Summary
Denne artikkelen beskriver en åpen kildekode-algoritme for digital bildekorrelasjon for måling av lokale 2D-vevstammer i seneeksplanter. Nøyaktigheten av teknikken er validert ved hjelp av flere teknikker, og den er tilgjengelig for offentlig bruk.
Abstract
Det er stor vitenskapelig interesse for å forstå stammene som seneceller opplever in situ og hvordan disse stammene påvirker vevsremodellering. Basert på denne interessen er det utviklet flere analyseteknikker for å måle lokale vevsstammer i seneplanter under belastning. I flere tilfeller har imidlertid nøyaktigheten og følsomheten til disse teknikkene ikke blitt rapportert, og ingen av algoritmene er offentlig tilgjengelige. Dette har gjort det vanskelig for den mer utbredte målingen av lokale vevsstammer i seneeksplanter. Målet med denne artikkelen var derfor å lage et validert analyseverktøy for måling av lokale vevsstammer i seneplanter som er lett tilgjengelig og enkelt å bruke. Spesielt ble en offentlig tilgjengelig augmented-Lagrangian digital bildekorrelasjon (ALDIC) algoritme tilpasset for måling av 2D-stammer ved å spore forskyvningene av cellekjerner i musens akillessener under uniaxial spenning. I tillegg ble nøyaktigheten av de beregnede stammene validert ved å analysere digitalt transformerte bilder, samt ved å sammenligne stammene med verdier bestemt fra en uavhengig teknikk (dvs. fotoblekede linjer). Til slutt ble en teknikk innlemmet i algoritmen for å rekonstruere referansebildet ved hjelp av det beregnede forskyvningsfeltet, som kan brukes til å vurdere nøyaktigheten av algoritmen i fravær av kjente tøyningsverdier eller en sekundær måleteknikk. Algoritmen er i stand til å måle stammer opp til 0,1 med en nøyaktighet på 0,00015. Teknikken for å sammenligne et rekonstruert referansebilde med det faktiske referansebildet identifiserte vellykket prøver som hadde feilaktige data og indikerte at i prøver med gode data var omtrent 85% av forskyvningsfeltet nøyaktig. Til slutt var stammene målt i musesener i samsvar med tidligere litteratur. Derfor er denne algoritmen et svært nyttig og tilpasningsdyktig verktøy for nøyaktig måling av lokale vevsstammer i sener.
Introduction
Sener er mekanosensitive vev som tilpasser seg og degenererer som respons på mekanisk belastning 1,2,3,4. På grunn av rollen som mekaniske stimuli spiller i senecellebiologi, er det stor interesse for å forstå stammene som seneceller opplever i det opprinnelige vevsmiljøet under belastning. Flere eksperimentelle og analytiske teknikker er utviklet for å måle lokale vevsstammer i sener. Disse inkluderer 2D / 3D digital bildekorrelasjon (DIC) analyser av overflatestammer ved bruk av enten flekkmønstre eller fotoblekede linjer (PBLs) 5,6,7,8, måling av endringene i sentroid-til-sentroidavstanden til individuelle kjerner i vevet 9,10, og en nylig fullfelt 3D DIC-metode som vurderer out-of-plane bevegelse og 3D-deformasjoner 11 . Imidlertid har nøyaktigheten og følsomheten til disse teknikkene blitt rapportert i bare noen få tilfeller, og ingen av disse teknikkene har blitt gjort offentlig tilgjengelig, noe som gjør utbredt adopsjon og bruk av disse teknikkene vanskelig.
Målet med dette arbeidet var å lage et validert analyseverktøy for måling av lokale vevsstammer i seneplanter som er lett tilgjengelig og enkelt å bruke. Den valgte metoden er basert på en offentlig tilgjengelig augmented-Lagrangian digital image correlation (ALDIC) algoritme skrevet i MATLAB som ble utviklet av Yang og Bhattacharya12. Denne algoritmen ble tilpasset for å analysere seneprøver og validert ved å bruke den på digitalt transformerte bilder og ved å sammenligne stammene målt i faktiske seneprøver med resultatene oppnådd fra fotoblekede linjer. Videre ble ytterligere funksjonalitet implementert i algoritmen for å bekrefte nøyaktigheten av det beregnede forskyvningsfeltet selv i fravær av kjente tøyningsverdier eller en sekundær måleteknikk. Derfor er denne algoritmen et svært nyttig og tilpasningsdyktig verktøy for nøyaktig måling av lokale 2D-vevstammer i sener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av Pennsylvania State University Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Vev forberedelse
- For denne protokollen, høst akillessenene fra 2-4 måneder gamle mannlige C57BL/6 mus.
MERK: Ulike sener eller leddbånd fra mus eller andre små dyr kan også brukes.- Gjør et snitt på huden overfladisk til akillessenen for å avsløre plantarissenen og det omkringliggende bindevevet. Fjern dem deretter ved hjelp av et kirurgisk blad.
