Summary
Burada, farelerde akut miyeloid lösemiyi (AML) oluşturmak ve yaymak için lösemi hücrelerinin intra-peritoneal enjeksiyonu kullanılır. Bu yeni yöntem, AML hücrelerinin seri transplantasyonunda etkilidir ve farelerde intravenöz enjeksiyon ile zorluk ve tutarsızlık yaşayabilecek kişiler için bir alternatif olarak hizmet edebilir.
Abstract
Akut miyeloid lösemiyi (AML) ve kalıcı lösemi kök hücrelerini (LSC'ler) içeren ilişkili nüksleri tedavi etmek için yeni tedavilere karşılanmamış bir ihtiyaç vardır. Alıcı farelerde retro-orbital enjeksiyonlar yoluyla bu hücrelerin başarılı bir şekilde nakledilmesine dayanan terapileri test etmek için deneysel bir AML kemirgen modeli, zorluklarla doludur. Bu çalışmanın amacı, intraperitoneal bir yol kullanarak sağlam bir murin AML modeli oluşturmak için kolay, güvenilir ve tutarlı bir yöntem geliştirmektir. Mevcut protokolde, kemik iliği hücreleri, insan MLL-AF9 füzyon onkoproteinini eksprese eden bir retrovirüs ile dönüştürüldü. Primer AML gelişiminde donör LSC'ler olarak soy negatif (Lin-) ve Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) popülasyonlarının etkinliği test edilmiş ve AML üretmek için yeni bir yöntem olarak intra-peritoneal enjeksiyon benimsenmiştir. Seri transplantasyonlarda intraperitoneal ve retro-orbital enjeksiyonlar arasında karşılaştırma yapılarak iki yöntemin karşılaştırılması ve karşılaştırılması sağlandı. İnsan MLL-AF9 virüsü ile transdübe edilen hem Lin- hem de LSK hücreleri, alıcıların kemik iliğine ve dalağına iyi aşılanmış ve tam gelişmiş bir AML'ye yol açmıştır. Donör hücrelerin intraperitoneal enjeksiyonu, seri transplantasyon üzerine alıcılarda AML oluşturdu ve akım sitometrisi, qPCR ve histolojik analizlerle AML hücrelerinin infiltrasyonu alıcıların kan, kemik iliği, dalak ve karaciğerinde tespit edildi. Bu nedenle, intraperitoneal enjeksiyon, donör lösemik hücrelerin seri transplantasyonu kullanılarak AML indüksiyonunun etkili bir yöntemidir.
Introduction
Akut miyeloid lösemi (AML), kötü prognozlu1 etiyolojisi olan çeşitli hematolojik malignitelerin bir türüdür. AML hayvan modellerinin oluşturulması, yeni tedavileri keşfetme çabasıyla karmaşık varyasyonlarının ve patobiyolojisinin anlaşılması için temel oluşturur2. Farelerde lösemigenez, insanlarda hastalığı taklit etmek için AML'yi güçlü bir şekilde indüklemek için karışık soy lösemi (MLL) genini içeren füzyonlar da dahil olmak üzere füzyon onkoproteinlerini eksprese eden donör hücrelerin transplantasyonunu içerir3. MLL geni ile ilişkili AML4'ün transplantasyonunda donör hücrelerin çeşitli hücresel kökenleri bildirilmiştir ve hastalığın kökeninden sorumlu hücreler hakkında çok az şey bilinmektedir.
Farelerde transplantasyon için birçok yol geliştirilmiştir; Mutant donör hücreleri doğrudan kemik iliği5'e sokan bir intra-femoral enjeksiyon yerine, venöz sinüs pleksus, kuyruk veni ve juguler veni kullanan intravenöz bir enjeksiyon, murin AML modelleri 6,7,8,9'u üretmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Retro-orbital (r.o.) enjeksiyon durumunda, hacim sınırlaması, yüksek teknik talep, tekrarlanan girişimler veya hatalar için az şans ve potansiyel oküler yaralanmalar gibi çeşitli doğal dezavantajlar, sınırlı veya hiç uygulanabilir alternatifi olmayan büyük tökezleyen bloklar olmuştur7. Kuyruk damarı enjeksiyonunda lokal yaralanmaların yanı sıra benzer sorunlar da olabilir; Prosedürü kolaylaştırmak için, farelerin kuyruk damarlarını genişletmek için genellikle ısıtılması gerekir10. Kuyruk damarını, özellikle C57BL / 6 fare suşunda, ek bir ışık kaynağı olmadan bulmak da zordur. Juguler ven enjeksiyonu için, araştırma personeli damarı bulmak ve olası komplikasyonları sınırlamak için yeterli eğitim gerektirir. Ek olarak, hem venöz sinüs hem de juguler ven enjeksiyonlarının anestezi altında yapılması gerekir, bu da başka bir karmaşıklık seviyesi ekler. Bu nedenle, AML murin modellerinin oluşturulmasını kolaylaştırmak için transplantasyon için yeni yollar araştırmak caziptir.
İntra-peritoneal (i.p.) enjeksiyon yaygın olarak ilaçları, boyaları ve anestezikleri uygulamak için kullanılır 11,12,13,14,15; Ayrıca ektopik hematopoez16 için hematopoetik hücreleri tanıtmak ve çeşitli fare modellerinde kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreleri nakletmek için kullanılmıştır17,18,19,20,21. Bununla birlikte, farelerde hematopoetik maligniteler oluşturmak için, özellikle AML hastalığının ilerlemesini incelemek için nadiren kullanılmıştır.
Bu çalışma, AML fare modellerinin üretiminde i.p. enjeksiyonunun fizibilitesini açıklamanın yanı sıra, soy negatif (Lin-) ve Lin-Sca-1 + c-Kit + (LSK) popülasyonlarının donör hücreler olarak transplantasyon verimliliğini karşılaştırmaktadır. Bu bulgular, AML ve ilişkili miyeloid lösemilerin deneysel modellerini oluşturmak için basit ve etkili bir yol sağlar. Böyle bir yöntem, hastalık mekanizmalarını daha iyi anlamamızın yanı sıra deneysel tedavileri test etmek için nispeten kolay bir model sağlama potansiyeline sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler, Pennsylvania Eyalet Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından önceden onaylanmıştır.
1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması
- Ampisilin takviyeli (AP) LB agar plakaları (steril 10 cm plakalar) hazırlayın. Bunu yapmak için, 10 g LB suyunu agar ile 400 mL damıtılmış suda çözün, karıştırın ve hacmi 500 mL'ye çıkarın. Çözeltiyi otoklavlayarak sterilize edin, ardından çözeltinin soğumasını bekleyin, çözeltiye 0,5 mL ampisilin (stok: 150 mg / mL) ekleyin ve karıştırmak için çalkalayın. Hemen bir alkol lambasının yakınındaki steril 10 cm'lik bir plakaya 18 mL çözelti ekleyin, oda sıcaklığında katılaşmaya bırakın ve plakaları daha sonraki kullanıma kadar 4 ° C'de baş aşağı saklayın.
