Summary
Detta dokument beskriver en öppen källkod digital bildkorrelationsalgoritm för mätning av lokala 2D-vävnadsstammar inom senexplantat. Teknikens noggrannhet har validerats med hjälp av flera tekniker, och den är tillgänglig för allmän användning.
Abstract
Det finns ett stort vetenskapligt intresse för att förstå de stammar som senceller upplever in situ och hur dessa stammar påverkar vävnadsremodellering. Baserat på detta intresse har flera analystekniker utvecklats för att mäta lokala vävnadsstammar inom senexplantat under belastning. I flera fall har dock dessa teknikers noggrannhet och känslighet inte rapporterats, och ingen av algoritmerna är offentligt tillgängliga. Detta har gjort det svårt för en mer utbredd mätning av lokala vävnadsstammar i senexplantat. Därför var målet med denna uppsats att skapa ett validerat analysverktyg för mätning av lokala vävnadsstammar i senexplantat som är lättillgängligt och lätt att använda. Specifikt anpassades en offentligt tillgänglig augmented-Lagrangian digital image correlation (ALDIC) algoritm för att mäta 2D-stammar genom att spåra förskjutningarna av cellkärnor i musens akillessenor under enaxlig spänning. Dessutom validerades noggrannheten hos de beräknade stammarna genom att analysera digitalt transformerade bilder, samt genom att jämföra stammarna med värden bestämda från en oberoende teknik (dvs. fotoblekta linjer). Slutligen införlivades en teknik i algoritmen för att rekonstruera referensbilden med hjälp av det beräknade förskjutningsfältet, som kan användas för att bedöma algoritmens noggrannhet i frånvaro av kända töjningsvärden eller en sekundär mätteknik. Algoritmen kan mäta stammar upp till 0,1 med en noggrannhet på 0,00015. Tekniken för att jämföra en rekonstruerad referensbild med den faktiska referensbilden identifierade framgångsrikt prover som hade felaktiga data och indikerade att i prover med bra data var cirka 85% av förskjutningsfältet korrekt. Slutligen överensstämde de stammar som uppmättes i hälsenor med den tidigare litteraturen. Därför är denna algoritm ett mycket användbart och anpassningsbart verktyg för noggrann mätning av lokala vävnadsstammar i senor.
Introduction
Senor är mekanokänsliga vävnader som anpassar sig och degenererar som svar på mekanisk belastning 1,2,3,4. På grund av den roll som mekaniska stimuli spelar i sencellbiologi finns det ett stort intresse för att förstå de stammar som senceller upplever i den ursprungliga vävnadsmiljön under belastning. Flera experimentella och analytiska tekniker har utvecklats för att mäta lokala vävnadsstammar i senor. Dessa inkluderar 2D / 3D digital bildkorrelation (DIC) analyser av ytstammar med antingen fläckmönster eller fotoblekta linjer (PBL) 5,6,7,8, mätning av förändringarna i centroid-till-centroidavståndet för enskilda kärnor i vävnaden 9,10 och en ny fullfälts 3D DIC-metod som tar hänsyn till rörelse utanför planet och 3D-deformationer 11 . Noggrannheten och känsligheten hos dessa tekniker har dock rapporterats i endast ett fåtal fall, och ingen av dessa tekniker har gjorts allmänt tillgängliga, vilket gör det svårt att allmänt anta och använda dessa tekniker.
Målet med detta arbete var att skapa ett validerat analysverktyg för mätning av lokala vävnadsstammar i senexplantat som är lättillgängligt och lätt att använda. Den valda metoden är baserad på en offentligt tillgänglig augmented-Lagrangian digital image correlation (ALDIC) algoritm skriven i MATLAB som utvecklades av Yang och Bhattacharya12. Denna algoritm anpassades för att analysera senprover och validerades genom att tillämpa den på digitalt transformerade bilder och genom att jämföra de stammar som uppmättes i faktiska senprover med resultaten erhållna från fotoblekta linjer. Dessutom implementerades ytterligare funktionalitet i algoritmen för att bekräfta noggrannheten i det beräknade förskjutningsfältet även i frånvaro av kända töjningsvärden eller en sekundär mätteknik. Därför är denna algoritm ett mycket användbart och anpassningsbart verktyg för att noggrant mäta lokala 2D-vävnadsstammar i senor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av Pennsylvania State University Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Beredning av vävnad
- För detta protokoll, skörda hälsenorna från 2-4 månader gamla manliga C57BL / 6-möss.
OBS: Olika senor eller ligament från möss eller andra små djur kan också användas.- Gör ett snitt på huden ytligt till akillessenen för att exponera plantarissenan och den omgivande bindväven. Ta sedan bort dem med ett kirurgiskt blad.