- Separer de eksponerte soleus- og gastrocnemiusmusklene fra bakbenet, og skrap dem forsiktig av akillessenen med det kirurgiske bladet
- Separer calcaneus fra resten av foten med et skjærehjulfeste på et roterende verktøy.
- Farg vevet i 1,5 ml av en 5 μg/ml oppløsning av 5-(4,6-diklortriazinyl) aminofluorescein (DTAF) og 0,1 M natriumbikarbonatbuffer i 20 minutter på en roterende mikser ved romtemperatur. Denne løsningen flekker proteiner (f.eks. ekstracellulær matriks) i vevet.
MERK: I løpet av denne perioden på 20 minutter skal trinn 1.3 fullføres. - Forbered en 1: 1,000-løsning av DRAQ5 i fosfatbufret saltvann (PBS) for å flekke kjernene. Bruk en hvirvelblander for å homogenisere løsningen.
- Etter inkubasjonsperioden på 20 minutter i trinn 1.2, overfør vevet fra DTAF-oppløsningen til DRAQ5-oppløsningen, og inkuber i et mørkt rom i 10 minutter ved romtemperatur.
2. Senebelastning og bildeoppkjøp
MERK: Denne protokollen krever en strekkenhet som kan monteres på toppen av et konfokalmikroskop. For denne studien ble mikrostrekkenheten beskrevet av Peterson og Szczesny13 brukt.
- Plasser senen i grepene på strekklasteanordningen. Før du monterer grepene i lasteanordningen, bruk digitale kalipere til å måle avstanden mellom calcaneus-festet og motsatt grep. Denne avstanden er senemålerlengden.
- Alternativt kan du montere grepene i lasteanordningen før du setter inn senen, og trykke i kontakt for å definere motorposisjonen med null fortrengning. Forskyvningen av motorene etter at senen er satt inn, kan gi en potensielt mer nøyaktig målerlengde for grep-til-grep.
- Monter grepene i lasteanordningen, som inneholder PBS for å opprettholde vevhydrering. Juster senen så godt som mulig med enten x-aksen eller y-aksen på mikroskopbildene, slik at x-belastnings- og y-belastningsutgangene til algoritmen samsvarer med seneaksene.
MERK: I denne studien var senene på linje med x-aksen. Hvis det ikke er mulig å justere senen perfekt med bildeaksene, kan algoritmens x-belastning og y-belastningsutganger transformeres for å justere seg med senens langsgående / vinkelrette akser ved hjelp av standard belastningstransformasjonsligninger14. - Forbelast senen med 1 g spenning, og påfør om ønskelig syklisk belastning for å forutsette prøven. I denne protokollen ble ingen prekondisjonering brukt siden studiemålet var å validere de målte lokale vevsstammene i stedet for å måle vevsmaterialets egenskaper. Hvis det er interesse for å måle makroskalamaterialegenskapene, som er avhengige av lasthistorikken, anbefales forkondisjonering. Etter forkondisjonering og gjenoppretting påfører du en forhåndsinnlasting på 1 g på nytt.
- Om ønskelig, fotobleach et sett med fire linjer fordelt 80 μm fra hverandre i midten av vevet (se Peterson og Szczesny13 for flere detaljer).
MERK: De fotoblekede linjene ble brukt til å validere målingene av den ALDISKE algoritmen og er ikke nødvendige for å utføre ALDIC selv. Antallet og avstanden mellom linjene kan justeres, og plasseringen av linjene bør velges for å unngå artefakter i prøven som vil redusere linjens klarhet. - Gjenta fotoblekingsprosedyren på venstre og høyre ekstremer av vevet nær grepene.
- Ved hjelp av konfokalmikroskopet får du volumetriske bilder (x,y: 1,25 μm / piksel, z: 2,5 μm / piksel) av DTAF og DRAQ5-fluorescensen ved 1 g forspenning.
- Utfør en belastningsrampe ved 0,5% / s til 2% belastning. Merk at belastningshastigheten og den trinnvise belastningsstørrelsen kan justeres.
- La vevet stresse, slapp av i 10 minutter.
MERK: Varigheten av stressavslapning bør velges slik at prøven er under en tilnærmet kvasistatisk belastning under bildeopptak. For å avgjøre om varigheten av stressavslapping er akseptabel, bestem helningen på kraft-tid-kurven i løpet av det siste minuttet av stressavslapning (tilleggsfigur 1), og multipliser denne skråningen med den totale bildevarigheten. I denne studien endret kraften som ble påført ved den største belastningsøkningen aldri mer enn 5%. - Ta et annet volumetrisk bilde av vevet etter deformasjon.
- Gjenta trinn 2,7-2,9 til ønsket sluttbelastning er nådd. I denne artikkelen ble det valgt en endelig belastningsverdi på 12 %.
3. Bildebehandling
- Bruk ImageJ eller Fiji til å opprette maksimale z-projeksjoner av hvert volumetrisk bilde av DRAQ5-kanalen (kjernefysisk). Dette vil fungere som 2D-flekkete bilder for ALDIC.