- 10 g LB'yi agarsız olarak 500 mL damıtılmış suda çözerek LB ortamını hazırlayın. Çözeltiyi otoklavlayarak sterilize edin, çözeltinin soğumasını bekleyin, çözeltiye 0.5 mL ampisilin (stok: 150 mg / mL) ekleyin ve karıştırmak için çalkalayın.
- 485 mL 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinine (DPBS) 5 mL penisilin/streptomisin ve 10 mL ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu (hiFBS) ekleyerek akış tamponunu hazırlayın.
NOT: FBS'yi ısıtarak devre dışı bırakmak için, çözülmüş FBS şişelerini 56 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Şişelerin devrilmediğinden veya başka bir şekilde su banyosuna batırılmadığından emin olun. Sıcaklık, tam bozulma için kritik öneme sahiptir; Bunu sağlamak için, şişeleri su banyosuna koyduktan sonra sıcaklık 56 ° C'de sabitlenene kadar bekleyin. Şişeleri her 10 dakikada bir üç kez yavaşça döndürün. Serumun 30 dakikadan fazla kuluçkaya yatmasına izin vermeyin. - 440 mL Dulbecco'nun modifiye kartal ortamına (DMEM) 50 mL hiFBS, 5 mL L-glutamin ve 5 mL penisilin/streptomisin ekleyerek bakım ortamı hazırlayın. 445 mL DMEM ortamına 50 mL hiFBS ve 5 mL L-glutamin ekleyerek transfeksiyon ortamı hazırlayın.
- 500 mL damıtılmış suya 4.145 g NH4Cl, 0.504 g NaHCO3 ve 16.81 mg etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyerek kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponu hazırlayın. 416,5 mL IMDM ortamına 75 mL hiFBS, 5 g sığır serum albümini (BSA), 0,5 mL 10 mg/mL insülin, 2,5 mL 4 mg/mL holo-transferrin, 3,5 μL β-merkaptoetanol, 5 mL L-glutamin ve 0,5 mL siprofloksasin ekleyerek eksik Iscove'un modifiye Dulbecco'nun besiyeri (IMDM) ortamını hazırlayın.
- 10 μL 50 ng/μL mr-SCF, 20 μL 25 ng/μL mr-Flt3L, 20 μL 10 ng/μL mr-IL-6, 20 μL 10 ng/μL mr-IL-6, 20 μL 10 ng/μL mr-IL-3, 10 μL 10 mg/mL insülin ekleyerek sitokinlerin konsantrasyonunun 1x IMDM ortamındaki miktarın iki katı olduğu 10 mL 2x IMDM ortamı hazırlayın, ve 50 μL 4 mg/mL holo-transferrin, 9.87 mL tamamlanmamış IMDM ortamına dönüşür.
NOT: Kullanmadan önce akış tamponunun, RBC lizis tamponunun, bakım ortamının, transfeksiyon ortamının ve tamamlanmamış IMDM ortamının filtre sterilize edildiğinden emin olun.
2. Plazmid dönüşümü
- 20 μL α-Select yetkin hücrelerini buz üzerinde çözün. Çözülmüş yetkin hücrelere 1 μL (~2 ng) MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3 plazmid22 ekleyin ve tüpe dokunarak hafifçe karıştırın. Reaksiyonu buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Karışımı 42 °C'lik bir ısıtma bloğunda 40 s inkübasyonla ısındırın. Tüpü hemen 2 dakika boyunca buz üzerinde aktarın.
- Tüpe 1 mL LB ortamı (ampisilin olmadan) ekleyin ve 1 saat boyunca 37 ° C ve 200 rpm'de çalkalayın.
- Tüpü oda sıcaklığında 500 x g'de 4 dakika boyunca santrifüj edin ve 0.9 mL süpernatan atın. Çökeltiyi kalan 0,1 mL LB ortamında yeniden askıya alın.
- Dönüştürülmüş yetkin hücreleri önceden ısıtılmış (37 °C) AP LB agar plakalarına yayın. Plakayı 12-16 saat boyunca 37 ° C'de baş aşağı inkübe edin.
- Tek bir koloni seçin ve dönüştürülmüş hücreleri 37 °C ve 200 rpm'de bir gecede 10 mL AP LB ortamında harcayın.
- Bir şişede 500 mL AP LB ortamına 5 mL harcanmış dönüştürülmüş yetkin hücre ekleyin ve şişeyi gece boyunca 37 ° C ve 200 rpm'de inkübe edin.
- Üreticinin talimatlarına göre bir plazmid ekstraksiyon kiti kullanarak plazmidi ekstrakte edin ve 0,5 mL otoklavlanmış ultra saf suda yeniden askıya alın. Bir spektrofotometre kullanarak plazmidi sayısallaştırın.
3. Phoenix Ecotropic (pECO) hücrelerinin transfeksiyonu
- Kültür 2 x 106 pECO hücreleri/plakası, 37 °C'de nemlendirilmiş %5 CO2 inkübatörde 10 cm'lik plakalarda bakım ortamında. pECO hücrelerinin üstel büyüme fazında tutulduğundan ve geçişten önce aktif olarak bölündüğünden emin olun.
- Hücreler% 80 birleşdiğinde, plakaları iki kez 5 mL DPBS ile yıkayın, plakaya 1 mL tripsin ekleyin ve 2 dakika boyunca 37 ° C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin. Hücreleri steril 15 mL'lik bir tüpte 5 mL bakım ortamı ile toplayın ve 3 dakika boyunca 4 ° C'de ve 400 x g'de santrifüj yapın. Hücre peletini 5 mL bakım ortamında yeniden askıya alın.
- 10 μL hücre süspansiyonu ve 10 μL tripan mavisini karıştırın ve hücreleri saymak için bir hemositometreye 10 μL yükleyin.
Toplam hücre/mL = (Sayılan toplam hücre sayısı x Seyreltme faktörü x 104 hücre/mL)/ Sayılan kare sayısı)
2 x 106 hücre/tabağı 37 °C'de nemlendirilmiş %5 CO2 inkübatörde transfeksiyon ve kültür için 5 mL bakım ortamı kullanarak 6 cm'lik kaplara tohumlayın. - Bakım ortamını, hücreler 18 saatlik kültürden sonra% 50-60 oranında birleştiğinde 5 mL transfeksiyon ortamı ile değiştirin.
- Transfeksiyon reaktifini transfeksiyondan önce en az 30 dakika oda sıcaklığında tutun.
- Steril 1,5 mL'lik bir tüpe 5,5 μg MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3 plazmid22 ila 0,5 mL düz DMEM ortamı ekleyin. Tüpe dokunarak hafifçe karıştırın ve 10 dakika oturmasına izin verin.
- Tüpe 14.6 μL (plazmid miktarının 3 katı; v / w) transfeksiyon reaktifi ekleyin ve tüpe her 10 dakikada bir üç kez hafifçe dokunun.