- Separera de exponerade soleus- och gastrocnemiusmusklerna från bakbenet och skrapa dem försiktigt av akillessenen med det kirurgiska bladet
- Separera calcaneus från resten av foten med ett skärhjulsfäste på ett roterande verktyg.
- Färga vävnaden i 1,5 ml av en 5 μg/ml lösning av 5-(4,6-diklortriazinyl) aminofluorescein (DTAF) och 0,1 M natriumbikarbonatbuffert i 20 minuter på en roterande mixer vid rumstemperatur. Denna lösning färgar proteiner (t.ex. extracellulär matris) i vävnaden.
Under denna 20-minutersperiod ska steg 1.3 slutföras. - Förbered en 1:1 000 lösning av DRAQ5 i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att färga kärnorna. Använd en virvelblandare för att homogenisera lösningen.
- Efter 20 minuters inkubationsperiod i steg 1.2, överför vävnaden från DTAF-lösningen till DRAQ5-lösningen och inkubera i ett mörkt utrymme i 10 minuter vid rumstemperatur.
2. Senladdning och bildförvärv
OBS: Detta protokoll kräver en draganordning som kan monteras ovanpå ett konfokalmikroskop. För denna studie användes den mikrotensilanordning som beskrivits av Peterson och Szczesny13 .
- Placera senan i dragbelastningsanordningens grepp. Innan du monterar greppen i laddningsanordningen, använd digitala bromsok för att mäta avståndet mellan calcaneusfästet och motsatt grepp. Detta avstånd är senans mätlängd.
- Alternativt kan du montera greppen i laddningsanordningen innan du sätter in senan och trycka i kontakt för att definiera motorpositionen med nollförskjutning. Förskjutningen av motorerna efter att senan har satts in kan ge en potentiellt mer exakt grepp-till-grepp-mätarlängd.
- Montera greppen i laddningsanordningen, som innehåller PBS för att upprätthålla vävnadshydrering. Rikta in senan så bra som möjligt med antingen x-axeln eller y-axeln i mikroskopbilderna så att algoritmens x-töjnings- och y-töjningsutgångar motsvarar senaxlarna.
OBS: I denna studie var senorna i linje med x-axeln. Om det inte är möjligt att perfekt rikta in senan med bildaxlarna, kan algoritmens x-töjnings- och y-töjningsutgångar transformeras för att anpassa sig till senans längsgående / vinkelräta axlar med hjälp av standardspänningstransformationsekvationer14. - Förbelasta senan med 1 g spänning och, om så önskas, applicera cyklisk belastning för att förkonditionera provet. I detta protokoll användes ingen förkonditionering eftersom studiens mål var att validera de uppmätta lokala vävnadsstammarna snarare än att mäta vävnadsmaterialets egenskaper. Om det finns intresse för att mäta materialegenskaperna i makroskala, som är beroende av belastningshistoriken, rekommenderas förkonditionering. Efter förkonditionering och återhämtning, applicera en förspänning på 1 g igen.
- Om så önskas, fotoblek en uppsättning av fyra linjer med 80 μm mellanrum i vävnadens mittregion (se Peterson och Szczesny13 för mer information).
De fotoblekta linjerna användes för att validera mätningarna av ALDIC-algoritmen och är inte nödvändiga för att utföra själva ALDIC. Antalet och avståndet mellan linjerna kan justeras och radernas placering bör väljas för att undvika artefakter i exemplet som skulle minska linjens tydlighet. - Upprepa fotoblekningsproceduren på vänster och höger ytterligheter av vävnaden nära greppen.
- Använd det konfokala mikroskopet för att få volymetriska bilder (x,y: 1,25 μm/pixel, z: 2,5 μm/pixel) av DTAF- och DRAQ5-fluorescensen vid 1 g förspänning.
- Utför en töjningsramp med 0,5 %/s till 2 % belastning. Observera att töjningshastigheten och den inkrementella töjningsstorleken kan justeras.
- Låt vävnaden stressa, slappna av i 10 minuter.
OBS: Varaktigheten av spänningsavslappning bör väljas så att provet är under en ungefär kvasistatisk belastning under bildinsamling. För att avgöra om stressavslappningstiden är acceptabel, bestäm lutningen på kraft-tidskurvan under den sista minuten av stressavslappning (kompletterande figur 1) och multiplicera denna lutning med den totala bildperioden. I denna studie förändrades aldrig kraften som applicerades vid den största töjningsökningen med mer än 5%. - Ta en annan volymetrisk bild av vävnaden efter deformation.
- Upprepa steg 2.7-2.9 tills önskad slutstam uppnås. I detta dokument valdes ett slutligt töjningsvärde på 12%.
3. Bildbehandling
- Använd ImageJ eller Fiji för att skapa maximala z-projektioner av varje volymetrisk bild av DRAQ5-kanalen (kärnkraft). Detta kommer att fungera som 2D-fläckiga bilder för ALDIC.