- Lagre z-projeksjonene med maksimal intensitet som .tiff filer, og navngi dem i henhold til følgende navnekonvensjon.
- Bruk et tall som første tegn i bildenavnet.
- La nummeret samsvare med rekkefølgen som bildene vil bli vurdert under belastningsanalysen. For eksempel skal det første bildet begynne med ett, og det andre bildet skal begynne med to. Ulike tall kan velges, men de må øke sekvensielt. Et eksempel på navnekonvensjon er som følger: "0_Experiment1_MaxZProjection".
- Lagre alle de omdøpte z-projeksjonene med maksimal intensitet i en mappe.
4. Fotobleket linjeanalyse, kodeinstallasjon og applikasjon
MERK: Disse trinnene er bare nødvendige hvis det er ønskelig å bekrefte nøyaktigheten av ALDIC-algoritmen ved hjelp av fotoblekede linjer. Koden beregner den lokale vevsstammen som den gjennomsnittlige normaliserte avstandsendringen mellom hver fotobleket linje i det fotoblekede linjesettet. I denne studien ble de gjennomsnittlige lokale verdiene deretter gjennomsnittet over alle fotoblekede linjesett (dvs. i midten og venstre / høyre ende) for å bestemme en enkelt gjennomsnittlig lokal vevstammeverdi for hver prøve. Denne verdien ble deretter brukt til å estimere nøyaktigheten til den aldisk algoritmen.
- Last ned "PBL-kode"-mappen fra GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc), og flytt alt innholdet til arbeidsmappen i MATLAB.
- Åpne MATLAB-skriptet "Micro_Mech_Template.m".
- Trykk på Kjør, og velg en av bildefilene som inneholder de volumetriske bildene. De volumetriske bildene kan være av følgende filtyper: .lsm, .tiff, .nd2.
- Programvaren vil automatisk laste alle bildene i mappen og vise et projisert bilde av referansevolumetrisk bilde. Når du blir bedt om det, venstreklikker du for å opprette flerpunktslinjer som sporer venstre og høyre ende av prøven. Høyreklikk for å avslutte en linje. Når inndataene er behandlet, hvis kantene er riktige, trykker du OK for å godta resultatet.
- Tegn en tilfeldig diagonal linje over utvalget som en referanselinje når du blir bedt om det.
- Skriv inn antall fotoblekede linjer som er opprettet, og spor de fotoblekede linjene med flerpunktslinjer.
- Hvis resultatet er akseptabelt, godta det. Hvis resultatet er feil, juster det og reprosesser.
- Gjenta trinn 4.2 for alle bildene, og flytt alle bildene av sporede linjer til en enkelt mappe.
- Åpne skriptet "Micro_Mech_Strain.m".
- Trykk på Kjør for å utføre koden, og velg et av de lagrede bildene der de fotoblekede linjene spores.
- Bekreft at de valgte tilhørende bildene er riktige når bildet er valgt, ved å trykke på OK.
5. Opprette digitalt transformerte bilder
MERK: Disse trinnene er bare nødvendige hvis det er ønskelig å bekrefte nøyaktigheten av ALDIC algoritmen ved hjelp av digitalt transformerte bilder. Disse bildene simulerer homogene 2D-stammefelt av en kjent størrelsesorden ved kunstig å transformere referansebildet.
- Last ned koden "Digital_strain.m" fra GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc).
- Åpne og kjør koden.
- Når du blir bedt om det, setter du inn ønskede verdier for maksimal påført belastning, påført tøyningsintervall og Poisson-forhold. Trykk på OK.
MERK: For dette eksperimentet var den maksimale påførte belastningen 0,1 (10%), den påførte belastningsøkningen var 0,02 (2%), og en Poissons ratio på 1 ble brukt, noe som er konsistent med eksperimentelle data for senestrekkprøving15,16. Koden bruker den innebygde MATLAB-funksjonen imwarp og inndataverdiene (f.eks. tøyningsintervaller, Poisson-forhold) til å lage de digitalt transformerte bildene. - Når du blir bedt om det, velger du det udeformerte referansebildet.
- For hvert tøyningsintervall vises et overlegg av referansebildet og det transformerte bildet. Det transformerte bildet vil bli lagret i katalogen under tittelen "DigitallyTransformedX%Strain", hvor X er belastningsøkningen.
6. Belastningsberegning og valideringskode installasjon og applikasjon
- Last ned mappen "Strain Calculation and Validation Code" fra GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc), og flytt alt innholdet til MATLAB-arbeidsmappen
- Installer en Mex C / C + + kompilator i henhold til Yang og Bhattacharya12. Trinnene er oppsummert nedenfor.
- Sjekk MATLAB for å se om en mex C / C ++ kompilatoren er installert ved å skrive "mex -setup" i MATLAB kommandovinduet og trykke Enter.
- Hvis det vises en feil som indikerer at en kompilator ikke støttes eller finnes, går du videre til trinn 6.3 og trinn 6.4.