- Karışımı, transfeksiyon ortamındaki pECO hücreleri ile bulaşıkların tüm alanlarına damla damla ekleyin. Bulaşıkları nazikçe 10 kez ileri ve geri ve 10 kez yana doğru hareket ettirin. Bulaşıkları nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de 48 saat boyunca inkübe edin.
- Transfeksiyon verimliliğini,22'de açıklandığı gibi yeşil floresan protein (GFP) için floresan mikroskobu ve akış sitometrisi ile ölçün. Hücreler ilk önce FSC-A / FSC-H ve FSC-A ve SSC-A üzerine kapılıdır ve singlet elde edilir. GFP + popülasyonu, transfekte olmayan hücrelerle karşılaştırılarak FL1 grafiği üzerinde geçitlenir.
- Süpernatantları 0,45 μm'lik bir şırınga filtresinden toplayın ve steril 50 mL'lik bir tüpe filtreleyin. Süpernatantları iletim için hemen kullanın veya sıvı azotta dondurun ve bir sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın.
NOT: pECO hücreleri uygun şekilde karıştırılmalı ve yemeklere eşit şekilde tohumlanmalıdır. Tohumlama sırasında bulaşıkları 10 kez ileri ve geri ve 10 kez yana doğru hareket ettirerek hücrelerin yayılmasına izin verin. Tohumlanacak hücre sayısı, sayımdaki değişikliklere bağlı olarak değişebilir. 18 saatlik kültürden sonra% 50-60 birleşme sağlayabilen en uygun tohumlama hücresi sayısını bulmak için, seri seyreltmeli hücrelerin tohumlanması yararlıdır.
4. Lentiviral transdüksiyon
- Bir CO2 odasında 8-10 haftalık CD45.1 dişi C57BL6 / J fareleri (alıcı fare başına iki ila üç donör fare) ötenazi yapın.
- Farelerin tüm vücudunu% 70 etanol ile sterilize edin. Fareleri strafor bir tahta üzerindeki steril bir cerrahi ped üzerine yerleştirin ve bacakları fare pençesi pedlerinden geçirin.
- Cildi orta hatta karın boşluğunun üzerinde kesin ve deri altı boşluğunu keskin uçlu steril makasla arka bacaklara doğru genişletin.
- Kesi karın orta hattından ayak bileklerine kadar uzatın. Arka ayakların altındaki deri altı boşluğunu keskin uçlu steril makas bıçaklarıyla genişletin.
- Aşil tendonunu keskin uçlu steril makasla kesin. Tendonu dişlerle forseps kullanarak tutun ve gastroknemius kasını çıkarmak için femura bağlı diğer ucu kesin.
- Diz üzerine tutturulmuş kuadriseps tendonunu keskin uçlu steril makasla kesin. Tendonu dişlerle forseps kullanarak tutun ve gastroknemius kasını çıkarmak için femura bağlı kas kafalarını kesin.
- Tibiaya tutturulmuş femuru çevreleyen diğer kasları keskin uçlu steril makasla kesin.
- Ayak bileğini keskin uçlu steril makasla kesin ve tibianın bozulmadan kalmasını sağlayın. Forseps kullanarak femurun distal ucunu dişlerle tutun ve kalça eklemini keskin uçlu steril makasla kesin, femur başının sağlam kalmasını sağlayın.
- Tibias ve femurları steril 15 mL'lik bir tüp içinde akış tamponuna aktarın.
- Tibia ve femuru diz elle kırarak ayırın. Tibial platoyu ve distal femuru elle ortaya çıkarmak için patella, kıkırdak ve femoral kondilleri çıkarın. Steril bir gazlı bez kullanarak kasları çıkarın ve ardından kemikleri akış tamponuna batırın.
- Femur boynunu kesin ve kemik iliği hücrelerini 23 G iğneli 10 mL'lik bir şırınga kullanarak femurun her iki ucundan akış tamponu ile yıkayın.
- Tibial malleolusu kesin ve kemik iliği hücrelerini 23 G iğneli 10 mL'lik bir şırınga kullanarak tibianın her iki ucundan akış tamponu ile yıkayın.
- 18 G iğneli 10 mL'lik bir şırınga kullanarak yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hücreleri dağıtın. Tek hücreli süspansiyonu 4 °C'de ve 400 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj edin.
- Süpernatantı atın ve RBC'leri 3 dakika boyunca lize etmek için hücreleri 5 mL RBC lizis tamponunda yeniden askıya alın.
- Lizisi durdurmak için 5 mL akış tamponu ekleyin ve hücre süspansiyonunu 4 ° C'de ve 400 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj edin.
- Steril 50 mL'lik bir tüpün üzerine 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin. Peletleri 5 mL akış tamponu ile askıya alın, karıştırın ve hücreleri toplamak için hücre süzgecinden geçirin.
- Akış tamponu ile hücre konsantrasyonunu yuvarlak tabanlı polipropilen tüplerde 1 x 108/mL'ye ayarlayın.
- Üreticinin talimatına göre bir fare hematopoetik hücre izolasyon kiti kullanarak Lin- hücrelerini seçin.
- Bir lekesiz kontrol için 100 μL tamponda 1 x 104 hücreden oluşan üç tüpü ve APC konjuge fare karşıtı CD117 (c-Kit) ve PE-Cy7 konjuge fare karşıtı Ly-6A/E (Sca-1) için iki tek antikor lekeli kontrolü bir kenara bırakın. Tek bir antikor boyalı kontrol için 1 μL antikor (0.2 mg / mL stoktan) kullanın.
- Hücrelerin geri kalanını her iki antikorla (her biri 0.2 mg / mL stoklardan 4 μL) 400 μL'de bir tüpte lekeleyin.
- Boyama işleminden sonra, 1 mL akış tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve 3 dakika boyunca 4 ° C'de ve 400 x g'de santrifüj yapın.
- Lekesiz kontrol ve tek antikor boyalı kontroller için hücreleri 100 μL akış tamponunda yeniden askıya alın. Çift antikor boyalı hücreleri sıralama için 1 mL akış tamponunda yeniden askıya alın.
- Hematopoetik kök hücreleri (HSC'ler),23,24'te açıklandığı gibi bir hücre sıralayıcı kullanarak bir LSK popülasyonu olarak sıralayın.
- Boyama yaparken, steril 6 cm'lik bir kabı aşağıdaki gibi retronektin ile kaplayın: PBS'de 100 μg / mL retronektin stoğu hazırlayın ve 6 cm'lik bir kaba 0.9 mL PBS ve 0.1 mL retronektin ekleyin. Çanağı 2 saat boyunca oda sıcaklığında steril bir başlıkta kaplayın. Daha sonra, retronektini çıkarın ve kabı 30 dakika boyunca 0.5 mL filtrelenmiş% 2 BSA (PBS'de) ile bloke edin. Çanağı iki kez 5 mL PBS ile yıkayın ve çanak iletim için hazırdır.