- Spara z-projektionerna med maxintensitet som .tiff filer och namnge dem enligt följande namnkonvention.
- Använd ett nummer som första tecken i bildnamnet.
- Låt numret motsvara den ordning i vilken bilderna kommer att beaktas under stamanalysen. Till exempel bör den första bilden börja med en, och den andra bilden ska börja med två. Olika nummer kan väljas, men de måste öka sekventiellt. Ett exempel på namngivningskonvention är följande: "0_Experiment1_MaxZProjection".
- Spara alla omdöpta z-projektioner med maxintensitet i en mapp.
4. Installation och tillämpning av fotoblekt linjeanalyskod
Dessa steg är endast nödvändiga om man vill bekräfta noggrannheten hos ALDIC-algoritmen med hjälp av fotoblekta linjer. Koden beräknar den lokala vävnadsstammen som den genomsnittliga normaliserade förändringen i avståndet mellan varje fotoblekt linje inom den fotoblekta linjeuppsättningen. I denna studie beräknades sedan medelvärdet av de genomsnittliga lokala värdena över alla fotoblekta linjeuppsättningar (dvs. i mitten och vänster / höger ände) för att bestämma ett enda genomsnittligt lokalt vävnadsstamvärde för varje prov. Detta värde användes sedan för att uppskatta noggrannheten hos ALDIC-algoritmen.
- Ladda ned mappen "PBL-kod" från GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc) och flytta allt innehåll till arbetskatalogen i MATLAB.
- Öppna MATLAB-skriptet "Micro_Mech_Template.m".
- Tryck på Kör och välj en av bildfilerna som innehåller de volymetriska bilderna. De volymetriska bilderna kan vara någon av följande filtyper: .lsm, .tiff, .nd2.
- Programvaran laddar automatiskt alla bilder i mappen och visar en projicerad bild av referensvolymetrisk bild. När du uppmanas till det vänsterklickar du för att skapa flerpunktslinjer som spårar exemplets vänstra och högra ändar. Högerklicka för att avsluta en rad. När inmatningen har bearbetats, om kanterna är korrekta, tryck på Ok för att acceptera resultatet.
- Rita en slumpmässig diagonal linje över provet som referenslinje när du uppmanas till det.
- Ange antalet fotoblekta linjer som skapats och spåra de fotoblekta linjerna med flerpunktslinjer.
- Om resultatet är acceptabelt, acceptera det. Om resultatet är felaktigt, justera det och bearbeta om.
- Upprepa steg 4.2 för alla bilder och flytta alla bilder av kalkerade linjer till en enda mapp.
- Öppna skriptet "Micro_Mech_Strain.m".
- Tryck på Kör för att köra koden och välj en av de sparade bilderna där de fotoblekta linjerna spåras.
- Kontrollera att de valda medföljande bilderna är korrekta när bilden har valts genom att trycka på Ok.
5. Skapa digitalt transformerade bilder
Dessa steg är endast nödvändiga om man vill bekräfta noggrannheten hos ALDIC-algoritmen med hjälp av digitalt transformerade bilder. Dessa bilder simulerar homogena 2D-töjningsfält av känd storlek genom att artificiellt omvandla referensbilden.
- Ladda ned koden "Digital_strain.m" från GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc).
- Öppna och kör koden.
- När du uppmanas till det infogar du önskade värden för maximal applicerad stam, applicerad töjningsökning och Poissons förhållande. Tryck på Ok.
OBS: För detta experiment var den maximala applicerade stammen 0,1 (10%), den applicerade töjningsökningen var 0,02 (2%) och ett Poissons förhållande på 1 användes, vilket överensstämmer med experimentella data från sendragprovning15,16. Koden använder den inbäddade MATLAB-funktionen imwarp och ingångsvärdena (t.ex. töjningssteg, Poissons förhållande) för att skapa de digitalt transformerade bilderna. - Välj den odeformerade referensbilden när du uppmanas till det.
- För varje töjningsökning visas ett överlägg av referensbilden och den omvandlade bilden. Den transformerade bilden sparas i katalogen under titeln "DigitallyTransformedX%Strain", där X är töjningssteget.
6. Installation och tillämpning av stamberäkning och valideringskod
- Ladda ned mappen "Stamberäknings- och valideringskod" från GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc) och flytta allt innehåll till MATLAB-arbetskatalogen
- Installera en mex C / C ++ kompilator enligt Yang och Bhattacharya12. Stegen sammanfattas nedan.
- Kontrollera MATLAB för att se om en mex C / C ++ kompilator har installerats genom att skriva "mex -setup" i MATLAB-kommandofönstret och trycka på Enter.
- Om ett fel visas som indikerar att en kompilator inte stöds eller finns, fortsätt till steg 6.3 och steg 6.4.