- Hvis det ikke finnes noen feil, går du videre til trinn 6.5
- For å laste ned en mex C / C ++ kompilator, gå til "https: / tdm-gcc.tdragon.net/", og velg TDM-gcc-kompilatoren.
- Installer den nedlastede kompilatoren på en kjent plassering.
- Gå tilbake til MATLAB-kommandovinduet, og skriv: "setenv("MW_MINGW64_LOC","[Skriv inn installasjonsbanen her]")". Dette kan for eksempel være "setenv("MW_MINGW64_LOC","C:\TDM-GCC-64")". Hvis denne kommandoen utføres, er mex-kompilatoren riktig installert.
- Skriv inn "main_aldic.m" -funksjonsskriptet, og endre linje 22 for å matche kommandoen som ble utført i trinn 6.5.
- Åpne skriptet "Strain_calc_and_validate.m".
- Trykk på Kjør for å starte bildeanalysen.
- Når du blir bedt om det, endrer du verdiene for ALDIC-parametrene etter ønske.
MERK: Vindusstørrelsen skal være 0,25 til 1 ganger delmengdestørrelsen. Hvis du vil ha mer informasjon om parametervalgene, kan du se den elektroniske brukerhåndboken: (https://www.researchgate.net/publication/344796296_Augmented_Lagrangian_Digital
_Image_Correlation_AL-DIC_Code_Manual).- Følgende verdier ble brukt i denne studien:
Delmengde Størrelse (piksler): 20
Vindusstørrelse (piksler): 10
Metode for å løse ALDIC: Endelig forskjell (1)
Parallell databehandling ble ikke brukt (1)
Metode for å beregne første antatthet: Flerrutenettsøk basert på bildepyramide (0)
- Følgende verdier ble brukt i denne studien:
- Når du blir bedt om det, merker du av for "Ja" for å få algoritmen til automatisk å lagre middelverdien, standardavviket og 2D-kartene for ønsket samling av variabler (f.eks. x-belastning, y-belastning, skjærbelastning, dårlige regioner osv.). Velg hvilke variabler som skal lagres, og trykk OK.
- Når du blir bedt om det, endrer du parametrene etter ønske.
- Følgende verdier ble brukt i dette eksperimentet:
Omkringliggende punkter for å beregne belastning (numP): 12
Korrelasjonskoeffisient for dårlig regionidentifikasjon (corr_threshold): 0,5
Størrelse på underområde (piksler) for analyse av ugyldig område (understørrelse): 32
- Følgende verdier ble brukt i dette eksperimentet:
- Når du blir bedt om det, velger du mappen som inneholder de omdøpte z-projeksjonene med maksimal intensitet. Merk at programvaren automatisk utfører inkrementell ALDIC for å bestemme tøyningsfeltene til de deformerte bildene. Det vil si at hvert deformert bilde fungerer som det nye "referanse" -bildet for det neste deformerte bildet. Dette forbedrer nøyaktigheten av resultatene (tilleggsfigur 2) sammenlignet med å utføre kumulativ ALDIC, der hvert deformert bilde sammenlignes tilbake med det opprinnelige referansebildet (0 % anstrengelse). Hvis du vil utføre en kumulativ analyse, laster du inn bildene, men velger bare det opprinnelige referansebildet og det deformerte bildet av interesse.
MERK: Den normale belastningen beregnes som λ - 1, hvor λ er vevsstrekket. Vevsstrekningen beregnes i henhold til
, hvor N = [1 0]T eller [0 1]T for henholdsvis x-retningen og y-retningen, og C = F T F, hvor F er deformasjonsgradienten beregnet ved hjelp av "numP" -punkter som omgir hver datapunktutgang av ALDIC-algoritmen. Skjærbelastningen beregnes som 
, hvor 
. - Når du blir bedt om det, venstreklikker du for å opprette en firepunkts polygon for å definere området av interesse for måling av stammene. Begynn med punktet øverst til venstre, og tilordne de påfølgende punktene med klokken.
MERK: Variabelen "Lagring" som er lagret i MATLAB-arbeidsområdet, inneholder alle verdiene for gjennomsnittlig x-belastning, standardavvik for x-belastning, gjennomsnittlig y-belastning, standardavvik for y-belastning, gjennomsnittlig skjærbelastning, standardavvik for skjærtøyning og prosentandel av skadede områder. De dårlige regionene er definert i henhold til korrelasjonskoeffisientanalysen innenfor interesseområdet valgt i trinn 6.13. Mappen "NuclearTrackingResults" (som kan omdøpes ved å justere linjene 555 og 556) lagrer alle plottene som er angitt i trinn 6.10. Denne mappen inneholder også en regnearkfil med navnet "Resultater", som lagrer alle midler og standardavvik som er spesifisert i trinn 6.10.