- Sıralanmış HSC'leri veya sıralanmamış Lin- hücrelerini 4 ° C'de ve 400 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj edin ve retronektin kaplı bir kapta 3 mL 2x (sitokin) IMDM ortamı ve 3 mL viral süpernatant (adım 3.10'dan üretilen) içinde yeniden askıya alın. Çanağı nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de 6 veya 24 saat boyunca inkübe edin.
NOT: Bu çalışmada, Lin- hücreleri deneysel tasarıma bağlı olarak ya sıralanmış ya da sıralanmamıştır.
5. Seri transplantasyon (Şekil 1)
NOT: Primer alıcı fareler 8-10 haftalık erkek C57BL6/J farelerdi (CD45.2). Fırsatçı sindirim enfeksiyonlarını önlemek için transplantasyondan 3 gün öncesinden transplantasyondan 7 gün sonrasına kadar antibiyotik içeren su ad libitum sağlandı. Primer alıcı fareler transplantasyondan 3 saat önce sublethally ışınlandı (4.75 Gy)25. İzofluran intraperitoneal enjeksiyonlu farelere uygulanmadı.
- 6 veya 24 saat boyunca transdüksiyondan sonra, hücreleri oda sıcaklığında santrifüjleme ve 3 dakika boyunca 400 x g ile toplayın. Gerekirse çanak tabanına bağlı hücreleri toplamak için tripsin kullanın. Süpernatantı atın ve hücreleri önceden ısıtılmış PBS'de yeniden askıya alın. Alıcı sayısına bağlı olarak PBS'nin hacmini belirleyin (yani, retro-orbital ve intra-peritoneal enjeksiyonları olan alıcılar için sırasıyla 0.1 mL / fare ve 0.5 mL / fare).
- Sublethally ışınlanmış alıcı fareleri bir izofluran odasına yerleştirin (oksijen akış hızı 1.0 L / dak olarak ayarlanır ve izoflurane buharlaştırıcısı% 5 olarak ayarlanır). Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere ıslak merhem sürün. Fareler, kalp atışı dakikada 60 atıma düştüğünde daha ileri prosedürler için hazırdır.
- Hücreleri birincil alıcı farelere retro-orbital olarak (0,1 mL/fare)7 veya intraperitoneal olarak (0,5 mL/fare)26 27 G1/2 iğne ile enjekte edin. Sternal yatmayı sürdürmek için yeterli bilinç kazanana kadar fareleri sürekli olarak gözlemleyin. Transplantasyon sonrası refahları için fareleri günlük olarak izleyin.
- 1 ay sonra, aşağıda tarif edildiği gibi bir hemavet üzerinde tam kan sayımını (CBC) değerlendirerek lökositozu izlemek için retro-orbital kanama ile haftalık kan toplayın.
- İzofluran ile anesteziden sonra fareyi yanal olarak yerleştirin (oksijen akış hızı 1,0 L/dak ve izoflurance buharlaştırıcısı %5 olarak ayarlanır). Fareler, kalp atışı dakikada 60 atıma düştüğünde daha ileri prosedürler için hazırdır.
- Gözü başparmak ve işaret parmağı ile proptoz. Venöz sinüs pleksusuna asteril hemacrit kılcal tüp ile iç kanthustan nüfuz edin.
- Bir EDTA kan toplama tüpüne 20-25 μL kan toplayın ve kanamayı durdurmak için göz kapaklarını kapatın. Göze bir damla gentamisin sülfat oftalmik çözeltisi uygulayın.
- Son noktada, beyaz kan hücreleri (WBC'ler) 4 x 10 4 hücre / μL'ye ulaştığında, fareyi bir CO2 odasında ötenazi yapın ve femurları ve tibiaları akış tamponu ile yıkayarak kemik iliği hücrelerini izole edin, ardından adım4'te belirtildiği gibi RBC lizisi izleyin.
- Son noktada, splenositleri aşağıda belirtildiği gibi hasat edin.
- Fareyi bir CO2 odasında ötenazi yapın. Fareleri strafor bir tahta üzerindeki steril bir cerrahi ped üzerine yerleştirin ve bacakları fare pençesi pedlerinden geçirin. Farelerin tüm vücudunu% 70 etanol ile sterilize edin.
- Karın boşluğunu keskin uçlu steril makasla ortaya çıkarmak için orta hattaki cildi ve kası kesin. Dalağı keskin uçlu steril makasla izole edin ve steril 15 mL'lik bir tüp içinde akış tamponuna koyun.
- Dalağı, 3 mL akış tamponuna sahip 6 cm'lik bir tabakta 70 μm steril bir süzgeçten geçirin. Hücreleri çanaktan steril bir 15 mL tüpe aktarın ve tek hücreli süspansiyonu 4 ° C'de ve 400 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj edin.
- Süpernatantı atın ve RBC'leri 3 dakika boyunca lize etmek için hücreleri 5 mL RBC lizis tamponunda yeniden askıya alın. Lizisi durdurmak için 5 mL akış tamponu ekleyin ve hücre süspansiyonunu 4 ° C'de ve 400 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj edin.
- Steril 50 mL'lik bir tüpün üzerine 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin. Peletleri 5 mL akış tamponu ile askıya alın, karıştırın ve hücreleri toplamak için hücre süzgecinden geçirin.
- Splenositleri ve kemik iliği hücrelerini FITC-konjuge anti-fare CD45.1 antikoru ile boyayarak ve bir akış sitometresinde tespit ederek primer (1°) AML hücrelerini tanımlayın. Hücreler ilk önce FSC-A / FSC-H ve FSC-A ve SSC-A üzerine kapılıdır ve singlet elde edilir. CD45.1+ popülasyonu, lekelenmemiş hücrelerle karşılaştırılarak FL1 grafiği üzerinde geçitlenir.
- Sekonder (2°) transplantasyon için, PBS'deki (0.1 mL/fare) 1° r.o. alıcılarından CD45.1 AML dalak hücrelerini yeniden askıya alın ve CD45.2 erkek C57BL6/J farelere retro-orbital olarak enjekte edin. Buna paralel olarak, PBS'deki (0.5 mL / fare) 1 ° i.p. alıcılarından AML splenik hücrelerini yeniden askıya alın ve bunları 8-12 haftalık kırmızı floresan proteini (RFP) eksprese eden Ai14TdDomates erkek farelere intraperiton olarak enjekte edin27.
- Üçüncül (3°) transplantasyon için, 2° i.p. alıcılarının kemik iliğinden veya periton boşluğundan izole edilen AML hücrelerini yeniden askıya alın ve bunları sırasıyla Ai14TdDomates (RFP +) veya CD45.2 farelerine intraperiton olarak enjekte edin. 2° r.o. alıcılarının periton boşluğundan izole edilen AML hücrelerini yeniden askıya alın ve bunları Ai14Tddomates (RFP +) farelerine r.o. enjeksiyonu ile nakledin.
