Summary
Настоящий протокол описывает этапы очистки и последующие исследования четырех различных грибковых β-глюканов в качестве потенциальных иммуномодулирующих молекул, которые усиливают противоопухолевые свойства микроглии против клеток глиобластомы.
Abstract
Одной из самых больших проблем в разработке эффективных методов лечения глиобластомы является преодоление сильного подавления иммунитета в микроокружении опухоли. Иммунотерапия стала эффективной стратегией, позволяющей обратить реакцию иммунной системы против опухолевых клеток. Глиома-ассоциированные макрофаги и микроглия (ГАМ) являются основными факторами таких противовоспалительных сценариев. Таким образом, усиление противоракового ответа при ГАМ может представлять собой потенциальную коадъювантную терапию для лечения пациентов с глиобластомой. В этом ключе грибковые молекулы β-глюкана давно известны как мощные иммуномодуляторы. Описана их способность стимулировать врожденную иммунную активность и улучшать реакцию на лечение. Эти модулирующие особенности частично объясняются их способностью связываться с рецепторами распознавания образов, которые, что интересно, в значительной степени экспрессируются в GAM. Таким образом, данная работа сосредоточена на выделении, очистке и последующем использовании грибковых β-глюканов для усиления опухолевого ответа микроглии против клеток глиобластомы. Клеточные линии глиобластомы мыши (GL261) и микроглии (BV-2) используются для проверки иммуномодулирующих свойств четырех различных грибковых β-глюканов, извлеченных из грибов, широко используемых в современной биофармацевтической промышленности: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus и Ganoderma lucidum. Для тестирования этих соединений были проведены анализы совместной стимуляции для измерения влияния предварительно активированной среды, кондиционированной микроглией, на пролиферацию и активацию апоптоза в клетках глиобластомы.
Introduction
Несмотря на появление новых достижений в области нейроонкологии, продолжительность жизни пациентов с глиобластомой остается мизерной. Золотой стандарт лечения опухолей головного мозга основан на сочетании хирургии, лучевой терапии и химиотерапии. Однако в последнее десятилетие иммунотерапия стала мощной стратегией лечения различных видов рака1. Таким образом, возможность использования иммунного ответа организма против опухолевых клеток в последнее время стала четвертым столпом онкологии.
Давно известно, что одной из самых больших проблем в этой области является преодоление сильной иммуносупрессии, обнаруженной в микроокружении опухоли2. В частности, в случае глиобластомы, одной из наиболее распространенных и агрессивных форм рака мозга, раскрытие ключевых путей, которые организуют такие проопухолевые сценарии, и поиск новых соединений, которые могли бы противодействовать угнетающей реакции иммунной системы, может проложить путь для будущих методов лечения этого неизлечимого заболевания.
Мозг обладает собственными клетками иммунной системы, и наиболее подходящим типом клеток являются микроглии. Было доказано, что эти клетки имеют довольно сложное поведение при различных центральных заболеваниях3. В случае первичных опухолей головного мозга (например, глиобластомы) эти клетки смещаются в сторону противовоспалительного фенотипа, который поддерживает опухолевые клетки для колонизации паренхимы головного мозга3. Многочисленные публикации усиливают важную роль этих клеток во время прогрессирования опухоли. Одной из основных причин этого является то, что микроглия, связанная с глиомой, и инфильтрированные макрофаги (ГАМ) составляют одну треть от общей массы опухоли, что позволяет предположить однозначное влияние их активационных состояний при прогрессировании опухоли головного мозга 4,5.
В этом ключе грибковые β-глюканы были описаны как мощные молекулы, вызывающие эффективные иммунные реакции, включая фагоцитоз и выработку провоспалительных факторов, что приводит к элиминации пагубных агентов 6,7,8,9,10. Грибковые β-глюканы, как правило, изучались с использованием экстрактов из различных частей грибов. Однако атрибуция специфических эффектов требует его очистки, чтобы избежать двусмысленностей и иметь возможность понять механизм действия таких молекул, как иммуномодулирующие агенты8.
В этой работе растворимые β-глюканы очищаются от плодового тела четырех различных грибов, регулярно используемых в качестве съедобных (Pleurotus ostreatus и Pleurotus djamor) и лекарственных (Ganoderma lucidum и Hericium erinaceus) грибов. В частности, эти четыре гриба широко используются в пищевой и фармацевтической промышленности и были произведены в рамках экологически чистой экономики замкнутого цикла на коммерческом предприятии (см. Таблицу материалов).
