Summary
מאמר זה מתאר אלגוריתם מתאם תמונה דיגיטלית בקוד פתוח למדידת זני רקמות דו-ממדיים מקומיים בתוך צמחי גידים. דיוק הטכניקה אומת באמצעות טכניקות רבות, והיא זמינה לשימוש ציבורי.
Abstract
קיים עניין מדעי רב בהבנת הזנים שתאי גידים חווים באתרם וכיצד זנים אלה משפיעים על עיצוב מחדש של רקמות. בהתבסס על עניין זה, פותחו מספר טכניקות אנליטיות למדידת זני רקמה מקומיים בתוך צמחי גידים במהלך העמסה. עם זאת, במספר מקרים, הדיוק והרגישות של טכניקות אלה לא דווחו, ואף אחד מהאלגוריתמים אינו זמין לציבור. עובדה זו הקשתה על מדידה נרחבת יותר של זני רקמה מקומיים בצמחי גידים. לכן, מטרת מאמר זה הייתה ליצור כלי ניתוח מתוקף למדידת זני רקמה מקומיים בצמחי גידים, זמין וקל לשימוש. באופן ספציפי, אלגוריתם ALDIC (רגימנט-לגראנז'יאני) זמין לציבור הותאם למדידת זנים דו-ממדיים על ידי מעקב אחר התזוזות של גרעיני התא בתוך גידי אכילס של עכבר תחת מתח חד-צירי. בנוסף, הדיוק של הזנים המחושבים אומת על ידי ניתוח תמונות שעברו טרנספורמציה דיגיטלית, כמו גם על ידי השוואת הזנים עם ערכים שנקבעו מטכניקה עצמאית (כלומר, קווים מולבנים). לבסוף, שולבה באלגוריתם טכניקה לשחזור תמונת הייחוס באמצעות שדה התזוזה המחושב, שניתן להשתמש בו כדי להעריך את דיוק האלגוריתם בהיעדר ערכי מתח ידועים או טכניקת מדידה משנית. האלגוריתם מסוגל למדוד זנים עד 0.1 בדיוק של 0.00015. הטכניקה להשוואת תמונת ייחוס משוחזרת לתמונת הייחוס בפועל זיהתה בהצלחה דגימות עם נתונים שגויים והצביעה על כך שבדגימות עם נתונים טובים, כ-85% משדה התזוזה היה מדויק. לבסוף, הזנים שנמדדו בגידי אכילס של עכברים תאמו את הספרות הקודמת. לכן, אלגוריתם זה הוא כלי שימושי ביותר וניתן להתאמה למדידה מדויקת של זני רקמות מקומיים בגידים.
Introduction
גידים הם רקמות רגישות למכנו שמסתגלות ומתנוונות בתגובה לעומס מכני 1,2,3,4. בשל התפקיד שממלאים גירויים מכניים בביולוגיה של תאי הגידים, קיים עניין רב בהבנת הזנים שתאי הגידים חווים בסביבת הרקמה הטבעית במהלך ההעמסה. פותחו מספר טכניקות ניסיוניות ואנליטיות למדידת זני רקמות מקומיים בגידים. אלה כוללים ניתוחי מתאם תמונה דיגיטלית דו-ממדית / תלת-ממדית (DIC) של זני פני השטח באמצעות תבניות כתמים או קווים פוטו-מולבנים (PBLs)5,6,7,8, מדידת השינויים במרחק הצנטרואידי לצנטרואידי של גרעינים בודדים בתוך הרקמה 9,10, ושיטת DIC תלת-ממדית בשדה מלא ששקלה לאחרונה תנועה מחוץ למישור ועיוותים תלת-ממדיים 11 . עם זאת, הדיוק והרגישות של טכניקות אלה דווחו רק במקרים ספורים, ואף אחת מהטכניקות הללו לא פורסמה לציבור, מה שמקשה על אימוץ ושימוש נרחב בטכניקות אלה.
מטרת עבודה זו הייתה ליצור כלי ניתוח מתוקף למדידת זני רקמה מקומיים בצמחי גידים, זמין וקל לשימוש. השיטה שנבחרה מבוססת על אלגוריתם ALDIC (ראשי תיבות של Augmented-Lagrangian Digital Image Correlation – Aldic) שנכתב ב-MATLAB ופותח על ידי Yang ו-Bhattacharya12. אלגוריתם זה הותאם לניתוח דגימות גידים ואומת על ידי יישומו על תמונות שעברו טרנספורמציה דיגיטלית ועל ידי השוואת הזנים שנמדדו בדגימות גידים בפועל לתוצאות שהתקבלו מקווים מולבנים. יתר על כן, פונקציונליות נוספת הוטמעה באלגוריתם כדי לאשר את הדיוק של שדה התזוזה המחושב גם בהיעדר ערכי מאמץ ידועים או טכניקת מדידה משנית. לכן, אלגוריתם זה הוא כלי שימושי ביותר וניתן להתאמה למדידה מדויקת של זני רקמה דו-ממדית מקומית בגידים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פנסילבניה.
1. הכנת רקמות
- לצורך פרוטוקול זה, קצרו את גידי אכילס מעכברים זכרים C57BL/6 בני 2-4 חודשים.
הערה: ניתן להשתמש גם בגידים או רצועות שונים מעכברים או בעלי חיים קטנים אחרים.- בצע חתך בעור שטחי לגיד אכילס כדי לחשוף את גיד הפלנטריס ואת רקמת החיבור שמסביב. לאחר מכן, הסר אותם באמצעות להב כירורגי.