NOT: 2° transplantasyon için, periferik kandaki CBC'yi izleyerek 2° alıcılarda hastalığın ilerlemesini belirledik. AML'nin kuruluşunu daha da doğrulamak için, kalp delinmesi, kemik iliği, dalak ve karaciğer ile tüm periferik kanı topladık. Ayrıca, i.p. hücrelerini toplamak için i.p. lavajı yaptık. Tek hücreli süspansiyonlar, yukarıda tarif edildiği gibi kemik iliği, dalak ve i.p. lavajından elde edildi. Bu bölgelerden gelen hücreler, RBC lizizini takiben bir akış sitometresinde analiz edildi. AML hücreleri RFP negatif (RFP-) hücreler olarak tanındı. 3° transplantasyon için uç noktada kan, kemik iliği, dalak, karaciğer ve i.p. hücrelerini örnekledik; RFP veya CD45.1+ hücreleri AML hücreleri olarak tanımlandı ve akım sitometrisi ile incelendi. 2° ve 3° alıcı farelere ışınlama veya antibiyotik su verilmedi.
Şekil 1: Kemik iliği HSC'lerinde MLL-AF9 viral transdüksiyonunun şeması ve seri transplantasyon (1°, 2° ve 3°). Sca-1 ve c-Kit çift pozitif popülasyonunun, kaynakların izin vermesi durumunda, noktalı gölge kutusunda gösterilen bir hücre sıralayıcısı kullanılarak sıralanması isteğe bağlı olarak kabul edilir. Şekil BioRender (https://biorender.com/) kullanılarak oluşturulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
6. İntra-peritoneal lavaj
- Hücreleri 15 mL'lik steril bir tüpte toplamak için periton boşluğuna iki kez 5 mL tamamlanmamış IMDM ortamı enjekte edin. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında ve 400 x g'da 3 dakika boyunca santrifüj edin. 2° alıcıların periton boşluğundan AML hücrelerini (4 x 105 hücre/fare) 3° CD45.2 alıcı farelere i.p. enjeksiyonu yoluyla nakledin (n = 3).
7. Histolojik analiz 28
- Dalakları, karaciğerleri ve femurları ötenazi üzerine farelerden izole edin. Bunları 5 mL'lik %10 (v/v) tamponlu formalin içinde sabitleyin. Karşılaştırmalar için dalakları ve karaciğerleri sağlıklı meslektaşlarından örnekleyin.
- Sabit dokuları parafine gömün ve bölümlere ayırın. Kesitleri hematoksilin ve eozin (H&E) boyaları ile lekeleyin.
- Görüntüleri mikroskop altında, histolojik analiz için uyumlu bir yazılımla yüklenmiş 20x büyütmede elde edin.
8. Yarı kantitatif PCR (qPCR) uygulanması
- RNA reaktifindeki RNA'ları üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
- Üreticinin talimatlarına göre bir cDNA ters transkripsiyon kiti kullanarak cDNA'yı sentezlemek için 0.5-1.0 μg RNA'ları kullanın.
- Bir qPCR kiti kullanarak qPCR gerçekleştirmek ve örnekleri bir qPCR sisteminde çalıştırmak için cDNA'yı kullanın. Aşağıdaki önceden doğrulanmış TaqMan problarını kullanın: KMT2A (MLL; Ref Seq: NM_001197104(2), IDT)29 ve 18S ribozomal RNA (Hs99999901_s1).
- İfadeyi görselleştirmek için KMT2A ve 18S amplikonlarını% 2'lik bir agaroz jeli üzerine yükleyin. Uyumlu yazılım programıyla birlikte yüklenen bir görüntüleyicide görüntü alın.
9. Veri işleme
- İstatistiksel analiz yazılımını kullanarak sonuçları analiz edin ve sonuçları SEM'± ortalama olarak sunun. ticari bir illustrator aracı kullanarak rakamlar oluşturun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Murin AML hücrelerinin transplantasyon etkinliğinin r.o. ve i.p. transplantasyon yolları kullanılarak karşılaştırılması
Daha önce, MLL-AF9-transdüse LSK hücreleri ile retro-orbital olarak nakledilen alıcı farelerde 1° AML oluşumu bildirilmiş ve 1° AML hücrelerinin nakledilebilirliği seri transplantasyon30 ile gösterilmiştir. Bu çalışma, transplantasyon gerçekleştirmek için kemik iliği Lin-hücrelerinin kullanılma olasılığını değerlendiren ilk çalışmadır. Anormal lökositoz varlığı (Şekil 2A) ve kemik iliği ve dalakta lösemik hücrelerin (CD45.1+) artmış infiltrasyonu (Şekil 2B), 1° AML üretmek için kemik iliği Lin- hücrelerinin kullanılmasının fizibilitesini desteklemektedir. Hastalık indüksiyon periyodunu karşılaştırmak için, LSK veya Lin- hücrelerini izole etmek için alıcı başına iki donör fareye ötenazi yapıldı. Sonuçlardan, LSK veya Lin- hücreleri ile nakledilen 1° alıcılarda anlamlı bir fark gözlenmedi (Şekil 2C).
1° AML metastazı incelendiğinde, AML hücrelerinin MLL-AF9-transdüe Lin- hücreleri tarafından 1° alıcıların karın boşluğuna yayıldığı keşfedilmiştir (Ek Şekil 1). Bu bulgu, yeni ve daha kolay bir nakil yolu olarak hizmet edebilecek olan murin AML üretiminde i.p. enjeksiyonunun benimsenip benimsenemeyeceğini test etmek için araştırmaya ilham verdi. Kemik iliği Lin- popülasyonunun AML donör hücreleri olarak kullanılmasının başarısı nedeniyle, mevcut veriler, lökositoz şeklinde görüldüğü gibi MLL-AF9-transdüne kemik iliği Lin- hücrelerinin i.p. enjeksiyonu yoluyla 1° AML'nin kurulduğunu doğrulamıştır (Şekil 2D) ve alıcı farelerin kemik iliği ve dalağında AML hücrelerinin (CD45.1+) varlığı (Şekil 2E). Bununla birlikte, i.p. enjeksiyonu yoluyla transplantasyon, alıcıların eşit sayıda donör hücre almasına rağmen, AML'nin gelişmesi r.o. enjeksiyonundan daha uzun sürdü (Şekil 2F). Ayrıca, Şekil 2F'de daha fazla Lin- hücresi (5.125 x 10 6 hücre/fare) ile retro-orbital olarak nakledilen fareler, Şekil 2C'de daha az Lin- hücresi (3.69 x 106 hücre/fare) ile nakledilenlerden daha hızlı AML geliştirmiş görünmektedir.
