Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את שלבי הטיהור ואת המחקרים הבאים של ארבעה β-גלוקנים פטרייתיים שונים כמולקולות אימונומודולטוריות פוטנציאליות המשפרות את התכונות האנטי-גידוליות של תאי מיקרוגליה כנגד תאי גליובלסטומה.
Abstract
אחד האתגרים הגדולים ביותר בפיתוח טיפולים יעילים נגד גליובלסטומה הוא התגברות על הדיכוי החיסוני החזק בתוך המיקרו-סביבה של הגידול. אימונותרפיה התפתחה כאסטרטגיה יעילה להפוך את תגובת מערכת החיסון נגד תאים סרטניים. מקרופאגים ותאי מיקרוגליה הקשורים לגליומה (GAMs) הם הגורמים העיקריים לתרחישים אנטי-דלקתיים כאלה. לכן, שיפור התגובה האנטי-סרטנית ב-GAMs עשוי להוות טיפול קו-אדג'ובנטי פוטנציאלי לטיפול בחולי גליובלסטומה. ברוח זו, מולקולות β-גלוקן פטרייתיות ידועות מזה זמן רב כאפנון חיסוני רב עוצמה. תוארה יכולתם לעורר את הפעילות החיסונית המולדת ולשפר את התגובה הטיפולית. תכונות אפנון אלה מיוחסות בחלקן ליכולתן להיקשר לקולטני זיהוי דפוסים, אשר, באופן מעניין, באים לידי ביטוי רב ב- GAMs. לפיכך, עבודה זו מתמקדת בבידוד, טיהור ושימוש עוקב של β-גלוקנים פטרייתיים כדי לשפר את התגובה הגידולית של מיקרוגליה נגד תאי גליובלסטומה. קווי התאים גליובלסטומה של עכבר (GL261) ומיקרוגליה (BV-2) משמשים לבדיקת התכונות האימונומודולטוריות של ארבעה β-גלוקנים פטרייתיים שונים המופקים מפטריות שנמצאות בשימוש נרחב בתעשיית הביו-פרמצבטיקה הנוכחית: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus ו-Ganoderma lucidum. כדי לבדוק תרכובות אלה, בוצעו בדיקות גירוי משותף כדי למדוד את ההשפעה של תווך מותנה מיקרוגליה מופעל מראש על התפשטות והפעלת אפופטוזיס בתאי גליובלסטומה.
Introduction
למרות כניסתם של הישגים חדשים בתחום הנוירו-אונקולוגיה, תוחלת החיים של חולי גליובלסטומה נותרה דלה. טיפולים סטנדרטיים נגד גידולי מוח מבוססים על מיזוג של ניתוחים, הקרנות וכימותרפיה. עם זאת, בעשור האחרון, אימונותרפיה התפתחה כאסטרטגיה רבת עוצמה לטיפול בסוגים שונים של סרטן1. כך, האפשרות לרתום את התגובה החיסונית של הגוף נגד תאים סרטניים הפכה לאחרונה לעמוד התווך הרביעי של האונקולוגיה.
זה זמן רב ידוע כי אחד האתגרים הגדולים בתחום הוא להתגבר על הדיכוי החיסוני החזק שנמצא בתוך מיקרו-סביבה של הגידול2. בפרט, במקרה של גליובלסטומה, אחת הצורות הנפוצות והאגרסיביות ביותר של סרטן המוח, חשיפת מסלולים מרכזיים המתזמרים תרחישים פרו-גידוליים כאלה ומציאת תרכובות חדשות שיכולות לנטרל את התגובה המדכאת של מערכת החיסון עשויה לסלול את הדרך לטיפולים עתידיים נגד מחלה חשוכת מרפא זו.
למוח יש תאי מערכת חיסון משלו, וסוג התא הרלוונטי ביותר הוא מיקרוגליה. תאים אלה הוכחו כבעלי התנהגות מורכבת למדי על פני מחלות מרכזיות שונות3. במקרה של גידולי מוח ראשוניים (למשל, גליובלסטומה), תאים אלה מוסטים לכיוון פנוטיפ אנטי דלקתי התומך בתאי הגידול כדי ליישב אתפרנכימה 3 במוח. פרסומים רבים שיפרו את התפקיד העיקרי של תאים אלה במהלך התקדמות הגידול. אחת הסיבות העיקריות לכך היא שתאי מיקרוגליה הקשורים לגליומה ומקרופאגים מסתננים (GAMs) מהווים שליש ממסת הגידול הכוללת, מה שמרמז על ההשפעה החד משמעית של מצבי ההפעלה שלהם במהלך התקדמות הגידול במוח 4,5.
ברוח זו, β-גלוקנים פטרייתיים תוארו כמולקולות חזקות המפעילות תגובות חיסוניות יעילות, כולל פגוציטוזה וייצור גורמים מעודדי דלקת, המובילים לסילוק חומרים מזיקים 6,7,8,9,10. β-גלוקנים פטרייתיים נחקרו בדרך כלל באמצעות תמציות מחלקי פטריות שונים. עם זאת, ייחוס של השפעות ספציפיות דורש טיהור שלה כדי למנוע עמימות כדי להיות מסוגל להבין את מנגנון הפעולה של מולקולות כגון סוכני immunomodulatory8.
