p.注射。右:2°レシピエント(n = 3)の腹腔(i.p.)からのAML細胞(4 x 105細胞/マウス)のi.p.注射。(A)ヘマベットによる3°レシピエントマウスのCBC解析。(B)3°レシピエントマウスの脾臓と肝臓の重量(mg)。影付きの領域は、脾臓と肝臓の通常の体重範囲を表しています。(C)3°レシピエントマウスの血液、骨髄、脾臓におけるAML細胞(左:RFP-、右:CD45.1+)の頻度のフローサイトメトリー解析。(D)KMT2Aおよび18Sの遺伝子発現をDNAバンドとして提示する。RNAは、3°レシピエントマウスの血液、骨髄、脾臓、および肝臓から単離されました。(E)3°レシピエントマウスの脾臓(左パネル)と大腿骨(右パネル)の組織学的変化の代表的な画像。(F)眼窩後(4 x 10 5細胞/マウス、n = 3)または腹腔内(4 x 105細胞/マウス、n = 3)に移植されたレシピエントにおける3°AMLのインキュベーション期間 2°r.o.およびi.p.移植レシピエントからそれぞれ分離されたAML細胞。結果はSEM±平均値です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:腹腔内のAML細胞浸潤のフローサイトメトリー解析。眼窩後移植した1°レシピエント(1°RO、n=2)、腹腔内移植した2°レシピエント(2°IP、n=2)、骨髄AML細胞をi.p.注射で移植した3°レシピエント(3°BM-IP、n=3)およびi.p.AML細胞(3°IP-IP、n=3)、およびAML脾細胞のr.o.注射で移植した3°レシピエント(3°SP-RO、 n = 3)。結果はSEM±平均値です。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:RO注射 による AML脾細胞の3°移植。 (A)2°レシピエントマウスの脾臓からAML細胞(4 x 105 細胞/マウス)を眼窩後移植した3°レシピエントマウスのCBC解析。(B)3°眼窩後移植レシピエントマウスの脾臓と肝臓の重量(mg)。影付きの領域は、脾臓と肝臓の通常の体重範囲を表しています。(C)3°眼窩後移植レシピエントマウスの血液、骨髄、脾臓におけるAML細胞(RFP-)の頻度(n=3)。結果はSEM±平均値です。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
これらの上記の研究は、Lin細胞の 移植が1°マウスAMLの生成においてLSK細胞に匹敵するという支持的な証拠を提供します。さらに、現在のデータは、i.p.注射が静脈内(またはr.o.)注射と比較してマウスAMLを確立するための効率的で便利な方法であることも示しています。
LSK細胞に加えて、顆粒球単球前駆細胞(GMP)、共通リンパ系前駆細胞(CLP)、および共通骨髄系前駆細胞(CMP)などの他の集団が、さまざまなインキュベーション期間31,32の1°MLL-AF9誘導AMLの生成においてドナー細胞として置換されることが報告されていますが、最適な選択を示唆するための定量的比較は不足しています。現在の研究では、同じドナーマウスから単離されたLin-およびLSKは、形質導入された骨髄系前駆細胞(Sca-1-)がAML33を開始できたことを考えると、1°MLL-AF9誘導AMLの生成に明らかな違いはありませんでした。LSK集団のフローサイトメトリーベースのソーティングに必要な費用と時間を考慮すると、これらの研究は、1°移植のドナー細胞としてのLin-集団の使用を支持しています。したがって、このプロトコルの4.19から4.23までの手順は必須ではなくオプションであり、最終結果には影響しません。
1°移植におけるドナーマウスの量に関しては、1人のドナーが~1.0〜1.5 x 105 LSK細胞を提供することができ、この量のLSK細胞を移植した1人のレシピエントは約4ヶ月で1°AMLを発症しました。ただし、LSK細胞を構築するためのドナーの数をレシピエントあたり~3 x 105細胞まで増やすと、潜伏期間を~70日に短縮できます。したがって、2人のドナーで1°のAMLを迅速に生成するのに十分です。この原理はLin-細胞にも適用され、各ドナーマウスから~1.0〜2.5 x 106 Lin-細胞を単離することができる。しかし、ドナー細胞密度が増加すると、白血病発生のターンアラウンドタイムはかなり短くなりました。これらのデータは、ステップ4.1でドナーマウスの数を決定する際に考慮に入れる必要があります。
i.o.注射と比較して、i.p.注射は本格的な1°AMLを開発するのに約~20日多くかかりましたが、この制限はi.p.注射用のドナー細胞を増やすことによって克服されました。このような明らかな違いにもかかわらず、両法はエンドポイントの骨髄と脾臓で同様の生着率(>80%)を示し、AMLの1°移植におけるi.p.注射の一般的な適用性を示しています。1°移植の潜伏期間が比較的長いこと、およびレシピエントマウスの潜伏期間の不一致という点で予測できない疾患進行は、薬理学的介入や機構研究などの対照実験の主要な制限です。したがって、その後の連続移植、通常は2°移植の移植に1°白血病細胞を使用することをお勧めします(図1)。エンドポイントの1°レシピエントごとに最大3 x 108 白血病細胞(骨髄では6 x 107 細胞)を生成できるため、300匹以上のマウスに2°移植を行うのに十分であるため、潜伏期間を短縮し、1°移植の生着率を高めるために、できるだけ多くの細胞をより少ないレシピエントに移植することが提案されています。 これはステップ4.1とステップ5.2にとって重要です。
2°移植は、その一貫した短い潜伏時間を考えると、上記の in vivo 実験を含む複数のアプリケーションに利用できます。さらに、i.p.注射は、経験の浅い技術者のための豊富な移植のための手順も容易にします。一般的に3週間でAMLを生成するRO注射経路と比較して、i.p.注射法は、同じ数のドナー細胞で本格的なAMLを確立するのにわずかに長い時間(~4週間)を要しました。比較的簡単で便利ですが、移植細胞数を増やしたり、三次移植を行ったりすることで、i.p.注射によるAMLの進行を加速することもできます。