- Om inget fel finns går du vidare till steg 6.5
- För att ladda ner en mex C / C ++ kompilator, gå till "https: / tdm-gcc.tdragon.net/" och välj TDM-gcc-kompilatorn.
- Installera den nedladdade kompilatorn på en känd plats.
- Gå tillbaka till MATLAB-kommandofönstret och skriv: "setenv("MW_MINGW64_LOC","[Skriv din installationssökväg här]")". Detta kan till exempel vara "setenv("MW_MINGW64_LOC","C:\TDM-GCC-64")". Om det här kommandot körs framgångsrikt är mex-kompilatorn korrekt installerad.
- Ange funktionsskriptet "main_aldic.m" och ändra rad 22 så att den matchar kommandot som utfördes i steg 6.5.
- Öppna skriptet "Strain_calc_and_validate.m".
- Tryck på Kör för att starta bildanalysen.
- Ändra värdena för ALDIC-parametrarna efter behov när du uppmanas till det.
OBS: Fönsterstorleken bör vara 0,25 till 1 gånger delmängdsstorleken. Mer information om parameteralternativen finns i användarhandboken online: (https://www.researchgate.net/publication/344796296_Augmented_Lagrangian_Digital
_Image_Correlation_AL-DIC_Code_Manual).- Följande värden användes i denna studie:
Delmängd Storlek (pixlar): 20
Fönsterstorlek (pixlar): 10
Metod för att lösa ALDIC: Finit skillnad (1)
Parallell databehandling användes inte (1)
Metod för att beräkna initial gissning: Multigrid-sökning baserad på bildpyramid (0)
- Följande värden användes i denna studie:
- När du uppmanas till det markerar du kryssrutan "Ja" om du vill att algoritmen automatiskt ska spara medelvärde, standardavvikelse och 2D-kartor för önskad samling variabler (t.ex. x-töjning, y-töjning, skjuvtöjning, dåliga områden osv.). Välj vilka variabler som ska sparas och tryck på OK.
- Ändra parametrarna efter behov när du uppmanas till det.
- Följande värden användes i det här experimentet:
Omgivande punkter för beräkning av töjning (numP): 12
Korrelationskoefficient för identifiering av dåliga regioner (corr_threshold): 0,5
Delregionstorlek (pixlar) för analys av dåliga regioner (Delstorlek): 32
- Följande värden användes i det här experimentet:
- När du uppmanas till det väljer du den mapp som innehåller de omdöpta z-projektionerna med maxintensitet. Observera att programvaran automatiskt utför inkrementell ALDIC för att bestämma töjningsfälten för de deformerade bilderna. Det vill säga varje deformerad bild fungerar som den nya "referens" -bilden för nästa deformerade bild. Detta förbättrar resultatens noggrannhet (kompletterande figur 2) jämfört med att utföra kumulativ ALDIC, där varje deformerad bild jämförs tillbaka med den ursprungliga referensbilden (0 % stam). För att utföra en kumulativ analys, ladda bilderna men välj bara den ursprungliga referensbilden och den deformerade bilden av intresse.
OBS: Den normala stammen beräknas som λ - 1, där λ är vävnadssträckan. Vävnadssträckningen beräknas enligt
, där N = [1 0]T eller [0 1]T för x-riktningen respektive y-riktningen, och C = F T F, där F är deformationsgradienten beräknad med hjälp av "numP"-punkter som omger varje datapunktsutdata av ALDIC-algoritmen. Skjuvtöjningen beräknas som 
, där 
. - När du uppmanas till det vänsterklickar du för att skapa en fyrpunktspolygon för att definiera intresseområdet för mätning av töjningarna. Börja med punkten i det övre vänstra hörnet och tilldela de efterföljande punkterna medurs.
OBS: Variabeln "Storage" som sparats i MATLAB-arbetsytan innehåller alla värden för genomsnittlig x-stam, x-töjning standardavvikelse, genomsnittlig y-töjning, y-töjning standardavvikelse, genomsnittlig skjuvtöjning, skjuvtöjning standardavvikelse och procentandel dåliga regioner. De dåliga regionerna definieras enligt korrelationskoefficientanalysen inom den intresseregion som valts i steg 6.13. Mappen "NuclearTrackingResults" (som kan döpas om genom att justera linjerna 555 och 556) lagrar alla tomter som anges i steg 6.10. Den här mappen innehåller också en kalkylarkfil med namnet "Resultat", som lagrar alla medel och standardavvikelser som anges i steg 6.10.