1° AML alıcılarında inkübasyon süresinin doğal tutarsızlığı nedeniyle (Şekil 2F), 2° alıcılarda i.p. transplantasyonunu test etmek için bir girişimde bulunulmuştur. 2° transplantasyon için intraperitoneal transplantasyon yapılan 1° alıcılardan izole edilen 8 x 105 AML hücre ile i.p. enjeksiyonu yapıldı. 2° alıcılar transplantasyondan sonra 1 aydan kısa bir sürede lökositoz (Şekil 2G) ve anlamlı hepatosplenomegali (Şekil 2H) gösterdi, bu da 1° transplantasyondan belirgin bir ilerlemeydi. Bu gözlemle tutarlı olarak, AML hücreleri (RFP-) periferik kan, kemik iliği ve dalakta (Şekil 2I) ve periton boşluğunda (Ek Şekil 1) de tespit edildi. Ayrıca, 2° alıcıların kan, dalak ve karaciğerindeki onkogen KMT2A ekspresyonu da AML'nin başarılı oluşumunu doğrulamıştır (Şekil 2J). Ayrıca, histolojik analiz, intraperitoneal transplante edilen farelerin dalağında ve karaciğerinde lösemik hücrelerin infiltrasyonunu göstermiştir (Şekil 2K). Bu veriler, i.p. enjeksiyonu ile üretilen 1 ° AML hücrelerinin 2 ° alıcılara nakledilebildiğini doğrulamaktadır. Ayrıca, alıcılara fare başına 8 x 105 AML hücrenin i.p. enjeksiyonu, alıcılara fare başına 8 x 105 AML hücrenin r.o. enjeksiyonu ile karşılaştırılabilir engraftman elde etmiştir (Şekil 2L).
LSC'lerin temel özelliklerinden biri seri nakledilebilirliktir; Bu nedenle, 2 ° alıcılarda AML'nin kurulmasını daha da belirlemek için, bu protokol 2 ° i.p. transplantasyonundan AML hücrelerinin seri olarak nakledilebilir olup olmadığını ve 3 ° transplantasyonda i.p. enjeksiyonu ile kök hücre transplantasyonunun fizibilitesini doğrulamaya çalışmıştır. 2° alıcıların kemik iliğinden (0.5 mL PBS'de 8 x 10 5 lösemik hücre/fare) veya i.p. lavajından (0.5 mL PBS'de 4 x 105 lösemik hücre/fare) izole edilen AML hücreleri 3° alıcılara enjekte edildi. Farklı kaynaklardan üretilen donör hücrelerle nakledilmesine rağmen, 3° alıcı fareler, lökositoz (Şekil 3A) ve hepatosplenomegali (Şekil 3B), kan, kemik iliği ve dalakta lösemik hücrelerin varlığı (Şekil 3C) ve KMT2A ekspresyonu (Şekil 3D) dahil olmak üzere AML belirtileri (sırasıyla kemik iliği hücreleri ve i.p. hücreleri için 3 ve 4 hafta içinde) akut olarak sergilemiştir (Şekil 3D ). Femur ve dalağın histolojik gözlemi ayrıca lösemik hücrelerin infiltrasyonunu göstermiştir (Şekil 3E). Bir karşılaştırma olarak, 2° alıcılardan lösemik splenositlerin (4 x 105 hücre) r.o. enjeksiyonu, lökositoz (Ek Şekil 2A), hepatosplenomegali (Ek Şekil 2B) ve kan, kemik iliği ve dalaktaki AML hücrelerinin infiltrasyonu (Ek Şekil 2C) ile karakterize edilen 3° alıcılarda AML'yi engrafize etme ve geliştirme konusunda eşit derecede yetenekliydi (Ek Şekil 2C).
İntraperitoneal transplantasyon, AML hücrelerinin 3° transplantasyonunda bile etkilidir
2° ve 3° transplantasyonlarla karşılaştırıldığında, 3° transplantasyonun (Şekil 3F) hem i.p. hem de r.o. enjeksiyonları için 2° transplantasyondan (Şekil 2L) çok daha hızlı ilerlediği sonucuna kolayca varılabilir. Özellikle, 4 x 105 AML hücresi / faresinin i.p. enjeksiyonu, 6 gün boyunca aynı sayıda AML hücresinin ro'dan daha sonra AML'yi geliştirdi (Şekil 3F), muhtemelen periton boşluğundan kemik iliği nişine göçe harcanan zamanı gösterir. İlginç bir şekilde, 3 ° nakledilen farelerde periton boşluğundaki (Ek Şekil S2) yüksek lösemik hücre sıklığı, periton boşluğunun lösemik hücrelerin hızlı genişlemesi için niş sağlayabileceğini düşündürmüştür. Ayrıca, retro-orbital olarak nakledilen 1° ve 3° alıcılarının periton boşluğunda lösemik hücrelerin varlığı, lösemik hücrelerin periton boşluğu ile kan sistemi arasındaki karşılıklı dolaşımını göstererek i.p. transplantasyonunu haklı çıkarmıştır. Toplu olarak, bu bulgular AML'nin seri transplantasyonunda i.p. enjeksiyonunun kullanımını doğrulamaktadır.