- להפריד את שרירי הסולאוס והגסטרוקנמיוס החשופים מהגפה האחורית, ולגרד אותם בזהירות מגיד אכילס עם להב הניתוח
- להפריד את calcaneus משאר כף הרגל עם חיבור גלגל חיתוך על כלי סיבובי.
- צבעו את הרקמה ב-1.5 מ"ל של תמיסה של 5 מיקרוגרם/מ"ל של 5-(4,6-dichlorotriazinyl) aminofluorescein (DTAF) ו-0.1 M סודיום ביקרבונט למשך 20 דקות על מיקסר מסתובב בטמפרטורת החדר. תמיסה זו מכתימה חלבונים (למשל, מטריצה חוץ-תאית) ברקמה.
הערה: במהלך פרק זמן זה של 20 דקות, יש להשלים את שלב 1.3. - הכינו תמיסה בקנ"מ 1:1,000 של DRAQ5 במי מלח חוצצי פוספט (PBS) כדי להכתים את הגרעינים. השתמש מערבול מערבולת כדי הומוגניזציה של התמיסה.
- לאחר תקופת הדגירה של 20 דקות בשלב 1.2, מעבירים את הרקמה מתמיסת DTAF לתמיסת DRAQ5, ודגרים בחלל חשוך למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
2. העמסת גידים ורכישת תמונה
הערה: פרוטוקול זה דורש התקן מתיחה שניתן להרכיבו על גבי מיקרוסקופ קונפוקלי. עבור מחקר זה, מכשיר microtensile שתואר על ידי Peterson ו Szczesny13 שימש.
- הניחו את הגיד בידיות האחיזה של מכשיר העמסת המתיחה. לפני הרכבת ידיות האחיזה במכשיר הטעינה, השתמש בקליפרים דיגיטליים כדי למדוד את המרחק בין חיבור הקלקניוס לבין האחיזה הנגדית. מרחק זה הוא אורך מד הגיד.
- לחלופין, הרכיבו את ידיות האחיזה במכשיר ההעמסה לפני החדרת הגיד, ודחפו למגע כדי להגדיר את מיקום המנוע ללא תזוזה. תזוזת המנועים לאחר החדרת הגיד עשויה לספק אורך מד אחיזה מדויק יותר.
- הרכיבו את ידיות האחיזה במכשיר הטעינה, המכיל PBS לשמירה על לחות הרקמות. יישרו את הגיד בצורה הטובה ביותר האפשרית עם ציר ה-X או ציר ה-Y של תמונות המיקרוסקופ, כך שיציאות זן ה-X וזן ה-Y של האלגוריתם יתאימו לצירי הגידים.
הערה: במחקר זה, הגידים היו מיושרים עם ציר ה-x. אם לא ניתן ליישר באופן מושלם את הגיד עם צירי התמונה, אזי ניתן להפוך את פלטי זן ה-x וה-y של האלגוריתם כך שיתאימו לצירים האורכיים/ניצבים של הגיד באמצעות משוואות טרנספורמציית מאמץסטנדרטיות 14. - טען מראש את הגיד עם 1 גרם של מתח, ואם תרצה, להחיל עומס מחזורי כדי precondition את הדגימה. בפרוטוקול זה, לא נעשה שימוש בהתניה מוקדמת מכיוון שמטרת המחקר הייתה לאמת את זני הרקמה המקומיים שנמדדו ולא למדוד את תכונות חומר הרקמה. אם יש עניין למדוד את תכונות החומר בקנה מידה מאקרו, אשר תלויים בהיסטוריית הטעינה, אז preconditioning מומלץ. לאחר התניה מוקדמת והתאוששות, יש להחיל מחדש טעינה מוקדמת של 1 גרם.
- אם תרצה, בצע פוטואקונומיקה של קבוצה של ארבעה קווים במרווחים של 80 מיקרומטר זה מזה באזור המרכזי של הרקמה (ראה Peterson and Szczesny13 לפרטים נוספים).
הערה: הקווים המולבנים שימשו לאימות המדידות של אלגוריתם ALDIC ואינם נחוצים לביצוע ה- ALDIC עצמו. ניתן להתאים את מספר הקווים וריווחם, ולבחור את מיקום הקווים כדי למנוע ממצאים במדגם שיפחיתו את בהירות הקו. - חזור על הליך ההלבנה בצד שמאל וימין של הרקמה ליד האחיזות.
- באמצעות המיקרוסקופ הקונפוקלי, קבל תמונות נפחיות (x,y: 1.25 μm/pixel, z: 2.5 μm/pixel) של הפלואורסצנטיות DTAF ו-DRAQ5 בטעינה מוקדמת של 1 גרם.
- בצעו כבש מאמץ במתח של 0.5%/s עד 2%. שימו לב שניתן להתאים את קצב המאמץ ואת גודל המאמץ המצטבר.
- הניחו לרקמה להילחץ למשך 10 דקות.
הערה: יש לבחור את משך ההרפיה במתח כך שהדגימה תהיה תחת עומס כמו-סטטי בקירוב במהלך רכישת התמונה. כדי לקבוע אם משך הרפיית המאמץ מקובל, קבעו את שיפוע עקומת הכוח-זמן במהלך הדקה האחרונה של הרפיית המאמץ (איור משלים 1), והכפילו את השיפוע הזה במשך ההדמיה הכולל. במחקר זה, הכוח המופעל בהפרש הזן הגדול ביותר מעולם לא השתנה ביותר מ-5%. - צלם תמונה נפחית נוספת של הרקמה לאחר עיוות.
- חזור על שלבים 2.7-2.9 עד לקבלת הזן הסופי הרצוי. במאמר זה נבחר ערך זן סופי של 12%.