, där N = [1 0]T eller [0 1]T för x-riktningen respektive y-riktningen, och C = F T F, där F är deformationsgradienten beräknad med hjälp av "numP"-punkter som omger varje datapunktsutdata av ALDIC-algoritmen. Skjuvtöjningen beräknas som 
, där 
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Innan analysen av töjningsfälten i faktiska vävnadsprover validerades ALDIC-protokollet först med hjälp av digitalt ansträngda/transformerade bilder av kärnor i hälsenor hos möss. Specifikt omvandlades bilderna för att digitalt producera enhetliga stammar i x-riktningen 2%, 4%, 6%, 8% och 10% stam med en simulerad Poissons förhållande på 115,16. ALDIC-algoritmens noggrannhet bedömdes sedan genom att jämföra de genomsnittliga beräknade töjningsvärdena med de kända digitala stammarna. Dessutom bedömdes standardavvikelsen för töjningsvärdena för att bestämma töjningsfältets heterogenitet. Skillnaden mellan de stammar som beräknats med ALDIC (med inkrementell analys) och de faktiska töjningar som tillämpas på de digitalt transformerade bilderna visas i figur 1. Den genomsnittliga töjningen i x-riktningen beräknad med ALDIC-programvaran var genomgående en underskattning av den verkliga applicerade töjningen (figur 1A), och felets storlek ökade med större tillämpad töjning. Storleken var dock alltid mindre än 0,00015 för alla töjningssteg. Det fanns också en liten underskattning av belastningen i y-riktningen (figur 1C). Standardavvikelsen för de beräknade stammarna inom hela det intressanta området för x-stammen och y-stammen ökade också med större applicerade stammar, men storleken var också mycket liten (<0,002) (figur 1B, D). Dessa fel var betydligt större vid användning av kumulativ analys (kompletterande figur 2).
Figur 1: Algoritmjämförelse och validering med digitalt ansträngda bilder . (A) De uppmätta ALDIC-töjningsdata i x-riktningen var genomgående lägre än den faktiska töjning som föreskrevs av de digitala transformationerna, och felet ökade gradvis med större tillämpad belastning. (B) Standardavvikelsen för töjningsvärdena i x-riktningen ökade också med större applicerade digitala stammar. (C) De uppmätta ALDIC-töjningsdata i y-riktningen var genomgående lägre än den faktiska töjning som föreskrevs av de digitala transformationerna. (D) Standardavvikelsen för töjningsvärdena i y-riktningen ökade med större applicerad töjning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Vid stamanalys på faktiska vävnadsprover är det inte möjligt att direkt bedöma ALDIC-algoritmens noggrannhet. Ändå utvecklades en teknik för att uppskatta noggrannheten i förskjutningsfältet. Specifikt förvrängdes den deformerade bilden tillbaka till en förutsägelse av referensbilden baserat på det beräknade förskjutningsfältet. En normaliserad korskorrelationskoefficient användes sedan för att bestämma hur väl den förvrängda/rekonstruerade referensbilden matchade den sanna referensbilden. Alla underregioner (32 pixlar x 32 pixlar) där det normaliserade korskorrelationsvärdet var mindre än 0,5 betraktades som ett "dåligt område" där förskjutningsfältet troligen var felaktigt. Denna analys identifierade att det fanns en signifikant skillnad mellan prestanda för inkrementella och kumulativa analystekniker. Specifikt började antalet dåliga regioner öka med den kumulativa metoden efter den 6% tillämpade stammen (figur 2A), medan mycket få (1%) dåliga regioner observerades i någon av de digitalt transformerade regionerna för inkrementell analys. Vid tillämpning av denna noggrannhetsbedömningsteknik på de fyra musens akillessenor som testades (kompletterande figur 3) bestämdes att för tre prover var det genomsnittliga antalet dåliga regioner mindre än 25% av bilden. I ett av de fyra proverna (experiment 2) identifierades dock nästan hälften av bilden som dålig vid maximal töjningsökning (figur 2B). Antalet dåliga regioner som var närvarande i experiment 2 varierade från medelvärdet av de andra tre proverna med över fyra standardavvikelser. Detta gjorde det möjligt att fastställa att ALDIC-data från experiment 2 utgjorde en extrem faktor, och dessa data eliminerades därför från den vidare analysen av resultaten.
Figur 2: Framgångsrik identifiering av områden med ogiltiga töjningsberäkningar genom analys av dåliga regioner. (A) Mängden dåliga regioner i de digitalt transformerade bilderna som analyserades med den kumulativa metoden ökade konsekvent efter 6% tillämpad belastning, medan den inkrementella kvantiteten förblev på 1%. (B) Mängden dåliga regioner för alla senprover ökade stadigt vid större töjningssteg. Experiment 2 ansågs vara en outlier och ingår därför inte i medelvärdet och standardavvikelsestaplarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Dessutom mättes de lokala dragspänningarna i de testade musens akillessenor med fotoblekta linjer (PBL) som en andra metod för att bestämma noggrannheten hos ALDIC-algoritmen. De x-riktningsstammar som beräknats med ALDIC tenderade att vara större än de som bestämdes från PBL, men skillnaden låg i allmänhet inom 0,005 stam (figur 3A). Denna felmagnitud liknade den standardavvikelse som observerades för de olika PBL inom ett givet urval (figur 3B).