בעבודה זו, β-גלוקנים מסיסים מטוהרים מגוף הפרי של ארבע פטריות שונות, בשימוש קבוע כאכילים (Pleurotus ostreatus ו- Pleurotus djamor) וכפטריות מרפא (Ganoderma lucidum ו - Hericium erinaceus). בפרט, לארבע פטריות אלה יש שימוש רב בתעשיית המזון והתרופות והן יוצרו במסגרת כלכלה מעגלית ידידותית לסביבה במפעל מסחרי (ראו טבלת חומרים).
על מנת להניח את היסודות לשימוש עתידי של β-גלוקנים פטרייתיים בטיפולים בסרטן המוח, אסטרטגיות טיהור מוגדרות היטב ומחקרים פרה-קליניים המתעמקים באינטראקציה המשוערת שלהם עם תאי מערכת החיסון חיוניים להערכת תפקידם הפוטנציאלי כמתווכים נגד גידולים. עבודה זו מתארת את השלבים הרבים של בידוד וטיהור הדרושים כדי להחזיר את β-גלוקנים מסיסים הכלולים בגופי הפרי של הפטרייה שנבחרה. לאחר טיהור מוצלח, תאי מיקרוגליה מופעלים כדי לשפר את הפנוטיפ הדלקתי שלהם. תאי גליובלסטומה של עכבר (GL261) מצופים בתווך מותנה אחר המותנה במיקרוגליה, שטופל בעבר בתמציות אלה, ולאחר מכן מוערכת השפעתו על התנהגות תאי הגידול. באופן מעניין, מחקרי פיילוט מהמעבדה שלנו (נתונים לא מוצגים) חשפו כיצד תאי מיקרוגליה פרו-דלקתיים עשויים להאט את נדידת תאי הגידול ואת תכונות הפלישה לא רק בתאי גליובלסטומה אלא גם בשורות תאים סרטניים אחרים. עבודה רב-תחומית זו עשויה לספק כלי שימושי לחוקרי אונקולוגיה לבחון תרכובות מבטיחות המסוגלות להגביר את התגובה החיסונית בסוגים רבים ושונים של גידולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ארבע גרסאות הפטריות השונות המתוארות בפרוטוקול זה התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).
1. בידוד של β-גלוקנים פטרייתיים
- מיצוי ובידוד של פוליסכרידים פטרייתיים מסיסים
הערה: פוליסכרידים של פטריות מסיסות (SMPs) התקבלו בהתאם להליך שמוצג באופן סכמטי באיור 1.- שטפו בעדינות גופי פרי טריים של P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus ו-G. lucidum (כ-2,000 גרם/פטריות) במים מזוקקים חמש פעמים.
- יבש את גופי הפרי ב 50 ± 2 מעלות צלזיוס בתנור ייבוש אוויר רגיל עד שמגיעים למשקל קבוע (~ 24 שעות).
- טוחנים את הפטריות המיובשות בטחנת להבים, ומקבלים כ -200 גרם אבקה מכל פטרייה.
- יש להשהות 100 גרם אבקת פטריות (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus ו-G. lucidum) ב-1,000 מ"ל של H2Od. לאחר מכן, autoclave ב 121 ° C במשך 15 דקות, ולבסוף לעזוב בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
- צנטריפוגה את המתלים המתקבלים ב 6,000 x גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C.
- יבש את המשקע המכיל פוליסכרידים פטריות בלתי מסיסים (IMPs) ב 50 ± 2 ° C בתנור ייבוש באוויר במשך 24 שעות.
- השליכו את המשקע ושמרו על הסופרנטנט. רכזים את הסופרנאטנט 10 פעמים במאייד סיבובי.
- יש לזרז את התרכיז המכיל SMPs עם אתנול (ריכוז סופי של 80%) ב-4°C למשך הלילה.
- צנטריפוגה את מתלה האתנול ב 6,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C, לשמור על הגלולה (משקע), ולהשליך את supernatant עם פיפטה.
- שטפו את המשקע שלוש פעמים עם 80% אתנול לפני המסתו ב-H2Od (10% w/v). יש לכוונן את רמת החומציות ל-6.5/7 ואת הטמפרטורה ל-37°C, ולטפל עם 2 U ו-4U של α-עמילאז וגלוקועמילאז, בהתאמה, כדי להמיס α-גלוקנים בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
- לאחר הטיפול ב-α-עמילאז/גלוקועמילאז, יש להתאים את רמת החומציות והטמפרטורה ל-8.0 ו-50 מעלות צלזיוס, בהתאמה, ולטפל באלקלאז (2.5 U/g חלבון) (ראה טבלת חומרים) כדי להמיס את החלבונים.
הערה: טיפול אנזימטי רציף זה מסיר את רוב α-גלוקנים והחלבונים המזרזים יחד עם β-גלוקנים במשקעי האתנול. - לאחר הידרוליזה, צנטריפוגה את ההידרוליזה ב 6,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C, ואת supernatant נקי להתרכז חמש פעמים במאייד סיבובי. לזרז שוב עם 80% אתנול.
- יש להמיס את המשקע שנוצר ב- H2Od ולבצע דיאליזה במים מזוקקים למשך 24 שעות באמצעות קרומי צינורות תאית (12,000 ממברנות חתוכות Da ; ראה טבלת חומרים) כדי להסיר מולקולות בעלות משקל מולקולרי נמוך. שחזרו את החלק המסיס במים וייבשו אותו בהקפאה כדי לייצר β-גלוקנים מסיסים (SβGs).