Чтобы заложить основу для будущего использования грибковых β-глюканов в терапии рака мозга, для оценки их потенциальной роли в качестве противоопухолевых медиаторов необходимы четко определенные стратегии очистки и доклинические исследования, посвященные их предполагаемому взаимодействию с клетками иммунной системы. В этой работе описываются многочисленные этапы выделения и очистки, необходимые для извлечения растворимых β-глюканов, содержащихся в плодовых телах выбранного гриба. После успешной очистки клетки микроглии активируются для усиления их воспалительного фенотипа. Клетки глиобластомы мыши (GL261) покрывают другой средой, кондиционированной микроглией, предварительно обработанной этими экстрактами, а затем оценивают ее влияние на поведение опухолевых клеток. Интересно, что пилотные исследования, проведенные в нашей лаборатории (данные не показаны), показали, как провоспалительная микроглия может замедлять миграцию опухолевых клеток и свойства инвазии не только в клетках глиобластомы, но и в других линиях раковых клеток. Эта междисциплинарная работа может стать полезным инструментом для исследователей в области онкологии для тестирования перспективных соединений, способных усиливать иммунный ответ при многих различных типах опухолей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Четыре различных варианта грибов, описанные в этом протоколе, были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).
1. Выделение грибковых β-глюканов
- Экстракция и выделение растворимых полисахаридов грибов
ПРИМЕЧАНИЕ: Растворимые полисахариды грибов (SMP) были получены в соответствии с процедурой, схематически показанной на рисунке 1.- Аккуратно промойте свежие плодовые тела P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus и G. lucidum (около 2,000 г на гриб) в дистиллированной воде пять раз.
- Высушите плодовые тела при температуре 50 ± 2 °C в обычной сушильной печи на воздухе до достижения постоянного веса (~24 часа).
- Измельчите высушенные грибы в лопастной мельнице, получив около 200 г порошка от каждого гриба.
- Суспендировать 100 г грибного порошка (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus и G. lucidum) в 1,000 млH2O d. Затем в автоклаве при 121 °C в течение 15 минут и, наконец, оставить при комнатной температуре на 30 минут.
- Центрифугируют полученную суспензию при 6000 x g в течение 10 мин при 4 °C.
- Осадок, содержащий нерастворимые полисахариды грибов (IMPs), высушить при температуре 50 ± 2 °C в сушильной печи на воздухе в течение 24 часов.
- Выбросьте осадок и сохраните надосадочную жидкость. Сконцентрируйте надосадочную жидкость 10 раз во роторном испарителе.
- Осаждайте концентрат, содержащий SMP, этанолом (конечная концентрация 80%) при температуре 4 °C в течение ночи.
- Центрифугируют суспензию этанола при 6000 x g в течение 15 мин при 4 °C, сохраняют гранулы (осадок) и отбрасывают надосадочную жидкость пипеткой.
- Трижды промойте осадок 80% этанолом перед растворением его в H2O d (10% мас./об.). Отрегулируйте рН до 6,5/7 и температуру до 37 °C и обработайте 2 U и 4 ЕД α-амилазы и глюкоамилазы соответственно для растворения α-глюканов в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
- После обработки α-амилазой/глюкоамилазой отрегулируйте рН и температуру до 8,0 и 50 °C соответственно и обработайте алкалазой (2,5 ЕД/г белка) (см. Таблицу материалов) для растворения белков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта последовательная ферментативная обработка удаляет большинство α-глюканов и белков, которые осаждаются вместе с β-глюканами при осаждении этанола. - После гидролиза центрифугируют гидролизат при 6000 x g в течение 15 мин при 4 °C, а чистый надосадочный концентрат пять раз в ротационном испарителе. Снова выпадайте в осадок с 80% этанолом.
- Растворяют полученный осадок в H2Od и диализируют в дистиллированной воде в течение 24 ч с использованием мембран из целлюлозных трубок (отсечные мембраны 12 000 Да; см. Таблицу материалов) для удаления низкомолекулярных молекул. Восстановите водорастворимую часть и высушите ее вымораживанием для получения растворимых β-глюканов (SβGs).