Figur 3: Validering av ALDIC-töjningsberäkningar genom jämförelse med fotoblekta linjedata . (A) Skillnaden mellan ALDIC-töjningsvärdena och PBL-töjningsvärdena förblev relativt konstant för alla töjningssteg, omkring ett värde på 0,005. (B) Standardavvikelsen för PBL-data i genomsnitt för alla urval förblev relativt konstant på cirka 0,005. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Efter att ha bedömt ALDIC-algoritmens noggrannhet bestämdes magnituderna och rumsfördelningarna för de lokala töjningarna i musens hälsenor under dragbelastning (figur 4, figur 5 och figur 6). Observera att stammarna inte inkluderar förskjutningsdata från de "dåliga regionerna" inom varje prov. X-riktningens dragspänningar var konsekventa över alla tre proverna och var väsentligt lägre än de applicerade vävnadsstammarna (figur 4A). Dessutom var x-riktningsstammen relativt heterogen, med tanke på att standardavvikelsen över 2D-bilden alltid var större än det genomsnittliga töjningsvärdet. Däremot fanns det signifikant inkonsekvens mellan de tre proverna för y-riktningsstammarna, med ett prov som uppvisade positiva medelvärden, ett prov som uppvisade negativa medelvärden och ett prov som uppvisade noll töjning i y-riktningen (figur 4B). Dessutom var standardavvikelsen för y-riktningsstammarna inom ett givet prov större än standardavvikelsen för x-riktningsstammarna. Slutligen var skjuvtöjningen relativt låg i alla töjningssteg (figur 4C).
Figur 4: Mikroskala stammar av mus Achilles senor . (A) Den genomsnittliga stammen i x-riktningen förblev under den applicerade vävnadsstammen men ökade med varje stamsteg. (B) Den genomsnittliga töjningen i y-riktningen var ungefär noll för alla steg, men standardavvikelsen var hög. (C) Den genomsnittliga skjuvtöjningen ökade stadigt under hela töjningsstegen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Rumslig fördelning av x-stammar, y-stammar och skjuvstammar. Representativa kartor över (A) x-stammar, (B) y-stammar och (C) skjuvstammar i hela senregionen av intresse Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Rumsliga fördelningar av maximal princip, lägsta princip och maximal skjuvning. Representativa kartor över (A) maximala huvudstammar, (B) minsta huvudstammar och (C) maximala skjuvstammar i hela senregionen av intresse. De vita linjerna anger riktningarna för de maximala och minsta huvudspänningarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Identifiering av kvasistatiskt tillstånd under avbildning. Kraft-tidskurvans lutning under den sista minuten av spänningsavslappningsperioden (röd linje) kan användas för att approximera den totala kraftförändringen under avbildning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Jämförelse av inkrementella och kumulativa analystekniker. (A) Skillnaden mellan de uppmätta och faktiska x-riktningstöjningarna i de digitalt transformerade bilderna var signifikant större med den kumulativa metoden jämfört med den inkrementella metoden med en töjning på över 4 %. (B) Standardavvikelsen för x-töjningsvärden var också signifikant större med den kumulativa metoden över 4% stam. (C) Skillnaden mellan de uppmätta och faktiska y-stammarna i de digitalt transformerade bilderna var betydligt större med den kumulativa metoden över 8% töjning. (D) Standardavvikelsen för y-töjningsvärdena var signifikant större med den kumulativa metoden över 4% stam. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: Visualisering och kvantifiering av dåliga regioner för varje experiment. Dåliga regioner definierades som lokala områden inom den rekonstruerade referensbilden som inte matchade (under korrelationskoefficienten på 0,5) samma region i den faktiska referensbilden. Varje dålig region som identifieras inom en intressant region (markerad i vitt) markeras med en blå ruta. Procentandelen dåliga regioner inom intresseområdet anges ovanför varje bild inom parentes. Observera att dessa bilder rekonstrueras från den deformerade bilden med 12% applicerad belastning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syftet med denna artikel var att tillhandahålla en validerad metod med öppen källkod för att mäta 2D-töjningsfält i senor under dragbelastning. Grunden för programvaran baserades på en allmänt tillgänglig ALDIC-algoritm12. Denna algoritm var inbäddad i en större MATLAB-kod med den extra funktionaliteten för inkrementell (kontra kumulativ) stamanalys. Denna anpassade algoritm tillämpades sedan på dragprovning av senor, och dess noggrannhet bedömdes med två olika tekniker (dvs. digitalt transformerade bilder och töjningsmätning med fotoblekta linjer). Dessutom lades en förmåga till att bedöma noggrannheten i ALDIC-mätningarna på vilket prov som helst utan att kräva kunskap om de verkliga töjningsvärdena.