- מדידת סוכר וחלבון
- למדוד את תכולת הסוכר הכוללת של כל חלק על ידי שיטת חומצה פנול-גופרתית, באמצעות גלוקוז כתקן8.
הערה: ניתן לכמת את תכולת הגלוקן β גם באמצעות ערכת הבדיקה β-גלוקן (פטריות ושמרים; ראה טבלת חומרים), המבוססת על הידרוליזה אנזימטית ופעילות האוקסידורדוקטאזים: כלומר exo-1,3-β-glucanase, גלוקוז אוקסידאז, β-glucosidase, ו peroxidase, עם היווצרות הבאים של quinoneimine. בצע את הוראות היצרן, עם שינויים קלים. - השתמש ב- 18 MH2 SO 4 במקום ב- 12 MH2SO4.
- להעריך את התוכן של סך גלוקנים ו α גלוקנים בנפרד.
- מדוד את ערכי β-גלוקן המתקבלים כהפרש בין ערכי הגלוקן הכולל לערך α-גלוקן (משולש) בעקבות פרוטוקול Kjeldahl. במקרים מסוימים, ניתן לקבוע את תכולת החלבון בשיטת לורי, תוך שימוש באלבומין כדי להתוות את עקומת הכיול11,12.
- למדוד את תכולת הסוכר הכוללת של כל חלק על ידי שיטת חומצה פנול-גופרתית, באמצעות גלוקוז כתקן8.
- ניתוח ספקטרוסקופיית ספיגה אולטרה סגולה
- השיגו את ספקטרום האולטרה-סגול (UV) SβG באמצעות ספקטרופוטומטר נראה UV (ראו טבלת חומרים) על-ידי סריקת הדגימות באזור 200-400 ננומטר (איור 2).
- הכינו 1.0 מ"ג/מ"ל מכל SβG ב-H2Od, העבירו את התמיסה לקובט קוורץ וסרקו בטמפרטורת החדר.
- ניתוח התפלגות משקל מולקולרית
- להעריך את ההומוגניות של SβGs ואת המשקל המולקולרי של פולימרים לפי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) בעלת ביצועים גבוהים (ראה טבלת חומרים) המצוידת בגלאי אינדקס שבירה ובעמוד סינון ג'ל ליניארי אולטרה-הידרוג'ל (300 מ"מ x 7.8 מ"מ; איור 3).
- בצע את הבדיקה בטמפרטורה של 40°C תוך שימוש במים נטולי יונים, כמו eluent בקצב זרימה של 0.5 מ"ל/min-1 ודקסטרנים (110, 80 ו-50 kDa) כתקנים (ראה טבלת חומרים). לאסוף חלק 5 מ"ל.
- ניתוח אינפרא אדום התמרת פורייה (FTIR)
- הקלט את ספקטרום האינפרא אדום (איור 4) על ספקטרומטר FTIR בטווח של 4000-500 סמ"ק-1. יש לערבב בעבר את הדגימות עם KBr ליצירת יריעות (הליך FTIR סטנדרטי; ראה הוראות יצרן וטבלת חומרים).
- ניתוח הרכב מולקולרי
- להעריך את ההרכבים המולקולריים של SβGs על ידי כרומטוגרפיה דקיקה בעלת ביצועים גבוהים (HPTLC) וכן כרומטוגרפיית גז המצומדת לספקטרומטריית מסות (GC-MS), בהתאם לנהלים סטנדרטיים12.
2. מחקר חוץ גופי של גירוי מיקרוגליה המושרה על ידי β-גלוקן
- תרבית תאים של גליובלסטומה עכברית ותאי מיקרוגליה בשקופיות תא 8 בארות
הערה: פרוטוקול זה ספציפי עבור קווי תאים GL261 (גליובלסטומה) ו-BV2 (מיקרוגליה). עם זאת, עם שינויים קלים, צעדים אלה יכולים לשמש באופן פוטנציאלי לחקר סרטן אחרים וקווי תאים חיסוניים.- הכינו את המדיום השלם של Dulbecco (DMEM) עם L-גלוטמין, 4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז, וללא פירובט. הוסף 10% של סרום בקר עוברי (FBS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (ראה טבלה של חומרים). מחממים מראש את החומר באמבט מים ב 37 ° C במשך 15 דקות.
- הפשירו את ה-BV2 וה-GL261 הקפואים לתוך אמבט מים (37°C) למשך 2 דקות, ורגע לפני שהם מפשירים לחלוטין, נשאו אותם לתוך מכסה מנוע של זרימה למינרית והכניסו את התאים לשתי צלוחיות T25 סטריליות שונות (אחת לכל קו תאים).
- לדגור על צלוחיות T25 ב 37 ° C, 5% CO2 עד התרבות הוא התמזגות.
הערה: בהתאם לתנאי ההקפאה והזמן בהקפאה, הזמן עד למפגש עשוי להשתנות. קווי תאים אלה דורשים בדרך כלל בין 3 ל -5 ימים כדי להגיע למפגש בבקבוק T75. - לאחר שתרבית התאים BV2 הופכת למשתלבת, העבר אותה לשקופיות תא 8 בארות 0.6 x 106 תאים / באר. שמור את שקופיות התא 8 בארות באינקובטור במשך 24 שעות.