Şekil 2: 1° ve 2° transplantasyonlarda murin AML modelinin oluşturulması. (A) Tam kan sayımı (CBC; 1 x 103 hücre/μL kan), WBC, nötrofil (NE), lenfosit (LY), monosit (MO), eozinofil (EO) ve BAZOFIL (BA) profili, hemavet (n=3) ile MLL-AF9 transdüne kemik iliği Lin- hücreleri (5.125 x 106 hücre/fare) ile retro-orbital olarak nakledildi. (B) MLL-AF9-transdüe kemik iliği Lin- (5.125 x 106 hücre/fare) hücreleri (n=3) ile retro-orbital olarak nakledilen 1° CD45.2 alıcı farelerin kemik iliği ve dalağındaki AML hücrelerinin (CD45.1+) frekansının akış sitometrik analizi. (C) MLL-AF9 transdüslü kemik iliği LSK hücreleri (iki donörden izole edilen 3.16 x 105 hücre/fare, n = 4) veya Lin- hücreleri (iki donörden izole edilen 3.69 x 106 hücre/fare, n = 3) ile retro-orbital olarak nakledilen alıcılarda 1° AML'lik inkübasyon süresi. Her alıcıya iki donörden izole edilmiş hücreler verildi. (D) MLL-AF9 transdüse kemik iliği Lin- hücreleri (5.125 x 106 hücre/fare) ile periton içi nakledilen 1° alıcı farelerin hemavet (n = 4) ile CBC analizi. (E) MLL-AF9 transdüe kemik iliği Lin- hücreleri (5.125 x 106 hücre/fare, n = 3) ile peritoneal olarak nakledilen 1° CD45.2 alıcı farelerin kemik iliği ve dalağındaki AML hücrelerinin (CD45.1+) frekansının akış sitometrik analizi. (F) MLL-AF9 transdüe kemik iliği Lin- hücreleri ile retro-orbital (n = 3) veya intra-peritoneal (n = 3) nakledilen alıcılarda 1° AML'lik inkübasyon süresi. Her alıcı aynı miktarda donör hücre aldı (5.125 x 106 hücre / fare). (G) Hemavet (n = 3) ile nakledilen 1° i.p. alıcılarının dalağından izole edilen AML hücreleri (8 x 105 hücre/fare) ile intraperitoneal olarak nakledilen 2° alıcıların CBC analizi. (H) 1° i.p. nakledilen alıcıların dalağından izole edilen AML hücreleri (8 x 105 hücre/fare) ile periton içi nakledilen 2° alıcı farelerin dalak ve karaciğerinin ağırlıkları (mg). Gölgeli alanlar dalak ve karaciğerin normal ağırlık aralıklarını temsil eder. 2 ° alıcı farelerden ve sağlıklı meslektaşlarından dalak ve karaciğerin temsili görüntüsü. (I) 1° i.p. nakledilen alıcıların dalağından izole edilen AML hücreleri (8 x 105 hücre/fare) ile periton içi nakledilen 2° RFP+ alıcı farelerin kan, kemik iliği ve dalaktaki AML hücrelerinin (RFP-) frekansının akış sitometrik analizi (n = 3). (J) Bir DNA bandı olarak sunulan KMT2A ve 18S'nin gen ekspresyonu. RNA'lar, intraperitoneal olarak nakledilen 2° alıcı farelerin kan, kemik iliği, dalağı ve karaciğerinden, 1° i.p. nakledilen alıcıların dalağından izole edilen AML hücreleri (8 x 105 hücre/fare) ile izole edildi. (K) 1° i.p. nakledilen alıcıların ve sağlıklı muadillerinin dalağından izole edilen AML hücreleri (8 x 10,5 hücre/fare) ile intraperitoneal olarak nakledilen 2° alıcıların dalağında (sol panel) ve karaciğerinde (sağ panel) histolojik değişikliklerin temsili görüntüleri. (L) Sırasıyla 1° r.o. ve i.p. nakledilen alıcılardan izole edilen AML hücreleri ile retro-orbital olarak (4 x 10 5/fare, n = 9) veya intraperitoneal olarak (8 x 105/fare, n = 4) nakledilen alıcılarda 2° AML'lik inkübasyon süresi. Sonuçlar SEM ± ortalamadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: AML hücrelerinin i.p. transplantasyonu ile 3° transplantasyonu. (A-E) 3° RFP+ veya CD45.2 alıcı fareler. Solda: 2° alıcıların kemik iliğinden AML hücrelerinin (8 x 105 hücre/fare) i.p. enjeksiyonu. Sağ: i.p. 2° alıcıların periton boşluğundan (i.p.) AML hücrelerinin (4 x 105 hücre/fare) enjeksiyonu (n=3). (A) Hemavet tarafından 3° alıcı farelerin CBC analizi. (B) 3° alıcı farelerin dalak ve karaciğerinin ağırlıkları (mg). Gölgeli alanlar dalak ve karaciğerin normal ağırlık aralıklarını temsil eder. (C) 3° alıcı farelerin kan, kemik iliği ve dalaktaki AML hücrelerinin (sol: RFP-; sağ: CD45.1+) frekansının akış sitometrik analizi. (D) DNA bandı olarak sunulan KMT2A ve 18S'nin gen ekspresyonu. RNA'lar 3° alıcı farelerin kan, kemik iliği, dalak ve karaciğerinden izole edildi. (E) 3° alıcı farelerin dalağında (sol panel) ve femurunda (sağ panel) histolojik değişikliklerin temsili görüntüleri. (F) Sırasıyla 2° r.o. ve i.p. nakledilen alıcılardan izole edilen AML hücreleri ile retro-orbital olarak (4 x 10 5 hücre/fare, n = 3) veya intraperitoneal olarak (4 x 105 hücre/fare, n = 3) nakledilen alıcılarda 3° AML'lik kuluçka süresi. Sonuçlar SEM ± ortalamadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Periton boşluğundaki AML hücre infiltrasyonunun akım sitometrik analizi. Retro-orbital olarak nakledilen 1° alıcıların (1° RO, n = 2), intraperitoneal olarak nakledilen 2° alıcıların (2° IP, n = 2) ve kemik iliği AML hücreleri (3° BM-IP, n = 3) ve i.p. AML hücreleri (3° IP-IP, n = 3) ile i.p. enjeksiyonu yoluyla nakledilen 3° alıcıların periton lavajındaki AML hücrelerinin sıklığı ve ayrıca AML splenositlerinin r.o. enjeksiyonu yoluyla nakledilen 3° alıcılar (3° SP-RO, n = 3). Sonuçlar SEM ± ortalamadır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: AML splenositlerinin r.o. enjeksiyonu yoluyla 3° transplantasyonu. (A) 2° alıcı farelerin dalağından AML hücreleri (4 x 105 hücre/fare) ile retro-orbital olarak nakledilen 3° alıcı farelerin CBC analizi. (B) 3° retro-orbital olarak nakledilen alıcı farelerin dalak ve karaciğer ağırlıkları (mg). Gölgeli alanlar dalak ve karaciğerin normal ağırlık aralıklarını temsil eder. (C) Retro-orbital olarak nakledilen 3° alıcı farelerin kan, kemik iliği ve dalaktaki AML hücrelerinin (RFP-) sıklığı (n = 3). Sonuçlar SEM ± ortalamadır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda tarif edilen bu çalışmalar, Lin- hücrelerinin transplantasyonunun 1 ° murin AML oluşumundaki LSK hücreleri ile karşılaştırılabilir olduğuna dair destekleyici kanıtlar sunmaktadır. Ek olarak, mevcut veriler ayrıca i.p. enjeksiyonunun, intravenöz (veya ro) enjeksiyona kıyasla murin AML'yi oluşturmak için etkili ve uygun bir yöntem olduğunu göstermektedir.
LSK hücrelerine ek olarak, granülosit-monosit progenitör (GMP), ortak lenfoid progenitör (CLP) ve ortak miyeloid progenitör (KMP) gibi diğer popülasyonların, çeşitli inkübasyon süreleri31,32 olan 1° MLL-AF9 ile indüklenen AML oluşumunda donör hücreler olarak ikame edildiği bildirilmiştir, ancak kantitatif karşılaştırma optimal seçimi önermek için eksiktir. Mevcut çalışmada, aynı donör farelerden izole edilen Lin- ve LSK, transdüe miyeloid progenitör hücrelerin (Sca-1-) AML33'ü başlatabildiği göz önüne alındığında, 1 ° MLL-AF9 ile indüklenen AML oluşumunda belirgin bir fark yoktu. LSK popülasyonunun akış sitometrisine dayalı olarak sınıflandırılması için gereken masraf ve zaman göz önüne alındığında, bu çalışmalar Lin- popülasyonunun 1° transplantasyon için donör hücreler olarak kullanılmasını desteklemektedir. Bu nedenle, bu protokoldeki 4.19'dan 4.23'e kadar olan adımlar gerekli değil, isteğe bağlıdır ve nihai sonucu etkilemez.