Analysen av de digitalt transformerade bilderna visade att algoritmen exakt kunde mäta stammar upp till 10% med mycket lite fel, vilket inte kunde bedömas från dragprovningen av faktiska musens akillessenor på grund av de låga storlekarna på stammarna i senproverna. En jämförelse av de stammar som beräknats i hälhälsenor av ALDIC med de stammar som mättes med fotoblekta linjer visade dock att ALDIC-teknikens fel låg inom mätvariationen för de fotoblekta linjerna själva. Som en slutlig validering bedömdes noggrannheten hos de fullständiga 2D-förskjutningsfälten beräknade av ALDIC-algoritmen genom att rekonstruera referensbilden från den deformerade bilden och jämföra rekonstruktionen med den faktiska referensbilden. I de digitalt transformerade bilderna ökade antalet dåliga regioner och töjningsfel med större tillämpade stammar, särskilt för den kumulativa ALDIC-analysen (figur 2 och kompletterande figur 2). Detta var förväntat eftersom inkrementell teknik omdefinierar referensbilden med varje mellanliggande bild för att minimera förskjutningsskillnaderna mellan bildpar. Antalet dåliga regioner var ännu högre i de faktiska senproverna eftersom senvävnadens struktur och belastning inte var homogen (till skillnad från de digitalt transformerade bilderna). Ändå var det i genomsnitt bara cirka 15% av den rekonstruerade bilden som inte matchade den faktiska referensbilden. Ett prov (experiment 2) hade dock ett stort antal felaktiga regioner (~ 45%). Även om det är oklart varför detta prov inte kunde bearbetas korrekt, var denna analys av den rekonstruerade referensbilden värdefull eftersom den möjliggjorde erkännandet att data från detta prov inte var tillförlitliga. Sammantaget visar dessa experiment att denna open source-algoritm med säkerhet kan användas för att noggrant mäta vävnadsstammar inom senexplantat.
Dessa experiment gav också värdefull information om det mekaniska beteendet hos mus Achilles senor. Specifikt, vid en applicerad vävnadsstam på 12%, var den genomsnittliga längsgående (x-riktning) stammen i vävnadsprovet endast 2%. En del av denna töjningsdämpning berodde på det faktum att vävnadsstammarna i makroskala beräknades utifrån förändringar i vävnadens grepp-till-grepp-längd, vilket sannolikt inkluderade signifikanta töjningskoncentrationer vid greppgränssnittet i den myotendinösa korsningen. Ändå överensstämmer detta med andra studier av mikroskala stammar i senor10,17,18. Dessutom motsvarade 12% stammen cirka 5 MPa belastning, vilket sannolikt är jämförbart med de maximala fysiologiska belastningarna in vivo19. Detta tyder på att celler i mus Achilles senor inte upplever dragspänningar över 2%. Den tvärgående (y-riktningen) stammen var mer variabel över prover, med både positiva och negativa värden. Detta tyder på att senproverna uppvisade positiva och negativa Poissons förhållanden, vilket överensstämmer med tidigare testning av akillessenor20. Som förväntat för enaxlig spänning var skjuvtöjningens storlek i allmänhet låg (<4° i genomsnitt). För alla drag- och skjuvtöjningar var dock standardavvikelsen över den intressanta regionen alltid större än det genomsnittliga töjningsvärdet, vilket visar att det fanns en stor grad av töjningsheterogenitet. Dessutom ökade denna heterogenitet med större applicerade stammar, troligen på grund av vävnadsstrukturens heterogenitet samt det ökade felet inom ALDIC-beräkningarna till följd av de större förskjutnings- och förskjutningsfälten. Detta tyder på att de stammar som upplevs av enskilda senceller är mycket varierande i vävnaden.