, hvor N = [1 0]T eller [0 1]T for henholdsvis x-retningen og y-retningen, og C = F T F, hvor F er deformasjonsgradienten beregnet ved hjelp av "numP" -punkter som omgir hver datapunktutgang av ALDIC-algoritmen. Skjærbelastningen beregnes som 
, hvor 
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før man analyserte tøyningsfeltene i faktiske vevsprøver, ble ALDIC-protokollen først validert ved hjelp av digitalt anstrengte / transformerte bilder av kjerner i musesener. Spesifikt ble bildene transformert for å produsere ensartede stammer digitalt i x-retningen på 2%, 4%, 6%, 8% og 10% belastning med et simulert Poissons forhold på 115,16. Nøyaktigheten av den ALDIC algoritmen ble deretter vurdert ved å sammenligne gjennomsnittlig beregnede tøyningsverdier med kjente digitale stammer. I tillegg ble standardavviket til tøyningsverdiene vurdert for å bestemme heterogeniteten til tøyningsfeltet. Forskjellen mellom stammene beregnet av ALDIC (ved hjelp av inkrementell analyse) og de faktiske belastningene som påføres de digitalt transformerte bildene er vist i figur 1. Den gjennomsnittlige belastningen i x-retningen beregnet av ALDIC-programvaren var konsekvent en underestimering av den sanne påførte belastningen (figur 1A), og størrelsen på feilen økte med større påført belastning. Størrelsen var imidlertid alltid mindre enn 0,00015 for alle tøyningstrinnene. Det var også en svak underestimering av belastningen i y-retningen (figur 1C). Standardavviket til de beregnede stammene innenfor hele interesseområdet for x-stammen og y-stammen økte også med større påførte stammer, men størrelsen var også svært liten (<0,002) (figur 1B, D). Disse feilene var vesentlig større ved kumulativ analyse (tilleggsfigur 2).
Figur 1: Algoritmesammenligning og validering med digitalt anstrengte bilder . (A) De målte ALDIC belastningsdataene i x-retningen var konsekvent lavere enn den faktiske belastningen foreskrevet av de digitale transformasjonene, og feilen økte gradvis med større påført belastning. (B) Standardavviket til tøyningsverdiene i x-retningen økte også med større påførte digitale tøyninger. (C) De målte ALDIC belastningsdataene i y-retningen var konsekvent lavere enn den faktiske belastningen foreskrevet av de digitale transformasjonene. (D) Standardavviket til tøyningsverdiene i y-retningen økte med større påført tøyning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Når du utfører belastningsanalyse på faktiske vevsprøver, er det ikke mulig å direkte vurdere nøyaktigheten av ALDIC algoritmen. Likevel ble det utviklet en teknikk for å estimere nøyaktigheten av forskyvningsfeltet. Spesielt ble det deformerte bildet fordreid tilbake til en prediksjon av referansebildet basert på det beregnede forskyvningsfeltet. En normalisert krysskorrelasjonskoeffisient ble deretter brukt til å bestemme hvor godt det fordreide/rekonstruerte referansebildet stemte overens med det sanne referansebildet. Alle underregioner (32 piksler x 32 piksler) der den normaliserte krysskorrelasjonsverdien var mindre enn 0,5, ble ansett som et "dårlig område" der forskyvningsfeltet sannsynligvis var unøyaktig. Denne analysen identifiserte at det var en signifikant forskjell mellom ytelsen til de inkrementelle og kumulative analyseteknikkene. Spesielt begynte antall dårlige regioner å stige med den kumulative metoden etter den påførte belastningen på 6% (figur 2A), mens svært få (1%) dårlige regioner ble observert i noen av de digitalt transformerte regionene for den inkrementelle analysen. Ved bruk av denne nøyaktighetsvurderingsteknikken på de fire akillessenene hos mus som ble testet (tilleggsfigur 3), ble det fastslått at for tre prøver var gjennomsnittlig antall dårlige regioner mindre enn 25 % av bildet. I en av de fire prøvene (eksperiment 2) ble imidlertid nesten halvparten av bildet identifisert som dårlig ved maksimal belastningsøkning (figur 2B). Antallet dårlige regioner som var til stede i eksperiment 2 varierte fra gjennomsnittet av de tre andre prøvene med over fire standardavvik. Dette gjorde det mulig å fastslå at de ALDISKE dataene fra eksperiment 2 representerte en uteligger, og disse dataene ble derfor eliminert fra den videre analysen av resultatene.
Figur 2: Vellykket identifisering av områder med ugyldige belastningsberegninger ved hjelp av dårlig regionanalyse. (A) Mengden dårlige regioner i de digitalt transformerte bildene som ble analysert ved hjelp av den kumulative metoden, økte konsekvent etter 6 % påført belastning, mens den inkrementelle mengden forble på 1 %. (B) Mengden dårlige regioner for alle seneprøvene økte jevnt ved større belastningstrinn. Eksperiment 2 ble ansett som en outlier og er derfor ikke inkludert i gjennomsnitts- og standardavviksstolpene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
I tillegg ble de lokale strekkstammene i de testede akillessenene hos mus målt ved hjelp av fotoblekede linjer (PBL) som en annen metode for å bestemme nøyaktigheten til den ALDISKE algoritmen. X-retningsstammene beregnet av ALDIC hadde en tendens til å være større enn de som ble bestemt fra PBL, men forskjellen var generelt innenfor 0,005 belastning (figur 3A). Denne feilstørrelsen var lik standardavviket observert på tvers av de ulike PBLene i et gitt utvalg (figur 3B).