3. עיבוד תמונה
- השתמש ב- ImageJ או בפיג'י כדי ליצור הקרנות z מרביות של כל תמונה נפחית של ערוץ DRAQ5 (גרעיני). זה ישמש כתמונות מנוקדות דו-ממדיות עבור ALDIC.
- שמור את הקרנות z בעוצמה מרבית כקבצים .tiff, ותן להן שם בהתאם למוסכמה הבאה למתן שמות.
- השתמש במספר כתו הראשון של שם התמונה.
- יש את המספר מתאים לסדר שבו התמונות ייחשבו במהלך ניתוח המתח. לדוגמה, התמונה הראשונה צריכה להתחיל באחת, והתמונה השנייה צריכה להתחיל בשתיים. ניתן לבחור מספרים שונים, אך עליהם להגדיל ברצף. מוסכמה למתן שמות לדוגמה היא כדלקמן: "0_Experiment1_MaxZProjection".
- שמור את כל הקרנות z בעוצמה מרבית ששמן השתנה בתיקיה.
4. ניתוח שורות פוטולבין, התקנת קוד ויישום
הערה: שלבים אלה נחוצים רק אם רוצים לאשר את הדיוק של אלגוריתם ALDIC באמצעות קווים מולבנים. הקוד מחשב את זן הרקמה המקומית כשינוי הממוצע המנורמל במרחק בין כל קו מולבן בתוך קבוצת הקווים הפוטו-מולבנים. במחקר זה, הערכים המקומיים הממוצעים הוערכו בממוצע על פני כל קבוצות הקווים המולבנים (כלומר, במרכז ובקצה השמאלי/ימני) כדי לקבוע ערך זן רקמה מקומי ממוצע יחיד עבור כל דגימה. ערך זה שימש אז להערכת הדיוק של אלגוריתם ALDIC.
- הורד את התיקיה "קוד PBL" מ- GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc), והעבר את כל התוכן לספריית העבודה ב- MATLAB.
- פתח את סקריפט MATLAB "Micro_Mech_Template.m".
- לחצו על ' הפעל' ובחרו באחד מקובצי התמונה הכוללים את התמונות הנפחיות. התמונות הנפחיות יכולות להיות כל אחד מסוגי הקבצים הבאים: .lsm , .tiff , .nd2 .
- התוכנה תטען באופן אוטומטי את כל התמונות בתיקייה ותציג תמונה מוקרנת של תמונת נפח הייחוס. כשתתבקש, לחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי ליצירת קווים מרובי נקודות העוקבים אחר הקצה השמאלי והימני של הדגימה. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לסיים שורה. לאחר עיבוד הקלט, אם הקצוות נכונים, הקש על אישור כדי לקבל את התוצאה.
- צייר קו אלכסוני אקראי על פני הדגימה כקו התייחסות כשתתבקש.
- הזן את מספר הקווים הפוטו-לבנים שנוצרו, ועקוב אחר הקווים המולבנים באמצעות קווים מרובי נקודות.
- אם התוצאה מקובלת, קבל אותה. אם התוצאה שגויה, התאם אותה ועבד מחדש.
- חזור על שלב 4.2 עבור כל התמונות והעבר את כל התמונות של קווים במעקב לתיקייה אחת.
- פתח את הסקריפט "Micro_Mech_Strain.m".
- הקש Run כדי להפעיל את הקוד ובחר אחת מהתמונות שנשמרו שבהן מתבצע מעקב אחר הקווים הפוטולבנים.
- ודא שהתמונות הנלוות שנבחרו נכונות לאחר בחירת התמונה על-ידי הקשה על אישור.
5. יצירת תמונות שעברו טרנספורמציה דיגיטלית
הערה: שלבים אלה נחוצים רק אם רוצים לאשר את הדיוק של אלגוריתם ALDIC באמצעות תמונות שעברו טרנספורמציה דיגיטלית. תמונות אלה מדמות שדות מתח דו-ממדיים הומוגניים בסדר גודל ידוע על ידי שינוי מלאכותי של תמונת הייחוס.
- הורד את הקוד "Digital_strain.m" מ- GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc).
- פתח והפעל את הקוד.
- כשתתבקשו, הוסיפו את הערכים הרצויים למאמץ המרבי שהופעל, לתוספת המאמץ שהוחלה וליחס פואסון. לחץ על אישור.
הערה: עבור ניסוי זה, הזן המרבי שהופעל היה 0.1 (10%), תוספת הזן המופעל הייתה 0.02 (2%), ונעשה שימוש ביחס פואסון של 1, אשר עולה בקנה אחד עם נתוני הניסוי של בדיקת מתיחה של גידים15,16. הקוד משתמש בפונקציה המוטבעת MATLAB imwarp ובערכי הקלט (לדוגמה, דרגות מאמץ, יחס פואסון) כדי ליצור את התמונות שעברו טרנספורמציה דיגיטלית. - כשתתבקש, בחר בתמונת ההפניה הלא מעוותת.
- לכל הפרש קבוע של מאמץ, מוצגת שכבת-על של תמונת הייחוס והתמונה ששינתה את צורתה. התמונה שעברה טרנספורמציה תישמר בספרייה תחת הכותרת "DigitallyTransformedX%Strain", כאשר X הוא תוספת המאמץ.
6. חישוב מאמץ ותיקוף, התקנת קוד ויישום
- הורד את התיקיה "חישוב מאמץ וקוד אימות" מ- GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc), והעבר את כל התוכן לספריית העבודה של MATLAB
- התקן מהדר mex C/C++ לפי Yang and Bhattacharya12. השלבים מסוכמים להלן.
- בדקו את MATLAB אם הותקן מהדר mex C/C++ על ידי הקלדת "mex -setup" בחלון הפקודה של MATLAB והקשה על Enter.