Trots den framgångsrika valideringen av ALDIC-algoritmen finns det vissa begränsningar i dess användning för att analysera stammar inom senexplantat. Den primära begränsningen är det faktum att algoritmen bara kan utföra en 2D-analys av ett 3D-objekt. Ett mer rigoröst tillvägagångssätt skulle vara att utföra en fullständig digital volymkorrelation (DVC), som har utförts på digitalt transformerade bilder av senor11. Detta är dock i allmänhet svårt att utföra på faktiska senprover eftersom bilderna innehåller lösbara kärnor till ett djup av endast 100 μm. Detta innebär att provernas inre volym inte har någon textur i de volymetriska bilderna, vilket gör DVC opålitlig. Därför kollapsade bilderna i denna studie till 2D-maximala projektioner, vilket artificiellt tvingar alla kärnor i ett enda bildplan. Även om detta kan ge vissa fel i töjningsanalysen och förhindra mätning av förskjutningar utanför planet, tyder valideringsresultaten på att tekniken fortfarande är korrekt. En ytterligare begränsning är att töjningarna beräknades i slutet av en spänningsavslappningsperiod och inte kunde beräknas under dynamisk cyklisk belastning. Denna fråga var oundviklig eftersom det fanns en begränsad bildtid för att förvärva de volymetriska bilderna som användes för stamanalysen. Trots dessa begränsningar var framgången med analysen relativt robust, med tanke på att tre av de fyra senproverna gav exakta töjningsdata. Därför kommer denna algoritm att vara ett användbart verktyg för forskare som är intresserade av att mäta töjningsfält inom senexplantat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av National Institutes of Health (R21 AR079095) och National Science Foundation (2142627).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-DTAF (5-(4,6-Dichlorotriazinyl) Aminofluorescein), single isomer | ThermoFisher | D16 | |
| Calipers | Mitutoyo | 500-196-30 | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1R HD | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Coning | 6775 | |
| DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) | ThermoFisher | 62554 | |
| MATLAB | MathWorks | R2022b | |
| Tensile Loading Device | N/A | N/A | Tensile loading device described in Peterson et al, 2020. (ref 13) |
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher | 88881001 |
References
- Devkota, A. C. Distributing a fixed amount of cyclic loading to tendon explants over longer periods induces greater cellular and mechanical responses. Journal of Orthopaedic Research. 11 (4), 1609-1612 (2007).
- Sun, H. B., et al. Cycle-dependent matrix remodeling gene expression response in fatigue-loaded rat patellar tendons. Journal of Orthopaedic Research. 28 (10), 1380-1386 (2010).
- Shepherd, J. H., Screen, H. R. C.
- Paschall, L., Pedaprolu, K., Carrozzi, S., Dhawan, A., Szczesny, S. Mechanical stimulation as both the cause and the cure of tendon and ligament injuries. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. , Springer. Cham, Switzerland. 359-386 (2022).
- Andarawis-Puri, N., Ricchetti, E. T., Soslowsky, L. J. Rotator cuff tendon strain correlates with tear propagation. Journal of Biomechanics. 42 (2), 158-163 (2009).
- Cheng, V. W. T., Screen, H. R. C.
- Luyckx, T., et al. Digital image correlation as a tool for three-dimensional strain analysis in human tendon tissue. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 7 (2014).
- Duncan, N. A., Bruehlmann, S. B., Hunter, C. J., Shao, X., Kelly, E. J. In situ cell-matrix mechanics in tendon fascicles and seeded collagen gels: Implications for the multiscale design of biomaterials. Computer Methods in Biomechanics and Biomedical Engineering. 17 (1), 39-47 (2014).
- Arnoczky, S. P., Lavagnino, M., Whallon, J. H., Hoonjan, A. In situ cell nucleus deformation in tendons under tensile load; A morphological analysis using confocal laser microscopy. Journal of Orthopaedic Research. 20 (1), 29-35 (2002).
- Screen, H. R. C., Bader, D. L., Lee, D. A., Shelton, J. C.
- Fung, A. K., Paredes, J. J., Andarawis-Puri, N. Novel image analysis methods for quantification of in situ 3-D tendon cell and matrix strain. Journal of Biomechanics. 67, 184-189 (2018).
- Yang, J., Bhattacharya, K. Augmented Lagrangian digital image correlation. Experimental Mechanics. 59 (2), 187-205 (2019).
- Peterson, B. E., Szczesny, S. E. Dependence of tendon multiscale mechanics on sample gauge length is consistent with discontinuous collagen fibrils. Acta Biomaterialia. 117, 302-309 (2020).
- Humphrey, J. D., O'Rourke, S. L. An Introduction to Biomechanics. , Springer. New York, NY. (2015).
- Reese, S. P., Weiss, J. A. Tendon fascicles exhibit a linear correlation between Poisson's ratio and force during uniaxial stress relaxation. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (3), 34501 (2013).
- Ahmadzadeh, H., Freedman, B. R., Connizzo, B. K., Soslowsky, L. J., Shenoy, V. B. Micromechanical poroelastic finite element and shear-lag models of tendon predict large strain dependent Poisson's ratios and fluid expulsion under tensile loading. Acta Biomaterialia. 22, 83-91 (2015).
- Szczesny, S. E., Elliott, D. M. Interfibrillar shear stress is the loading mechanism of collagen fibrils in tendon. Acta Biomaterialia. 10 (6), 2582-2590 (2014).
- Han, W. M., et al. Macro- to microscale strain transfer in fibrous tissues is heterogeneous and tissue-specific. Biophysical Journal. 105 (3), 807-817 (2013).
- Pedaprolu, K., Szczesny, S. E. A novel, open-source, low-cost bioreactor for load-controlled cyclic loading of tendon explants. Journal of Biomechanical Engineering. 144 (8), 084505 (2022).
- Gatt, R., et al. Negative Poisson's ratios in tendons: An unexpected mechanical response. Acta Biomaterialia. 24, 201-208 (2015).