Figur 3: Validering av ALDIC tøyningsberegninger ved sammenligning med fotoblekede linjedata . (A) Forskjellen mellom ALDIC belastningsverdier og PBL-belastningsverdiene forble relativt konstant for alle tøyningsintervallene, rundt en verdi på 0,005. (B) Standardavviket for PBL-dataene i gjennomsnitt på tvers av alle utvalgene holdt seg relativt konstant på ca. 0,005. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Etter å ha vurdert nøyaktigheten av den ALDIC algoritmen, ble størrelsene og romlige fordelinger av de lokale stammene i musens akillessener under strekkbelastning bestemt (figur 4, figur 5 og figur 6). Merk at stammene ikke inkluderer forskyvningsdataene fra de "dårlige områdene" i hver prøve. X-retnings strekkstammene var konsistente på tvers av alle tre prøvene og var vesentlig lavere enn de påførte vevsstammene (figur 4A). I tillegg var x-retningsstammen relativt heterogen, gitt at standardavviket over 2D-bildet alltid var større enn den gjennomsnittlige tøyningsverdien. I kontrast var det signifikant inkonsistens mellom de tre prøvene for y-retningsstammene, med en prøve som viste positive gjennomsnittsverdier, en prøve som viste negative gjennomsnittsverdier og en prøve som viste nullbelastning i y-retningen (figur 4B). I tillegg var standardavviket til y-retningsstammene i en gitt prøve større enn standardavviket til x-retningsstammene. Til slutt var skjærbelastningen relativt lav over alle tøyningsintervallene (figur 4C).
Figur 4: Mikroskalastammer av musesener . (A) Den gjennomsnittlige belastningen i x-retningen forble under den påførte vevsstammen, men økte med hver belastningsøkning. (B) Middelbelastningen i y-retningen var tilnærmet null for alle økningene, men standardavviket var høyt. (C) Den gjennomsnittlige skjærbelastningen økte jevnt gjennom tøyningstrinnene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Romlig fordeling av x-stammer, y-stammer og skjærstammer. Representative kart over (A) x-stammer, (B) y-stammer og (C) skjærstammer i hele seneområdet av interesse Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Romlige fordelinger av maksimal hoved-, minimums- og maksimumsskjærstammer. Representative kart over (A) maksimale hovedstammer, (B) minimum hovedstammer, og (C) maksimale skjærstammer i hele seneområdet av interesse. De hvite linjene angir retningene for maksimums- og minimumsspenningene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Identifisering av kvasistatisk tilstand under avbildning. Hellingen på krafttidskurven i det siste minuttet av stressavslapningsperioden (rød linje) kan brukes til å tilnærme den totale kraftendringen under avbildning. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: Sammenligning av inkrementelle og kumulative analyseteknikker. (A) Forskjellen mellom de målte og faktiske x-retningsstammene i de digitalt transformerte bildene var signifikant større med den kumulative metoden sammenlignet med den inkrementelle metoden over 4% belastning. (B) Standardavviket for x-tøyningsverdier var også signifikant større med den kumulative metoden over 4 % belastning. (C) Forskjellen mellom de målte og faktiske y-stammene i de digitalt transformerte bildene var vesentlig større med den kumulative metoden over 8 % belastning. (D) Standardavviket til y-tøyningsverdiene var signifikant større med den kumulative metoden over 4 % belastning. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 3: Dårlig regionvisualisering og kvantifisering for hvert eksperiment. Ugyldige regioner ble definert som lokale områder i det rekonstruerte referansebildet som ikke samsvarte (under korrelasjonskoeffisienten på 0,5) med samme område i det faktiske referansebildet. Hvert ugyldig område som identifiseres innenfor et interesseområde (hvitt markert), merkes med en blå boks. Prosentandelen ugyldige områder innenfor interesseområdet angis over hvert bilde i parentes. Merk at disse bildene er rekonstruert fra det deformerte bildet ved 12% påført belastning. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denne artikkelen var å tilby en åpen kildekode, validert metode for å måle 2D-belastningsfeltene i sener under strekkbelastning. Grunnlaget for programvaren var basert på en offentlig tilgjengelig ALDIC algoritme12. Denne algoritmen ble innebygd i en større MATLAB-kode med den ekstra funksjonaliteten til inkrementell (versus kumulativ) belastningsanalyse. Denne tilpassede algoritmen ble deretter brukt til strekkprøving av sener, og nøyaktigheten ble vurdert av to forskjellige teknikker (dvs. digitalt transformerte bilder og belastningsmåling ved hjelp av fotoblekede linjer). I tillegg ble det lagt til en evne til å vurdere nøyaktigheten av ALDIC-målingene på en hvilken som helst prøve uten å kreve kunnskap om de sanne belastningsverdiene.