- אם מופיעה שגיאה המציינת שהמהדר אינו נתמך או קיים, המשך לשלב 6.3 ולשלב 6.4.
- אם אין שגיאה, המשך לשלב 6.5
- כדי להוריד מהדר mex C/C++, עבור אל "https:/tdm-gcc.tdragon.net/" ובחר את מהדר TDM-gcc.
- התקן את המהדר שהורדת במיקום ידוע.
- חזור לחלון הפקודה של MATLAB והקלד: "setenv("MW_MINGW64_LOC","[הקלד את נתיב ההתקנה שלך כאן]")". לדוגמה, זה יכול להיות "setenv("MW_MINGW64_LOC","C:\TDM-GCC-64")". אם פקודה זו פועלת בהצלחה, המהדר mex מותקן כראוי.
- הזן את סקריפט הפונקציה "main_aldic.m" ושנה את שורה 22 כך שתתאים לפקודה שבוצעה בשלב 6.5.
- פתח את הסקריפט "Strain_calc_and_validate.m".
- לחץ על Run כדי להתחיל בניתוח התמונה.
- כשתתבקש, שנה את הערכים עבור פרמטרי ALDIC כרצונך.
הערה: גודל החלון צריך להיות פי 0.25 עד פי 1 מגודל קבוצת המשנה. לקבלת מידע נוסף אודות אפשרויות הפרמטרים, עיין במדריך למשתמש המקוון: (https://www.researchgate.net/publication/344796296_Augmented_Lagrangian_Digital
_Image_Correlation_AL-DIC_Code_Manual).- במחקר זה נעשה שימוש בערכים הבאים:
גודל תת-קבוצה (פיקסלים): 20
גודל חלון (פיקסלים): 10
שיטה לפתרון ALDIC: הפרש סופי (1)
לא נעשה שימוש במחשוב מקבילי (1)
שיטה לחישוב ניחוש ראשוני: חיפוש Multigrid מבוסס על פירמידת תמונה (0)
- במחקר זה נעשה שימוש בערכים הבאים:
- כשתתבקש, בחר בתיבת הסימון "כן" כדי שהאלגוריתם ישמור באופן אוטומטי את הערך הממוצע, סטיית התקן והמפות הדו-ממדיות עבור אוסף המשתנים הרצוי (לדוגמה, זן x, זן y, זן גזירה, אזורים פגומים וכו'). בחר אילו משתנים יש לשמור ולחץ על אישור.
- כשתתבקש, שנה את הפרמטרים כרצונך.
- בניסוי זה נעשה שימוש בערכים הבאים:
נקודות מסביב לחישוב מאמץ (numP): 12
מקדם מתאם לזיהוי אזור רע (corr_threshold): 0.5
גודל אזור משנה (פיקסלים) לניתוח אזור שגוי (תת-גודל): 32
- בניסוי זה נעשה שימוש בערכים הבאים:
- כשתתבקש, בחר בתיקייה המכילה את הקרנות z בעוצמה מרבית ששמן השתנה. שים לב שהתוכנה מבצעת באופן אוטומטי ALDIC מצטבר כדי לקבוע את שדות המאמץ של התמונות המעוותות. כלומר, כל תמונה מעוותת משמשת כתמונת "ייחוס" חדשה לתמונה המעוותת הבאה. זה משפר את דיוק התוצאות (איור משלים 2) בהשוואה לביצוע ALDIC מצטבר, שבו כל תמונה מעוותת מושווית בחזרה לתמונת הייחוס המקורית (0% מתח). לביצוע ניתוח מצטבר, טען את התמונות אך בחר רק בתמונת ההפניה המקורית ובתמונה המעוותת המעניינת.
הערה: הזן הרגיל מחושב כ- λ - 1, כאשר λ הוא מתיחת הרקמה. מתיחת הרקמה מחושבת לפי
, כאשר N = [1 0]T או [0 1]T עבור כיוון x וכיוון y, בהתאמה, ו- C = F T F, כאשר F הוא שיפוע העיוות המחושב באמצעות נקודות "numP" המקיפות כל פלט נקודת נתונים על ידי אלגוריתם ALDIC. זן הגזירה מחושב כ
- , כאשר 
. - כשתתבקש, לחץ לחיצה שמאלית ליצירת מצולע בעל ארבע נקודות כדי להגדיר את אזור העניין למדידת הזנים. התחל עם הנקודה בפינה השמאלית העליונה, והקצה את הנקודות הבאות בכיוון השעון.
הערה: המשתנה "אחסון" שנשמר בסביבת העבודה של MATLAB מכיל את כל הערכים עבור זן x ממוצע, סטיית תקן של זן x, זן y ממוצע, סטיית תקן של זן Y, זן גזירה ממוצע, סטיית תקן של זן גזירה ואחוז אזורים פגומים. האזורים הרעים מוגדרים על פי ניתוח מקדם המתאם באזור העניין שנבחר בשלב 6.13. התיקיה "NuclearTrackingResults" (אשר ניתן לשנות את שמה על ידי התאמת שורות 555 ו 556) מאחסן את כל החלקות שצוינו בשלב 6.10. תיקיה זו מכילה גם קובץ גיליון אלקטרוני בשם "תוצאות", המאחסן את כל האמצעים וסטיות התקן שצוינו בשלב 6.10.