- Измерение сахара и белка
- Измерьте общее содержание сахара в каждой фракции фенол-сернокислотным методом, используя глюкозу в качестве стандарта8.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количественное определение содержания β-глюкана также может быть выполнено с использованием набора для анализа β-глюкана (грибы и дрожжи; см. Таблицу материалов) на основе ферментативного гидролиза и активности оксидоредуктаз: а именно экзо-1,3-β-глюканазы, глюкозооксидазы, β-глюкозидазы и пероксидазы с последующим образованием хинонимина. Следуйте инструкциям производителя с небольшими изменениями. - Используйте 18 MH 2 SO 4вместо 12 MH2SO4.
- Оценивают содержание общих глюканов и α-глюканов отдельно.
- Измерьте результирующие значения β-глюкана как разницу между общими значениями глюкана и α-глюкана (в трех экземплярах) в соответствии с протоколом Кьельдаля. В некоторых случаях содержание белка можно определить по методу Лоури, используя альбумин для построения калибровочной кривой11,12.
- Измерьте общее содержание сахара в каждой фракции фенол-сернокислотным методом, используя глюкозу в качестве стандарта8.
- Анализ ультрафиолетовой абсорбционной спектроскопии
- Получение ультрафиолетовых (УФ) спектров SβG с помощью УФ-видимого спектрофотометра (см. Таблицу материалов) путем сканирования образцов в области 200-400 нм (рис. 2).
- Приготовьте 1,0 мг/мл каждого SβG в H2Od, перенесите раствор в кварцевую кювету и просканируйте при комнатной температуре.
- Анализ молекулярно-массового распределения
- Оценить гомогенность SβGs и молекулярную массу полимеров методом эксклюзионной хроматографии (SEC) с использованием системы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (см. Таблицу материалов), оснащенной детектором показателя преломления и ультрагидрогелевой линейной гелевой фильтрационной колонкой (300 мм x 7,8 мм; Рисунок 3).
- Проведите анализ при 40 ° C, используя деионизированную воду в качестве элюента со скоростью потока 0,5 мл / мин-1 и декстранс (110, 80 и 50 кДа) в качестве стандартов (см. Таблицу материалов). Соберите фракцию 5 мл.
- Инфракрасный анализ с преобразованием Фурье (FTIR)
- Запишите инфракрасные спектры (рис. 4) на ИК-Фурье спектрометре в диапазоне 4000-500 см-1. Образцы должны быть предварительно смешаны с KBr для формирования пленок (стандартная процедура FTIR; см. инструкции производителя и таблицу материалов).
- Анализ молекулярного состава
- Оцените молекулярный состав SβG с помощью высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ), а также газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС) в соответствии со стандартными процедурами12.
2. Исследование in vitro стимуляции микроглии, индуцированной β-глюканом
- Культура клеток глиобластомы мыши и клеток микроглии на 8-луночных камерных предметных стеклах
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол специфичен для клеточных линий GL261 (глиобластома) и BV2 (микроглия). Однако, с небольшими изменениями, эти шаги потенциально могут быть использованы для изучения других линий рака и иммунных клеток.- Приготовьте модифицированную среду Eagle's Medium (DMEM) от Dulbecco, модифицированную L-глутамином, 4,5 г/л D-глюкозы и без пирувата. Добавьте 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина (см. Таблицу материалов). Предварительно прогрейте материал на водяной бане при температуре 37 °C в течение 15 минут.
- Разморозьте замороженные аликвоты BV2 и GL261 на водяной бане (37 °C) в течение 2 минут, а непосредственно перед их полным оттаиванием перенесите их в колпак с ламинарным потоком и поместите клетки в две разные стерильные колбы T25 (по одной для каждой клеточной линии).
- Инкубируйте колбы T25 при 37 °C, 5% CO2 до тех пор, пока культура не сольется.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от условий замораживания и времени криоконсервации время до слияния может варьироваться. Этим клеточным линиям обычно требуется от 3 до 5 дней, чтобы достичь слияния в колбе T75. - После того, как культура клеток BV2 станет сливающейся, перенесите ее в 8-луночные камерные слайды 0,6 х 106 клеток/лунку. Храните 8-луночные камерные предметные стекла в инкубаторе в течение 24 часов.
- После того, как клетки микроглии помещены в 8-луночные камерные предметные стекла, повторите тот же протокол с клетками GL261.
- Активация микроглии β-глюканами
- Покройте клетки BV2 четырьмя различными β-глюканами (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum и H. erinaceus) в концентрации 0,2 мг / мл в течение 72 часов. Одно экспериментальное состояние должно оставаться необработанным (нормальная среда), выступая в качестве контрольной группы.