- לאחר שתאי המיקרוגליה מצופים לתוך שקופיות תא 8 בארות, חזור על אותו פרוטוקול עם תאי GL261.
- הפעלת מיקרוגליה עם β-גלוקנים
- צפו את תאי BV2 בארבעה β-גלוקנים שונים (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum ו-H. erinaceus) בריכוז של 0.2 מ"ג/מ"ל למשך 72 שעות. תנאי ניסוי אחד חייב להישאר לא מטופל (מדיום נורמלי), מתפקד כקבוצת ביקורת.
- אוספים את הסופרנאטנט עם פיפטה לאחר 72 שעות ומעבירים את הנפח הנותר דרך מסנן מזרק 0.20 מיקרומטר. לאחר מכן, להקפיא את supernatant ב -80 ° C לפחות 24 שעות.
- טיפול ב-GL261 בתווך מותנה במיקרוגליה מופעל מראש
- ברגע שה-GL261 מתלכד ב-80% בתוך המגלשות הקאמריות בעלות 8 הקידוחים, יש להוסיף מדיום מיקרוגליאלי המטופל בגלוקן β (שלב 2.2.2) בריכוז נפח סופי של 25% למשך 72 שעות (נפח כולל: 250 מיקרוליטר/באר).
- מוציאים את המדיום לאחר 72 שעות דגירה ומשליכים אותו.
- שטפו את התאים במי מלח חוצצי פוספט (PBS; pH 7.4, 0.1 M) שלוש פעמים במשך 5 דקות.
- תקן את התאים על ידי הוספת 200 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) ב 4 ° C למשך 15 דקות.
הערה: בהתאם לנוגדנים השונים שעשויים לשמש עבור immunofluorescence, שיטות קיבוע עשוי להיות שונה טיפוסי 4% PFA. קיבוע על בסיס אלכוהול עשוי להיות יעיל יותר בשימור אפיטופים מסוימים.
- מחקר אימונופלואורסנציה
- שטפו את הדגימות עם PBS עם טריטון X (PBST; 0.01%) במשך 10 דקות שלוש פעמים.
- הסר את PBST והוסף מאגר חוסם אלבומין בסרום בקר (BSA) 10% ב- PBST (טבלה 1) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את המאגר החוסם והוסף 200 μL לכל באר של PBS המכילה את תערובת הנוגדנים הראשונית (1:500 נוגדן חד שבטי Ki-67 חולדה ונוגדן 1:500 ארנב שסע קספאז-3; ראה טבלת חומרים). לדגור לילה ב 4 °C (75 °F).
- לאחר 24 שעות של דגירה ב 4 °C (75 °F), להשאיר את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
- שטפו את הבארות שלוש פעמים במשך 10 דקות עם PBS על שייקר (מהירות נמוכה).
- הסר את PBS והחלף ב 200 μL לכל באר של PBS המכיל תערובת של נוגדנים משניים (1:200 חמור נגד חולדה IgG (H + L) נוגדן משני צולב מאוד, Alexa Fluor 488 ו 1:200 חמור נגד ארנב IgG (H + L) נוגדן משני צולב מאוד, Alexa Fluor 647; ראה טבלה של חומרים) במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
- שטפו את הדגימות עם PBS במשך 10 דקות על שייקר רב תכליתי.
- הסר את PBS והוסף 200 μL לכל באר של 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) מדולל PBS (1:5,000) למשך 1 דקות.
- הסר DAPI (ראה טבלת חומרים) ושטוף את התאים במשך 5 דקות ב- PBS.
- הסר את מסגרת הבאר והוסף 50 μL של PBS:glycerol (1: 1) על כל באר ולכסות עם כיסוי.
- אטמו את המגלשות בלק.
- קבל תמונות במהירות של 20x באמצעות מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי (ראה טבלת חומרים).
3. כימות וניתוח של התרבות תאי גידול ואפופטוזיס
הערה: על מנת למדוד את ההשפעה הפוטנציאלית של β-גלוקנים שונים על התפשטות תאי הגידול ואפופטוזיס, נעשה שימוש בסקריפט פנימי בתוכנת ImageJ כדי לכמת את מספר הפיקסלים החיוביים של Ki67 (התפשטות) ו-cCasp3 (אפופטוזיס)13.
- פתח את ImageJ. לחץ על כפתור התוספים . לחץ על Coloc2, תוסף שהותקן בעבר בתיקיית התוסף, ולבסוף בחר את התמונה לניתוח11.
הערה: תוסף זה היה זמין בעקבות קשר קודם עם ד"ר ואסיליקי אקונומופולוס (veconom@uwo.ca). במקום הסקריפט, גם לתוכנת ImageJ וגם לתוכנת פיג'י יש כלים שונים לניתוח לוקליזציה (ראו טבלת חומרים), עם מאפיינים דומים. - הגדר ערכי סף בהתאם לתנאי הבקרה (לא מטופלים, DMEM בלבד). לחץ על בסדר לחצן.