, כאשר N = [1 0]T או [0 1]T עבור כיוון x וכיוון y, בהתאמה, ו- C = F T F, כאשר F הוא שיפוע העיוות המחושב באמצעות נקודות "numP" המקיפות כל פלט נקודת נתונים על ידי אלגוריתם ALDIC. זן הגזירה מחושב כ
- , כאשר 
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לפני ניתוח שדות המאמץ בדגימות רקמה אמיתיות, פרוטוקול ALDIC אומת לראשונה באמצעות תמונות מתוחות/מותמרות דיגיטלית של גרעינים בתוך גידי אכילס של עכבר. באופן ספציפי, התמונות שונו כדי לייצר באופן דיגיטלי זנים אחידים בכיוון x של 2%, 4%, 6%, 8% ו -10% מתח עם יחס פואסון מדומה של 115,16. הדיוק של אלגוריתם ALDIC הוערך לאחר מכן על ידי השוואת ערכי הזן הממוצע המחושב עם הזנים הדיגיטליים הידועים. בנוסף, סטיית התקן של ערכי הזן הוערכה כדי לקבוע את ההטרוגניות של שדה הזן. ההבדל בין הזנים שחושבו על-ידי ALDIC (באמצעות ניתוח מצטבר) לבין הזנים בפועל שהוחלו על התמונות שעברו טרנספורמציה דיגיטלית מוצג באיור 1. המאמץ הממוצע בכיוון ה-x שחושב על-ידי תוכנת ALDIC היה באופן עקבי הערכת חסר של הזן המופעל האמיתי (איור 1A), ועוצמת השגיאה גדלה ככל שהמאמץ המופעל היה גדול יותר. עם זאת, הגודל היה תמיד פחות מ 0.00015 עבור כל תוספות הזן. הייתה הערכת חסר קלה של המתח גם בכיוון Y (איור 1C). סטיית התקן של הזנים המחושבים באזור העניין המלא של זן X וזן Y גדלה גם היא עם הזנים שהופעלו יותר, אך גם העוצמה הייתה קטנה מאוד (<0.002) (איור 1B, D). טעויות אלה היו גדולות משמעותית בעת שימוש בניתוח מצטבר (תרשים משלים 2).
איור 1: השוואה ואימות של אלגוריתמים עם תמונות מתוחות דיגיטלית . (A) נתוני המתח ה-ALDIC שנמדדו בכיוון ה-x היו נמוכים באופן עקבי מהמאמץ בפועל שנקבע על ידי הטרנספורמציות הדיגיטליות, והשגיאה גדלה בהדרגה ככל שמתח מופעל גדול יותר. (B) סטיית התקן של ערכי הזן בכיוון x גדלה גם היא ככל שמופעלים זנים דיגיטליים גדולים יותר. (C) נתוני זן ALDIC שנמדדו בכיוון Y היו נמוכים באופן עקבי מהמתח בפועל שנקבע על ידי הטרנספורמציות הדיגיטליות. (D) סטיית התקן של ערכי הזן בכיוון y גדלה ככל שמופעל מאמץ גדול יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
בעת ביצוע ניתוח מאמץ על דגימות רקמה בפועל, לא ניתן להעריך ישירות את הדיוק של אלגוריתם ALDIC. ובכל זאת, פותחה טכניקה להערכת הדיוק של שדה העקירה. באופן ספציפי, התמונה המעוותת עוותה בחזרה לחיזוי של תמונת הייחוס בהתבסס על שדה התזוזה המחושב. לאחר מכן נעשה שימוש במקדם מתאם צולב מנורמל כדי לקבוע עד כמה תמונת הייחוס המעוותת/משוחזרת תואמת את תמונת הייחוס האמיתית. כל תת-אזורים (32 פיקסלים x 32 פיקסלים) שבהם ערך המתאם הצולב המנורמל היה קטן מ-0.5 נחשבו ל"אזור רע" שבו שדה ההזחה ככל הנראה לא היה מדויק. ניתוח זה זיהה כי קיים הבדל משמעותי בין הביצועים של טכניקות הניתוח המצטברות והמצטברות. באופן ספציפי, מספר האזורים הרעים החל לעלות בשיטה המצטברת לאחר שהזן הפעיל 6% (איור 2A), בעוד שמעט מאוד (1%) אזורים רעים נצפו בכל אחד מהאזורים שעברו טרנספורמציה דיגיטלית לצורך הניתוח המצטבר. כאשר יישמו את טכניקת הערכת הדיוק הזו על ארבעת גידי אכילס של העכבר שנבדקו (איור משלים 3), נקבע כי עבור שלוש דגימות, המספר הממוצע של אזורים רעים היה פחות מ-25% מהתמונה. אולם באחת מארבע הדגימות (ניסוי 2), כמעט מחצית מהתמונה זוהתה כגרועה בהפרש המאמץ המרבי (איור 2B). מספר האזורים הרעים שהיו נוכחים בניסוי 2 השתנה מהממוצע של שלוש הדגימות האחרות ביותר מארבע סטיות תקן. זה איפשר את הקביעה כי נתוני ALDIC מניסוי 2 מייצגים חריג, ולכן נתונים אלה נמחקו מניתוח נוסף של התוצאות.
איור 2: זיהוי מוצלח של אזורים עם חישובי זנים לא חוקיים באמצעות ניתוח אזורים שגויים. (A) כמות האזורים הרעים בתמונות שעברו טרנספורמציה דיגיטלית שנותחו בשיטה המצטברת עלתה באופן עקבי לאחר ש-6% הפעילו מתח, בעוד שהכמות המצטברת נותרה על 1%. (B) כמות האזורים הרעים בכל דגימות הגידים גדלה בהתמדה בהפרשי מאמץ גדולים יותר. ניסוי 2 נחשב לחריג, ולכן אינו נכלל בסרגלי הממוצע וסטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
בנוסף, זני המתיחה המקומיים בגידי אכילס של העכבר שנבדקו נמדדו באמצעות קווים פוטו-מולבנים (PBLs) כשיטה שנייה לקביעת הדיוק של אלגוריתם ALDIC. זני כיוון ה-x שחושבו על-ידי ALDIC נטו להיות גדולים יותר מאלה שנקבעו מה-PBLs, אולם ההבדל היה בדרך כלל בטווח של 0.005 (איור 3A). גודל השגיאה הזה היה דומה לסטיית התקן שנצפתה בין PBLs שונים בתוך מדגם נתון (איור 3B).