Analysen av de digitalt transformerte bildene viste at algoritmen nøyaktig kunne måle stammer opp til 10% med svært liten feil, noe som ikke kunne vurderes ut fra strekkprøving av faktiske akillessener hos mus på grunn av de lave størrelsene på stammene i seneprøvene. Likevel, sammenligning av stammene beregnet i musens akillessener av ALDIC til stammene målt ved hjelp av fotoblekede linjer, viste at feilen i ALDIC-teknikken var innenfor målevariasjonen til de fotoblekede linjene selv. Som en endelig validering ble nøyaktigheten av de fullstendige 2D-forskyvningsfeltene beregnet av ALDIC-algoritmen vurdert ved å rekonstruere referansebildet fra det deformerte bildet og sammenligne rekonstruksjonen med det faktiske referansebildet. I de digitalt transformerte bildene var det en økning i antall dårlige regioner og tøyningsfeil med større påførte stammer, spesielt for den kumulative ALDIC-analysen (figur 2 og tilleggsfigur 2). Dette var forventet siden den inkrementelle teknikken omdefinerer referansebildet med hvert mellomliggende bilde for å minimere forskyvningsforskjellene mellom bildepar. Antallet dårlige regioner var enda høyere i de faktiske seneprøvene siden strukturen og belastningen av senevevet ikke var homogen (i motsetning til de digitalt transformerte bildene). Likevel var det i gjennomsnitt bare ca. 15 % av det rekonstruerte bildet som ikke stemte overens med det faktiske referansebildet. Imidlertid hadde en prøve (eksperiment 2) et stort antall feilaktige regioner (~ 45%). Selv om det er uklart hvorfor denne prøven ikke kunne behandles riktig, var denne analysen av det rekonstruerte referansebildet verdifullt fordi det muliggjorde anerkjennelsen av at dataene fra denne prøven ikke var pålitelige. Til sammen viser disse eksperimentene at denne open source-algoritmen trygt kan brukes til å måle vevstammer i seneplanter nøyaktig.
Disse eksperimentene ga også verdifull informasjon om den mekaniske oppførselen til musesener. Spesielt ved en påført vevsstamme på 12% var gjennomsnittlig langsgående (x-retning) belastning i vevsprøven bare 2%. En del av denne belastningsdempingen skyldtes det faktum at makroskalavevsstammene ble beregnet ut fra endringer i vevets grip-til-grip-lengde, som sannsynligvis inkluderte signifikante belastningskonsentrasjoner ved gripegrensesnittet til det myotendinøse overgangen. Likevel stemmer dette overens med andre studier av mikroskalastammer i sener10,17,18. Videre tilsvarte belastningen på 12 % ca. 5 MPa belastning, noe som sannsynligvis er sammenlignbart med de maksimale fysiologiske belastningene in vivo19. Dette antyder at celler i musens akillessener ikke opplever strekkbelastninger over 2%. Den tverrgående (y-retning) stammen var mer variabel på tvers av prøver, med både positive og negative verdier. Dette tyder på at seneprøvene viste positiv og negativ Poisson-ratio, noe som er forenlig med tidligere testing av akillessener20. Som forventet for uniaxial spenning var størrelsen på skjærbelastningen generelt lav (<4° i gjennomsnitt). For alle strekk- og skjærstammene var imidlertid standardavviket på tvers av interesseområdet alltid større enn den gjennomsnittlige tøyningsverdien, noe som viser at det var en stor grad av tøyningsheterogenitet. Videre økte denne heterogeniteten med større anvendte stammer, sannsynligvis på grunn av heterogeniteten i vevsstrukturen, samt den økte feilen i ALDIC-beregningene som følge av de større forskyvnings- og forskyvningsfeltene. Dette antyder at stammene som oppleves av individuelle seneceller er svært variable i vevet.