הערה: כדי למנוע פערי רקע ועוצמה, יש לצלם את כל התמונות באותם תנאים. רצוי לבצע הדמיה באותו היום, ופרמטרים של מיקרוסקופ ללא שינוי על פני תמונות. - ודא שהתמונות המתקבלות של הפיקסלים המותאמים לשפות אחרות וחלון סיכום המספק את אחוז או מספר הפיקסלים הגולמי מעל הסף מוקפצים. לנרמל את התוצאות ביחס לתנאי הבקרה (לא מטופלים).
הערה: כל הנתונים ניתנים כממוצע ± SEM. הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות תוכנת גרפים וניתוח (ראה טבלת חומרים). נעשה שימוש ב-ANOVA חד-כיווני עם מבחן ההשוואה המרובה של Tukey. שגיאות מיוצגות כשגיאת תקן של הממוצע (s.e.m.) (*p < 0.05, **p < 0.01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טיהור מוצלח של β-גלוקנים
המסה של MP, SMPs ו-SβGs המתקבלת מגופי פרי של P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum ו-H. erinaceus לאחר תהליך המיצוי והטיהור מסוכמת בטבלה 1. ההרכב הבסיסי (סך כל הפחמימות, β-גלוקנים וחלבון) של MP, SMPs ו-SβGs המתקבלים מהפטריות מתואר בטבלה 2. תוצאות אלה מראות כיצד הפרוטוקול איפשר אחזור של כמות גדולה של תכולת חלבון ב-SMPs. עם זאת, הטיפול האנזימטי ב-α-עמילאז/גלוקועמילאז ופרוטאז הפחית את כמות החלבון והעלה את ריכוז ה-β-גלוקן.
ספקטרום UV של SβGs שונים לא הראה שיאי ספיגת UV ב-260 ו-280 ננומטר (איור 2A), מה שמצביע על כך של-SβGs חסרות חומצות גרעין (260 ננומטר) וחלבונים (280 ננומטר). יתר על כן, ההומוגניות של SβGs נבדקה בעקבות ספקטרואלקטרוכימיה של בליעה נראית UV (SEC). הכרומטוגרמות (איור 3) הראו הומוגניות טובה, עם שיא חד ויחיד עיקרי של 8.20, 10.5, 10,9 ו-11.3 דקות עבור H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus ו-P. djamor, בהתאמה. נתונים אלה מצביעים על כך שהשבר עקבי עם הומופולימרים. יתר על כן, המשקל הממוצע של Mw חושב בסביבות 120.8, 92.8, 80.7 ו- 75.9 kDa עבור H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus ו- P. djamor, בהתאמה, על פי משוואת עקומת הכיול (y = -0.0655x + 2.6194; R2 = 0.9951).
ספקטרום FTIR מדד תנודות מולקולריות שהתאימו לקשרים רב-סוכריים קוולנטיים (איור 4). הספקטרום הציג קבוצת הידרוקסיל רחבה ואינטנסיבית בסביבות 3,435 ס"מ-1. הוא גם הראה שיא מתיחה חלש של C-H בסביבות 2,922 ס"מ-1, המקביל לרב-סוכרים14. יתר על כן, ניתן להקצות את הספיגה בסביבות 1,641 ס"מ-1 לאמיד I15, הקשור לתנודות ההתארכות של קבוצות C=O ו-CN. האות בסביבות 1,154 ס"מ-1 עשוי לנבוע ממתיחה אסימטרית של C-O-C של הקישור הגליקוזידי16. לבסוף, הרצועה בסביבות 1,072 ס"מ-1 הצביעה על מתיחה C-O של β-גלוקנים16. הספיגה החלשה ליד 893 סמ"ק-1 עשויה לנבוע מתנודת השבירה הא-סימטרית של β-פירנוז, המראה את תצורת β של יחידות סוכר17. בסך הכל, נמצא כי SβGs מורכב בעיקר מפחמימות מצומדות עם כמות מינימלית של חלבון.
הפרופיל החד-סוכרי של SβGs נחקר עוד יותר על ידי HPTLC ו-GC-MS. נוכחות של כמות גדולה של D-גלוקוז עם כמויות קטנות יותר של D-גלקטוז ו- D-mannose ועקבות של D-xylose, D-rhamnose, D-fucose, ו- L-arabinose אושר. טבלה 3 מסכמת את התוצאות שהתקבלו עבור SβGs של H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus ו- P. djamor.
תווך מותנה מיקרוגליה, מופעל מראש עם β-גלוקן, המושרה אפופטוזיס בתאים סרטניים
לאחר ש-β-גלוקנים מהפטריות שנבחרו בודדו בהצלחה ואופיינו במלואם, הם נוספו לתרבית תאי מיקרוגליה (BV2). 72 שעות לאחר הוספת התווך המותנה במיקרוגליה לתאי GL261 (איור 5), הביטוי של שני סמנים מרכזיים להתרבות (Ki67) ואפופטוזיס (קספזה שסוע 3 [cCasp3]) נמדד על-ידי אימונופלואורסצנציה. באמצעות סקריפט פנימי בתוכנת ImageJ, כומתה מספר הפיקסלים החיוביים עבור כל ערוץ פלואורסצנטי, וכך נותחה הדרך שבה ההשפעה הפוטנציאלית של הפעלת מיקרוגליאה הנגרמת על ידי β גלוקן עשויה להשפיע על התנהגות תאי הגידול. באמצעות דגימות בקרה כסף לעוצמה של כל פלואורופור, הסקריפט סיפק את מספר הפיקסלים, וכך ציין את הביטוי עבור כל סמן לאחר תנאי הניסוי השונים (איור 6).