איור 3: אימות חישובי זן ALDIC בהשוואה לנתוני קו פוטו-מולבן . (A) ההפרש בין ערכי זן ALDIC לערכי זן PBL נשאר קבוע יחסית עבור כל דרגות הזן, סביב ערך של 0.005. (B) סטיית התקן של נתוני ה-PBL בממוצע בכל הדגימות נותרה קבועה יחסית ועמדה על כ-0.005. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
לאחר הערכת הדיוק של אלגוריתם ALDIC, נקבעו הגדלים וההתפלגויות המרחביות של הזנים המקומיים בגידי אכילס של העכבר תחת עומס מתיחה (איור 4, איור 5 ואיור 6). שימו לב שהזנים אינם כוללים את נתוני התזוזה מ"האזורים הרעים" בתוך כל דגימה. זני המתיחה בכיוון X היו עקביים בכל שלוש הדגימות והיו נמוכים משמעותית מזני הרקמה שהופעלו (איור 4A). בנוסף, זן כיוון ה-x היה הטרוגני יחסית, בהתחשב בכך שסטיית התקן על פני התמונה הדו-ממדית הייתה תמיד גדולה מערך המאמץ הממוצע. לעומת זאת, היה חוסר עקביות מובהק בין שלוש הדגימות עבור הזנים בכיוון Y, כאשר מדגם אחד הציג ערכי ממוצע חיוביים, מדגם אחד הציג ערכי ממוצע שליליים, ומדגם אחד הציג זן אפס בכיוון Y (איור 4B). בנוסף, סטיית התקן של זני כיוון y במדגם נתון הייתה גדולה יותר מסטיית התקן של זני כיוון x. לבסוף, זן הגזירה היה נמוך יחסית בכל דרגות המאמץ (איור 4C).
איור 4: זנים מיקרוסקולריים של גידי אכילס של עכברים . (A) הזן הממוצע בכיוון X נשאר מתחת לזן הרקמה המופעל, אך גדל עם כל תוספת מאמץ. (B) המאמץ הממוצע בכיוון y היה בערך אפס עבור כל הפרשים, אך סטיית התקן הייתה גבוהה. (C) זן הגזירה הממוצע גדל בהתמדה לאורך כל הפרשי הזן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: התפלגות מרחבית של זני X, זני Y וזני גזירה. מפות מייצגות של זני (A) x, (B) זני y ו-(C) זני גזירה בכל אזור העניין של הגידים לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: התפלגות מרחבית של מקסימום זני גזירה ראשיים, מינימום ראשוניים ומקסימום גזירה. מפות מייצגות של (A) הזנים העיקריים המרביים, (B) הזנים העיקריים המינימליים, ו-(C) זני הגזירה המרביים בכל אזור הגידים המעניין. הקווים הלבנים מציינים את כיווני הלחצים העיקריים המקסימליים והמינימליים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תרשים משלים 1: זיהוי מצב קוואזיסטטי במהלך ההדמיה. ניתן להשתמש בשיפוע עקומת הכוח-זמן במהלך הדקה האחרונה של תקופת הרפיית המאמץ (הקו האדום) כדי להעריך בקירוב את השינוי הכולל בכוח במהלך ההדמיה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תרשים משלים 2: השוואה בין טכניקות ניתוח מצטברות ומצטברות. (A) ההבדל בין הזנים שנמדדו לבין זני כיוון ה-x שנמדדו בפועל בתמונות שעברו טרנספורמציה דיגיטלית היה גדול משמעותית בשיטה המצטברת בהשוואה לשיטה המצטברת מעל 4% מתח. (B) גם סטיית התקן של ערכי זן X הייתה גדולה משמעותית כאשר השיטה המצטברת הייתה מעל 4% זן. (C) ההבדל בין זני ה-y שנמדדו לבין זני ה-y שנמדדו בפועל בתמונות שעברו טרנספורמציה דיגיטלית היה גדול משמעותית כאשר השיטה המצטברת הייתה מעל 8% מתח. (D) סטיית התקן של ערכי זן y הייתה גדולה משמעותית כאשר השיטה המצטברת הייתה מעל 4% זן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 3: ויזואליזציה וכימות של אזורים גרועים עבור כל ניסוי. אזורים פגומים הוגדרו כאזורים מקומיים בתוך תמונת הייחוס המשוחזרת שלא התאימו (מתחת למקדם מתאם של 0.5) לאותו אזור בתמונת הייחוס בפועל. כל אזור רע המזוהה בתוך אזור עניין (מסומן בלבן) מסומן בתיבה כחולה. אחוז האזורים הפגומים באזור העניין מצוין מעל כל תמונה בסוגריים. שימו לב שתמונות אלה משוחזרות מהתמונה המעוותת במתח מוחל של 12%. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מטרת מאמר זה הייתה לספק שיטה מתוקפת בקוד פתוח למדידת שדות המאמץ הדו-ממדי בגידים תחת עומס מתיחה. הבסיס של התוכנה התבסס על אלגוריתם ALDICזמין לציבור 12. אלגוריתם זה הוטמע בקוד MATLAB גדול יותר עם פונקציונליות נוספת של ניתוח מתח מצטבר (לעומת מצטבר). אלגוריתם מותאם זה יושם לאחר מכן לבדיקת מתיחה של גידים, והדיוק שלו הוערך על ידי שתי טכניקות שונות (כלומר, תמונות שעברו טרנספורמציה דיגיטלית ומדידת מאמץ באמצעות קווים מולבנים). בנוסף, נוספה יכולת להעריך את דיוק מדידות ה-ALDIC על כל דגימה ללא צורך בידע על ערכי הזן האמיתיים.