- Соберите надосадочную жидкость пипеткой через 72 ч и пропустите оставшийся объем через шприц-фильтр 0,20 мкм. Затем заморозьте надосадочную жидкость при -80 °C не менее чем на 24 часа.
- Обработка GL261 предварительно активированной средой, кондиционированной микроглией
- После того, как GL261 на 80% растворится в предметных стеклах 8-луночной камеры, добавьте обработанную β глюканом микроглиальную среду (этап 2.2.2) с конечной объемной концентрацией 25% в течение 72 ч (общий объем: 250 мкл / лунка).
- Удалите среду после 72 часов инкубации и выбросьте ее.
- Промойте клетки фосфатным буферным физиологическим раствором (PBS; pH 7,4, 0,1 М) три раза в течение 5 минут.
- Зафиксируйте ячейки, добавив 200 мкл 4% параформальдегида (PFA) при 4 ° C в течение 15 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от различных антител, которые могут быть использованы для иммунофлюоресценции, методы фиксации могут отличаться от типичных 4% PFA. Фиксаторы на спиртовой основе могут быть более эффективными в сохранении определенных эпитопов.
- Иммунофлюоресцентное исследование
- Промойте образцы PBS с тритоном X (PBST; 0,01%) в течение 10 мин три раза.
- Удалите PBST и добавьте бычий сывороточный альбумин (BSA), блокирующий буфер 10% в PBST (таблица 1) в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Удалите блокирующий буфер и добавьте 200 мкл на лунку PBS, содержащую смесь первичных антител (моноклональное антитело Ki-67 крысы 1:500 и расщепленное антитело каспазы-3 кролика 1:500; см. Таблицу материалов). Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C.
- После 24 ч инкубации при 4 °C оставляют образцы при комнатной температуре на 30 мин.
- Промойте колодцы три раза в течение 10 минут с помощью PBS на шейкере (низкая скорость).
- Удалите PBS и замените PBS 200 мкл на лунку, содержащую смесь вторичных антител (вторичное антитело 1:200 против крыс IgG (H + L) с высокой перекрестной адсорбцией, Alexa Fluor 488 и вторичное антитело против кролика 1:200 против кролика (H + L) с высокой перекрестной адсорбцией, Alexa Fluor 647; см. Таблицу материалов) в течение 45 минут при комнатной температуре в темноте.
- Промойте образцы с помощью PBS в течение 10 минут на универсальном шейкере.
- Удалите PBS и добавьте 200 мкл на лунку 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI), разбавленного PBS (1:5,000) в течение 1 мин.
- Снимите DAPI (см. Таблицу материалов) и промойте ячейки в течение 5 мин в PBS.
- Снимите раму скважины и добавьте 50 мкл PBS:глицерина (1:1) в каждую лунку и накройте покровным стеклом.
- Заклейте слайды лаком для ногтей.
- Получение изображений в 20-кратном формате с помощью системы конфокального микроскопа (см. Таблицу материалов).
3. Количественная оценка и анализ пролиферации и апоптоза опухолевых клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы измерить потенциальное влияние различных β-глюканов на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток, в программном обеспечении ImageJ был использован собственный сценарий для количественной оценки количества положительных пикселей Ki67 (пролиферация) и cCasp3 (апоптоз)13.
- Откройте ImageJ. Нажмите на кнопку «Плагины ». Нажмите на Coloc2, плагин, ранее установленный в папке плагина, и, наконец, выберите изображение для анализа11.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот плагин был доступен после предыдущего контакта с доктором Василики Экономопулосом (veconom@uwo.ca). Вместо скрипта и ImageJ, и фиджийское программное обеспечение имеют разные инструменты для анализа колокализации (см. Таблицу материалов) со схожими свойствами. - Установите пороговые значения в соответствии с контрольными условиями (необработанные, только DMEM). Нажмите на кнопку ОК .
ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание расхождений фона и интенсивности все изображения должны быть сделаны в одинаковых условиях. Предпочтительно, сеансы визуализации должны проводиться в один и тот же день, а параметры микроскопа не изменялись на всех изображениях. - Убедитесь, что во всплывающем окне появляются результирующие изображения колокализованных пикселов и сводное окно, содержащее процентное или необработанное количество пикселов выше порогового значения. Нормализуют результаты по отношению к контрольным (необработанным) условиям.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все данные приведены в виде среднего значения ± SEM. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения для построения графиков и анализа (см. Таблицу материалов). Был использован односторонний ANOVA с многократным сравнительным тестом Тьюки. Погрешности представляются как стандартная погрешность среднего значения (s.e.m.) (*p < 0,05, **p < 0,01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешная очистка β-глюканов
Масса MP, SMP и SβG, полученных из плодовых тел P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum и H. erinaceus после процесса экстракции и очистки, обобщена в таблице 1. Основной состав (общие углеводы, β-глюканы и белок) МП, СМП и SβG, полученных из грибов, изображен в таблице 2. Эти результаты показывают, как протокол позволил получить большое количество белка в SMP. Однако ферментативная обработка α-амилазой/глюкоамилазой и протеазой уменьшала количество белка и увеличивала концентрацию β-глюканов.
УФ-спектры различных SβG не показали пиков поглощения УФ-излучения при 260 и 280 нм (рис. 2A), что указывает на то, что в SβG отсутствуют нуклеиновые кислоты (260 нм) и белки (280 нм). Кроме того, однородность SβG была проверена с помощью спектроэлектрохимии поглощения УФ-видимого излучения (SEC). Хроматограммы (рис. 3) показали хорошую однородность с основным резким и единичным пиком в 8,20, 10,5, 10,9 и 11,3 мин для H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus и P. djamor соответственно. Эти данные свидетельствуют о том, что фракция согласуется с гомополимерами. Кроме того, усредненный по весу Mw был рассчитан как около 120,8, 92,8, 80,7 и 75,9 кДа для H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus и P. djamor соответственно в соответствии с уравнением калибровочной кривой (y = -0,0655x + 2,6194; R2 = 0,9951).
Спектры FTIR измеряли молекулярные колебания, которые соответствовали ковалентным полисахаридным связям (рис. 4). Спектры показали широкую и интенсивную гидроксильную группу на уровне около 3,435 см-1. Он также показал слабый пик растяжения C-H на уровне около 2,922 см-1, что соответствует полисахаридам14. Кроме того, поглощение на уровне около 1,641 см-1 может быть отнесено к амиду I15, связанному с колебаниями удлинения групп C = O и CN. Сигнал на расстоянии около 1,154 см-1 может быть обусловлен асимметричным растяжением C-O-C гликозидной связи16. Наконец, полоса на уровне около 1,072 см-1 указывала на растяжение C-O β-глюканов16. Слабое поглощение вблизи 893 см-1 может быть связано с асимметричной преломляющей вибрацией β-пиранозы, демонстрирующей β-конфигурацию сахарных звеньев17. В целом, было обнаружено, что SβG в основном состоят из углеводов, конъюгированных с минимальным количеством белка.
Моносахаридный профиль SβGs был дополнительно изучен с помощью ВЭТХХ и ГХ-МС. Подтверждено наличие большого количества D-глюкозы с меньшими количествами D-галактозы и D-маннозы и следами D-ксилозы, D-рамнозы, D-фукозы и L-арабинозы. В таблице 3 обобщены результаты, полученные для SβG H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus и P. djamor.
Среда, кондиционированная микроглией, предварительно активированная β-глюканом, индуцировала апоптоз в раковых клетках
После того, как β-глюканы из отобранных грибов были успешно выделены и полностью охарактеризованы, их добавляли в культуру клеток микроглии (BV2). Через 72 ч после добавления кондиционированной микроглией среды к клеткам GL261 (рис. 5) иммунофлуоресценцией измеряли экспрессию двух ключевых маркеров пролиферации (Ki67) и апоптоза (расщепленная каспаза 3 [cCasp3]). Используя собственный сценарий в программном обеспечении ImageJ, количество положительных пикселей для каждого флуоресцентного канала было количественно определено, и, таким образом, был проанализирован способ, которым потенциальный эффект β-глюкан-индуцированной активации микроглии может повлиять на поведение опухолевых клеток. Используя контрольные образцы в качестве порога интенсивности каждого флуорофора, сценарий предоставил количество пикселей и, таким образом, указал экспрессию для каждого маркера после различных условий эксперимента (рис. 6).