要約すると、この技術の主な制限は、1°および2°の両方の移植において、同じ量のドナー細胞を静脈内注射するよりも長いインキュベーション時間である。しかし、移植する細胞数を増やすことで簡単に克服できます。明らかな利点とは別に、この手法には他にもいくつかのアプリケーションがあります。例えば、i.p.移植法を使用する能力は、高価な インビトロ 培養培地を必要とせずにこれらの細胞を日常的に培養するのにも役立ち得る。リンパ性白血病や慢性骨髄性白血病などの他の血液悪性腫瘍、および患者由来の異種移植片にこの技術を適用するには、将来的にさらなる研究を行う必要があります。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
著者らは、ペンシルベニア州立大学獣医生物医科学部動物診断研究所のハック研究所のフローサイトメトリーコアファシリティと組織病理学コアファシリティがタイムリーな技術サポートを提供してくれたことに感謝します。この研究は、米国がん研究所(KSP)、ペンシルベニア州立農業科学大学、ペンシルベニア州立がん研究所、USDA-NIFAプロジェクト4771、K.S.P.およびRFPへのアクセッション番号00000005からの助成金によってサポートされました。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
a-Select competent cells | Bioline | BIO-85027 | |
Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
Ampicillin | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade | Gemini bio-products | Cat# 700-102P | |
Ciprofloxacin HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | Cat# 11960-044 | |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade | Calbiochem | Cat# 324503 | |
Fetal Bovine Serum - Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
Holo-transferrin, bovine | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
Insulin solution human | Sigma | Cat# I-9278 | |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
L-glutamine 200 mM (100×) solution | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
LB broth, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
LB Broth with agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
Mouse Interleukin-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
Mouse Interleukin-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
Mouse Stem Cell Factor (SCF) | Gemini bio-products | Cat# 300-348P | |
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
Phenix-Eco (pECO) cells | ATCC | CRL-3214 | |
Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
Recombinant Murine Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | TaKaRa | Cat# T100A | |
TransIT-293 Reagent | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
TRI Reagent | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | Cat# 25200-056 | |
β-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
Commercial Assays | |||
EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
Animals | |||
Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
CD45.1 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 002014 | |
CD45.2 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
Instruments and Softwares | |||
Adobe illustrator | Version 25.2.3 | ||
BD accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | ||
FlowJo 10.8.0 | BD | ||
GeneSys software program | Version 1.5.7.0 | ||
GraphPad Prism version 6 | GraphPad | ||
Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
7300 Real time PCR system | Applied Biosystems | ||
Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging | G:Box Chemi |
References
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