ניתוח התמונות שעברו טרנספורמציה דיגיטלית הראה כי האלגוריתם יכול למדוד במדויק זנים עד 10% עם מעט מאוד טעויות, שלא ניתן להעריך מבדיקת המתיחה של גידי אכילס של עכבר בפועל בשל הגדלים הנמוכים של הזנים בדגימות הגידים. עם זאת, השוואת הזנים שחושבו בגידי אכילס של עכברים על ידי ALDIC לזנים שנמדדו באמצעות קווים פוטו-לבנים הראתה כי השגיאה של טכניקת ALDIC הייתה בתוך וריאציית המדידה של הקווים הפוטו-מולבנים עצמם. כאימות סופי, הדיוק של שדות התזוזה הדו-ממדיים המלאים שחושבו על ידי אלגוריתם ALDIC הוערך על ידי שחזור תמונת הייחוס מהתמונה המעוותת והשוואת השחזור לתמונת הייחוס בפועל. בתמונות שעברו טרנספורמציה דיגיטלית חלה עלייה במספר האזורים הרעים וטעויות המאמץ עם זנים מופעלים גדולים יותר, במיוחד עבור ניתוח ALDIC מצטבר (איור 2 ואיור משלים 2). זה היה צפוי מכיוון שהטכניקה המצטברת מגדירה מחדש את תמונת הייחוס עם כל תמונת ביניים כדי למזער את הבדלי התזוזה בין זוגות תמונות. מספר האזורים הרעים היה גבוה עוד יותר בדגימות הגידים עצמן מכיוון שהמבנה והעומס של רקמת הגיד לא היו הומוגניים (בניגוד לתמונות שעברו טרנספורמציה דיגיטלית). עם זאת, בממוצע, רק כ-15% מהתמונה המשוחזרת לא תאמה את תמונת הייחוס בפועל. עם זאת, מדגם אחד (ניסוי 2) הכיל מספר רב של אזורים שגויים (~45%). אמנם לא ברור מדוע לא ניתן היה לעבד מדגם זה כראוי, אך ניתוח זה של תמונת הייחוס המשוחזרת היה בעל ערך מכיוון שהוא איפשר את ההכרה בכך שהנתונים ממדגם זה אינם אמינים. בסך הכל, ניסויים אלה מראים כי אלגוריתם קוד פתוח זה יכול לשמש בביטחון כדי למדוד במדויק את זני הרקמה בתוך explants גידים.
ניסויים אלה סיפקו גם מידע רב ערך לגבי ההתנהגות המכנית של גידי אכילס של עכברים. באופן ספציפי, בזן רקמה מוחל של 12%, הזן האורכי הממוצע (כיוון x) בדגימת הרקמה היה רק 2%. חלק מהנחתת זן זה נבע מכך שזני הרקמה המקרוסקלית חושבו משינויים באורך האחיזה לאחיזה של הרקמה, שכללו ככל הנראה ריכוזי מאמץ משמעותיים בממשק האחיזה של צומת המיוטנדינוס. עם זאת, זה עולה בקנה אחד עם מחקרים אחרים על זנים מיקרוסקולריים בגידים10,17,18. יתר על כן, המאמץ של 12% התאים לכ-5 מגפ"ס של העמסה, מה שככל הנראה דומה לעומס הפיזיולוגי המרבי in vivo19. זה מצביע על כך שתאים בתוך גידי אכילס של עכבר אינם חווים זני מתיחה מעל 2%. הזן הרוחבי (כיוון y) היה משתנה יותר בין הדגימות, עם ערכים חיוביים ושליליים כאחד. הדבר מצביע על כך שבדגימות הגידים נמצאו יחסי פואסון חיוביים ושליליים, דבר העולה בקנה אחד עם בדיקות קודמות של גידי אכילס20. כצפוי במתח חד-צירי, עוצמת זן הגזירה הייתה בדרך כלל נמוכה (<4° בממוצע). עם זאת, עבור כל זני המתיחה והגזירה, סטיית התקן על פני אזור העניין הייתה תמיד גדולה מערך הזן הממוצע, מה שמראה שיש מידה רבה של הטרוגניות זן. יתר על כן, הטרוגניות זו גדלה עם הזנים המופעלים הגדולים יותר, ככל הנראה בשל ההטרוגניות של מבנה הרקמה, כמו גם השגיאה המוגברת בחישובי ALDIC כתוצאה משדות התזוזה והתזוזה הגדולים יותר. זה מצביע על כך שהזנים שחווים תאי גידים בודדים משתנים מאוד בתוך הרקמה.