Интересно, что GL261 не претерпел каких-либо существенных различий в отношении пролиферации опухоли после воздействия различных сред, кондиционированных микроглией (рис. 7). Однако P. djamor (B) и H. erinaceus (C) показали сильную индукцию (примерно шестикратное и девятикратное увеличение соответственно) cCasp3.
Рисунок 1: Протокол изоляции. Схема протокола выделения и очистки препарата SβG от P. streatus, P. djamor, H. erinaceus и G. lucidum. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: УФ-спектры β-глюканов. УФ-спектры в области 200-400 нм (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. jamor и (D) H. erinaceus. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Хроматограммы исключения размера. Эксклюзионные хроматограммы (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. jamor и (D) H. erinaceus. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Спектры ИК-Фурье. Инфракрасные спектры с преобразованием Фурье (FTIR) (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor и (D) H. erinaceus. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Схема анализов костимуляции. Анализ костимуляции, при котором клетки микроглии мыши (BV2) были покрыты в течение 72 часов β-глюканами. После криоконсервации и фильтрации надосадочную жидкость собирали и переносили в культуру клеток GL261 (25%) в течение 72 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Изображения пролиферации и апоптоза. Иммунофлуоресцентные изображения, показывающие тройную колокализацию GL261 с DAPI (синий), Ki67 (зеленый) и cCasp3 (красный). Скрипт «Prob Coloc» (нижние изображения) позволил количественно определить количество положительных пикселей от каждого маркера и колокализацию между ними. Масштабная линейка: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Количественная оценка скорости пролиферации и апоптоза. Нормализованные значения по отношению к контрольным условиям (DMEM) экспрессии Ki67 (слева) и cCasp3 (справа) в клетках GL261 после экспозиции среды, кондиционированной микроглией. (А) Pleurotus ostreatus, (B) Pleurotus djamor, (C) Hericium erinaceus y, (D) Ganoderma lucidum. Ошибки представляются в виде s.e.m. (*p < 0.05, **p < 0.01). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| МП (г) | СМП (г) | SβGs (г) | |
| P. ostreatus | 201,3 ± 2,2 | 14,4 ± 0,9 (7,1%) | 5.3 ± 0.2 (2.6%) |
| . джамор | 200.8 ± 1.9 | 13,5 ± 0,6 (6,7%) | 4,9 ± 0,3 (2,4%) |
| G. lucidum | 201.8 ± 1.6 | 14,7 ± 1,2 (7,3%) | 5,5 ± 0,2 (2,7%) |
| H. erinaceus | 204.2 ± 1.2 | 15,4 ± 0,8 (7,5%) | 5,7 ± 0,2 (2,8%) |
Таблица 1: Таблица содержания глюканов. Баланс массы для получения MP, SMP и SβG из плодовых тел P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum и H. erinaceus.
| НАРДЕП | СМП | SβGs | ||
| СНт (%) | 67,3 ± 1,9 | 53,8 ± 2,3 | 90,1 ± 1,2 | |
| P. ostreatus | β-глюкан (%) | 22.7 ± 1.4 | 31.3 ± 2.4 | 89,4 ± 2,3 |
| Белки (%) | 21,5±0,9 | 19,6 ± 0,8* | 0,4 ± 0,1* | |
| СНт (%) | 68,3 ± 2,1 | 61,4 ± 3,1 | 93,4 ± 1,1 | |
| . джамор | β-глюкан (%) | 24.3 ± 2.8 | 30.8 ± 3.5 | 91,3 ± 3,4 |
| Белки (%) | 19.9 ± 1.0 | 22.3 ± 1.1* | 0,9 ± 0,2* | |
| G. lucidum | СНт (%) | 66,4 ± 1,8 | 56,8 ± 2,9 | 93.7 ± 0.9 |
| β-глюкан (%) | 22.5 ± 1.9 | 24.9 ± 3.1 | 92,0 ± 2,6 | |
| Белки (%) | 18.9 ± 0.8 | 21,4 ± 0,6* | 1,5 ± 0,4* | |
| H. erinaceus | СНт (%) | 67,4 ± 1,2 | 58,9 ± 1,9 | 93,8 ± 1,4 |
| β-глюкан (%) | 23.9 ± 1.6 | 35,9 ± 2,1 | 91,8 ± 2,8 | |
| Белки (%) | 17.6 ± 1.3 | 22,7 ± 1,8* | 1.3 ± 0.2* |
Таблица 2: Общее количество углеводов. Сухая масса (г) Содержание общих углеводов (CHt), β-глюкана и белка MP, SMP и SβGs. Содержание белка (MP) количественно определено по методу Кьельда12. (*, белки, количественно определяемые по методу Лоури9).