Til tross for den vellykkede valideringen av ALDIC-algoritmen, er det noen begrensninger i bruken av den for å analysere stammer i seneeksplanter. Den primære begrensningen er at algoritmen bare kan utføre en 2D-analyse av et 3D-objekt. En strengere tilnærming ville være å utføre en full digital volumkorrelasjon (DVC), som har blitt utført på digitalt transformerte bilder av sener11. Dette er imidlertid generelt vanskelig å utføre på faktiske seneprøver siden bildene inneholder oppløselige kjerner til en dybde på bare 100 μm. Dette betyr at det indre volumet av prøvene ikke har noen tekstur i de volumetriske bildene, noe som gjør DVC upålitelig. Derfor ble bildene i denne studien kollapset til 2D maksimale projeksjoner, som kunstig tvinger alle kjernene inn i et enkelt bildeplan. Selv om dette kan gi noen feil i belastningsanalysen og forhindre måling av forskyvninger utenfor planet, tyder valideringsresultatene på at teknikken fortsatt er nøyaktig. En ytterligere begrensning er at belastningene ble beregnet på slutten av en stressrelaksasjonsperiode og ikke kunne beregnes under dynamisk syklisk belastning. Dette problemet var uunngåelig siden det var en begrenset avbildningstid for å skaffe de volumetriske bildene som ble brukt til belastningsanalysen. Til tross for disse begrensningene var analysens suksess relativt robust, gitt at tre av de fire seneprøvene ga nøyaktige belastningsdata. Derfor vil denne algoritmen være et nyttig verktøy for forskere som er interessert i å måle tøyningsfelt i seneeksplanter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health (R21 AR079095) og National Science Foundation (2142627).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-DTAF (5-(4,6-Dichlorotriazinyl) Aminofluorescein), single isomer | ThermoFisher | D16 | |
| Calipers | Mitutoyo | 500-196-30 | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1R HD | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Coning | 6775 | |
| DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) | ThermoFisher | 62554 | |
| MATLAB | MathWorks | R2022b | |
| Tensile Loading Device | N/A | N/A | Tensile loading device described in Peterson et al, 2020. (ref 13) |
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher | 88881001 |
References
- Devkota, A. C. Distributing a fixed amount of cyclic loading to tendon explants over longer periods induces greater cellular and mechanical responses. Journal of Orthopaedic Research. 11 (4), 1609-1612 (2007).
- Sun, H. B., et al. Cycle-dependent matrix remodeling gene expression response in fatigue-loaded rat patellar tendons. Journal of Orthopaedic Research. 28 (10), 1380-1386 (2010).
- Shepherd, J. H., Screen, H. R. C.
- Paschall, L., Pedaprolu, K., Carrozzi, S., Dhawan, A., Szczesny, S. Mechanical stimulation as both the cause and the cure of tendon and ligament injuries. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. , Springer. Cham, Switzerland. 359-386 (2022).
- Andarawis-Puri, N., Ricchetti, E. T., Soslowsky, L. J. Rotator cuff tendon strain correlates with tear propagation. Journal of Biomechanics. 42 (2), 158-163 (2009).
- Cheng, V. W. T., Screen, H. R. C.
- Luyckx, T., et al. Digital image correlation as a tool for three-dimensional strain analysis in human tendon tissue. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 7 (2014).
- Duncan, N. A., Bruehlmann, S. B., Hunter, C. J., Shao, X., Kelly, E. J. In situ cell-matrix mechanics in tendon fascicles and seeded collagen gels: Implications for the multiscale design of biomaterials. Computer Methods in Biomechanics and Biomedical Engineering. 17 (1), 39-47 (2014).
- Arnoczky, S. P., Lavagnino, M., Whallon, J. H., Hoonjan, A. In situ cell nucleus deformation in tendons under tensile load; A morphological analysis using confocal laser microscopy. Journal of Orthopaedic Research. 20 (1), 29-35 (2002).
- Screen, H. R. C., Bader, D. L., Lee, D. A., Shelton, J. C.
- Fung, A. K., Paredes, J. J., Andarawis-Puri, N. Novel image analysis methods for quantification of in situ 3-D tendon cell and matrix strain. Journal of Biomechanics. 67, 184-189 (2018).
- Yang, J., Bhattacharya, K. Augmented Lagrangian digital image correlation. Experimental Mechanics. 59 (2), 187-205 (2019).
- Peterson, B. E., Szczesny, S. E. Dependence of tendon multiscale mechanics on sample gauge length is consistent with discontinuous collagen fibrils. Acta Biomaterialia. 117, 302-309 (2020).
- Humphrey, J. D., O'Rourke, S. L. An Introduction to Biomechanics. , Springer. New York, NY. (2015).
- Reese, S. P., Weiss, J. A. Tendon fascicles exhibit a linear correlation between Poisson's ratio and force during uniaxial stress relaxation. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (3), 34501 (2013).
- Ahmadzadeh, H., Freedman, B. R., Connizzo, B. K., Soslowsky, L. J., Shenoy, V. B. Micromechanical poroelastic finite element and shear-lag models of tendon predict large strain dependent Poisson's ratios and fluid expulsion under tensile loading. Acta Biomaterialia. 22, 83-91 (2015).
- Szczesny, S. E., Elliott, D. M. Interfibrillar shear stress is the loading mechanism of collagen fibrils in tendon. Acta Biomaterialia. 10 (6), 2582-2590 (2014).
- Han, W. M., et al. Macro- to microscale strain transfer in fibrous tissues is heterogeneous and tissue-specific. Biophysical Journal. 105 (3), 807-817 (2013).
- Pedaprolu, K., Szczesny, S. E. A novel, open-source, low-cost bioreactor for load-controlled cyclic loading of tendon explants. Journal of Biomechanical Engineering. 144 (8), 084505 (2022).
- Gatt, R., et al. Negative Poisson's ratios in tendons: An unexpected mechanical response. Acta Biomaterialia. 24, 201-208 (2015).