באופן מעניין, GL261 לא סבל מהבדל משמעותי בנוגע להתפשטות הגידול לאחר שנחשף לאמצעי מיקרוגליה שונים (איור 7). עם זאת, P. djamor (B) ו- H. erinaceus (C) הראו אינדוקציה חזקה (בערך פי שישה ופי תשעה, בהתאמה) של cCasp3.
איור 1: פרוטוקול בידוד. סכמטי של הפרוטוקול לבידוד וטיהור הכנת SβG מ P. streatus, P. djamor, H. erinaceus ו - G. lucidum. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ספקטרום UV של β-גלוקנים. ספקטרום UV באזור 200-400 ננומטר של (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor ו-(D) H. erinaceus. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: כרומטוגרמות אי-הכללת גודל. כרומטוגרמות אי הכללת גודל של (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor, ו- (D) H. erinaceus. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ספקטרום FTIR. ספקטרום אינפרא-אדום התמרת פורייה (FTIR) של (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor ו-(D) H. erinaceus. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: סכמטיות של מבחני הגירוי המשותף. בדיקת גירוי משותף שבה תאי מיקרוגליה בעכבר (BV2) צופו במשך 72 שעות ב-β-גלוקנים. לאחר שימור וסינון בהקפאה, הסופרנאטנט נאסף והועבר לתרבית תאים GL261 (25%) למשך 72 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: תמונות התפשטות ואפופטוזיס. תמונות אימונופלואורסנציה המציגות לוקליזציה משולשת של GL261 עם DAPI (כחול), Ki67 (ירוק) ו-cCasp3 (אדום). סקריפט 'Prob Coloc' (תמונות תחתונות) איפשר לכמת את מספר הפיקסלים החיוביים מכל סמן ולבצע קולוקליזציה ביניהם. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תרשים 7: כימות שיעורי התרבות ואפופטוזיס. ערכים מנורמלים ביחס לתנאי הבקרה (DMEM) של ביטוי Ki67 (משמאל) ו- cCasp3 (מימין) בתאי GL261 לאחר תערוכת המדיום המותנה במיקרוגליה. (א) Pleurotus ostreatus, (B) Pleurotus djamor, (C) Hericium erinaceus y, (D) Ganoderma lucidum. שגיאות מיוצגות כ- s.e.m. (*p < 0.05, **p < 0.01). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| מגה (ז) | SMPs (g) | SβGs (גרם) | |
| פ. אוסטריטוס | 201.3 ± 2.2 | 14.4 ± 0.9 (7.1%) | 5.3 ± 0.2 (2.6%) |
| פ. דג'מור | 200.6 ± 1.9 | 13.5 ± 0.6 (6.7%) | 4.9 ± 0.3 (2.4%) |
| ג. לוסידום | 201.8 ± 1.6 | 14.7 ± 1.2 (7.3%) | 5.5 ± 0.2 (2.7%) |
| H. erinaceus | 204.2 ± 1.2 | 15.4 ± 0.8 (7.5%) | 5.7 ± 0.2 (2.8%) |
טבלה 1: טבלת תוכן גלוקן. מאזן מסה להשגת MP, SMPs ו-SβGs מגופי פרי של P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum ו-H. erinaceus.
| מגה | SMPs | SβGs | ||
| CHt (%) | 107.3 ± 1.9 | 86.6 ± 2.3 | 90.7 ± 1.2 | |
| פ. אוסטריטוס | β-גלוקן (%) | 36.5 ± 1.4 | 51.4 ± 2.4 | 83.7 ± 2.3 |
| חלבון (%) | 34.5±0.9 | 19.6 ± 0.8* | 0.4 ± 0.1* | |
| CHt (%) | 68.9 ± 2.1 | 98.8 ± 3.1 | 153.1 ± 1.1 | |
| פ. דג'מור | β-גלוקן (%) | 39.1 ± 2.8 | 39.6 ± 3.5 | 91.3 ± 3.4 |
| חלבון (%) | 19.1 ± 1.0 | 35.9 ± 1.1* | 0.9 ± 0.2* | |
| ג. לוסידום | CHt (%) | 106.9 ± 1.8 | 51.4 ± 2.9 | 150.7 ± 0.9 |
| β-גלוקן (%) | 36.2 ± 1.9 | 40.1 ± 3.1 | 92.0 ± 2.6 | |
| חלבון (%) | 30.4 ± 0.8 | 31.4 ± 0.6* | 1.5 ± 0.4* | |
| H. erinaceus | CHt (%) | 107.5 ± 1.2 | 94.8 ± 1.9 | 153.7 ± 1.4 |
| β-גלוקן (%) | 38.5 ± 1.6 | 57.8 ± 2.1 | 91.3 ± 2.8 | |
| חלבון (%) | 28.3 ± 1.3 | 36.7 ± 1.8* | 1.3 ± 0.2* |
טבלה 2: סה"כ פחמימות. משקל יבש (g) תכולת סך הפחמימות (CHt), β-גלוקן וחלבון של MP, SMPs ו-SβGs. תכולת החלבון (MP) כומתה בשיטת Kjeldah12. (*, חלבונים שכומתו בשיטת לורי9).