למרות האימות המוצלח של אלגוריתם ALDIC, ישנן כמה מגבלות בשימוש בו לניתוח זנים בתוך צמחים גידים. המגבלה העיקרית היא העובדה שהאלגוריתם יכול לבצע רק ניתוח דו-ממדי של אובייקט תלת-ממדי. גישה קפדנית יותר תהיה לבצע מתאם נפח דיגיטלי מלא (DVC), אשר בוצע על תמונות טרנספורמציה דיגיטלית של גידים11. עם זאת, בדרך כלל קשה לבצע זאת על דגימות גידים אמיתיות מכיוון שהתמונות מכילות גרעינים פתירים לעומק של 100 מיקרומטר בלבד. משמעות הדבר היא שלנפח הפנימי של הדגימות אין מרקם בתוך התמונות הנפחיות, מה שהופך את ה- DVC ללא אמין. לכן, התמונות במחקר זה צומצמו למקסימום הקרנות דו-ממדיות, אשר מאלצות באופן מלאכותי את כל הגרעינים למישור תמונה אחד. בעוד שזה עלול לייצר כמה טעויות בניתוח המאמץ ולמנוע מדידה של תזוזות מחוץ למישור, תוצאות התיקוף מצביעות על כך שהטכניקה עדיין מדויקת. מגבלה נוספת היא שהזנים חושבו בתום תקופת הרפיית מתח ולא ניתן היה לחשב אותם במהלך העמסה מחזורית דינמית. בעיה זו הייתה בלתי נמנעת מכיוון שהיה זמן הדמיה סופי לרכוש את התמונות הנפחיות ששימשו לניתוח המתח. למרות מגבלות אלה, הצלחת הניתוח הייתה חזקה יחסית, בהתחשב בכך ששלוש מתוך ארבע דגימות הגידים הפיקו נתוני מאמץ מדויקים. לכן, אלגוריתם זה יהיה כלי שימושי עבור חוקרים המעוניינים למדוד שדות מתח בתוך explants גידים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לכל המחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R21 AR079095) והקרן הלאומית למדע (2142627).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-DTAF (5-(4,6-Dichlorotriazinyl) Aminofluorescein), single isomer | ThermoFisher | D16 | |
| Calipers | Mitutoyo | 500-196-30 | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1R HD | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Coning | 6775 | |
| DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) | ThermoFisher | 62554 | |
| MATLAB | MathWorks | R2022b | |
| Tensile Loading Device | N/A | N/A | Tensile loading device described in Peterson et al, 2020. (ref 13) |
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher | 88881001 |
References
- Devkota, A. C. Distributing a fixed amount of cyclic loading to tendon explants over longer periods induces greater cellular and mechanical responses. Journal of Orthopaedic Research. 11 (4), 1609-1612 (2007).
- Sun, H. B., et al. Cycle-dependent matrix remodeling gene expression response in fatigue-loaded rat patellar tendons. Journal of Orthopaedic Research. 28 (10), 1380-1386 (2010).
- Shepherd, J. H., Screen, H. R. C.
- Paschall, L., Pedaprolu, K., Carrozzi, S., Dhawan, A., Szczesny, S. Mechanical stimulation as both the cause and the cure of tendon and ligament injuries. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. , Springer. Cham, Switzerland. 359-386 (2022).
- Andarawis-Puri, N., Ricchetti, E. T., Soslowsky, L. J. Rotator cuff tendon strain correlates with tear propagation. Journal of Biomechanics. 42 (2), 158-163 (2009).
- Cheng, V. W. T., Screen, H. R. C.
- Luyckx, T., et al. Digital image correlation as a tool for three-dimensional strain analysis in human tendon tissue. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 7 (2014).
- Duncan, N. A., Bruehlmann, S. B., Hunter, C. J., Shao, X., Kelly, E. J. In situ cell-matrix mechanics in tendon fascicles and seeded collagen gels: Implications for the multiscale design of biomaterials. Computer Methods in Biomechanics and Biomedical Engineering. 17 (1), 39-47 (2014).
- Arnoczky, S. P., Lavagnino, M., Whallon, J. H., Hoonjan, A. In situ cell nucleus deformation in tendons under tensile load; A morphological analysis using confocal laser microscopy. Journal of Orthopaedic Research. 20 (1), 29-35 (2002).
- Screen, H. R. C., Bader, D. L., Lee, D. A., Shelton, J. C.
- Fung, A. K., Paredes, J. J., Andarawis-Puri, N. Novel image analysis methods for quantification of in situ 3-D tendon cell and matrix strain. Journal of Biomechanics. 67, 184-189 (2018).
- Yang, J., Bhattacharya, K. Augmented Lagrangian digital image correlation. Experimental Mechanics. 59 (2), 187-205 (2019).
- Peterson, B. E., Szczesny, S. E. Dependence of tendon multiscale mechanics on sample gauge length is consistent with discontinuous collagen fibrils. Acta Biomaterialia. 117, 302-309 (2020).
- Humphrey, J. D., O'Rourke, S. L. An Introduction to Biomechanics. , Springer. New York, NY. (2015).
- Reese, S. P., Weiss, J. A. Tendon fascicles exhibit a linear correlation between Poisson's ratio and force during uniaxial stress relaxation. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (3), 34501 (2013).
- Ahmadzadeh, H., Freedman, B. R., Connizzo, B. K., Soslowsky, L. J., Shenoy, V. B. Micromechanical poroelastic finite element and shear-lag models of tendon predict large strain dependent Poisson's ratios and fluid expulsion under tensile loading. Acta Biomaterialia. 22, 83-91 (2015).
- Szczesny, S. E., Elliott, D. M. Interfibrillar shear stress is the loading mechanism of collagen fibrils in tendon. Acta Biomaterialia. 10 (6), 2582-2590 (2014).
- Han, W. M., et al. Macro- to microscale strain transfer in fibrous tissues is heterogeneous and tissue-specific. Biophysical Journal. 105 (3), 807-817 (2013).
- Pedaprolu, K., Szczesny, S. E. A novel, open-source, low-cost bioreactor for load-controlled cyclic loading of tendon explants. Journal of Biomechanical Engineering. 144 (8), 084505 (2022).
- Gatt, R., et al. Negative Poisson's ratios in tendons: An unexpected mechanical response. Acta Biomaterialia. 24, 201-208 (2015).