| D-глюкоза (%) | D-Mann (%) | D-Gala (%) | D-Fuco (%) | D-Xylo (%) | D-Rham (%) | L-араб (%) | |
| H. erinaceus | 91.6 ± 0.6 | 3.8 ± 0.1 | 2.1 ± 0.2 | 0,5 ± 0,2 | 0,8 ± 0,2 | 0,3 ± 0,1 | н.д. |
| G. lucidum | 94.3 ± 0.8 | 2.6 ± 0.2 | 1.9 ± 0.2 | 0,3 ± 0,1 | 0,9 ± 0,2 | н.д. | 0,4 ± 0,1 |
| P. ostreatus | 93.8 ± 0.5 | 4.4 ± 0.1 | 0,8 ± 0,1 | 0,4 ± 0,1 | н.д. | н.д. | н.д. |
| . джамор | 95.2 ± 0.7 | 1.7 ± 0.2 | 1.1 ± 0.1 | 0,3 ± 0,1 | н.д. | н.д. | н.д. |
Таблица 3: Характеристика моносахаридов. Моносахаридный профиль SβGs P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum и H. erinaceus (n.d., некоторые моносахариды не были обнаружены).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой работе описывается использование хорошо зарекомендовавших себя методов для успешного выделения, очистки и характеристики содержания SβG из четырех различных грибов. Результаты показали, как после экстракции горячей водой SMP, полученных из P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum и H. erinaceus, с последующей гидролитической обработкой α-амилазой, глюкозидазой и протеазой, содержание α-глюкана и белка снижалось, тем самым значительно обогащая количество чистых SβG.
Несмотря на это, мы заметили, что большинство грибковых β-глюканов были нерастворимы в воде в процессе очистки. Основной интерес в исследовании представляли SβGs, в силу их медицинских/фармацевтических свойств10,18. Кроме того, благодаря гидролитической обработке, осаждению этанола и диализу растворимые низкомолекулярные углеводы, пептиды, олигопептиды и аминокислоты были успешно удалены из SMP, показав эффективность, аналогичную другим предыдущим работам с использованием другого типа грибов, но с аналогичными процессами19,20.
Чтобы проверить чистоту SβGs, УФ-спектры различных SβG исследовали с помощью УФ-спектрофотометрии, сканируя образцы в области 200-400 нм. Пики поглощения ультрафиолета не наблюдались на длине волны 260 и 280 нм, что указывает на то, что SβG не имеют ни нуклеиновых кислот (260 нм), ни белков (280 нм), что еще раз показывает, что β-глюканы в основном составляют SβG. Хотя УФ-спектры в области 200-400 нм показали отсутствие какого-либо определенного/резкого пика на длине волны 280 нм, небольшой пик все же можно было наблюдать. Это можно объяснить наличием небольшого количества белков, связанных с полисахаридами, что согласуется с результатами, показанными в таблице 2. Однако интересно учитывать, что такое ничтожно малое количество полисахаридов также может быть объяснено задержкой доступа к остальным белкам, которые могут быть экранированы глюканами, или стерическими эффектами, которые предотвращают полную деградацию белков, связанных с глюканом. Важно отметить, что однородность SβG была дополнительно проверена с помощью SEC, мощного аналитического метода, используемого для очистки растворенных молекул по размеру, который подтвердил результаты протокола.
Кроме того, спектры FTIR использовались для измерения молекулярных колебаний, соответствующих ковалентным полисахаридным связям. Как было описано ранее, сходные спектры были получены для всех четырех грибов. Особенность спектров показала присутствие полисахаридов14, амида I15 и β-глюканов16. Слабое поглощение около 893 см-1 предполагало β-конфигурацию сахарных единиц17. В целом, было обнаружено, что SβG в основном образуются из углеводов, конъюгированных с минимальным количеством белка. Что касается интереса к использованию SβG в качестве иммуномодулирующих молекул, стоит подчеркнуть, что полисахаридно-белковые комплексы часто отмечаются за их иммуномодулирующие свойства21.