1 ° transplantasyondaki donör farelerin miktarı açısından, bir donör ~ 1.0 ila 1.5 x 105 LSK hücresi sağlayabildi ve bu miktarda LSK hücresi ile nakledilen bir alıcı yaklaşık 4 ay içinde 1 ° AML geliştirdi. Bununla birlikte, LSK hücrelerini oluşturmak için donör sayısının alıcı başına ~ 3 x 105 hücreye kadar arttırılması, inkübasyon süresini ~ 70 güne kadar kısaltabilir. Bu nedenle, iki donör hızlı bir şekilde 1 ° AML üretmek için yeterli olmalıdır. Bu ilke aynı zamanda Lin- hücreleri için de geçerlidir, burada ~ 1.0 ila 2.5 x 106 Lin hücreleri her donör fareden izole edilebilir. Bununla birlikte, donör hücre yoğunluğu arttırıldığında, lösemiogenezin geri dönüş süresi oldukça kısaydı. Bu veriler, adım 4.1'deki donör farelerin sayısına karar verirken dikkate alınmalıdır.
R.o. enjeksiyonu ile karşılaştırıldığında, i.p. enjeksiyonu, tam gelişmiş 1 ° AML'yi geliştirmek için yaklaşık ~ 20 gün daha sürdü, ancak bu sınırlama, i.p. enjeksiyonu için donör hücrelerin arttırılmasıyla aşıldı. Bu kadar belirgin bir farklılığa rağmen, her iki yöntem de kemik iliğinde ve dalakta benzer engraftman oranı (% >80) gösterdi ve bu da AML'de 1 ° transplantasyonda i.p. enjeksiyonunun genel uygulanabilirliğini gösterdi. 1° transplantasyon için nispeten uzun inkübasyon süresi ve alıcı farelerde gecikmenin tutarsızlığı açısından öngörülemeyen hastalık ilerlemesi, farmakolojik müdahaleler ve mekanik çalışmalar gibi kontrollü deneyler için önemli bir sınırlamadır. Bu nedenle, sonraki seri transplantasyonlarda, tipik olarak 2° transplantasyonda transplantasyon için 1° lösemik hücrelerin kullanılması önerilmektedir (Şekil 1). Dalaktaki her bir 1° alıcıdan dalakta 3 x 108 adede kadar lösemik hücre (ve kemik iliğinde 6 x 107 hücre) üretilebildiğinden, 300'den fazla farede 2° transplantasyon yapmak için yeterli olacağından, gecikmeyi kısaltmak ve 1° transplantasyonun engraftman oranını artırmak için mümkün olduğunca çok hücrenin daha az alıcıya nakledilmesi önerilmektedir. adım 4.1 ve adım 5.2 için önemlidir.
Tutarlı ve kısa gecikme süresi göz önüne alındığında, 2 ° transplantasyon, yukarıda belirtilen in vivo deneyler de dahil olmak üzere birçok uygulamada kullanılabilir. Ayrıca, i.p. enjeksiyonu, deneyimsiz teknisyenler için bol miktarda nakil prosedürünü de kolaylaştırır. Genellikle AML'yi 3 haftada üreten r.o. enjeksiyon yolu ile karşılaştırıldığında, i.p. enjeksiyon yöntemi, tam gelişmiş bir AML oluşturmak için aynı sayıda donör hücre ile biraz daha uzun sürdü (~ 4 hafta). Nispeten daha kolay ve daha uygun olmasına rağmen, nakledilen hücre sayısının arttırılması veya üçüncül transplantasyon yapılması da AML'nin i.p. enjeksiyonu ile ilerlemesini hızlandırabilir.
Özetle, bu tekniğin en büyük sınırlaması, hem 1 ° hem de 2 ° transplantasyonlarda aynı miktarda donör hücre ile intravenöz enjeksiyondan daha uzun inkübasyon süresidir. Ancak nakledilecek hücre sayısının arttırılması ile kolaylıkla aşılabilir. Bariz avantajlarının yanı sıra, bu tekniğin başka uygulamaları da vardır. Örneğin, i.p. transplantasyon yöntemlerini kullanma yeteneği, pahalı in vitro kültür ortamına ihtiyaç duymadan bu hücrelerin rutin olarak kültürlenmesine de hizmet edebilir. Bu tekniğin lenfoid lösemi ve kronik miyeloid lösemi gibi diğer hematolojik malignitelerde ve hasta kaynaklı ksenogreftlerde uygulanmasını genişletmek için gelecekte daha ileri çalışmaların yapılması gerekmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar, Huck Enstitüsü'nün Akış Sitometri Çekirdek Tesisi'ne ve Pennsylvania Eyalet Üniversitesi, Veterinerlik ve Biyomedikal Bilimler Bölümü, Hayvan Teşhis Laboratuvarı'nın Histopatoloji Çekirdek Tesisi'ne zamanında teknik destek sağladıkları için teşekkür eder. Bu çalışma, Amerikan Kanser Araştırmaları Enstitüsü (KSP), Penn State Tarım Bilimleri Koleji, Penn State Kanser Enstitüsü, USDA-NIFA projesi 4771, K.S.P. ve R.F.P.'ye 00000005 katılım numarası ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| a-Select competent cells | Bioline | BIO-85027 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade | Gemini bio-products | Cat# 700-102P | |
| Ciprofloxacin HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-transferrin, bovine | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Insulin solution human | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamine 200 mM (100×) solution | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB broth, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Mouse Interleukin-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
| Mouse Interleukin-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
| Mouse Stem Cell Factor (SCF) | Gemini bio-products | Cat# 300-348P | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Reagent | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Commercial Assays | |||
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
| Instruments and Softwares | |||
| Adobe illustrator | Version 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys software program | Version 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism version 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Real time PCR system | Applied Biosystems | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging | G:Box Chemi |
References
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D.
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Ernst, P., et al. Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).
- Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models. Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).
- Zhan, Y., Zhao, Y. Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection. Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).
- Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes. Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. The Laboratory Mouse. , CRC Press Inc. (2001).
- Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).
- Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).
- Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Leong, S. -K., Ling, E. -A. Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route. Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).
- Ma, P., et al. Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice. International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation. Transfusion. 51, Suppl_4 106-117 (2011).
- Zhao, W., et al. Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).
- Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).
- Cheng, K., et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms. Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).
- Castelo-Branco, M., et al. Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis. PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).
- Bazhanov, N., et al. Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs. Stem Cell Research & Therapy. 7, 27 (2016).
- Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model. Cell Death & Disease. 7 (9), 2361 (2016).
- Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. Identification and isolation of hematopoietic stem cells. Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).
- Randall, T. D., Weissman, I. L. Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population. Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).
- Gott, K. M., et al. A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model. Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L.
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin. Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).
- Qian, F., et al. Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia. FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Chen, W., et al. Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells. Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).
- Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