| D-גלוק (%) | די-מאן (%) | די-גאלה (%) | די-פוקו (%) | די-קסילו (%) | די-ראם (%) | ל-ערב (%) | |
| H. erinaceus | 91.6 ± 0.6 | 6.1 ± 0.1 | 2.1 ± 0.2 | 0.5 ± 0.2 | 0.8 ± 0.2 | 0.3 ± 0.1 | נ.ד. |
| ג. לוסידום | 151.3 ± 0.8 | 2.6 ± 0.2 | 3.1 ± 0.2 | 0.3 ± 0.1 | 1.4 ± 0.2 | נ.ד. | 0.4 ± 0.1 |
| פ. אוסטריטוס | 153.7 ± 0.5 | 4.4 ± 0.1 | 0.8 ± 0.1 | 0.4 ± 0.1 | נ.ד. | נ.ד. | נ.ד. |
| פ. דג'מור | 153.9 ± 0.7 | 1.7 ± 0.2 | 1.1 ± 0.1 | 0.3 ± 0.1 | נ.ד. | נ.ד. | נ.ד. |
טבלה 3: אפיון חד-סוכרים. פרופיל חד-סוכרי של SβGs של P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum ו-H. erinaceus (n.d., חלק מהחד-סוכרים לא היו ניתנים לגילוי).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבודה זו מתארת את השימוש בטכניקות מבוססות היטב כדי לבודד, לטהר ולאפיין בהצלחה את התוכן של SβGs מארבע פטריות שונות. התוצאות הראו כיצד לאחר מיצוי מים חמים של SMPs, שהתקבלו מ- P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum ו- H. erinaceus, ולאחר מכן טיפול הידרוליטי עם α-עמילאז, גלוקוזידאז ופרוטאז, התוכן של α-גלוקן וחלבון הופחת, ובכך העשיר באופן משמעותי את כמות SβG טהור.
למרות זאת, ראינו שרוב ה-β-גלוקנים הפטרייתיים היו בלתי מסיסים במים במהלך תהליך הטיהור. העניין העיקרי של המחקר היה SβGs, בשל התכונות הרפואיות / פרמצבטיות שלהם10,18. יתר על כן, הודות לעיבוד הידרוליטי, משקעי אתנול ודיאליזה, פחמימות, פפטידים, אוליגופפטידים וחומצות אמינו מסיסים בעלי משקל מולקולרי נמוך הוסרו בהצלחה מ-SMPs, והראו יעילות דומה לעבודות קודמות אחרות שהשתמשו בסוג אחר של פטריות אך בתהליכים דומים19,20.
כדי לבדוק את טוהר ה-SβGs, ספקטרום ה-UV של ה-SβGs השונים נחקר על ידי ספקטרופוטומטריית UV, וסרקו את הדגימות באזור 200-400 ננומטר. לא נצפו שיאי ספיגת UV ב-260 ו-280 ננומטר, מה שמצביע על כך של-SβGs לא היו חומצות גרעין (260 ננומטר) ולא חלבונים (280 ננומטר), מה שמראה שוב ש-β-גלוקנים היוו בעיקר את ה-SβGs. למרות שספקטרום UV באזור של 200-400 ננומטר הראה היעדר כל פיק מוגדר/חד ב 280 ננומטר, עדיין ניתן היה להבחין בשיא קטן. זה יכול להיות מוסבר על ידי נוכחות של כמות קטנה של חלבונים הקשורים פוליסכריד, מסכים עם התוצאות המוצגות בטבלה 2. עם זאת, מעניין לשקול כי כמות זניחה כזו של סוכרים יכולה להיות מוסברת גם על ידי גישה מאוחרת לחלבונים הנותרים, אשר עשויים להיות מוגנים על ידי גלוקנים או על ידי השפעות סטריות המונעות פירוק מוחלט של חלבונים הקשורים גלוקן. חשוב לציין, ההומוגניות של SβGs נבדקה עוד יותר על ידי SEC, טכניקה אנליטית רבת עוצמה המשמשת לטיהור מולקולות מומסות לפי גודל, שאישרה את תוצאות הפרוטוקול.
בנוסף, ספקטרום FTIR שימש למדידת תנודות מולקולריות המתאימות לקשרים רב-סוכריים קוולנטיים. כפי שתואר קודם לכן, ספקטרום דומה התקבל עבור כל ארבע הפטריות. תכונת הספקטרום הציגה נוכחות של רב-סוכרים14, אמיד I 15 ו-β-גלוקנים16. הספיגה החלשה ליד 893 ס"מ-1 הצביעה על תצורת β של יחידות סוכר17. בסך הכל, נמצא כי SβGs נוצר בעיקר על ידי פחמימות מצומדות עם חלבון מינימלי. לגבי העניין בשימוש ב- SβGs כמולקולות אימונומודולטוריות, ראוי להדגיש כי קומפלקסים של חלבון רב-סוכר מצוינים לעתים קרובות בזכות היתרונות האימונומודולטוריים שלהם21.