Наконец, моносахаридный профиль SβGs был изучен с помощью ВЭТХХ и ГХ-МС. Наличие большого количества D-глюкозы с меньшими количествами D-галактозы и D-маннозы и следов D-ксилозы, D-рамнозы и D-фукозы строго подразумевает, что преобладающим компонентом в SβG является β-глюкан. Однако важно уточнить, что наша система очистки является результатом оптимизации различных классических процедур. В настоящее время мы работаем над улучшением нескольких этапов, в основном сосредоточенных на методах хроматографии (эксклюзия по размеру и ионообменная хроматография).
Что касается основной цели этой работы, которая состояла в том, чтобы проверить влияние β-глюканов на иммунные клетки, после того, как четыре различных типа β-глюканов были успешно очищены, было проверено их потенциальное влияние на активацию микроглии. Иммунофлуоресценцию использовали против двух маркеров золотого стандарта пролиферации и апоптоза22,23.
Несмотря на отсутствие статистических различий в скорости пролиферации опухолей, P. ostreatus (A) и H. erinaceus (C) смогли снизить экспрессию Ki67 до 50%. Отсутствие значимости, вероятно, связано с высокой дисперсией в исследовании в отношении G. lucidum. Кроме того, индукция апоптоза в раковых клетках является довольно интересным терапевтическим подходом, и P. djamor (B) и H. erinaceus (C) показали значительную индукцию уровней cCasp3, что свидетельствует об активации программы клеточной гибели. Все эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями, которые показали противоопухолевое действие этих грибов при других типах опухолей24,25. Эксперименты проводились в двух экземплярах, в одинаковых условиях и под руководством одних и тех же исследователей. Программный анализ результатов иммунофлуоресцентных исследований поддерживает непредвзятый подход и расширяет потенциальный охват этого исследования.
В целом, эти исследования имеют основную проблему, связанную с использованием β-глюканов, которая заключается в чистоте соединений. Необходимо следовать самым высоким стандартам, чтобы подтвердить, что наблюдаемые эффекты после их использования в иммунологических исследованиях вызваны исключительно углеводами, а не белками или другими структурами, которые могут оставаться прикрепленными к ним, если очистка не выполняется должным образом. Одним из дополнительных шагов, который может быть рассмотрен в будущих исследованиях, является использование методов хроматографии (например, ионный обмен или исключение размера).
Общий вывод после исследований помещает H. erinaceus в качестве главного кандидата в качестве потенциального иммунотерапевтического варианта для лечения глиобластомы из-за его способности снижать пролиферацию опухоли (~ 50%) и вызывать сильную активацию программы гибели клеток в клетках глиобластомы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет никаких конкурирующих интересов, которые можно было бы декларировать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить доктора Василики Экономопулос за ее собственный сценарий для измерения сигнала фулюоресценции в ImageJ. Мы также хотели бы поблагодарить CITIUS (Университет Севильи) и весь их персонал за поддержку во время демонстрации. Эта работа была поддержана испанским FEDER I + D + i-USE, US-1264152 из Университета Севильи и Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
| Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
| Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
| Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
| Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4 | |||
| HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
| Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
| Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
| Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
| Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
| Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
| Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
| Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
| β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
| β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |
References
- Aldape, K., et al. Challenges to curing primary brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).
- Himes, B. T., et al. Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications. Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).
- Ma, J., Chen, C. C., Li, M.
- Sevenich, L. Turning "cold" into "hot" tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers. Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).
- Niesel, K., et al. The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis. EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).
- McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses. Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).
- Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. Effects of medicinal fungi-derived β-glucan on tumor progression. Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).
- Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells. Journal of Hematology & Oncology. 2, 25 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Klaus, A., et al. Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune. Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).
- Soto, M. S., et al. STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction. Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).
- Chromý, V., Vinklárková, B., Šprongl, L., Bittová, M. The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).
- Waterborg, J. H., Matthews, H. R. The Lowry method for protein quantitation. Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).
- Zhang, L., et al. Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms. International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).
- Barbosa, J. S., et al. Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2. Food Chemistry. 330, 127173 (2020).
- Ma, Y. H., et al. Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).
- Nie, L., et al. Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro. Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).
- Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health. Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).
- Klaus, A., et al. The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants. International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).
- Kozarski, M., et al. Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification. Food Research International. 64, 53-64 (2014).
- Ayimbila, F., Keawsompong, S. Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus. 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).
- de Azambuja, E., et al. Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients. British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).
- Holubec, H., et al. Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).
- Borges, G. M., et al. Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180. Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).
- Sohretoglu, D., Huang, S. Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).