לבסוף, הפרופיל החד-סוכרי של SβGs נחקר על ידי HPTLC ו-GC-MS. הנוכחות של כמות גדולה של D-גלוקוז עם כמויות קטנות יותר של D-גלקטוז ו- D-מנוז ועקבות של D-xylose, D-rhamnose, ו- D-fucose בהחלט מרמז כי המרכיב השולט ב- SβGs הוא β-גלוקן. עם זאת, חשוב להבהיר כי מערכת הטיהור שלנו נובעת מאופטימיזציה של הליכים קלאסיים שונים. כיום אנו עובדים על שיפור מספר שלבים, המתמקדים בעיקר בטכניקות כרומטוגרפיה (אי הכללת גודל וכרומטוגרפיה של החלפת יונים).
באשר למטרה העיקרית של עבודה זו, שהייתה לבחון את ההשפעה של β-גלוקנים על תאי מערכת החיסון, לאחר שארבעת הסוגים השונים של β-גלוקנים טוהרו בהצלחה, נבדקו ההשפעות הפוטנציאליות שלהם על הפעלת מיקרוגליה. Immunofluorescence שימש נגד שני סמנים תקן זהב עבור התפשטות אפופטוזיס22,23.
למרות שלא היו הבדלים סטטיסטיים בשיעורי התפשטות הגידול, P. ostreatus (A) ו- H. erinaceus (C) הצליחו להוריד את ביטוי Ki67 בשיעור של עד 50%. חוסר המשמעות נובע ככל הנראה מהשונות הגבוהה במחקר לגבי G. lucidum. יתר על כן, השראת אפופטוזיס בתאים סרטניים היא גישה טיפולית מעניינת למדי, ו- P. djamor (B) ו- H. erinaceus (C) הראו השראה משמעותית של רמות cCasp3, מה שמרמז על הפעלת תוכנית המוות התאי. כל התוצאות הללו הן בהתאם למחקרים קודמים שהראו את ההשפעה האנטי גידולית של פטריות אלה בסוגים אחרים של גידולים24,25. הניסויים בוצעו באופן כפול, תוך שמירה על אותם תנאים ובהובלת אותם חוקרים. ניתוח מבוסס תוכנה של התוצאות ממחקרי האימונופלואורסנציה תומך בגישה בלתי משוחדת ומשפר את טווח ההגעה הפוטנציאלי של מחקר זה.
באופן כללי, למחקרים אלה יש אתגר מרכזי בנוגע לשימוש ב β-גלוקנים, שהוא טוהר התרכובות. חובה להמשיך בסטנדרטים הגבוהים ביותר על מנת לאשר כי ההשפעות שנצפו, לאחר השימוש בהן במחקרים אימונולוגיים, מתעוררות באופן בלעדי על ידי הפחמימות, ולא בגלל חלבונים או מבנים אחרים שעשויים להישאר מחוברים אליהם אם הטיהור אינו מבוצע כראוי. צעד נוסף שניתן לשקול במחקרים עתידיים הוא שימוש בטכניקות כרומטוגרפיה (למשל, חילופי יונים או אי הכללת גודל).
המסקנה הכוללת לאחר המחקרים מציבה את H. erinaceus כמועמד המוביל כאופציה אימונותרפית פוטנציאלית לטיפול בגליובלסטומה, בשל יכולתו להפחית את התפשטות הגידול (~ 50%) ולגרום להפעלה חזקה של תוכנית המוות התאית בתאי גליובלסטומה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין אינטרסים מתחרים להצהיר.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לד"ר ואסיליקי אקונומופולוס על התסריט הפנימי שלה למדידת אות המילוי ב-ImageJ. ברצוננו גם להודות ל-CITIUS (אוניברסיטת סביליה) ולכל אנשיהם על תמיכתם במהלך ההפגנה. עבודה זו נתמכה על ידי הפדרציה הספרדית I + D + i-USE, US-1264152 מאוניברסיטת סביליה, ואת Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
| Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
| Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
| Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
| Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4 | |||
| HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
| Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
| Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
| Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
| Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
| Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
| Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
| Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
| β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
| β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |
References
- Aldape, K., et al. Challenges to curing primary brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).
- Himes, B. T., et al. Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications. Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).
- Ma, J., Chen, C. C., Li, M.
- Sevenich, L. Turning "cold" into "hot" tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers. Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).
- Niesel, K., et al. The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis. EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).
- McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses. Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).
- Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. Effects of medicinal fungi-derived β-glucan on tumor progression. Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).
- Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells. Journal of Hematology & Oncology. 2, 25 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Klaus, A., et al. Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune. Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).
- Soto, M. S., et al. STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction. Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).
- Chromý, V., Vinklárková, B., Šprongl, L., Bittová, M. The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).
- Waterborg, J. H., Matthews, H. R. The Lowry method for protein quantitation. Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).
- Zhang, L., et al. Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms. International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).
- Barbosa, J. S., et al. Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2. Food Chemistry. 330, 127173 (2020).
- Ma, Y. H., et al. Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).
- Nie, L., et al. Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro. Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).
- Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health. Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).
- Klaus, A., et al. The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants. International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).
- Kozarski, M., et al. Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification. Food Research International. 64, 53-64 (2014).
- Ayimbila, F., Keawsompong, S. Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus. 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).
- de Azambuja, E., et al. Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients. British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).
- Holubec, H., et al. Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).
- Borges, G. M., et al. Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180. Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).
- Sohretoglu, D., Huang, S. Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).
